Исследование клеточных функций и механизма работы белка-аргонавта из цианобактерии Synechococcus elongatus. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Олина Анна Викторовна

• Олина Анна Викторовна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Олина Анна Викторовна

Список условных сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость исследования

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личное участие автора в проведении исследований

2. Обзор литературы

2.1. Открытие РНК-интерференции

2.2. Белки-аргонавты эукариот

2.3. Короткие некодирующие РНК

2.3.1. МикроРНК (тРНК)

2.3.2. Короткие интерферирующие РНК ^РНК)

2.3.3. piРНК (РНК, ассоциированные с белком PIWI)

2.3.4. tRFs ^РНК) - короткие некодирующие РНК-производные тРНК

2.3.5. rRFs (короткие РНК-производные рРНК)

2.4. Структура гидовой нуклеиновой кислоты

2.5. Механизмы работы RISC в клетках эукариот

2.6. Белки-аргонавты прокариот

2.6.1. Разнообразие и структурные особенности

2.6.2. Генерация гидов и загрузка их в аргонавт

2.6.3. Предполагаемые функции прокариотических аргонавтов

2.6.4. Применение прокариотических белков-аргонавтов в биотехнологии

2.7. Заключение

3. Материалы и методы

3.1. Бактериальные штаммы, плазмиды, среды

3.1.1. Штаммы

3.1.2. Плазмиды

3.1.3. Питательные среды и антибиотики

3.1.4. Подсчет КОЕ/мл

3.2. Методы работы с ДНК

3.2.1. Электрофоретическое разделение молекул ДНК

3.2.1.1. Электрофорез в агарозном геле

3.2.1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле

3.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3.2.2.1. ПЦР с колоний

3.2.3. Очистка ПЦР-продуктов

3.2.4. Выделение ДНК из агарозного геля

3.2.5. Выделение ДНК из полиакриламидного геля

3.2.6. Измерение концентрации ДНК и РНК

3.2.7. Лигирование

3.2.8. Трансформация бактерий

3.2.9. Выделение плазмидной ДНК

3.2.10. Приготовление проб для секвенирования

3.3. ПЦР и клонирование

3.3.1. Получение плазмид, содержащих оптимизированный ген ago S. elongatus PCC 7942 с His6-tag

3.3.2. Получение плазмид, содержащих гены SSB белков S. elongatus

3.4. Выделение белков

3.4.1. Электрофорез в денатурирующем геле

3.4.2. Определение концентрации белков

3.4.3. Выделение SeAgo-His6

3.4.3.1. Суперпродукция SeAgo-His6

3.4.3.2. Выделение и очистка SeAgo-His6

3.4.3.3 Выделение и очистка SeAgoOPT-His6

3.4.4. Выделение SeSSB белков

3.4.5. Буферы, использованные при выделении и очистке белков SeAgo и SeAgoOPT и SeSSB белков

3.5. Характеристика биохимических свойств SeAgo и ассоциированных НК

3.5.1. Выделение нуклеиновых кислот, связанных с аргонавтом

3.5.2. Дефосфорилирование коротких нуклеиновых кислот

3.5.3. Фосфорилирование коротких нуклеиновых кислот

3.5.4. Обработка нуклеиновых кислот ДНКазой и РНКазой

3.5.5. Визуализация нуклеиновых кислот в геле

3.5.6. Приготовление библиотек для секвенирования

3.5.7. Биоинформатический анализ библиотек коротких ДНК

3.5.8. Определение активности аргонавта

3.5.9. Определение влияния транскрипции на активность аргонавта на суперскрученной плазмидной ДНК

3.6. Культивирование S. elongatus, ростовые кривые

3.7. Выделение SeAgo-His6 из клеток S. elongatus, белковая масс-спектрометрия

3.8. Определение активности промотора гена ago в клетках S. elongatus

3.9. Определение уровня мРНК SeAgo в клетках S. elongatus

4. Результаты

4.1. Эксперименты in vitro

4.1.1. Экспрессия SeAgo в клетках E. coli. Подбор и оптимизация условий выделения и очистки белка

4.1.2. Выделение и очистка SeAgo-His6

4.1.3. Тест на определение нуклеазной активности и специфичности SeAgo

4.1.4. Влияние структуры 5'-конца гида на активность SeAgo

4.1.5. Определение предпочтения к каталитическому иону

4.1.6. Влияние мисматчей в дуплексе гид-мишень на активность SeAgo

4.1.7. Оценка активности SeAgo на линейной дцДНК

4.1.8. Оценка активности SeAgo на кольцевой суперскрученной плазмидной ДНК. Влияние транскрипции

4.2. Эксперименты in vivo в клетках E. coli

4.2.1. Выделение и анализ нуклеиновых кислот, ассоциированных с SeAgo в клетках E. coli

4.3. Эксперименты in vivo в клетках S. elongatus

4.3.1. Влияние мутаций в гене ago на рост культуры S. elongatus

4.3.2. Определение уровня экспрессии SeAgo в исследуемых штаммах, определение активности промотора гена ago

4.3.3. Выделение SeAgo из клеток S. elongatus и анализ совыделяющихся нуклеиновых кислот

4.3.4. Белковая масс-спектрометрия и поиск белков-партнеров SeAgo в клетках S. elongatus

4.3.5. Анализ влияния SSB белка на активность SeAgo in vitro

4.3.6. Анализ библиотек коротких ДНК, ассоциированных с SeAgo в клетках S. elongatus

4.4. Влияние SeAgo на устойчивость клеток E. coli к ципрофлоксацину

5. Обсуждение результатов

5.1. In vitro активность S eAgo

5.2. Предполагаемые функции SeAgo в клетках E. coli и S. elongatus

6. Заключение

7. Выводы

8. Благодарности

9. Список литературы

10. Приложение

Список условных сокращений

eAgo - эукариотический белок-аргонавт

pAgo - прокариотический белок-аргонавт

дцДНК - двуцепочечная ДНК

дцРНК - двуцепочечная РНК

мРНК - матричная РНК (messenger RNA)

нт - нуклеотид

по - пара оснований

НТФ - нуклеозидтрифосфат

оцДНК - одноцепочечная ДНК

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

РНКП - РНК-полимераза

Ago - белок-Аргонавт (Argonaute)

AaAgo - белок-Аргонавт из Aquifex aeolicus

AfAgo - белок-Аргонавт из Archaeoglobus fulgidus

CbAgo - белок-Аргонавт из Clostridium butyricum

CpAgo белок-Аргонавт из Clostridium perfringens

KmAgo - белок-аргонавт из Kurthia massiliensis

IbAgo - белок-Аргонавт из Intestinibacter bartlettii

KjAgo - белок-Аргонавт из Kordia jejudonensis

LrAgo - белок-Аргонавт из Limnothrix rosea

MjAgo - белок-Аргонавт из Methanocaldococcus jannaschii

т1РНК - микроРНК

MpAgo - белок-Аргонавт из Marinitoga piezophila

NgAgo - белок-Аргонавт из Natronobacterium gregoryi

PfAgo - белок-Аргонавт из Pyrococcus furiosus

р1РНК - РНК, ассоциированные с белком PIWI

RsAgo - белок-Аргонавт из Cereibacter sphaeroides

SeAgo - белок-Аргонавт из Synechococcus elongatus

siРНК - короткие интерферирующие РНК

TtAgo - белок-Аргонавт из Thermus thermophilus

тДНК - таргетная ДНК (мишень)

tRF - короткая некодирующая РНК, производная транспортной РНК

rRF - короткая некодирующая РНК, производная рибосомальной РНК

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

РНК-интерференция является важным компонентом регуляции экспрессии генов в клетках практически всех эукариот. Основными участниками процессов РНК-интерференции являются короткие некодирующие РНК и белки-аргонавты. Процессы с участием аргонавтов, протекающие в клетках эукариот, охарактеризованы довольно полно, как и структурные особенности эукариотических белков-аргонавтов. Все эукариотические аргонавты являются специфическими РНК-зависимыми РНК-нуклеазами и обладают схожей консервативной структурой.

В течение нескольких последних лет было обнаружено, что значительная часть геномов бактерий и архей также содержит гены белков-аргонавтов. Прокариотические аргонавты более разнообразны по структуре, могут обладать иными вариантами субстратной специфичности: большая часть из них - ДНК-зависимые ДНК-нуклеазы.

Изучение прокариотических белков-аргонавтов началось с исследования белков термофильных микроорганизмов, после чего было изучено несколько аргонавтов из мезофильных бактерий. Затем, когда были получены некоторые базовые знания о структуре и возможностях прокариотических аргонавтов, возникло два основных направления развития дальнейших исследований. Первое, фундаментальное, связано с изучением роли белков-аргонавтов в клетках прокариот и механизма их работы. Разнообразие прокариотических аргонавтов велико, распространение среди микроорганизмов тоже, однако о функциональной роли этих белков пока известно мало. На данный момент считается, что аргонавты защищают клетки прокариот от чужеродных ДНК: плазмид и бактериофагов. Однако большая

часть работ, направленных на изучение функций аргонавтов, была выполнена в гетерологичной системе E. coli, что не позволяет однозначно определить функции аргонавтов в клетках естественных хозяев. Второе направление, более прикладное, связано с использованием прокариотических белков аргонавтов как инструментов биотехнологии. Благодаря отличной от эукариотических аргонавтов субстратной специфичности, их рассматривают как перспективные инструменты регуляции экспрессии генов и редактирования геномов в клетках эукариот. Кроме того, уже сейчас некоторые прокариотические аргонавты нашли применение в методах детекции нуклеиновых кислот, так как способны специфически распознавать определенные последовательности в их составе.

В связи с тем, что разнообразие прокариотических аргонавтов очень велико, поиск и исследование новых белков-аргонавтов могут быть важны для понимания разнообразия функций и механизмов работы данных белков в бактериях и создания новых инструментов генной инженерии. Однако лишь малая часть прокариотических аргонавтов может быть экспрессирована и изучена в «родных» штаммах бактерий-хозяев из-за трудностей культивирования и сложности разработки методов генетических манипуляций. Тем не менее, только такое исследование может максимально точно охарактеризовать механизм работы аргонавтов в клетках бактерий.

Данная работа посвящена изучению механизмов функционирования белка-аргонавта SeAgo из мезофильной цианобактерии Synechococcus elongatus PCC 7942. Белок SeAgo представляет интерес как новый представитель группы прокариотических аргонавтов, для которого существует уникальная возможность изучения в организме естественного хозяина, а также в системе E. coli и в условиях

in vitro. Значительный научный интерес представляет сравнение полученных данных.

Цели и задачи исследования

Цель:

Изучить параметры экспрессии белка-аргонавта SeAgo Synechococcus elongatus PCC 7942 в клетках цианобактерий и охарактеризовать его свойства в системе in vitro и in vivo.

Задачи:

1. Подобрать условия экспрессии SeAgo в E. coli и условия его очистки, получить очищенный препарат белка, охарактеризовать его свойства в тестах in vitro;

2. Оценить влияние мутаций в гене белка-аргонавта на рост клеток S. elongatus PCC 7942 и параметры экспрессии гена ago в клетках S. elongatus;

3. Выделить белок-аргонавт из клеток S. elongatus и проанализировать ассоциированные с ним нуклеиновые кислоты и белки;

4. Изучить SeAgo-ассоциированные нуклеиновые кислоты в гетерологичной системе E. coli.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В ходе работы впервые был изучен белок-аргонавт из мезофильной цианобактерии S. elongatus PCC 7942 SeAgo. Данный белок был охарактеризован биохимически in vitro, были определены ключевые параметры его работы как программируемой ДНК-зависимой ДНК-нуклеазы, что позволяет рассматривать его как

перспективный инструмент для использования в генной инженерии. SeAgo также был исследован in vivo в гетерологичной системе экспрессии E. coli и в клетках естественного хозяина S. elongatus. Такое параллельное исследование сразу в двух системах позволяет более полно оценить функциональную значимость белка в живых клетках. На данный момент существует всего один белок-аргонавт (кроме SeAgo), который можно изучать в клетках естественного хозяина, но это термофильный организм, тогда как S. elongatus является более удобным объектом для лабораторной работы из-за возможности культивирования в диапазоне температур 20-34°С и разработанных методов генной инженерии. В системе S. elongatus возможно изучение естественных функций белков-аргонавтов, что ранее было затруднительно.

Методология и методы исследования

Рабoта вышлнена с применением современных молекулярно-биологических методов, а также сoвременнoго обoрудования. Методами молекулярного клонирования получены экспрессионные вектора, содержащие гены белков-аргонавтов дикого типа, с заменами в активном центре, а также кодон-оптимизированного варианта для экспрессии в E. coli, гены белков ssb. Путем трансформации бактериальных клеток получены штаммы-сверхпродуценты рекомбинантных белков, подобраны условия экспрессии и очистки белков методами аффинной, ионообменной хроматогрфии и гель-фильтрции. Разработаны системы для проверки нуклеазной активности и параметров функционирования SeAgo, изучены его биохимические свойства в тестах in vitro. Исследовано влияние мутаций в гене аргонавта на рост культуры S. elongatus, получены и проанализированы библиотеки коротких ДНК, ассоциированных с аргонавтом в клетках E. coli и S.

elongatus. С использованием метода тандемной белковой масс-спектрометрии проведен анализ белков-партнеров аргонавта в клетках S. elongatus. Оценен уровень экспрессии мРНК гена ago на разных стадиях роста культуры S. elongatus методом ПЦР в реальном времени. Проанализировано влияние SeAgo на восприимчивость клеток E. coli к ципрофлоксацину путем оценки количества КОЕ в мл культуры, анализа кривых роста бактерий и микроскопии.

Положения, выносимые на защиту

1. Белок SeAgo из мезофильной цианобактерии S. elongatus - программируемая ДНК нуклеаза, которая способна к гид-зависимому расщеплению одноцепочечных ДНК-мишеней и неспецифическому расщеплению двуцепочечных мишеней.

2. Мутации в гене ago не оказывают существенного влияния на рост клеток S. elongatus; в процессе роста аргонавт присутствует в клетках в стабильно небольшом количестве.

3. При экспрессии в клетках S. elongatus SeAgo ассоциирован с короткими ДНК, происходящими из всего генома, а также совыделяется с SSB-белками.

4. При экспрессии в клетках E. coli SeAgo ассоциирован с короткими ДНК, преимущественно происходящими из областей терминации репликации, генерация которых зависит от каталитической активности аргонавта.

5. SeAgo снижает чувствительность клеток E. coli к ингибитору гиразы ципрофлоксацину, вероятно, за счет участия в разделении хромосом при репликации.

Степень достоверности и апробация результатов

По результатам данной работы было опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных журналах. Основные результаты были представлены также на 7 научных конференциях.

Публикации в журналах:

1. Олина А. В., Кульбачинский А. В., Аравин А. А., & Есюнина Д. М. (2018). Белки-аргонавты и механизмы РНК-интерференции у эукариот и прокариот. Биохимия, 83(5),

2. Olina A., Kuzmenko, A., Ninova M., Aravin A. A., Kulbachinskiy A., Esyunina D. (2020). Genome-wide DNA sampling by Ago nuclease from the cyanobacterium Synechococcus elongatus. RNA biology, 17(5),

Тезисы конференций:

1. Olina A., Kulbachinskiy A., Esyunina D. «Investigation of the argonaute protein from Synechococcus elongatus» // FEBS Open Bio. - 2018. - V. 8. - №. S1. - С. Art. No. P

2. А. В. Кузьменко, Д. А. Юдин, Е. В. Кропочева, А. В. Олина, А. А. Котов, С.С. Рязанский, Д. М. Есюнина, А. А. Аравин, А. В. Кульбачинский «Бактериальные белки-Аргонавты как потенциальный инструмент для редактирования геномов» // Гены и клетки. - 2018. - №2 Материалы Международного конгресса CRISPR-2018, с

3. Anton Kuzmenko, DenisYudin, Anna Olina, Ekaterina Kropocheva, Lidiya Lisitskaya, Anastasia Oguienko, Daria Esyunina, Sergei Ryazansky, Andrey Kulbachinskiy, Alexei Aravin «Programmable DNA and RNA processing by

prokaryotic Argonaute proteins» // 84th Symposium: RNA control and regulation, May 29 - June 3, 2019, Cold Spring Harbor, NY, USA.

4. A. Olina, A. Kudinova, M. Petrova, A. Aravin, A. Kulbachinskiy, D. Esyunina, «Catalytically active Argonaute nuclease from Synechococcus elongatus» // The 44-rd FEBS Congress, July 6-11, 2019, Krakow, Poland.

5. Anna Olina, Andrey Kulbachinskiy, Daria Esyunina «A new argonaute protein from the mesophilic cyanobacterium Synechococcus elongatus» // The new microbiology young scientists school, 04 - 12 September 2019, Spetses Island, Greece.

6. Олина А.В., Нинова М., Аравин А.А., Кульбачинский А.В., Есюнина Д.М. «Новый белок-аргонавт из мезофильной цианобактерии Synechococcus elongatus» // II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, Дагомыс, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Том 2. - С

7. Кузьменко А.В., Юдин Д.А., Кропочева Е.В., Лисицкая Л.А., Олина А.В., Огиенко А.Д., Кудинова А.Г., Петрова М.А., Рязанский С.С., Есюнина Д.М., Аравин А.А., Кульбачинский А.В. «ДНК-интерференция и белки-аргонавты в клетках бактерий» // II объединенный научный форум: VI съезд физиологов СНГ, VI съезд биохимиков России, IX российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, Дагомыс, 1-6 октября 2019). Научные труды. Acta Naturae. Спецвыпуск. Том 2. - С

Личное участие автора в проведении исследований

Все ключевые эксперименты (создание генно-инженерных конструкций,

получение штаммов-продуцентов E.coli, экспрессия и выделение белка-аргонавта, подбор условий очистки и хроматографическая очистка белка, анализ нуклеазной активности, подготовка проб для белковой масс-спектрометрии, подготовка библиотек коротких ДНК для высокопроизводительного секвенирования, оценка параметров роста штаммов S. elongatus, выделение РНК, ПЦР в реальном времени, оценка активности люциферазы, анализ устойчивости E. coli к ципрофлоксацину, флуоресцентная микроскопия) были выполнены лично автором. Кроме того, автор внес вклад в подготовку и редактирование научных публикаций по теме диссертации. Биоинформатический анализ данных высокопроизводительного секвенирования библиотек коротких ДНК был выполнен совместно с сотрудниками Лаборатории биологии РНК и эпигенетики НИЦ «Курчатовский институт» ИМГ Кузьменко А.В. и Агаповым А. А. Штаммы S. elongatus с мутациями в гене белка-Аргонавта получены Есюниной Д. М.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование клеточных функций и механизма работы белка-аргонавта из цианобактерии Synechococcus elongatus.»

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов»), заключения и выводов. Работа изложена на 151 странице, содержит 25 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 166 источников.

2. Обзор литературы 2.1. Открытие РНК-интерференции

В 1990-х было описано явление РНК-интерференции - процесса сайленсинга генов в случае присутствия в клетке короткого РНК-дуплекса, одна из цепей которого комплементарна мРНК исследуемого гена. Ранее предполагалось, что короткие некодирующие РНК могут регулировать экспрессию генов в клетках эукариот (Lee et al, 1993; Wightman et al, 1993). В 1998 Andrew Fire и Craig Mello показали, что у C. elegans дцРНК запускают механизм посттранскрипционного сиквенс-специфичного сайленсинга генов (Fire et al, 1998). Эта работа Fire, Mello и коллег положила начало полноценному изучению процессов РНК-интерференции, и в 2006 г. они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие процесса РНК-интерференции. Через несколько лет после открытия РНК-интерференции у C. elegans было показано участие коротких некодирующих РНК и других компонентов РНК-интерференции в сайленсинге центромерных областей во время деления дрожжей Schizosaccharomycespombe (Bhattacharjee et al, 2019). В ходе дальнейших исследований было выяснено, что РНК-интерференция - высоко консервативный процесс для подавляющего большинства эукариот и связана с другими путями сайленсинга РНК, ранее описанными для грибов и растений, такими как процессинг транскрипта, косупрессия и посттранскрипционный сайленсинг генов. Более того, РНК-интерференция является частью эпигенетической регуляции геномов эукариот и может действовать как противовирусный механизм у растений, насекомых и млекопитающих (Adiliaghdam et al, 2020).

В ходе изучения РНК-интерференции у разных организмов было выяснено, что основной функциональной единицей РНК-интерференции в клетках эукариот

является RISC - RNA-induced silencing complex, который состоит из короткой некодирующей РНК, называемой гидом, и белка-аргонавта (Wei et al, 2012a; Hammond et al, 2000; Elbashir et al, 2001). Короткие некодирующие РНК обычно имеют длину 19-22 нт и могут иметь экзогенное или эндогенное происхождение. Комплекс белка-аргонавта с гидом специфически распознает РНК-мишень, комплементарную короткой гидовой молекуле РНК в его составе (Jinek & Doudna, 2008). После успешного распознавания мишени она может быть либо разрезана аргонавтом, либо к месту связывания аргонавта с мишенью могут быть привлечены белки-партнеры для модификации или деградации мишени (Meister, 2013). Ключевые компоненты процессов РНК-интерференции были хорошо изучены за последние несколько десятилетий. Так, было показано, что в качестве гидовых молекул могут быть использованы разные типы коротких некодирующих РНК; была изучена структура белков-аргонавтов, их разнообразие в клетках эукариот, механизмы генерации гидовых РНК и их загрузки в аргонавт, а также механизмы регуляции экспрессии генов с участием RISC (Олина и соавт., 2018).

2.2. Белки-аргонавты эукариот

Среди эукариот белок семейства аргонавтов был впервые описан в ходе изучения мутанта AGO1 Arabidopsis thaliana - этот мутант внешне напоминал моллюска аргонавта, что и дало имя всему семейству впоследствии. Аргонавты широко распространены среди эукариот (Bohmert et al, 1998).

Структура эукариотических белков-аргонавтов очень консервативна. Аргонавт состоит из четырех доменов, организованных в две крупные доли с каналом между ними. В состав первой доли входят домены N-концевой и PAZ

(PIWI-Argonaute-ZWILLE), вторая доля включает в себя домены MID (Middle) и PIWI. В канале между долями происходит связывание гидовой нуклеиновой кислоты и мишени (Tolia & Joshua-Tor, 2006; Swarts et al, 2014). Домен PAZ состоит из примерно 140 аминокислотных остатков и необходим для связывания одноцепочечных нуклеиновых кислот, в составе аргонавта он отвечает за координацию З'-конца гида (Lingel et al, 2003; Song et al, 2003; Yan et al, 2003). За связывание 5'-конца гида отвечает домен MID, который имеет характерную структуру - укладку Россмана со специальным нуклеотид связывающим карманом. Аминокислотные остатки, формирующие карман MID-домена, могут отличаться у разных аргонавтов, что приводит к предпочтительному связыванию гидовых нуклеиновых кислот с определенным 5'-концевым нуклеотидом (Parker et al, 2005; Ma et al, 2005; Boland et al, 2010; Frank et al, 2010). N-концевой домен является самым неконсервативным доменом в составе белков-аргонавтов, его функция до конца не определена, но показано его участие в расплетании дуплекса РНК при загрузке аргонавта гидом (Kwak & Tomari, 2012). PIWI домен имеет структуру, подобную РНКазе Н, с консервативной тетрадой аминокислот DEDX (X=H/D/K/N), которая координирует два иона магния и отвечает за нуклеазную активность аргонавта (Song et al, 2004; Parker et al, 2004; Parker, 2010). Далеко не все эукариотические аргонавты обладают полноценной каталитической тетрадой и проявляют нуклеазную активность. Например, в геноме человека закодировано четыре аргонавта, из которых только AGO2 каталитически активен и функционирует как эндонуклеаза (Liu et al, 2004; Meister et al, 2004) (Рис. 2.1).

Рисунок 2.1. Доменная структура белков-аргонавтов эукариот и принципиальная схема их работы: А -Схема расположения доменов в белке-аргонавте (Makarova et al, 2009). Б - структура белка-аргонавта человека hAgo2 (PDB: 4W5O). Цвета доменов соответствуют на рисунке А и Б. Фиолетовым цветом указан ион магния в активном центре (Schirle et al, 2015). В - структура каталитически активного аргонавта, который содержит каталитическую тетраду и два иона магния (показаны сиреневыми сферами) в домене PIWI, в комплексе с гидовой нуклеиновой кислотой (слева) и при связывании с мишенью (справа) (Олина и соавт, 2018).

Эукариотические аргонавты на основе гомологии последовательностей их генов можно разделить на три подкласса: AGO-like, PIWI-like и WAGO (Рис. 2.2). AGO-like аргонавты похожи по структуре на белок AGO1 Arabidopsis thaliana, они связывают в качестве гидов микроРНК (miPHK) или короткие интерферирующие РНК (siPHK), нуждаются в помощи специальных ферментов Dicer или Drosha для загрузки, работают в цитозоле. Аргонавты этого подкласса отвечают за РНК-интерференцию и другие способы посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Белки подкласса PIWI обладают высокой степенью гомологии с белком Piwi Drosophila melanogaster. Ген piwi (P-element induced wimpy testis) был впервые охарактеризован Lin и Spradling как необходимый для нормального развития клеток половой линии Drosophila melanogaster (Lin & Spradling, 1997). Затем было установлено, что продукт этого гена - белок Piwi - подавляет активность

транспозонов в клетках половой линии дрозофилы. Подобные белки были обнаружены и в других организмах, для них характерна ядерная локализация, они связывают piPHK (PIWI interacting РНК) и регулируют активность мобильных генетических элементов. WAGO - специфические аргонавты нематод, нуждающиеся в помощи других белков-аргонавтов для загрузки (Carmell et al, 2002; Hutvagner & Simard, 2008; Meister, 2013; Swarts et al, 2014) (Рис. 2.2).

Рисунок 2.2. Филогенетическое дерево белков-аргонавтов D. melanogaster (Dm), Homo sapiens (Hs) и C. elegans (Ce). Указаны типы гидовых РНК, с которыми предпочтительно связываются перечисленные белки (Montgomery et al, 2012).

Филогенетический анализ белков-аргонавтов эукариот (eAgos) показал, что общий предок эукариот с большой вероятностью имел аргонавты типа AGO-like и аргонавты типа PIWI-like. В ходе эволюции растения сохранили только AGO-like аргонавты, филум Amoebozoa только представителей группы PIWI-like, животные имеют оба варианта аргонавтов. Для аргонавтов характерна высокая степень дупликации генов в процессе эволюции (обзор Hutvagner & Simard, 2008). На примере растений можно отследить увеличение числа аргонавтов в ходе филогенеза.

Зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii содержит три аргонавта (Schroda, 2006), мох Physcomitrellapatens имеет шесть аргонавтов (Axtell et al, 2007; Arif et al, 2013). Количество аргонавтов подкласса AGO сильно возрастает у цветковых растений: 10 у Arabidopsis thaliana (Carmell et al, 2002), 15 у тополя (Populus trichocarpa) (ZHAO et al, 2015), 17 у кукурузы (Zea mays) (Qian et al, 2011; Zhai et al, 2019) и 19 у риса (Oryza sativa) (Kapoor et al, 2008). Среди животных также существуют примеры множественных дупликаций генов аргонавтов: геном человека содержит 4 AGO-like и 4 PIWI-like аргонавта, дрозофилы 2 AGO-like и 3 PIWI-like (обзорHutvagner & Simard, 2008). Существуют и противоположные примеры: дрожжи S. pombe имеют всего один белок-аргонавт, принадлежащий к группе AGO-like и участвующий сразу в нескольких путях регуляции экспрессии генов, Saccharomyces cerevisiae и паразитические организмы Trypanosoma cruzi и Leishmania major независимо утратили все белки-аргонавты и остальную машинерию РНК-интерференции (Drinnenberg et al, 2009; Ullu et al, 2004).

2.3. Короткие некодирующие РНК

В процессах РНК-интерференции участвуют несколько классов коротких некодирующих РНК: микроРНК (miPHK), короткие интерферирующие РНК (siPHK) и РНК, ассоциированные с белком PIWI ^РНК), короткие РНК-производные транспортных РНК (tRFs) и рибосомальных РНК (rRFs). Эти классы некодирующих РНК различаются по биогенезу и механизмам работы.

2.3.1. МикроРНК (miPHK)

МикроРНК формируются в ядре из двуцепочечных предшественников. Источником предшественников служит собственный геном организма (Ambros,

2003; Bartel, 2004; Cullen, 2004). РНК-полимераза II синтезирует primary RNA (pri-miPHK) длиной около 1000 нуклеотидов, которая содержит одну или несколько шпилек с небольшими концевыми петлями (около 10 нт) (Saini et al, 2007). С таким транскриптом связывается белковый комплекс микропроцессор, включающий белок семейства РНКаз III (у человека Drosha) и белок, связывающий двуцепочечную РНК (DGCR8 или Pasha у человека) (Lee et al, 2002; Han et al, 2004; Denli et al, 2004). Микропроцессор связывается в основании шпильки в pri-miPHK и вносит разрывы в РНК на расстоянии 11 нт от основания шпильки (Lee et al, 2006), образуется более короткий продукт - pre-miPHK, который связывается с белками экспортином 5 и Ran-GTP и выходит в цитозоль из ядра (Lund & Dahlberg, 2006). В цитозоле с pre-miPHK связывается эндонуклеаза Dicer, которая содержит домен PAZ и два домена РНКазы III. 3'-конец pre-miPHK фиксируется в PAZ домене, затем РНК укладывается на поверхности фермента вдоль РНКаза III подобных доменов, каждый из которых вносит разрыв в одну из цепей дуплекса pre-miPHK (Zhang et al, 2004). Длина получившегося продукта зависит от расстояния между PAZ доменом и активными центрами РНКаза III подобных доменов и может отличаться у разных организмов (MacRae et al, 2006). В результате разрезания pre-miPHK образуются двуцепочечные РНК длиной 21-25 нт, на каждом 3'-конце остаются по 2 неспаренных нуклеотида, а на каждом 5'-конце - фосфат (Schwarz et al, 2003). Далее такая двуцепочечная РНК загружается в белок-аргонавт. Загрузка может происходить при контакте аргонавта непосредственно с Dicer, либо при участии дцРНК-связывающих белков (dsRBPs, например, TRBP у человека) (Eamens et al, 2009). Распределение коротких РНК дуплексов между аргонавтами происходит неслучайно, вероятно, на этом этапе происходит регуляция работы аргонавтов.

Загрузка определённого аргонавта конкретной нуклеиновой кислотой зависит от структуры дуплекса дцРНК, 5'-концевого нуклеотида и комплементарности цепей в дуплексе (Tomari et al, 2007; Czech et al, 2009). В результате загрузки короткой дцРНК в аргонавт образуется комплекс preRISC, после этого дуплекс раскручивается, одна из цепей (пассажирская) удаляется, а вторая (гидовая) остается связанной с аргонавтом - формируется зрелый RISC (Kawamata & Tomari, 2010) (Рис. 2.3).

miRISC siRISC

Рисунок 2.3. Биогенез miPHK (слева) и siPHK (справа) (Олина и соавт, 2018)

2.3.2. Короткие интерферирующие РНК (siPHK)

siPHK могут происходить из экзогенных (exosiPHK) или эндогенных (endosiPHK) источников (Carthew & Sontheimer, 2009). Экзогенные предшественники siPHK - вирусные или химически синтезированные нуклеиновые кислоты - попадают в клетки из внешней среды. В классической работе Andrew Fire и Craig Mello использовали химически синтезированные двуцепочечные предшественники exosiPHK для инъекции в C. elegans. В результате такой инъекции они наблюдали снижение экспрессии гена, мРНК которого была комплементарна одной из цепей инъецированного дуплекса (Fire et al, 1998). Далее подобные эксперименты были успешно проведены на модели клеток млекопитающих (Elbashir et al, 2001), что привело к значительному интересу к siPHK со стороны медицины. На основе exosiPHK разработаны препараты, направленные на борьбу с вирусными инфекциями и некоторыми заболеваниями человека, например, макулодистрофией и несколькими видами рака (Kaiser et al, 2010; Tabernero et al, 2013). Предшественники endosiPHK - продукты транскрипции транспозонов или повторов, находящихся в геноме, они попадают в цитозоль из ядра в сопровождении экспортина 5 (Ipsaro & Joshua-Tor, 2015). Процессинг предшественников siPHK в цитозоле совпадает с таковым для miPHK, но предшественники siPHK отличаются от предшественников miPHK идеальной комплементарностью цепей в дуплексе предшественника (для miRNA характерно наличие мисматчей в предшественнике) (Wilson & Doudna, 2013). Hекоторые организмы содержат несколько белков Dicer, в таком случае может происходить функциональная специализация Dicer на процессинге только miPHK или только siPHK (как, например, у Drosophila melanogaster) (Tomari & Zamore, 2005) ^ис. 2.3).

2.3.3. р1РНК (РНК, ассоциированные с белком PIWI)

piPHK - короткие РНК, ассоциированные с аргонавтами из подкласса PIWI-like. Впервые piPHK были обнаружены в клетках герминальной линии Drosophila melanogaster, затем они были найдены и в соматических клетках (Aravin et al, 2006). Эта группа коротких некодирующих РНК отличается от упомянутых ранее по длине (26-32 нуклеотида) и имеет иные пути биогенеза. Производство piPHK не зависит от Dicer, длинные одноцепочечные РНК-предшественники синтезируются в ядре в ходе транскрипции с piPHK кластера - специального геномного локуса, кодирующего фрагменты, соответствующие транспозонам (Brennecke et al, 2007; Muerdter et al, 2012). Далее такие транскрипты переносятся в перинуклеарные области цитоплазмы (Zhang et al, 2012), где подвергаются разрезанию эндонуклеазой Zucchini (она способна связывать только одноцепочечную РНК в отличие от Dicer) (Ipsaro et al, 2012; Nishimasu et al, 2012). Продукты Zuc загружаются в белки Piwi. Основной процесс, в котором участвуют piPHK - подавление активности ретротраспозонов и других мобильных генетических элементов в герминальных клетках. При активации ретротранспозонов происходит их транскрипция, затем обратная транскрипция, после чего новосинтезированная ДНК интегрируется в геном в случайном месте, что приводит к мутагенезу. Особенно опасна активация транспозонов в клетках герминальной линии. Если в piPHK кластере присутствует участок, соответствующий активному транспозону, то транскрипт этого транспозона будет специфически связываться с Piwi белком, загруженным piPHK, и разрезаться. ^оме описанного выше первичного биогенеза может происходить вторичный биогенез piPHK - пинг-понг цикл. В ходе этого процесса фрагменты разрезания транскрипта активного транспозона могут быть загружены в Piwi белки

и использованы для разрезания транскриптов piРНК кластеров. Такой процесс приводит к появлению piРНК, комплементарных и смысловой, и антисмыловой РНК транспозонов, и происходит дополнительная амплификация piРНК (Aravm а1, 2008; Siomi а а1, 2011) (Рис. 2.4).

р1РНК-кластер

I

5

í

Активный транспозон

I

3'-

■5'

Транскрипты - предшественники р1РНК 5'-3'

3'-

■5'

I

Смысловой транскрипттранспозона

Ядро

К

Экспорт из ядра

Экспорт из ядра

т

Цитоплазма

5'-

■3'

3'-

РШ/

I

■5'

3'-

и

АиЬ

и.

3' -концевое укорочение р1РНК/^

Разрезание рт/

ц АиЬ

У--Неп1

/

Р1\Л/1/

ДмЬ

\

Р1\Л/1/

Пинг-понг-цикл АиЬ_

-А — -А-

-А —

5'

С" А-

Загрузка в Р1\Л/1/АиЬ р|РНК с и на 5' -конце

Р1\Л/1/ АиЬ

/

3'

Рисунок 2.4. Биогенез piРНК (Олина и соавт, 2018)

2.3.4. tRFs ^РНК) - короткие некодирующие РНК-производные тРНК

Транспортные РНК (тРНК) - важная группа некодирующих РНК, необходимая для синтеза белка. В последнее время с развитием технологий глубокого секвенирования РНК было обнаружено, что тРНК способны расщепляться на фрагменты разной длины. Первоначальное предположение о том,

что эти фрагменты являются всего лишь случайными продуктами деградации тРНК, было опровергнуто в ряде исследований. На данный момент показано участие производных тРНК в делении клеток, развитии рака, подавлении активности транспозонов, биогенезе рибосом, созревании сперматозоидов и формировании эпигенетической наследственности (Goodarzi et al, 2015; Honda et al, 2015; Balatti et al, 2017; Sharma et al, 2016; Kim et al, 2017; Martinez et al, 2017; Schorn et al, 2017).

тРНК обычно имеет характерную структуру «клеверного листа». Различные нуклеазы могут разрезать её в определенных сайтах, производя фрагменты разных размеров (Kumar et al, 2016). Фрагменты, которые образуются в результате разрезания зрелой тРНК, можно разделить на две категории. Первая категория -продукты разрезания в области антикодоновой петли - они представляют собой «половинки» тРНК длиной около 35 нт. У дрожжей за производство таких фрагментов отвечает нуклеаза Rnyl, у млекопитающих ANG (Thompson & Parker, 2009; Ivanov et al, 2011). 35-нуклеотидные фрагменты тРНК также называются tRNA-derived stress-induced RNAs (ЙРНК), так как к их появлению в клетке приводят разнообразные стрессовые факторы, например, тепловой шок, оксидативный стресс и УФ-излучение (Yamasaki et al, 2009; Ivanov et al, 2011; Wang et al, 2013). Вторая категория - фрагменты, образующиеся в результате разрезания в области D-петли и T-петли - это РНК длиной 15-32 нт (Kumar et al, 2014, 2015). В биогенез этой группы производных тРНК, согласно некоторым исследованиям, вовлечен Dicer (Babiarz et al, 2008; Cole et al, 2009), однако существуют исследования, опровергающие участие Dicer в этом процессе (Li et al, 2012; Kumar et al, 2015, 2014). Возможно, короткие производные тРНК имеют множественные пути биогенеза. Интересно, что tRFs преимущественно производятся из конкретных тРНК. Так, у дрозофилы это тРНК°1у,

тРНК*^, тРНК^, и тРНКАяр, а также уровень их в клетке меняется в процессе онтогенеза а а1, 2018).

Механизмы действия tRFs в клетках пока не ясны окончательно. Существуют примеры работы таких коротких РНК, не требующие их связи с белком-аргонавтом (Sobala & Hutvagner, 2013). Однако не меньше примеров их функционирования в комплексе с аргонавтом. Например, в клетках дрозофилы tRFs в комплексе с AGO2 ингибируют синтез рибосомальных белков и факторов инициации трансляции, связываясь с мРНК и блокируя трансляцию (без разрезания мишени) а1,

2018). Примеры участия tRFs в регуляции экспрессии генов в клетках других организмов кратко описаны в обзоре (Dou а а1, 2019) (Рис. 2.5).

Рисунок 2.5. Схема биогенеза tRFs из зрелой тРНК. Разрезание в области D-петли и T-петли ведет к образованию 3'-концевого фрагмента и 5'-концевого фрагмента. В этом процессе могут быть задействованы Dicer и рибонуклеаза Angiogenin. Более длинные фрагменты тРНК (35 нт) образуются в результате работы нуклеазы Rnyl или нуклеазы Angiogenin в дрожжах и млекопитающих соответственно (Dou et al, 2019).

2.3.5. rRFs (короткие РНК-производные рРНК)

Недавно при анализе транскриптомов было показано наличие в клетках эукариот специфических коротких РНК - производных рРНК (Chen et al, 2017). Наличие в клетках таких фрагментов было показано для многих организмов, включая человека (Lambert et al, 2019). rRFs в основном являются продуктами эндо-и экзонуклеазного расщепления 28 S рРНК, причем большая часть производится из концевых участков рРНК и имеет длину 15-40 нт (Chen et al, 2017), но некоторая часть появляется и в результате расщепления остальных рибосомальных РНК. Биогенез этих коротких РНК может происходить Dicer-зависимо, в результате чего появляются РНК длиной 20-21 нт, кроме того, их биогенез может идти по пути, напоминающем биогенез piРНК, без участия Dicer (образуются более длинные фрагменты). Показано участие коротких РНК-производных рРНК в комплексе с аргонавтом в регуляции экспрессии генов по пути, похожем на работу miРНК, за счет связывания с мРНК (Chen et al, 2013; Chak et al, 2015). Второй возможный вариант работы таких коротких РНК - участие в регуляции активности транспозонов (Garcia-Lopez et al, 2015).

2.4. Структура гидовой нуклеиновой кислоты

BSJ u F ? u

гидовой молекуле можно выделить несколько частей: 5 -концевой нуклеотид, «seed» район (2-8 нт считая от 5'-конца), сайт, комплементарный месту разрезания в мишени (10-11 нт), 3'-дополнительный район и 3'-концевой район (Willkomm et al, 2017; Salomon et al, 2015) (Рис. 2.6.). 5'-концевой нуклеотид связывается с карманом MID домена, фиксируя гид в белке. Некоторые аргонавты имеют предпочтение к гидам с определенным остатком на 5'-конце гида, например, hAgo2

и SIWI предпочитают гиды с U в этом положении (Elkayam et al, 2012; Frank et al, 2010; Matsumoto et al, 2016). Из-за участия первого нуклеотида гида во взаимодействии с аминокислотами MID домена, он не участвует в образовании дуплекса с мишенью (Frank et al, 2010). Нуклеотид мишени, оставшийся неспаренным, может распознаваться в специальном кармане домена PIWI, например, в случае hAgo2 так распознается A в положении 1' мишени - напротив 1 нуклеотида гида считая с 5'-конца (Schirle et al, 2015). «Seed» район гида является критическим для распознавания мишени эукариотическими аргонавтами, формирование дуплекса гид-мишень в этой области приводит к конформационным изменениям в аргонавте и делает возможным разрезание мишени. eAgos очень чувствительны к мисматчам в этом районе (Parker et al, 2009). Сайт разрезания мишени для большинства эукариотических аргонавтов находится между позициями 10 и 11 гида, но в некоторых случаях может сдвигаться (Tomari & Zamore, 2005). 3'-дополнительный район также играет роль в распознавании мишени у eAgos. 3'-конец гида связан в кармане домена PAZ и высвобождается при взаимодействии с мишенью. При этом 3'-концевая часть гида остается подвижной, что может быть важно для формирования дуплекса (Salomon et al, 2015).

Рисунок 2.6. Схема строения гидовой молекулы. Сайт разрезания показан с учетом сдвигов, которые могут происходить при смене условий.

2.5. Механизмы работы RISC в клетках эукариот

В зависимости от типа гидовой РНК и белка-аргонавта, RISC может иметь разные функции и механизмы работы. Работая в цитозоле, белки-аргонавты осуществляют посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов - связываются с мРНК, разрезают её или вызывают ингибирование трансляции. Второй вариант регуляции экспрессии генов - транскрипционный, осуществляется за счет работы аргонавтов в ядре с первичными транскриптами и привлечения к конкретному месту генома ферментов ремоделинга хроматина (Law & Jacobsen, 2010; Rogers & Chen, 2013). Кроме этих двух основных вариантов, есть данные об участии некоторых аргонавтов в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК и альтернативном сплайсинге (Ba & Qi, 2013; Wei et al, 2012b).

Рисунок 2.7. Механизмы посттранскрипционного сайленсинга генов с участием белков-аргонавтов. Сайленсинг может происходить за счет подавления инициации (1) или элонгации (2) трансляции, деаденилирования мРНК (3) или ее разрезания (4) (Олина и соавт, 2018).

Посттранкрипционная регуляция с использованием siPHK чаще происходит через разрезание мРНК, тогда как miRISC связывается в З'-нетранслируемой области мРНК и ингибирует трансляцию без внесения разрывов в мишень (Hendrickson et al, 2009; Guo et al, 2010; Arribas-Layton et al, 2013). Вероятно, выбор одного из вариантов регуляции происходит на основе структуры дуплекса гид-мишень (Zhu et al, 2011). Так, например, гидовые miPHK часто не полностью комплементарны мишени, miRISC связывается с мишенью, но не разрезает её. Если же происходит полное взаимодействие гида и мишени, это ведет к разрезанию мРНК (Hutvagner & Zamore, 2002). siPHK обычно полностью комплементарны мишени.

Механизм репрессии трансляции без внесения разрывов в мРНК пока до конца не ясен - происходит ли репрессия на стадии инициации или элонгации? Инициация трансляции - более вероятное место регуляции, показано, что miRISC способен связывать фактор элонгации 4F, что препятствует формированию инициаторного комплекса трансляции (Fukao et al, 2014). Кроме того, miRISC может привлекать к месту своего связывания белок GW182, который в свою очередь привлекает белок PABP (поли-А связывающий белок), что приводит к дестабилизации мРНК, повышается её восприимчивость к деаденилированию (Bazzini et al, 2012; Bethune et al, 2012; Djuranovic et al, 2012) (Рис. 2.7).

Транскрипционная регуляция экспрессии генов при участии белков-аргонавтов была впервые описана для дрожжей Schizosaccharomyces pombe: комплекс AGO1 и siPHK связывается с новосинтезированным транскриптов РНК-полимеразы II, после чего к такому комплексу привлекается метилтрансфераза гистонов Clr4 и вносит метку H3K9me3, приводящую к образованию гетерохроматина в данном участке. Эта метка, будучи внесенной на фоне отсутствия

H3K4me3 и H3K27ac, приводит к репрессии транскрипции. Такой комплекс аргонавта и короткой гидовой РНК назвали RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing). RITS играет важную роль в формировании гетерохроматина и регуляции активности мобильных генетических элементов (Verdel et al, 2004; Jih et al, 2017; Lan et al, 2007).

Аналогичный механизм транскрипционного сайленсинга генов в ядре существует и у других эукариот. PIWI белки в комплексе с piPHK способны взаимодействовать с первичными транскриптами в ядрах клеток Drosophila melanogaster и привлекать ферменты метилирования гистонов. В клетках млекопитающих к местам связывания белков-аргонавтов могут быть рекрутированы также ферменты метилирования ДНК (Sienski et al, 2012; Thomas et al, 2013; Ariel Chen & Aravin, 2015).

У растений существует специфический путь РНК-интерференции - РНК-зависимое метилирование ДНК, в основе которого лежит работа РНК-полимеразы IV (Fang & Qi, 2016). К первичным транскриптам привлекается РНК-зависимая РНК-полимераза 2, которая синтезирует комплементарную цепь РНК на матрице транскрипта (He et al, 2009; Haag et al, 2012). Образовавшиеся короткие 30-40 нт дуплексы РНК разрезаются Dicer-подобными нуклеазами, затем 24 нт двуцепочечные продукты переносятся в цитоплазму, где связываются с AGO4, зрелый siRISC возвращается в ядро, где связывает транскрипты РНК-полимеразы V и привлекает ДНК-метилтрансферазы к месту связывания (Mosher et al, 2008; Wierzbicki et al, 2008; Pontier et al, 2005). В результате паттерн метилирования ДНК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Олина Анна Викторовна, 2022 год

9. Список литературы

1. Adiliaghdam F, Basavappa M, Saunders TL, Harjanto D, Prior JT, Cronkite DA, Papavasiliou N & Jeffrey KL (2020) A Requirement for Argonaute 4 in Mammalian Antiviral Defense. Cell Reports 30: 1690-1701.e4

2. Ambros V (2003) MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing. Cell 113: 673-676

3. Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, Lagos-Quintana M, Landgraf P, Iovino N, Morris P, Brownstein MJ, Kuramochi-Miyagawa S, Nakano T, et al (2006) A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature 2006 442:7099 442: 203-207

4. Aravin AA, Sachidanandam R, Bourc'his D, Schaefer C, Pezic D, Toth KF, Bestor T & Hannon GJ (2008) A piRNA Pathway Primed by Individual Transposons Is Linked to De Novo DNA Methylation in Mice. Molecular Cell 31: 785-799

5. Ariel Chen Y-C & Aravin AA (2015) Non-coding RNAs in Transcriptional Regulation. Current molecular biology reports 1: 10-18

6. Arif MA, Frank W & Khraiwesh B (2013) Role of RNA Interference (RNAi) in the Moss Physcomitrella patens. International Journal of Molecular Sciences 2013, Vol 14, Pages 1516-1540 14: 1516-1540

7. Arribas-Layton M, Wu D, Lykke-Andersen J & Song H (2013) Structural and functional control of the eukaryotic mRNA decapping machinery. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms 1829: 580-589

8. Axtell M, Snyder J & Bartel DP (2007) Common functions for diverse small RNAs of land plants. The Plant cell 19: 1750-1769

9. Ba Z & Qi Y (2013) Small RNAs: Emerging key players in DNA double-strand break repair. Science China Life Sciences 2013 56:10 56: 933-936

10. Babiarz JE, Ruby JG, Wang Y, Bartel DP & Blelloch R (2008) Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs. Genes & Development 22: 2773-2785

11. Balatti V, Pekarsky Y & Croce CM (2017) Role of the tRNA-Derived Small RNAs in Cancer: New Potential Biomarkers and Target for Therapy. Advances in Cancer Research 135: 173-187

12. Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281-297

13. Bazzini AA, Lee MT & Giraldez AJ (2012) Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in Zebrafish. Science 336: 233-237

14. Bethune J, Artus-Revel CG & Filipowicz W (2012) Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO reports 13: 716-723

15. Bhattacharjee S, Roche B & Martienssen RA (2019) RNA-induced initiation of transcriptional silencing (RITS) complex structure and function. RNA biology 16: 1133-1146

16. Bohmert K, Camus I, Bellini C, Bouchez D, Caboche M & Benning C (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. The EMBO Journal 17: 170-180

17. Boland A, Tritschler F, Heimstädt S, Izaurralde E & Weichenrieder O (2010) Crystal structure and ligand binding of the MID domain of a eukaryotic Argonaute protein. EMBO Reports 11: 522-527

18. Brennecke J, Aravin AA, Stark A, Dus M, Kellis M, Sachidanandam R & Hannon GJ (2007) Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila. Cell 128: 1089-1103

19. Cao X & Jacobsen SE (2002) Role of the Arabidopsis DRM Methyltransferases in De Novo DNA Methylation and Gene Silencing. Current Biology 12: 1138-1144

20. Cao Y, Sun W, Wang J, Sheng G, Xiang G, Zhang T, Shi W, Li C, Wang Y, Zhao F, et al (2019) Argonaute proteins from human gastrointestinal bacteria catalyze DNA-guided cleavage of single- and double-stranded DNA at 37 °C. Cell Discovery 5: 1-4

21. Carmell M, Xuan Z, Zhang MQ & Hannon GJ (2002) The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes & development 16: 2733-2742

22. Carthew RW & Sontheimer EJ (2009) Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136: 642-655

23. Chak L-L, Mohammed J, Lai EC, Tucker-Kellogg G & Okamura K (2015) A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA 21: 375384

24. Chen AH, Afonso B, Silver PA & Savage DF (2012) Spatial and Temporal Organization of Chromosome Duplication and Segregation in the Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. PLOS ONE 7: e47837

25. Chen H, Kobayashi K, Miyao A, Hirochika H, Yamaoka N & Nishiguchi M (2013) Both OsRecQl and OsRDRl Are Required for the Production of Small RNA in Response to DNA-Damage in Rice. PLOS ONE 8: e55252

26. Chen Z, Sun Y, Yang X, Wu Z, Guo K, Niu X, Wang Q, Ruan J, Bu W & Gao S (2017) Two featured series of rRNA-derived RNA fragments (rRFs) constitute a novel class of small RNAs. PLOS ONE 12: e0176458

27. Cole C, Sobala A, Lu C, Thatcher SR, Bowman A, Brown JWS, Green PJ, Barton GJ & Hutvagner G (2009) Filtering of deep sequencing data reveals the existence of abundant Dicer-dependent small RNAs derived from tRNAs. RNA 15: 21472160

28. Cullen BR (2004) Transcription and processing of human microRNA precursors. Molecular cell 16: 861-865

29. Czech B, Zhou R, Erlich Y, Brennecke J, Binari R, Villalta C, Gordon A, Perrimon N & Hannon GJ (2009) Hierarchical Rules for Argonaute Loading in Drosophila. Molecular Cell 36: 445-456

30. Denli A, Tops B, Plasterk RH, Ketting RF & Hannon GJ (2004) Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432: 231-235

31. Djuranovic S, Nahvi A & Green R (2012) miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science 336: 237-240

32. Dou S, Wang Y & Lu J (2019) Metazoan tsRNAs: Biogenesis, Evolution and Regulatory Functions. Non-Coding RNA 2019, Vol 5, Page 18 5: 18

33. Doxzen KW & Doudna JA (2017) DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute. PLOS ONE 12: e0177097

34. Drinnenberg I, Weinberg D, Xie K, Mower JP, Wolfe KH, Fink GR & Bartel DP (2009) RNAi in budding yeast. Science 326: 544-550

35. Eamens A, Smith N, Curtin S, Wang MB & Waterhouse PM (2009) The Arabidopsis thaliana double-stranded RNA binding protein DRB1 directs guide strand selection from microRNA duplexes. Rna 15: 2219-2235

36. Eisenhut M (2019) Manganese Homeostasis in Cyanobacteria. Plants 9: 18

37. Elbashir SM, Lendeckel W & Tuschl T (2001) RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development 15: 188-200

38. Elkayam E, Kuhn CD, Tocilj A, Haase AD, Greene EM, Hannon GJ & Joshua-Tor L (2012) The Structure of Human Argonaute-2 in Complex with miR-20a. Cell 150: 100-110

39. Enghiad B & Zhao H (2017) Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes. ACS Synthetic Biology 6: 752-757

40. Fang X & Qi Y (2016) RNAi in Plants: An Argonaute-Centered View. The Plant Cell 28: 272-285

41. Filius M, Cui TJ, Ananth AN, Docter MW, Hegge JW, Oost J van der & Joo C (2020) High-Speed Super-Resolution Imaging Using Protein-Assisted DNA-PAINT. Nano Letters 20: 2264-2270

42. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE & Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998 391:6669 391: 806-811

43. Frank F, Sonenberg N & Nagar B (2010) Structural basis for 5'-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AGO2. Nature 2010 465:7299 465: 818-822

44. Fu L, Xie C, Jin Z, Tu Z, Han L, Jin M, Xiang Y & Zhang A (2019) The prokaryotic Argonaute proteins enhance homology sequence-directed recombination in bacteria. Nucleic Acids Research 47: 3568-3579

45. Fukao A, Mishima Y, Takizawa N, Oka S, Imataka H, Pelletier J, Sonenberg N, Thoma C & Fujiwara T (2014) MicroRNAs Trigger Dissociation of eIF4AI and eIF4AII from Target mRNAs in Humans. Molecular Cell 56: 79-89

46. García-López J, Alonso L, Cárdenas DB, Artaza-Alvarez H, Hourcade J de D, Martínez S, Brieño-Enríquez MA & Mazo J del (2015) Diversity and functional convergence of small noncoding RNAs in male germ cell differentiation and fertilization. RNA 21: 946-962

47. Goodarzi H, Liu X, Nguyen HCB, Zhang S, Fish L & Tavazoie SF (2015) Endogenous tRNA-Derived Fragments Suppress Breast Cancer Progression via YBX1 Displacement. Cell 161: 790-802

48. Guo H, Ingolia NT, Weissman JS & Bartel DP (2010) Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature 466: 835-840

49. Haag JR, Ream TS, Marasco M, Nicora CD, Norbeck AD, Pasa-Tolic L & Pikaard CS (2012) In Vitro Transcription Activities of Pol IV, Pol V, and RDR2 Reveal Coupling of Pol IV and RDR2 for dsRNA Synthesis in Plant RNA Silencing. Molecular Cell 48: 811-818

50. Hammond SM, Bernstein E, Beach D & Hannon GJ (2000) An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 2000 404:6775 404: 293-296

51. Han J, Lee Y, Yeom KH, Kim YK, Jin H & Kim VN (2004) The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes & development 18: 3016-3027

52. He XJ, Hsu YF, Zhu S, Wierzbicki AT, Pontes O, Pikaard CS, Liu HL, Wang CS, Jin H & Zhu JK (2009) An Effector of RNA-Directed DNA Methylation in Arabidopsis Is an ARGONAUTE 4- and RNA-Binding Protein. Cell 137: 498-508

53. Hendrickson DG, Hogan DJ, McCullough HL, Myers JW, Herschlag D, Ferrell JE & Brown PO (2009) Concordant Regulation of Translation and mRNA Abundance for Hundreds of Targets of a Human microRNA. PLOS Biology 7: e1000238

54. Honda S, Loher P, Shigematsu M, Palazzo JP, Suzuki R, Imoto I, Rigoutsos I & Kirino Y (2015) Sex hormone-dependent tRNA halves enhance cell proliferation in breast and prostate cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences 112: E3816-E3825

55. Hunt EA, Jr. TCE & Tanner NA (2018) Single-stranded binding proteins and helicase enhance the activity of prokaryotic argonautes in vitro. PLOS ONE 13: e0203073

56. Hutvagner G & Simard MJ (2008) Argonaute proteins: key players in RNA silencing. Nature reviews Molecular cell biology 9: 22-32

57. Hutvagner G & Zamore PD (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 297: 2056-2060

58. Ipsaro J & Joshua-Tor L (2015) From guide to target: molecular insights into eukaryotic RNA-interference machinery. Nature structural & molecular biology 22: 20-28

59. Ipsaro JJ, Haase AD, Knott SR, Joshua-Tor L & Hannon GJ (2012) The structural biochemistry of Zucchini implicates it as a nuclease in piRNA biogenesis. Nature 2012 491:7423 491: 279-283

60. Ivanov P, Emara MM, Villen J, Gygi SP & Anderson P (2011) Angiogenin-Induced tRNA Fragments Inhibit Translation Initiation. Molecular Cell 43: 613623

61. Jih G, Iglesias N, Currie MA, Bhanu N v., Paulo JA, Gygi SP, Garcia BA & Moazed D (2017) Unique roles for histone H3K9me states in RNAi and heritable silencing of transcription. Nature 547: 463-467

62. Jinek M & Doudna JA (2008) A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference. Nature 2009 457:7228 457: 405-412

63. Johnson-Buck A, Su X, Giraldez MD, Zhao M, Tewari M & Walter NG (2015) Kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids. Nature Biotechnology 33: 730-732

64. Jolly SM, Gainetdinov I, Jouravleva K, Zhang H, Strittmatter L, Bailey SM, Hendricks GM, Dhabaria A, Ueberheide B & Zamore PD (2020) Thermus thermophilus Argonaute Functions in the Completion of DNA Replication. Cell 182: 1545-1559.e18

65. Kaiser PK, Symons RCA, Shah SM, Quinlan EJ, Tabandeh H, Do DV, Reisen G, Lockridge JA, Short B, Guerciolini R, et al (2010) RNAi-based treatment for neovascular age-related macular degeneration by Sirna-027. American journal of ophthalmology 150: 33-39

66. Kapoor M, Arora R, Lama T, Nijhawan A, Khurana JP, Tyagi AK & Kapoor S (2008) Genome-wide identification, organization and phylogenetic analysis of Dicer-like, Argonaute and RNA-dependent RNA Polymerase gene families and their expression analysis during reproductive development and stress in rice. BMC Genomics 2008 9:1 9: 1-17

67. Kawamata T & Tomari Y (2010) Making RISC. Trends in Biochemical Sciences 35:368-376

68. Kaya E, Doxzen KW, Knoll KR, Wilson RC, Strutt SC, Kranzusch PJ & Doudna JA (2016) A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences 113: 4057-4062

69. Kelley LA, Mezulis S, Yates CM, Wass MN & Sternberg MJE (2015) The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols 10: 845-858

70. Keren N, Matthew J. Kidd, Penner-Hahn J & Pakrasi H (2002) A Light-Dependent Mechanism for Massive Accumulation of Manganese in the Photosynthetic Bacterium Synechocystis sp. PCC 6803f. Biochemistry 41: 15085-15092

71. Kim HK, Fuchs G, Wang S, Wei W, Zhang Y, Park H, Roy-Chaudhuri B, Li P, Xu J, Chu K, et al (2017) A transfer-RNA-derived small RNA regulates ribosome biogenesis. Nature 552: 57-62

72. Kim SY, Jung Y & Lim D (2020) Argonaute system of Kordia jejudonensis is a heterodimeric nucleic acid-guided nuclease. Biochemical and Biophysical Research Communications 525: 755-758

73. Kropocheva E, Kuzmenko A, Aravin AA, Esyunina D & Kulbachinskiy A (2021) A programmable pAgo nuclease with universal guide and target specificity from the mesophilic bacterium Kurthia massiliensis. Nucleic Acids Research 49: 40544065

74. Kumar P, Anaya J, Mudunuri SB & Dutta A (2014) Meta-analysis of tRNA derived RNA fragments reveals that they are evolutionarily conserved and associate with

AGO proteins to recognize specific RNA targets. BMC Biology 2014 12:1 12: 114

75. Kumar P, Kuscu C & Dutta A (2016) Biogenesis and Function of Transfer RNA-Related Fragments (tRFs). Trends in Biochemical Sciences 41: 679-689

76. Kumar P, Mudunuri SB, Anaya J & Dutta A (2015) tRFdb: a database for transfer RNA fragments. Nucleic Acids Research 43: D141-D145

77. Kuzmenko A, Oguienko A, Esyunina D, Yudin D, Petrova M, Kudinova A, Maslova O, Ninova M, Ryazansky S, Leach D, et al (2020) DNA targeting and interference by a bacterial Argonaute nuclease. Nature 587: 632-637

78. Kuzmenko A, Yudin D, Ryazansky S, Kulbachinskiy A & Aravin AA (2019) Programmable DNA cleavage by Ago nucleases from mesophilic bacteria Clostridium butyricum and Limnothrix rosea. Nucleic Acids Research 47: 58225836

79. Kwak P & Tomari Y (2012) The N domain of Argonaute drives duplex unwinding during RISC assembly. Nature structural & molecular biology 19: 145-151

80. Lambert M, Benmoussa A & Provost P (2019) Small Non-Coding RNAs Derived from Eukaryotic Ribosomal RNA. Non-Coding RNA 2019, Vol 5, Page 16 5: 16

81. Lan F, Zaratiegui M, Villen J, Vaughn MW, Verdel A, Huarte M, Shi Y, Gygi SP, Moazed D, Martienssen RA, et al (2007) S. pombe LSD1 Homologs Regulate Heterochromatin Propagation and Euchromatic Gene Transcription. Molecular Cell 26: 89-101

82. Law JA & Jacobsen SE (2010) Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Nature Reviews Genetics 2010 11:3 11: 204-220

83. Lee RC, Feinbaum RL & Ambros V (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: 843-854

84. Lee Y, Han J, Yeom KH, Jin H & Kim VN (2006) Drosha in primary microRNA processing. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 71: 51-57

85. Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S & Kim VN (2002) MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. EMBO Journal 21: 4663-4670

86. Li Z, Ender C, Meister G, Moore PS, Chang Y & John B (2012) Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Research 40: 6787-6799

87. Lin H & Spradling AC (1997) A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development 124: 2463-2576

88. Lingel A, Simon B, Izaurralde E & Sattler M (2003) Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain. Nature 426: 465-469

89. Lisitskaya L, Aravin AA & Kulbachinskiy A (2018) DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nature Communications 9: 1 -12

90. Lisitskaya L, Petushkov I, Esyunina D, Aravin A & Kulbachinskiy A (2020) Recognition of double-stranded DNA by the Rhodobacter sphaeroides Argonaute protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 533: 1484-1489

91. Liu J, Carmell MA, Rivas F v., Marsden CG, Thomson JM, Song JJ, Hammond SM, Joshua-Tor L & Hannon GJ (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305: 1437-1441

92. Liu Y, Esyunina D, Olovnikov I, Teplova M, Kulbachinskiy A, Aravin AA & Patel DJ (2018) Accommodation of Helical Imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute Ternary Complexes with Guide RNA and Target DNA. Cell Reports 24:453-462

93. Liu Y, Li W, Jiang X, Wang Y, Zhang Z, Liu Q, He R, Chen Q, Yang J, Wang L, et al (2021) A programmable omnipotent Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia massiliensis. Nucleic Acids Research 49: 1597-1608

94. Lund E & Dahlberg JE (2006) Substrate selectivity of exportin 5 and Dicer in the biogenesis of microRNAs. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 71: 59-66

95. Luo S, He F, Luo J, Dou S, Wang Y, Guo A & Lu J (2018) Drosophila tsRNAs preferentially suppress general translation machinery via antisense pairing and participate in cellular starvation response. Nucleic Acids Research 46: 5250-5268

96. Ma J, Yuan Y, Meister G, Pei Y, Tuschl T & Patel D (2005) Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein. Nature 434: 666-670

97. MacLean B, Tomazela DM, Shulman N, Chambers M, Finney GL, Frewen B, Kern R, Tabb DL, Liebler DC & MacCoss MJ (2010) Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26:966-968

98. MacRae IJ, Zhou K, Li F, Repic A, Brooks AN, Cande WZ, Adams PD & Doudna JA (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195-198

99. Makarova KS, Wolf YI, van der Oost J & Koonin E v (2009) Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements. Biology Direct 2009 4:1 4: 115

100. Martinez G, Choudury SG & Slotkin RK (2017) tRNA-derived small RNAs target transposable element transcripts. Nucleic Acids Research 45: 5142-5152

101. Matsumoto N, Nishimasu H, Sakakibara K, Nishida KM, Hirano T, Ishitani R, Siomi H, Siomi MC & Nureki O (2016) Crystal Structure of Silkworm PIWI-Clade Argonaute Siwi Bound to piRNA. Cell 167: 484-497.e9

102. Meister G (2013) Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. Nature Reviews Genetics 2013 14:7 14: 447-459

103. Meister G, Landthaler M, Patkaniowska A, Dorsett Y, Teng G & Tuschl T (2004) Human Argonaute2 Mediates RNA Cleavage Targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell 15: 185-197

104. Miyoshi T, Ito K, Murakami R & Uchiumi T (2016) Structural basis for the recognition of guide RNA and target DNA heteroduplex by Argonaute. Nature Communications 7: 1 -12

105. Montgomery TA, Rim Y-S, Zhang C, Dowen RH, Phillips CM, Fischer SEJ & Ruvkun G (2012) PIWI Associated siRNAs and piRNAs Specifically Require the Caenorhabditis elegans HEN1 Ortholog henn-1. PLOS Genetics 8: e1002616

106. Mosher RA, Schwach F, Studholme D & Baulcombe DC (2008) PolIVb influences RNA-directed DNA methylation independently of its role in siRNA biogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 105: 3145-3150

107. Muerdter F, Olovnikov I, Molaro A, Rozhkov N v., Czech B, Gordon A, Hannon GJ & Aravin AA (2012) Production of artificial piRNAs in flies and mice. RNA 18: 42-52

108. Nishimasu H, Ishizu H, Saito K, Fukuhara S, Kamatani MK, Bonnefond L, Matsumoto N, Nishizawa T, Nakanaga K, Aoki J, et al (2012) Structure and function of Zucchini endoribonuclease in piRNA biogenesis. Nature 2012 491:7423 491: 284-287

109. Olovnikov I, Chan K, Sachidanandam R, Newman DK & Aravin AA (2013) Bacterial Argonaute Samples the Transcriptome to Identify Foreign DNA. Molecular Cell 51: 594-605

110. Parker J, Roe S & Barford D (2005) Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature 434: 663-666

111. Parker JS (2010) How to slice: Snapshots of Argonaute in action. Silence 1

112. Parker JS, Parizotto EA, Wang M, Roe SM & Barford D (2009) Enhancement of the Seed-Target Recognition Step in RNA Silencing by a PIWI/MID Domain Protein. Molecular Cell 33: 204-214

113. Parker JS, Roe SM & Barford D (2004) Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. EMBO Journal 23: 4727-4737

114. Pontier D, Yahubyan G, Vega D, Bulski A, Saez-Vasquez J, Hakimi M-A, Lerbs-Mache S, Colot V & Lagrange T (2005) Reinforcement of silencing at transposons and highly repeated sequences requires the concerted action of two distinct RNA polymerases IV in Arabidopsis. Genes & Development 19: 20302040

115. Qian Y, Cheng Y, Cheng X, Jiang H, Zhu S & Cheng B (2011) Identification and characterization of Dicer-like, Argonaute and RNA-dependent RNA polymerase gene families in maize. Plant Cell Reports 30: 1347-1363

116. Rogers K & Chen X (2013) Biogenesis, Turnover, and Mode of Action of Plant MicroRNAs. The Plant Cell 25: 2383-2399

117. Ryazansky S, Kulbachinskiy A & Aravin AA (2018) The Expanded Universe of Prokaryotic Argonaute Proteins. MBio 9: e01935-18

118. Saini HK, Griffiths-Jones S & Enright AJ (2007) Genomic analysis of human microRNA transcripts. National Acad Sciences

119. Salomon WE, Jolly SM, Moore MJ, Zamore PD & Serebrov V (2015) Single-Molecule Imaging Reveals that Argonaute Reshapes the Binding Properties of Its Nucleic Acid Guides. Cell 162: 84-95

120. Sashital DG (2017) Prokaryotic Argonaute Uses an All-in-One Mechanism to Provide Host Defense. Molecular Cell 65: 957-958

121. Schirle NT, Sheu-Gruttadauria J, Chandradoss SD, Joo C & MacRae IJ (2015) Water-mediated recognition of t1-adenosine anchors Argonaute2 to microRNA targets. eLife 4

122. Schorn AJ, Gutbrod MJ, LeBlanc C & Martienssen R (2017) LTR-Retrotransposon Control by tRNA-Derived Small RNAs. Cell 170: 61-71.e11

123. Schroda M (2006) RNA silencing in Chlamydomonas: Mechanisms and tools. Current Genetics 49: 69-84

124. Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N & Zamore PD (2003) Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115: 199-208

125. Sharma U, Conine CC, Shea JM, Boskovic A, Derr AG, Bing XY, Belleannee C, Kucukural A, Serra RW, Sun F, et al (2016) Biogenesis and function of tRNA fragments during sperm maturation and fertilization in mammals. Science 351:391-396

126. Sheng G, Zhao H, Wang J, Rao Y, Tian W, Swarts DC, Oost J van der, Patel DJ & Wang Y (2014) Structure-based cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences 111: 652-657

127. Shin S, Jung Y, Uhm H, Song M, Son S, Goo J, Jeong C, Song J-J, Kim VN & Hohng S (2020) Quantification of purified endogenous miRNAs with high sensitivity and specificity. Nature Communications 11: 1-8

128. Sienski G, Dönertas D & Brennecke J (2012) Transcriptional Silencing of Transposons by Piwi and Maelstrom and Its Impact on Chromatin State and Gene Expression. Cell 151: 964-980

129. Siomi MC, Sato K, Pezic D & Aravin AA (2011) PIWI-interacting small RNAs: the vanguard of genome defence. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2011 12:4 12: 246-258

130. Sobala A & Hutvagner G (2013) Small RNAs derived from the 5' end of tRNA can inhibit protein translation in human cells. RNA biology 10: 553-563

131. Song J, Hegge JW, Mauk MG, Chen J, Till JE, Bhagwat N, Azink LT, Peng J, Sen M, Mays J, et al (2020) Highly specific enrichment of rare nucleic acid fractions using Thermus thermophilus argonaute with applications in cancer diagnostics. Nucleic Acids Research 48: e19-e19

132. Song J, Liu J, Tolia N, Schneiderman J, Smith SK, Martienssen RA, Hannon G & Joshua-Tor L (2003) The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi effector complexes. Nature Structural & Molecular Biology 10: 1026-1032

133. Song JJ, Smith SK, Hannon GJ & Joshua-Tor L (2004) Crystal structure of argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434-1437

134. Swarts D, Makarova K, Wang Y, Nakanishi K, Ketting RF, Koonin E v., Patel D & van der Oost J (2014) The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nature structural & molecular biology 21: 743-753

135. Swarts DC, Koehorst JJ, Westra ER, Schaap PJ & Oost J van der (2015) Effects of Argonaute on Gene Expression in Thermus thermophilus. PLOS ONE 10:e0124880

136. Tabernero J, Shapiro GI, LoRusso PM, Cervantes A, Schwartz GK, Weiss GJ, Paz-Ares L, Cho DK, Infante JR, Alsina M, et al (2013) First-in-humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement. Cancer discovery 3: 406-417

137. Taton A, Erikson C, Yang Y, Rubin BE, Rifkin SA, Golden JW & Golden SS (2020) The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications 11: 1-11

138. Thomas A le, Rogers AK, Webster A, Marinov GK, Liao SE, Perkins EM, Hur JK, Aravin AA & Toth KF (2013) Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state. Genes & Development 27:390-399

139. Thompson DM & Parker R (2009) The RNase Rnylp cleaves tRNAs and promotes cell death during oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology 185: 43-50

140. Tolia NH & Joshua-Tor L (2006) Slicer and the Argonautes. Nature Chemical Biology 2007 3:1 3: 36-43

141. Tomari Y, Du T & Zamore PD (2007) Sorting of Drosophila Small Silencing RNAs. Cell 130: 299-308

142. Tomari Y & Zamore PD (2005) Perspective: machines for RNAi. Genes & Development 19: 517-529

143. Ullu E, Tschudi C & Chakraborty T (2004) RNA interference in protozoan parasites. Cellular microbiology 6: 509-519

144. Verdel A, Jia S, Gerber S, Sugiyama T, Gygi S, Grewal SIS & Moazed D (2004) RNAi-Mediated Targeting of Heterochromatin by the RITS Complex. Science 303: 672-676

145. Wang Q, Lee I, Ren J, Ajay SS, Lee YS & Bao X (2013) Identification and Functional Characterization of tRNA-derived RNA Fragments (tRFs) in Respiratory Syncytial Virus Infection. Molecular Therapy 21: 368-379

146. Wang Y, Juranek S, Li H, Sheng G, Tuschl T & Patel DJ (2008) Structure of an argonaute silencing complex with a seed-containing guide DNA and target RNA duplex. Nature 456: 921-926 doi:10.1038/nature07666 [PREPRINT]

147. Wang Y, Juranek S, Li H, Sheng G, Wardle GS, Tuschl T & Patel DJ (2009) Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes. Nature 461: 754-761

148. Watanabe S, Ohbayashi R, Shiwa Y, Noda A, Kanesaki Y, Chibazakura T & Yoshikawa H (2012) Light-dependent and asynchronous replication of cyanobacterial multi-copy chromosomes. Molecular Microbiology 83: 856-865

149. Wei KF, Wu LJ, Chen J, Chen YF & Xie DX (2012a) Structural evolution and functional diversification analyses of argonaute protein. Journal of Cellular Biochemistry 113: 2576-2585

150. Wei W, Ba Z, Gao M, Wu Y, Ma Y, Amiard S, White CI, Danielsen JMR, Yang YG & Qi Y (2012b) A Role for Small RNAs in DNA Double-Strand Break Repair. Cell 149: 101-112

151. Wickham H & Grolemund G (2016) R for Data Science: Import, Tidy, Transform, Visualize, and Model Data - Hadley Wickham, Garrett Grolemund -Google Книги O'Reilly Media, Inc.

152. Wierzbicki AT, Haag JR & Pikaard CS (2008) Noncoding Transcription by RNA Polymerase Pol IVb/Pol V Mediates Transcriptional Silencing of Overlapping and Adjacent Genes. Cell 135: 635-648

153. Wightman B, Ha I & Ruvkun G (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75: 855-862

154. Wigley DB (2012) Bacterial DNA repair: recent insights into the mechanism of RecBCD, AddAB and AdnAB. Nature Reviews Microbiology 11: 9-13

155. Willkomm S, Oellig CA, Zander A, Restle T, Keegan R, Grohmann D & Schneider S (2017) Structural and mechanistic insights into an archaeal DNA-guided Argonaute protein. Nature Microbiology 2: 1-7

156. Wilson RC & Doudna JA (2013) Molecular mechanisms of RNA interference. Annual Review of Biophysics 42: 217-239

157. Yamasaki S, Ivanov P, Hu G & Anderson P (2009) Angiogenin cleaves tRNA and promotes stress-induced translational repression. Journal of Cell Biology 185: 35-42

158. Yan K, Yan S, Farooq A, Han A, Zeng L & Zhou MM (2003) Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature 426: 469-474

159. Yuan YR, Pei Y, Ma JB, Kuryavyi V, Zhadina M, Meister G, Chen HY, Dauter Z, Tuschl T & Patel DJ (2005) Crystal Structure of A. aeolicus Argonaute, a Site-Specific DNA-Guided Endoribonuclease, Provides Insights into RISCMediated mRNA Cleavage. Molecular Cell 19: 405-419

160. Zander A, Willkomm S, Ofer S, van Wolferen M, Egert L, Buchmeier S, Stöckl S, Tinnefeld P, Schneider S, Klingl A, et al (2017) Guide-independent DNA cleavage by archaeal Argonaute from Methanocaldococcus jannaschii. Nature Microbiology 2: 1-10

161. Zhai L, Teng F, Zheng K, Xiao J, Deng W & Sun W (2019) Expression analysis of Argonaute genes in maize (Zea mays L.) in response to abiotic stress. Hereditas 156: 27

162. Zhang F, Wang J, Xu J, Zhang Z, Koppetsch BS, Schultz N, Vreven T, Meignin C, Davis I, Zamore PD, et al (2012) UAP56 Couples piRNA Clusters to the Perinuclear Transposon Silencing Machinery. Cell 151: 871-884

163. Zhang H, Kolb F, Jaskiewicz L, Westhof E & Filipowicz W (2004) Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 118: 5768

164. ZHAO KANG, ZHAO HUALIN, CHEN ZHU, FENG LIN, REN JIE, CAI RONGHAO & XIANG YAN (2015) The Dicer-like, Argonaute and RNA-dependent RNA polymerase gene families in Populus trichocarpa: gene structure, gene expression, phylogenetic analysis and evolution. Journal of Genetics 94: 317-321

165. Zhu H, Hu F, Wang R, Zhou X, Sze SH, Liou LW, Barefoot A, Dickman M & Zhang X (2011) Arabidopsis Argonaute10 Specifically Sequesters miR166/165 to Regulate Shoot Apical Meristem Development. Cell 145: 242-256

166. Олина АВ, Кульбачинский АВ, Аравин АА & Есюнина ДМ (2018) БЕЛКИ-АРГОНАВТЫ И МЕХАНИЗМЫ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ У ЭУКАРИОТ И ПРОКАРИОТ. Биохимия 83: 645-661

10. Приложение

Таблица П1. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название олигонуклеотида Последовательность (5'-3') Описание

1. О-гид ОТТАОАСТТТААОТСАА Т Гид, соответствующий О- тДНК, содержит 5'-О

2. С-гид СТТАОАСТТТААОТСАА Т Гид, соответствующий С- тДНК, содержит 5'-С

3. А-гид АТТАОАСТТТААОТСАА Т Гид, соответствующий А- тДНК, содержит 5'-А

4. Т-гид ТТТАОАСТТТААОТСАА Т Гид, соответствующий Т- тДНК, содержит 5'-Т

5. §38ЭТ_шш1 СТТАОАСТТТААОТСАА Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 1

6. §38ЭТ_шш2 ОАТАОАСТТТААОТСАА Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 2

7. §38ЭТ_шш3 ОТААОАСТТТААОТСАА Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 3

8. §38ЭТ_шш4 ОТТТОАСТТТААОТСАА Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 4

9. §38ЭТ_тт5 аттлслстттллатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 5

10. §38ЭТ_тт6 аттлатстттллатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 6

11. §38ЭТ_тт7 аттлалатттллатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 7

12. §38ЭТ_тт8 аттлалслттллатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 8

13. §38ЭТ_тт9 аттлалстлтллатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 9

14. §38ЭТ_тт10 аттлалсттлллатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 10

15. §38ЭТ_тт11 аттлалсттттлатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 11

16. §38ЭТ_тт12 аттлалстттлтатслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 12

17. §38ЭТ_тт13 аттлалстттллстслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 13

18. §38ЭТ_тт14 аттлалстттллалслл т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 14

19. §38ЭТ_шш15 ОТТАОАСТТТААОТОАА Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 15

20. §38ЭТ_шш16 ОТТАОАСТТТААОТСТА Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 16

21. §38ЭТ_шш17 ОТТАОАСТТТААОТСАТ Т Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 17

22. §38ЭТ_шш18 ОТТАОАСТТТААОТСАА А Гид, формирующий мисматч с О-тДНК в позиции 18

23. О-тДНК ТТТАТСАААААОАОТАТ ТОАСТТАААОТСТААСС ТАТАООАТАСТТАСАО 50 нт тДНК для О-гида

24. С- тДНК ТТТАТСАААААОАОТАТ ТОАСТТАААОТСТААОС ТАТАООАТАСТТАСАО 50 нт тДНК для С-гида

25. А- тДНК ТТТАТСАААААОАОТАТ ТОАСТТАААОТСТААТС ТАТАООАТАСТТАСАО 50 нт тДНК для А-гида

26. Т-тДНК ТТТАТСАААААОАОТАТ ТОАСТТАААОТСТАААС ТАТАООАТАСТТАСАО 50 нт тДНК для Т-гида

27. РНК гид оиилолсиииллоисл ли 18 нт РНК гид для определения нуклеазной специфичности

28. тРНК ииилислллллолоил ииолсиилллоисилл ссилилоолилсиилс лО 50 нт РНК мишень для определения нуклеазной специфичности

29. т-тДНК_Су3 су3- тттлтслллллОлОтлт толсттлллотстлллс тлтлООлтлсттлслО 50 нт флуоресцентно меченная тДНК для Т-гида

30. т гид ОсслтсссллтсОлслс Гид, использованный в опыте по разрезанию плазмиды

31. ЭТ гид ототсолттооолтоос Гид, использованный в опыте по разрезанию плазмиды

32. рШт-1аг§е1 вставка слотоллттстлтттоо лтсслолтсссоллллт ттлтслллллОлОтлтт ОлсттлллОтстллсст лтлоолтлсттлслосс лтсОлОлОООлслсОО соллтлосслтсссллт солслссоооотссоо Последовательность втавки в плазмиду рШт^а^й, подчеркнут сайт, комплементарный Т и Кт гидам

ОАТСТООАТСТООАТСО

СТААТААСАООССТОСТ

ООТААТСОСТСОАСТАО

ТСАССТОАОТСООТА

ТОТТТТТААОАОСАТСА

33. дРСЯ_а§о_а ААСАОТСТАТТААССАО С Праймеры для ЯТ-дРСЯ для гена

34. дРСЯ_а§о_г ААТАТССОСАОТСТТОО АОАСАОО

35. дРСЯ_трБ_а ССТАСОАСООАООСТО СААО Праймеры для ЯТ-дРСЯ для гена

36. дРСЯ_трБ_г ТООАТОАТСТССОСССО АОТ rnpB

5'Р-

3'-линкер ТООААТТСТСОООТОСС ААООААСТС-3МС Олигонуклеотиды для приготовления библиотек

ААТОАТАСООСОАССА коротких ДНК, ассоциированных

ЯР1 ССОАОАТСТАСАСОТТС АОАОТТСТАСАОТССОА с аргонавтом

5'AmMC6-

Bridge 1 CACCCGAGAATTCCAN NNNNN-3 ' AmMO

5'AmMC6-

Bridge 2 NNNNNNGATCGTCGGA CTGTA-3 'AmMO

CAAGCAGAAGACGGCA

Index 4 TACGAGATTGGTCAGTG ACTGGAGTTCCTTGGCA CCCGAGAATTCCA

CAAGCAGAAGACGGCA

Index 5 TACGAGATCACTGTGTG ACTGGAGTTCCTTGGCA CCCGAGAATTCCA

DA5 GTTCAGAGTTCTACAGT CCGACGATC

Рис. П1. Карты плазмид, использованных для экспрессии SeAgo в клетках E. coli. А - pLATE52 SeAgo, Б - pBAD SeAgoOPT, В - pET28 SeAgoOPT.

Таблица П2. Результаты масс-спектрометрии белков-партнеров SeAgo в клетках & е1о^аШв, показаны 15 наиболее представленных в элюции белков.

Number Protein name Description Gene number Molecula r weight Protein coverage, % Peptides number Protein probabilit y Total independen t spectra Initial probability N instance s

1 Uncharacterized protein Single-stranded DNA binding Synpcc7942 _0079 16055 51,4 10 1 120 0,999 36

2 Single-stranded DNA-binding protein Single-stranded DNA binding, DNA replication Synpcc7942 _0301 13556 56,7 10 1 93 0,999 21

3 Uncharacterized protein Unreviewed Synpcc7942 _1632 18434 19,5 3 1 33 0,999 6

4 Elongator protein 3/MiaB/NifB Cobalamin binding, Synpcc7942 _1621 60064 2,9 1 0,9996 21 0,999 21

iron-sulfur cluster binding, metal ion binding

5 Uncharacterized protein Unreviewed Synpcc7942 _0100 20270 8,2 2 1 7 0,9861 5

6 L-threonine synthase Threonine synthase activity, lyase Synpcc7942 _1782 46721 12,6 2 1 5 0,999 1

7 Cellulose synthase Cellulose synthase (UDP-forming) activity Synpcc7942 _2151 83495 2 1 0,9996 5 0,999 5

8 Response regulator receiver domain protein Phosphorelay sensor kinase activity Synpcc7942 _1815 46477 4,1 1 0,9996 4 0,999 4

9 Protein serine/threonine phosphatase Protein serine/threonine phosphatase activity Synpcc7942 _1515 32711 6,4 1 0,9996 4 0,999 4

10 Uncharacterized protein Unreviewed Synpcc7942 _0605 37247 4,3 1 0,9996 4 0,999 4

11 Probable glycosyltransferas e Transferase activity Synpcc7942 _2018 40377 9,9 2 1 3 0,999 1

12 Iron-regulated ABC transporter ATPase subunit SufC Oxidoreductase activity Synpcc7942 _2036 37144 10,7 2 1 3 0,999 2

13 Ribonuclease, Rne/Rng family Ribonuclease activity, RNA binding Synpcc7942 _0878 87431 6,1 3 1 3 0,999 1

14 3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase FabZ Involved in unsaturated fatty acids biosynthesis Synpcc7942 _0930 16900 12,9 1 0,9996 3 0,999 3

Uncharacterized Synpcc7942

15 GTP binding 48181 3 1 0,9996 3 0,999 3

protein _1154