Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Ладыгина, Надежда Григорьевна

• Ладыгина, Надежда Григорьевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ладыгина, Надежда Григорьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Процесс прикрепления хромосом к микротрубочкам веретена деления.

1.1 Организация митотического веретена деления.

1.2 Инициация взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами митотических хромосом.

1.3 Передвижение хромосом во время прометафазы.

1.4 Динамика микротрубочек веретена деления в процессе митоза.

Глава 2. Механизм передвижения митотических хромосом.

2.1 Роль белков-биологических моторов в процессе передвижения хромосом.

2.2 Турновер микротрубочек в процессе передвижения хромосом.

Глава 3.Значение взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами в регуляции митотической прогрессии.

3.1 Точка перехода митоза.

3.2 Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохоре.

3.3 Динамика компонентов митотической точки перехода.

Глава 4. Кинетохорассоциированный белок Е (СЕИР-Е).

4.1 Роль белка СЕ№-Е в передвижении хромосом во время митоза.

4.2 Роль белка СЕ№-Е в регуляции расхождения хромосом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.Полимеразная цепная реакция и ПЦР-мутагенез.

2. Культивирование клеточных линий НеЬа, НеЬа СЕР Н2В 7.1 и НеЬа СЕР а-тубулин.

3. Трансформация клеток HeLa и иммуноокрашивание слайдов.

4. Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосъемка.

5. Реакция трансляции in vitro.

6. Исследование способности связывать микротрубочки.

7. ПААГ и иммуноблоттинг.

8. Реакция иммунопреципитации и киназная реакция.

9. Анализ состояния клеточного цикла.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих»

Существование биологических видов, а, следовательно, и феномена жизни как такового, целиком зависит от точности передачи генетической информации как по вертикали - от организмов родителей к потомкам, так и по горизонтали - от одной соматической клетки к другой в процессе онтогенетического развития многоклеточных организмов. Для правильной передачи генетической информации исключительно важны как основные механизмы функционирования главной генетической системы, обеспечивающие воспроизведение генетической информации путем удвоения молекул ДНК - системы репликации; так и молекулярные механизмы, обеспечивающие расхождение удвоившихся хромосом между дочерними клетками у про - и эукариот в процессах митоза и мейоза. О

Учитывая тот факт, что 2,5x10 клеток человека подвергаются делению в каждый данный момент времени, появление хотя бы одной ошибки в данном процессе повлечет за собой возникновение множества генетически анормальных клеток на протяжении жизни индивидуума в целом.

В процессе деления клетка подвергается комплексу высоко организованных морфологических изменений, которые привлекают внимание биологов больше 100 лет, со времен открытия Вальтером Флемингом в 1882 году процесса, названного митозом. Основное событие митоза - это разделение реплицированных хромосом на две эквивалентные и чаще всего, физически обособленные клетки. Точность расхождения хромосом определяется сложными механическими процессами, главными из которых являются выравнивание и сегрегация хромосом, для правильного протекания которых необходимо прикрепление хромосом к веретену деления. Прикрепление - процесс стохастический, при этом хромосомы прикрепляются к микротрубочкам посредствам прямых столкновений. Это объясняет, почему хромосомы подвергаются выравниванию у клеточного экватора несинхронно, а также свидетельствует о необходимости наличия системы специального контроля - так называемой точки рестрикции (точки перехода митоза) (МТР).

Система точки рестрикции в клетках млекопитающих представлена эволюционно-консервативной группой белков, которая контролирует взаимодействие кинетохора и микротрубочек, предотвращая переход клетки в состояние анафазы при наличии невыравнеиных у клеточного экватора хромосом и, как следствие, появление в популяции клеток с неравномерным распределением генетической информации - анеуплоидов. Генетические и биохимические исследования выявили мишень митотической точки рестрикции - это макрокомплекс циклосом, известный также как Anaphase Promoting Complex (АРС/С), являющийся мультисубьединичной убиквитин-зависимой протеазой, подвергающей деградации такие ключевые митотические белки, как секурин и циклинВ, обуславливая тем самым расхождение хромосом и завершение митоза (Maiato et al., 2004; Rieder and Salmon, 1998). Ингибирование АРС/С осуществляется комплексом белков митотической точки рестрикции, получившим название MCC (Mitotic Checkpoint Complex), через взаимодействие с субстратом АРС/С - Cdc20.

Впервые выявленные в дрожжевых клетках белки МТР являются высоко консервативными в эволюционном плане. Гомологи дрожжевых BUB1, BUB3, MAD1, MAD2, MAD3 и Mpsl белков были идентифицированы у высших организмов, где также была показана их роль в регуляции митотической точки рестрикции. Характерной чертой представителей этой группы белков является их локализация на кинетохоре, где, как предполагается, они регулируют активность последних в процессе выстраивания хромосом. Наличие в клетке неприкрепленного к микротрубочкам веретена деления кинетохора вызывает увеличения плотности сигнала белков МТР на подобной хромосоме, что еще раз подтверждает, что белки митотической точки рестрикции чувствительны к взаимодействию кинетохоров и микротрубочек. На этапе, когда хромосома достигает состояния метафазного выравнивания, такие белки точки перехода как MAD1 и MAD2 полностью покидают кинетохоры, в то время как сигнал BUB1 и hBUBRl уменьшается в несколько раз(СЬап, 2003; King et al., 2000а).

Расхождение хромосом осуществляется и отчасти контролируется белками-биологическими моторами, локализующихся на кинетохорах клетки. Представителем данной группы является кинезиноподобный Centromere-associated Protein Е (CENP-E) белок, обеспечивающий формирование контакта между кинетохором и микротрубочками (МТ). В структуре данного белка отмечают два микротрубочко-связывающих домена, расположенных на NH2- и СООН-концах, роль которых на сегодняшний день остается до конца не изученной; кинетохорсвязывающий домен, а также домен взаимодействия с белками митотической точки рестрикции, в частности киназой hBUBRl. Функциональные исследования CENP-E показали, что активность этого белка регулируется системой митотической точки рестрикции. Так, клетки HeLa с делецией CENP-E-гена подвергаются аресту или существенной задержке в митозе. Молекулярная связь CENP-E с системой точки рестрикции была показана на примере прямого взаимодействия данного белка с hBUBRl киназой, гомологичной MAD3 и BUBI белкам точки рестрикции почкующихся дрожжей. И что наиболее важно, было показано, что митотический арест, индуцируемый отсутствием CENP-E, зависит от киназной активности hBUBRl. Учитывая все вышеприведенные результаты и тот факт, что hBUBRl также локализуется на кинетохоре, можно предположить, что CENP-E и hBUBRl являются неотъемлемой частью механосенсерного комплекса, который связывает функционирование кинетохоров и системы точки рестрикции.

В данной работе будут рассмотрены некоторые из аспектов функционального значения доменной структуры белка CENP-E, механизмы регуляции его активности и определена роль взаимодействия данного белка с белками митотической точки рестрикции, в частности киназы hBUBRl. Всесторонняя оценка активности данного белка в процессе митоза позволит использовать его в качестве избирательной мишени при лечении онкологических заболеваний (автору представляется, что потеря клетками данного CENP-E вызывает арест быстро делящихся раковых клеток), а также внесет вклад в понимание механизма атипичных митозов.

Цель и задачи работы. Цель данной работы - изучить роль белка CENP-E в процессах прикрепления кинетохоров сестринских хроматид к микротрубочкам веретена клеточного деления, хромосомной конгрессии и прохождения митотической точки рестрикции в делящихся культивируемых клетках млекопитающих (HeLa). Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Восстановить полноразмерную 8 кб кДНК копию гена CENP-E из имеющихся перекрывающихся фрагментов. Показать in vitro и in vivo, что полученная в процессе работы кДНК гена CENP-E является функциональным гомологом эндогенной формы.

2. Используя технологию pSHAG (короткошпилечных интерферирующих РНК) для ингибирования активности эндогенного белка, оценить in vivo роль каждого из двух микротрубочкосвязывающих доменов CENP-E в процессе митоза и эффект удаления двух МТсвязывающих доменов одновременно. Описать значение АТФ-азной активности МН2-терминального района CENP-E в процессе внутриклеточного турновера данного белка.

3. Используя технологию pSHAG, описать значение фосфорилирования CENP-E киназами MPF (комплексом циклина В и cdc2) и MAP р38 в процессе регуляции активности кинетохорсвязанного пула белка CENP-E на протяжении митотического цикла клетки.

Картировать район взаимодействия CENP-E и киназы митотической точки рестрикции hBUBRl и охарактеризовать in vivo роль подобного взаимодействия для завершения клеткой митотического деления.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Ладыгина, Надежда Григорьевна

ВЫВОДЫ:

1. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была получена полноразмерная копия кДНК человеческого гена CENP-E, которая при использовании в модельной системе in vivo в сочетании с технологией pSHAG (использование короткошпилечных РНК) полностью компенсировала эффекты ингибирования активности эндогенной формы этого белка.

2. Два микротрубочко-связывающих района CENP-E (как NH2-, так и СООН-терминальный) одинаково важны для создания функционального взаимодействия между кинетохором и микротрубочками веретена деления и для формирования напряженности между сестринскими хроматидами. Осуществление функций CENP-E на начальных этапах митоза обеспечивается способностью СООН-терминального домена стабилизировать и полимеризовать захваченные плюс-концы кинетохорных микротрубочек, в то время как ЫШ-терминальный домен обеспечивает шаговое передвижение молекулы CENP-E в комплексе с хромосомой вдоль микротрубочки. Элиминация любого из этих доменов приводит к активации сигнала митотической точки рестрикции и, как следствие, задержку клеток в митозе в связи с потерей напряженности на кинетохорах сестринских хроматид и появлением дефектов связывания кинетохоров и микротрубочек веретена деления.

3. Создание полноразмерной копии гена CENP-E, искусственно имитирующей его гиперфосфорилированное состояние, позволило показать in vivo, что фосфорилирование СООН-терминального района CENP-E ингибирует его микротрубочко-связывающую активность. Из чего нами был сделан вывод о том, что пул CENP-E, находящийся на кинетохорах, в процессе митоза поддерживается в гипофосфорилированном состоянии для активного связывания микротрубочек, в то время как в цитоплазме клетки митотические киназы осуществляют фосфорилирование свободного CENP-E, вызывая тем самым его дезактивацию.

4. Взаимодействие кинетохорассоциированного белка СЕИР-Е и киназы митотической точки рестрикции ЬВиВШ является необходимым условием правильности передачи сигнала митотической точки рестрикции. Нами было показано, что после завершения процесса выстраивания хромосом у клеточного экватора, СЕИР-Е подавляет киназную активность ЬВиВШ, что обуславливает блокировку сигнала митотической точки рестрикции, в результате чего клетка получает возможность завершить деление. При нарушении подобных взаимоотношений мы наблюдали вступление клеток в митоз, его незавершение и быструю клеточную гибель, что, как мы полагаем, является следствием гиперактивации системы митотической точки рестрикции. Полученные нами результаты позволяют считать, что киназа ЬВиВШ является механосенсором, контролирующим взаимодействие СЕМР-Е и микротрубочек (то есть процесс выравнивания хромосом), активность которого ингибируется присоединением микротрубочки к СЕИР-Е.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям доценту к.б.н. Рихарду Вольдемаровичу Лацису за внимательное руководство и конструктивную критику, проф. Тиму Ену за предоставленную возможность выполнения работы в его лаборатории и оказанную поддержку в осуществлении проекта и коллективу лаборатории, Джиму Ниттлу и Беатрис Конер за помощь в проведении экспериментов.

Автор также выражает благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой, проф. Эрике Големис и к.б.н. Илье Серебрийскому за организацию программы сотрудничества между Россиийским Государственным Медицинским Университетом и Онкологическим центром Фокс Чейс, Филадельфия, США (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia,USA).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ладыгина, Надежда Григорьевна, 2005 год

1. Васильев Ю.М. (1996) Клетка как архитектурное чудо. Часть 1. Живые нити. Соросовский образовательный журнал. Биология, с. 36-43.

2. Васильев Ю.М. (1999) Клетка как архитектурное чудо. Часть 3. Клетка единая, но делимая. Соросовский образовательный журнал. Биология, 18-23.

3. Кикнадзе И.И. (1972) Функциональная организация хромосом, JI., Наука.

4. Ладыгина Н.Г, Лацис, Р.В. and Ен, Т. (2005) Эффект применения фармакологического агента Гесперадина на клетках опухолевых клеток молочной железы и простаты. Вопросы медицинской химии, 52 , №2, стр 170-176.

5. Минин А.А., Кулик А.В, (2004) Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции. Успехи биологической химии, т.44,225-262.

6. Хемлебен В., Беридзе Т., Бахман Л., Коварик Я., Торрес Р. (2003) Сателлитные ДНК. Успехи биологической химии, jA3 с. 267-306.

7. Ченцов Ю.С. (1996) Современные представления о строении митотических хромосом. Соросовский образовательный журнал. Биология, с. 14-22.

8. Abrieu, А., КаЬапа, J.A., Wood, K.W. and Cleveland, D.W. (2000) CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell, 102, 817-826.

9. Abrieu, A., Magnaghi-Jaulin, L., Kahana, J.A., Peter, M., Castro, A., Vigneron, S., Lorca, Т., Cleveland, D.W. and Labbe, J.C. (2001) Mpsl is a kinetochore-associated kinase essential for the vertebrate mitotic checkpoint. Cell, 106, 83-93.

10. Amon, A. (1999) The spindle checkpoint. Curr Opin Genet Dev, 9,69-75.

11. Andrews, P.D., Ovechkina, Y., Morrice, N., Wagenbach, M., Duncan, K., Wordeman, L. and Swedlow, J.R. (2004) Aurora В regulates MCAK at the mitotic centromere. Dev Cell, 6, 253-268.

12. Bajer, A.S., Cypher, C., Mole-Bajer, J. and Howard, H.M. (1982) Taxol-induced anaphase reversal: evidence that elongating microtubules can exert a pushing force in living cells. Proc Natl AcadSci USA, 19, 6569-6573.

13. Basto, R., Gomes, R. and Karess, R.E. (2000) Rough deal and ZwlO are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nat Cell Biol, 2,939-943.

14. Beinhauer, J.D., Hagan, I.M., Hegemann, J.H. and Fleig, U. (1997) Mal3, the fission yeast homologue of the human APC-interacting protein EB-1 is required for microtubule integrity and the maintenance of cell form. J Cell Biol, 139,717-728.

15. Berrueta, L., Tirnauer, J.S., Schuyler, S.C., Pellman, D. and Bierer, B.E. (1999) The APC-associated protein EB1 associates with components of the dynactin complex and cytoplasmic dynein intermediate chain. CurrBiol, 9,425-428.

16. Biggins, S. and Murray, A.W. (1999) Sister chromatid cohesion in mitosis. Curr Opin Genet Dev, 9, 230-236.

17. Biggins, S. and Murray, A.W. (2001) The budding yeast protein kinase Ipll/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes Dev, 15, 3118-3129.

18. Biggins, S., Severin, F.F., Bhalla, N., Sassoon, I., Hyman, A.A. and Murray, A.W. (1999a) The conserved protein kinase Ipll regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev, 13,532-544.

19. Biggins, S., Severin, F.F., Bhalla, N., Sassoon, I., Hyman, A.A. and Murray, A.W. (1999b) The conserved protein kinase Ipll regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev., 13, 532-544.

20. Carpenter, A.T. (1991) Distributive segregation: motors in the polar wind? Cell, 64, 885-890.

21. Cassimeris, L. (2002) The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol, 14,18-24.

22. Chan, G.K., Jablonski, S.A., Starr, D.A., Goldberg, M.L. and Yen, T.J. (2000) Human ZwlO and ROD are mitotic checkpoint proteins that bind to kinetochores. Nat Cell Biol, 2, 944-947.

23. Chan, G.K., Jablonski, S.A., Sudakin, V., Hittle, J.C. and Yen, T.J. (1999) Human BUBR1 is a mitotic checkpoint kinase that monitors CENP-E functions at kinetochores and binds the cyclosome/APC. J. Cell. Biol., 146,941-954.

24. Chan, G.K., Schaar, B.T. and Yen, T.J. (1998) Characterization of the kinetochore binding domain of CENP-E reveals interactions with the kinetochore proteins CENP-F and hBUBRl. J. Cell Biol., 143,49-63.

25. Cheeseman, I.M., Anderson, S., Jwa, M., Green, E.M., Kang, J., Yates, J.R., 3rd, Chan, C.S., Drubin, D.G. and Barnes, G. (2002) Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipllp. Cell, 111, 163-172.

26. Cheeseman, I.M., Brew, C., Wolyniak, M., Desai, A., Anderson, S., Muster, N., Yates, J.R., Huffaker, T.C., Drubin, D.G. and Barnes, G. (2001) Implication of a novel multiprotein Damlp complex in outer kinetochore function. J Cell Biol, 155, 1137-1145.

27. Cheeseman, I.M., Niessen, S., Anderson, S., Hyndman, F., Yates, J.R., III, Oegema, K. and Desai, A. (2004) A conserved protein network controls assembly of the outer kinetochore and its ability to sustain tension. Genes Dev., 18,2255-2268.

28. Chen, R.H. (2002) BubRl is essential for kinetochore localization of other spindle checkpoint proteins and its phosphorylation requires Madl. J Cell Biol, 158,487-496.

29. Cleveland, D.W., Mao, Y. and Sullivan, K.F. (2003) Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell, 112,407-421.

30. Cooke, C.A., Schaar, B., Yen, T.J. and Earnshaw, W.C. (1997) Localization of CENP-E in the fibrous corona and outer plate of mammalian kinetochores from prometaphase through anaphase. Chromosoma, 106,446-455.

31. Coue, M., Lombillo, V.A. and Mcintosh, J.R. (1991) Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J Cell Biol, 112, 1165-1175.

32. DeLuca, J.G., C.N.Newton, R.H.Himes, M.A. Jordan, L. Wilson. (2001) Purification and characterisation of natife conventional kinesin, HSET, and CENP-E from mitotic HeLa cells. J Biol Chem, 276, 28014-28021.

33. DeLuca, J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V. and Salmon, E.D. (2002) hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells. J Cell Biol, 159, 549-555.

34. DeLuca, J.G. and Salmon, E.D. (2004) kinetochores: if you build it, they will come. Curr Biol, 14, 921-923.

35. Desai, A. and Mitchison, T.J. (1997) Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol, 13, 83-117.

36. Dogterom, M., Felix, M.A., Guet, C.C. and Leibler, S. (1996) Influence of M-phase chromatin on the anisotropy of microtubule asters. J Cell Biol, 133,125-140.

37. Donaldson, A.D. and Kilmartin, J.V. (1996) Spc42p: a phosphorylated component of the S. cerevisiae spindle pole body (SPD) with an essential function during SPB duplication. J Cell Biol, 132, 887-901.

38. Dujardin, D., Wacker, U.I., Moreau, A., Schroer, T.A., Rickard, J.E. and De Mey, J.R. (1998) Evidence for a role of CLIP-170 in the establishment of metaphase chromosome alignment. J Cell Biol, 141,849-862.

39. Earnshaw, W., Bordwell, B., Marino, C. and Rothfield, N. (1986) Three human chromosomal autoantigens are recognized by sera from patients with anti-centromere antibodies. J Clin Invest, 77, 426-430.

40. Endow, S.A., Kang, S.J., Satterwhite, L.L., Rose, M.D., Skeen, V.P. and Salmon, E.D. (1994) Yeast Kar3 is a minus-end microtubule motor protein that destabilizes microtubules preferentially at the minus ends. Embo J, 13,2708-2713.

41. Fang, G., Yu, H. and Kirschner, M.W. (1998) The checkpoint protein MAD2 and the mitotic regulator CDC20 form a ternary complex with the anaphase-promoting complex to control anaphase initiation. Genes Dev, 12, 1871-1883.

42. Faulkner, N.E., Dujardin, D.L., Tai, C.Y., Vaughan, K.T., O'Connell, C.B., Wang, Y. and Vallee, R.B. (2000) A role for the lissencephaly gene LIS1 in mitosis and cytoplasmic dynein function. Nat Cell Biol, 2,784-791.

43. Fraschini, R„ Beretta, A., Lucchini, G. and Piatti, S. (2001) Role of the kinetochore protein NdclO in mitotic checkpoint activation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Genet Genomics, 266, 115-125.

44. Funabiki, H. and Murray, A.W. (2000) The Xenopus chromokinesin Xkid is essential for metaphase chromosome alignment and must be degraded to allow anaphase chromosome movement. Cell, 102,411-424.

45. Gaglio, T., Dionne, M.A. and Compton, D.A. (1997) Mitotic spindle poles are organized by structural and motor proteins in addition to centrosomes. J Cell Biol, 138,1055-1066.

46. Garcia, M.A., Koonrugsa, N. and Toda, T. (2002) Two kinesin-like Kin I family proteins in fission yeast regulate the establishment of metaphase and the onset of anaphase A. Curr Biol, 12, 610-621.

47. Garcia-Saez, I., Yen, T., Wade, R.H. and Kozielski, F. (2004) Crystal Structure of the Motor Domain of the Human Kinetochore Protein CENP-E. Journal of Molecular Biology, 340, 1107-1116.

48. Gepner, J., Li, M., Ludmann, S., Kortas, C., Boylan, K., Iyadurai, S.J., McGrail, M. and Hays, T.S. (1996) Cytoplasmic dynein function is essential in Drosophila melanogaster. Genetics, 142, 865-878.

49. Gorbsky, G.J. and Borisy, G.G. (1989) Microtubule dynamics and the movement of chromosomes. Prog Clin Biol Res, 318,159-169.

50. Gorbsky, G.J. and Ricketts, W.A. (1993) Differential expression of a phosphoepitope at the kinetochores of moving chromosomes. J Cell Biol, 122,1311-1321.

51. Gorbsky, G.J., Sammak, P.J. and Borisy, G.G. (1988) Microtubule dynamics and chromosome motion visualized in living anaphase cells. J Cell Biol, 106, 1185-1192.

52. Gordon, M.B., Howard, L. and Compton, D.A. (2001) Chromosome movement in mitosis requires microtubule anchorage at spindle poles. J Cell Biol, 152,425-434.

53. Goshima, G. and Yanagida, M. (2000) Establishing biorientation occurs with precocious separation of the sister kinetochores, but not the arms, in the early spindle of budding yeast. Cell, 100, 619-633.

54. Guacci, V., Hogan, E. and Koshland, D. (1997a) Centromere position in budding yeast: evidence for anaphase A. Mol Biol Cell, 8,957-972.

55. Guacci, V., Koshland, D. and Strunnikov, A. (1997b) A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of MCD1 in S. cerevisiae. Cell, 91,47-57.

56. Gunawardane, R.N., Lizarraga, S.B., Wiese, C., Wilde, A. and Zheng, Y. (2000) gamma-Tubulin complexes and their role in microtubule nucleation. Curr Top Dev Biol, 49,55-73.

57. Hannak, E., Kirkham, M., Hyman, A.A. and Oegema, K. (2001) Aurora-A kinase is required for centrosome maturation in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol, 155,1109-1116.

58. Harper, J.W., Burton, J.L. and Solomon, M.J. (2002) The anaphase-promoting complex: it's not just for mitosis any more. Genes Dev, 16, 2179-2206.

59. Heald, R., Tournebize, R., Habermann, A., Karsenti, E. and Hyman, A. (1997) Spindle assembly in Xenopus egg extracts: respective roles of centrosomes and microtubule self-organization. J Cell Biol, 138,615-628.

60. Hill, T.L. (1985) Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc Natl Acad Sci USA, 82,4404-4408.

61. Hiramoto, Y. and Nakano, Y. (1988) Micromanipulation studies of the mitotic apparatus in sand dollar eggs. CellMotil Cytoskeleton, 10,172-184.

62. Hoffman, D.B., Pearson, C.G., Yen, T.J., Howell, B.J. and Salmon, E.D. (2001) Microtubule-dependent Changes in Assembly of Microtubule Motor Proteins and Mitotic Spindle Checkpoint Proteins at PtKl Kinetochores. Mol. Biol Cell, 12,1995-2009.

63. Hofmann, C., Cheeseman, I.M., Goode, B.L., McDonald, K.L., Barnes, G. and Drubin, D.G. (1998) Saccharomyces cerevisiae Duolp and Damlp, novel proteins involved in mitotic spindle function. J Cell Biol, 143,1029-1040.

64. Holy, T.E. and Leibler, S. (1994) Dynamic instability of microtubules as an efficient way to search in space. Proc Natl Acad Sci USA, 91,5682-5685.

65. Hori, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., Kimura, H. and Fukagawa, T. (2003) Dynamic behavior of Nuf2-Hecl complex that localizes to the centrosome and centromere and is essential for mitotic progression in vertebrate cells. J Cell Sci, 116, 3347-3362.

66. Howell, B.J., Hoffman, D.B., Fang, G., Murray, A.W. and Salmon, E.D. (2000) Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J Cell Biol, 150,1233-1250.

67. Hoyt, M.A. (2001) A new view of the spindle checkpoint. J Cell Biol, 154,909-911.

68. Hoyt, M.A., Totis, L. and Roberts, B.T. (1991) S. cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function. Cell, 66,507-517.

69. Hunt, A.J. and Mcintosh, J.R. (1998) The dynamic behavior of individual microtubules associated with chromosomes in vitro. Mol Biol Cell, 9,2857-2871.

70. Hyman, A.A. and Sorger, P.K. (1995) Structure and function of kinetochores in budding yeast. Annu Rev Cell Dev Biol, 11,471-495.

71. Joglekar, A.P. and Hunt, A.J. (2002) A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys J,83,42-58.

72. Jones, M.H., Bachant, J.B., Castillo, A.R., Giddings, T.H., Jr. and Winey, M. (1999) Yeast Damlp is required to maintain spindle integrity during mitosis and interacts with the Mpslp kinase. Mol Biol Cell, 10,2377-2391.

73. Kang, J., Cheeseman, I.M., Kallstrom, G., Velmurugan, S., Barnes, G. and Chan, C.S. (2001) Functional cooperation of Daml, Ipll, and the inner centromere protein (INCENP)-related protein Slil5 during chromosome segregation. J Cell Biol, 155,763-774.

74. Kaplan, K.B., Burds, A.A., Swedlow, J.R., Bekir, S.S., Sorger, P.K. and Nathke, I.S. (2001) A role for the Adenomatous Polyposis Coli protein in chromosome segregation. Nat Cell Biol, 3, 429-432.

75. Khodjakov, A., Copenagle, L., Gordon, M.B., Compton, D.A. and Kapoor, T.M. (2003) Minus-end capture of preformed kinetochore fibers contributes to spindle morphogenesis. J. Cell Biol, 160,671-683.

76. Khodjakov, A. and Rieder, C.L. (1996) Kinetochores moving away from their associated pole do not exert a significant pushing force on the chromosome. J Cell Biol, 135, 315-327.

77. Khodjakov, A. and Rieder, C.L. (1999) The sudden recruitment of gamma-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules. J Cell Biol, 146,585-596.

78. Khodjakov, A. and Rieder, C.L. (2001) Centrosomes enhance the fidelity of cytokinesis in vertebrates and are required for cell cycle progression. J Cell Biol, 153,237-242.

79. King, J.M., Hays, T.S. and Nicklas, R.B. (2000a) Dynein is a transient kinetochore component whose binding is regulated by microtubule attachment, not tension. J Cell Biol, 151, 739748.

80. King, J.M., Hays, T.S. and Nicklas, R.B. (2000b) Dynein Is a Transient Kinetochore Component Whose Binding Is Regulated by Microtubule Attachment, Not Tension. J. Cell Biol., 151, 739-748.

81. King, J.M. and Nicklas, R.B. (2000) Tension on chromosomes increases the number of kinetochore microtubules but only within limits. J Cell Sci, 113 Pt 21, 3815-3823.

82. Maddox, P.S., Bloom, K.S. and Salmon, E.D. (2000) The polarity and dynamics of microtubule assembly in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Cell Biol, 2,36-41.

83. Maiato, H., A, F.E., Rieder, C.L., Swedlow, J.R. and Earnshaw, W. (2003) Human CLASP 1 is an outer kinetochore component that regulates spindle microtubule dynamics. Cell, 167, 831840.

84. Maiato, H„ DeLuca, J., Salmon, E.D. and Earnshaw, W.C. (2004) The dynamic kinetochore-microtubule interface. J Cell Sci, 117, 5461-5477.

85. Maney, T., Ginkel, L.M., Hunter, A.W. and Wordeman, L. (2000) The kinetochore of higher eucaryotes: a molecular view. Int Rev Cytol, 194, 67-131.

86. Maney, T„ Hunter, A.W., Wagenbach, M. and Wordeman, L. (1998) Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol, 142,787-801.

87. Maney, T., Wagenbach, M. and Wordeman, L. (2001) Molecular dissection of the microtubule depolymerizing activity of mitotic centromere-associated kinesin. J Biol Chem, 276, 3475334758.

88. Mao, Y., Abrieu, A. and Cleveland, D.W. (2003a) Activating and silencing the mitotic checkpoint through CENP-E-dependent activation/inactivation of BubRl. Cell, 114, 87-98.

89. Mao, Y., Abrieu, A. and Cleveland, D.W. (2003b) Activating and silencing the Mitotic checkpoint through CENP-E-dependent activation/inactivation of hBUBRl. Cell, 114, 87-98.

90. Martin-Lluesma, S., Stucke, V.M. and Nigg, E.A. (2002) Role of heel in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of madl/mad2. Science, 297, 2267-2270.

91. McEwen, B.F., Heagle, A.B., Cassels, G.O., Buttle, K.F. and Rieder, C.L. (1997) Kinetochore fiber maturation in PtKl cells and its implications for the mechanisms of chromosome congression and anaphase onset. J Cell Biol, 137,1567-1580.

92. Mcintosh, J.R. and Pfarr, C.M. (1991) Mitotic motors. J Cell Biol, 115,577-585.

93. Millband, D.N. and Hardwick, K.G. (2002) Fission yeast Mad3p is required for Mad2p to inhibit the anaphase-promoting complex and localizes to kinetochores in a Bublp-, Bub3p-, and Mphlp-dependent manner. Mol Cell Biol, 22,2728-2742.

94. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N. and Tsukita, S. (2000) The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol, 10, 865-868.

95. Mitchison, T.J. (1989) Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J Cell Biol, 109,637-652.

96. Mitchison, T.J. and Krischner M, W. (1985) Properties of the kinetochores in vitro.I. Mictotuble nucleation and tubulin binding. J Cell Biol, 101,755-765.

97. Mitchison, T.J. and Salmon, E.D. (1992) Poleward kinetochore fiber movement occurs during both metaphase and anaphase-A in newt lung cell mitosis. J Cell Biol, 119,569-582.

98. Molina, I., Baars,-S., Brill, J.A., Hales, K.G., Fuller, M.T. and Ripoll, P. (1997) A chromatin-associated kinesin-related protein required for normal mitotic chromosome segregation in Drosophila .J Cell Biol, 139, 1361-1371.

99. Moore, J.D. (2001) The Ran-GTPase and cell-cycle control. Bioessays, 23,77-85.

100. Moores, C.A., Yu, M., Guo, J., Beraud, C., Sakowicz, R. and Milligan, R.A. (2002) A mechanism for microtubule depolymerization by KinI kinesins. Mol Cell, 9,903-909.

101. Nasmyth, K., Peters, J.M. and Uhlmann, F. (2000) Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science, 288, 1379-1385.

102. Nicklas, R.B. (1997) How cells get the right chromosomes. Science, 275, 632-637.

103. Nicklas, R.B. and Arana, P. (1992) Evolution and the meaning of metaphase. J Cell Sci, 102 ( Pt 4), 681-690.

104. Nicklas, R.B., Ward, S.C. and Gorbsky, G.J. (1995) Kinetochore chemistry is sensitive to tension and may link mitotic forces to a cell cycle checkpoint. J Cell Biol, 130,929-939.

105. Nicklas, R.B., Waters, J.C., Salmon, E.D. and Ward, S.C. (2001) Checkpoint signals in grasshopper meiosis are sensitive to microtubule attachment, but tension is still essential. J Cell Sci, 114, 4173-4183.

106. Oakley, B.R. (2000) gamma-Tubulin. Curr Top Dev Biol, 49,27-54.

107. Ohkura, H., Garcia, M.A. and Toda, T. (2001) Disl/TOG universal microtubule adaptors one MAP for all? J Cell Sci, 114,3805-3812.

108. Perez, F., Diamantopoulos, G.S., Stalder, R. and Kreis, T.E. (1999) CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell, 96,517-527.

109. Peters, J.M. (2002) The anaphase-promoting complex: proteolysis in mitosis and beyond. Mol Cell, 9,931-943.

110. Pluta, A.F., Mackay, A.M., Ainsztein, A.M., Goldberg, I.G. and Earnshaw, W.C. (1995) The centromere: hub of chromosomal activities. Science, 270,1591-1594.

111. Putkey, F.R., Cramer, T., Morphew, M.K., Silk, A.D., Johnson, R.S., Mcintosh, J.R. and Cleveland, D.W. (2002) Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Dev Cell, 3, 351-365.

112. Rieder, C.L. and Salmon, E.D. (1998) The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol, 8,310-318.

113. Rodionov, V. (Родионов В.И.), Nadezhdina, E (Надеждина E.C.). and Borisy, G. (1999) Centrosomal control of microtubule dynamics. PNAS, 96,115-120.

114. Salic, A., Waters, J.C. and Mitchison, T.J. (2004) Vertabrate shugoshin links sister centromere cohesion for chromosome alignment. Cell, 118, 567-578.

115. Salinà, D., Enarson, P., Rattner, J.B. and Burke, B. (2003) Nup358 integrates nuclear envelope breakdown with kinetochore assembly. J Cell Biol, 162, 991-1001.

116. Salmon, E.D., McKeel, M. and Hays, T. (1984) Rapid rate of tubulin dissociation from microtubules in the mitotic spindle in vivo measured by blocking polymerization with colchicine. J Cell Biol, 99,1066-1075.

117. Savoian, M.S., Goldberg, M.L. and Rieder, C.L. (2000) The rate of poleward chromosome motion is attenuated in Drosophila zwlO and rod mutants. Nat Cell Biol, 2, 948-952.

118. Sawin, K.E. and Mitchison, T.J. (1994) Microtubule flux in mitosis is independent of chromosomes, centrosomes, and antiparallel microtubules. Mol Biol Cell, 5,217-226.

119. Saxton, W.M., Stemple, D.L., Leslie, R.J., Salmon, E.D., Zavortink, M. and Mcintosh, J.R. (1984) Tubulin dynamics in cultured mammalian cells. J Cell Biol, 99, 2175-2186.

120. Scaerou, F., Aguilera, I., Saunders, R., Kane, N., Blottiere, L. and Karess, R. (1999) The rough deal protein is a new kinetochore component required for accurate chromosome segregation in Drosophila. J. Cell Sci., 112,3757-3768.

121. Schaar, B.T., Chan, G.K.T., Maddox, P., Salmon, E.D. and Yen, T.J. (1997) CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. J. Cell Biol., 139,1373-1382.

122. Schiebel, E. (2000) gamma-tubulin complexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation, CurrOpin Cell Biol, 12,113-118.

123. Shang, C., Hazbun, T.R., Cheeseman, I.M., Aranda, J., Fields, S., Drubin, D.G. and Barnes, G. (2003) Kinetochore protein interactions and their regulation by the Aurora kinase Ipllp. Mol Biol Cell, 14,3342-3355.

124. Sharp, D.J., Rogers, G.C. and Scholey, J.M. (2000) Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol, 2, 922-930.

125. Shelden, E. and Wadsworth, P. (1992) Microinjection of biotin-tubulin into anaphase cells induces transient elongation of kinetochore microtubules and reversal of chromosome-to-pole motion. J Cell Biol, 116,1409-1420.

126. Skibbens, R.V. and Salmon, E.D. (1997) Micromanipulation of chromosomes in mitotic vertebrate tissue cells: tension controls the state of kinetochore movement. Exp Cell Res, 235,314-324.

127. Skibbens, R.V., Skeen, V.P. and Salmon, E.D. (1993) Directional instability of kinetochore motility during chromosome congression and segregation in mitotic newt lung cells: a push-pull mechanism. J Cell Biol, 122, 859-875.

128. Skoufias, D.A., Andreassen, P.R., Lacroix, F.B., Wilson, L. and Margolis, R.L. (2001) Mammalian mad2 and bubl/bubRl recognize distinct spindle-attachment and kinetochore-tension checkpoints. Proc Natl Acad Sci USA, 98,4492-4497.

129. Starr, D.A., Williams, B.C., Hays, T.S. and Goldberg, M.L. (1998) ZW10 helps recruit dynactin and dynein to the kinetochore. J. Cell Biol., 142,763-774.

130. Sudakin, V., Chan, G.K. and Yen, T.J. (2001) Checkpoint inhibition of the APC/C in HeLa cells is mediated by a complex of BUBR1, BUB3, CDC20, and MAD2. J Cell Biol, 154,925-936.

131. Tang, Z., Bharadwaj, R., Li, B. and Yu, H. (2001) Mad2-lndependent inhibition of APCCdc20 by the mitotic checkpoint protein BubRl. Dev Cell, 1,227-237.

132. Tanudji, M., Shoemaker, J., L'ltalien, L., Russell, L., Chin, G. and Schebye, X.M. (2004) Gene Silencing of CENP-E by Small Interfering RNA in HeLa Cells Leads to Missegregation of Chromosomes after a Mitotic Delay. Mol. Biol. Cell, 15, 3771-3781.

133. Thorower, D.A., M.A. Jordan, B.T. Scharr, T.J. Yen and Wilson, L. (1995) Mitotic HeLa cells contain a CENP-E-associated minus-end directed mivrotuble motor. Embo J, 14,918-926.

134. Tippit, D.H., Pickett-Heaps, J.D. and Leslie, R. (1980) Cell division in two large pennate diatoms Hantzschia and Nitzschia HI. A new proposal for kinetochore function during prometaphase. J Cell Biol, 86,402-416.

135. Verde, F., Berrez, J.M., Antony, C. and Karsenti, E. (1991) Taxol-induced microtubule asters in mitotic extracts of Xenopus eggs: requirement for phosphorylated factors and cytoplasmic dynein. J Cell Biol, 112, 1177-1187.

136. Wang, S.Z. and Adler, R. (1995) Chromokinesin: a DNA-binding, kinesin-like nuclear protein. J Cell Biol, 128,761-768.

137. Waterman-Storer, C.M. and Salmon, E.D. (1998) How microtubules get fluorescent speckles. BiophysJ, 75,2059-2069.

138. Waters, J.C., Chen, R.H., Murray, A.W. and Salmon, E.D. (1998) Localization of Mad2 to kinetochores depends on microtubule attachment, not tension. J Cell Biol, 141,1181-1191.

139. Waters, J.C., Mitchison, T.J., Rieder, C.L. and Salmon, E.D. (1996) The kinetochore microtubule minus-end disassembly associated with poleward flux produces a force that can do work. Mol Biol Cell, 7,1547-1558.

140. Weiss, E. and Winey, M. (1996) The Saccharomyces cerevisiae spindle pole body duplication gene MPS1 is part of a mitotic checkpoint. J. Cell Biol, 132, 111-123.

141. West, R.R., Malmstrom, T. and Mcintosh, J.R. (2002) Kinesins klp5(+) and klp6(+) are required for normal chromosome movement in mitosis. J Cell Sci, 115, 931-940.

142. West, R.R., Malmstrom, T., Troxell, C.L. and Mcintosh, J.R. (2001) Two related kinesins, klp5+ and klp6+, foster microtubule disassembly and are required for meiosis in fission yeast. Mol Biol Cell, 12, 3919-3932.

143. Westermann, S., Cheeseman, I.M., Anderson, S., Yates, J.R., III, Drubin, D.G. and Barnes, G. (2003) Architecture of the budding yeast kinetochore reveals a conserved molecular core. J. Cell Biol., 163,215-222.

144. Wigge, P.A. and Kilmartin, J.V. (2001a) The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation. J Cell Biol, 152, 349-360.

145. Wigge, P.A. and Kilmartin, J.V. (2001b) The Ndc80p Complex from Saccharomyces cerevisiae Contains Conserved Centromere Components and Has a Function in Chromosome Segregation. J. Cell Biol., 152, 349-360.

146. Wise, D., Cassimeris, L., Rieder, C.L., Wadsworth, P. and Salmon, E.D. (1991) Chromosome fiber dynamics and congression oscillations in metaphase PtK2 cells at 23 degrees C. Cell Motil Cytoskeleton, 18,131-142.

147. Wittmann, Т., Hyman, A. and Desai, A. (2001) The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors. Nat Cell Biol, 3, E28-34.

148. Wojcik, E., Basto, R., Serr, M., Scaerou, F., Karess, R. and Hays, T. (2001) Kinetochore dynein: its dynamics and role in the transport of the Rough deal checkpoint protein. Nat Cell Biol, 3, 1001-1007.

149. Wood, K.W., Sakowicz, R., Goldstein, L.S. and Cleveland, D.W. (1997) CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell, 91, 357366.

150. Wordeman, L. and Mitchison, T.J. (1995) Identification and partial characterization of mitotic centromere-associated kinesin, a kinesin-related protein that associates with centromeres during mitosis. J Cell Biol, 128,95-104.

151. Wordeman, L., Steuer, E.R., Sheetz, M.P. and Mitchison, T. (1991) Chemical subdomains within the kinetochore domain of isolated CHO mitotic chromosomes. J Cell Biol, 114,285-294.

152. Wu, H., Lan, Z., Li, W., Wu, S., Weinstein, J., Sakamoto, K.M. and Dai, W. (2000) p55CDC/hCDC20 is associated with BUBR1 and may be a downstream target of the spindle checkpoint kinase. Oncogene, 19,4557-4562.

153. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y„ Sullivan, K.F. and Cleveland, D.W. (2000) CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nat Cell Biol, 2,484-491.

154. Yao, X., Anderson, K.L. and Cleveland, D.W. (1997) The microtubule-dependent motor centromere-associated protein E (CENP-E) is an integral component of kinetochore corona fibers that link centromeres to spindle microtubules. J Cell Biol, 139,435-447.

155. Yeh, E., Skibbens, R.V., Cheng, J.W., Salmon, E.D. and Bloom, K. (1995) Spindle dynamics and cell cycle regulation of dynein in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 130, 687-700.

156. Yen, T.J., Compton, D.A., Wise, D., Zinkowski, R.P., Brinkley, B.R., Earnshaw, W.C. and Cleveland, D.W. (1991) CENP-E, a novel human centromere-associated protein required for progression from metaphase to anaphase. EmboJ, 10, 1245-1254.

157. Yucel, J.K., Marszalek, J.D., Mcintosh, J.R., Goldstein, L.S., Cleveland, D.W. and Philp, A.V. (2000) CENP-meta, an essential kinetochore kinesin required for the maintenance of metaphase chromosome alignment in Drosophila. J Cell Biol, 150, 1-11.

158. Zecevic, M., Catling, A.D., Eblen, S.T., Renzi, L., Hittle, J.C., Yen, T.J., Gorbsky, G.J. and Weber, M.J. (1998) Active MAP kinase in mitosis: localization at kinetochores and association with the motor protein CENP-E. J Cell Biol, 142, 1547-1558.

159. Zheng, L., Chen, Y. and Lee, W.-H. (1999) Heclp, an Evolutionarily Conserved Coiled-Coil Protein, Modulates Chromosome Segregation through Interaction with SMC Proteins. Mol. Cell. Biol., 19,5417-5428.

160. Zhou, J., Panda, D., Landen, J.W., Wilson, L. and Joshi, H.C. (2002) Minor alteration of microtubule dynamics causes loss of tension across kinetochore pairs and activates the spindle checkpoint. J Biol Chem, 277, 17200-17208.