Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Гудимчук, Никита Борисович

• Гудимчук, Никита Борисович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Гудимчук, Никита Борисович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о клеточном делении

1.1.1. Фазы митоза и общий план строения митотического аппарата

1.1.2. Микротрубочки

1.1.3. Кинетохоры

1.1.4. Проблема сопряжения кинетохора с динамическими микротрубочками

1.1.5. Моторные белки

1.1.6. Микротрубочки как генераторы сил

1.1.7. Развитие сил и перемещение хромосом во время митоза

1.2. Кинетохорный мотор CENP-E

1.2.1. Локализация и клеточные функции

1.2.2. Исследования CENP-E in vitro

1.2.3. Открытые вопросы

1.3. Методики исследования индивидуальных молекул in vitro

1.3.1. Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF)

1.3.2. Лазерные ловушки

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Очистка белков

2.1.1. Тубулин

2.1.2. Daml и фибриллярные подвески

2.1.3. Полноразмерный белок CENP-E и его фрагменты

2.2. Измерение сил, развиваемых микротрубочкой

2.2.1. Измерение сил при латеральном закреплении без Daml комплекса

2.2.2. Измерение сил при латеральном закреплении с помощью Daml кольца

2.2.3. Измерение сил при торцевом закреплении с помощью Daml кольца

2.3. TIRF микроскопия CENP-E на стабильных микротрубочках

2.3.1. Приготовление стабилизированных микротрубочек

2.3.2. Приготовление простых проточных камер

2.3.3. Иммобилизация стабилизированных микротрубочек на покровном стекле

2.3.4. Одноцветная TERF микроскопия на стабильных микротрубочках

2.3.5. Анализ движения белков CENP-E вдоль стабильных микротрубочек

2.4. TIRF микроскопия CENP-E на динамических микротрубочках

2.4.1. Приготовление затравок для роста динамических микротрубочек

2.4.2. Приготовление герметичных проточных камер

2.4.3. Иммобилизация затравок микротрубочек на покровном стекле

2.4.4. Двуцветная TIRF микроскопия на динамических микротрубочках

2.4.5. Ингибирование моторной активности CENP-E

2.4.6. Эксперименты с фрагментами CENP-E на квантовых точках

2.4.7. Анализ движения белков CENP-E на динамических микротрубочках

2.5. Измерение аффинности белков CENP-E к полимерам тубулина

2.5.1. Приготовление имитаторов концов микротрубочек

2.5.2. Измерение связывания CENP-E с имитаторами концов микротрубочек

2.6. Измерение характеристик CENP-E с помощью лазерной ловушки

2.6.1 Лазерно-микроскопная установка

2.6.2. Приготовление микросфер, покрытых белками CENP-E

2.6.3. Наблюдение транспорта микросфер белками CENP-E

2.6.4. Проведение эксперимента в режиме постоянной силы (Force Clamp)

2.6.5. Вольт-нанометровая калибровка квадрантного фотодетектора

2.6.6. Калибровка жесткости оптической ловушки

2.7. Эксперимент с сегментными микротрубочками

2.7.1. Иммобилизация аксонем микротрубочек на покровном стекле

2.7.2. Приготовление сегментных микротрубочек

2.7.3. Проведение эксперимента с сегментными микротрубочками

2.7.4. Анализ положения микросфер на микротрубочках

2.8. Компьютерное моделирование

2.8.1. Алгоритм расчетов движения CENP-E по микротрубочке

2.8.2. Определение параметров модели и калибровка

2.8.3. Проведение расчетов

2.8.4. Визуализация расчетов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Механика сопряжения грузов с разборкой микротрубочек белковым комплексом Daml

3.1.1. Сопрягающие свойства Daml кольца при латеральном закреплении

3.1.2. Сопрягающие свойства Daml кольца при торцевом закреплении

3.2. Взаимодействие между белком CENP-E и стенкой микротрубочки

3.2.1. Характеристики свободно движущихся белков CENP-E

3.2.2. Характеристики белков CENP-E, транспортирующих микросферы

3.2.3. Влияние внешней силы на движение белков CENP-E

3.3. Следование за динамическими концами микротрубочек

3.4. Необходимые и достаточные условия следования за динамическими концами микротрубочек белком СЕ№-Е

3.4.1. Аффинности БЬ СЕОТ-Е к динамическим концам микротрубочек

3.4.2. Взаимодействие 1Ч-концевого фрагмента СЕЫР-Е с динамическими концами микротрубочекбб

3.4.3. Характеризация С-концевого сайта связывания для микротрубочек

3.4.4. Взаимодействие С-концевого фрагмента СЕКР-Е с динамическими микротрубочками

3.4.5. Воссоздание активности БЬ СБОТ-Е путем объединения К- и С-концевых фрагментов СЕМ*-Е

3.5. Математическая модель CENP-E и динамической микротрубочки

3.5.1. Описание модели

3.5.3. Сопоставление экспериментальных наблюдений с предсказаниями модели

3.6. Сопряжение белком СЕ№-Е движения искусственных грузов с разборкой микротрубочки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек»

ВВЕДЕНИЕ

Митотическое деление клеток (или митоз) - это важнейший процесс, который обеспечивает рост и регенерацию тканей многоклеточных организмов. При делении из каждой материнской клетки создаются две ее дочерние копии. Полная информация об устройстве клетки и о том, как построить новые клетки, записана в виде последовательности клеточной ДНК. Поэтому критически важно, чтобы каждая дочерняя клетка унаследовала точную копию ДНК матери. Для этого митозу предшествует удвоение материнской ДНК. Основная задача митоза - точно распределить удвоенную ДНК между образующимися дочерними клетками. Чтобы манипулировать чрезвычайно длинными цепями ДНК, клетка плотно упаковывает их в специальные червеобразные структуры, называемые хромосомами. Распределение хромосом по дочерним клеткам достигается в результате сложной последовательности перемещений, осуществляемых посредством митотического аппарата, который состоит главным образом из микротрубочек и кинетохоров. Микротрубочки представляют собой линейные полимеры белка тубулина, организованные в структуру, напоминающую веретено. Они динамически нестабильны: удлиняются и укорачиваются, развивая при этом толкающие и тянущие силы, соответственно. Кинетохоры - белковые суперкомплексы на хромосомах, которые помогают осуществлять закрепление хромосом за динамические концы микротрубочек и использовать силы, развиваемые микротрубочками, для перемещения хромосом. Механизмы сопряжения кинетохорами динамики микротрубочек и движений хромосом, однако, остаются плохо изученными.

В дрожжевых клетках сопряжение движения хромосомы с динамикой конца микротрубочки происходит посредством Оат1 комплекса, образующего кольцо вокруг микротрубочки. Теоретически предсказано, что Баш1 комплекс является эффективным устройством для передачи силы от микротрубочки к сопряженному с ней микрогрузу. Эти предсказания, однако, все еще ожидают экспериментальной проверки.

В животных клетках гомологи Оаш1 отсутствуют, а структурные данные указывают на то, что сопряжение между хромосомой и концом микротрубочки может осуществляться неизвестными длинными фибриллярными компонентами. Кандидатом на роль такого сопрягающего устройства является один из наиболее длинных фибриллярных белков кинетохора - кинезин СЕЫР-Е. Удаление его из клетки ведет к 50% уменьшению числа связанных с кинетохором хромосом. Кроме того, как и многие другие кинезины, СЕОТ-Е может транспортировать хромосомы вдоль микротрубочек, совершая механическую работу за счет энергии гидролиза АТФ. По причине чрезвычайно большого размера белка СЕ№-Е (более 300 кДа), осложняющего его очистку и исследование, на настоящий момент в литературе были предприняты лишь попытки характеризации небольшого 1Ч-концевого фрагмента СЕЫР-Е.

Экспериментальные данные о поведении индивидуальных молекул полноразмерного белка CENP-E полностью отсутствуют.

Актуальность изучения фундаментального вопроса сопряжения динамики микротрубочек с движением хромосом обусловлена последними достижениями молекулярной и структурной биологии. Эти исследования позволили впервые за более чем 100 лет изучения митоза, установить конкретные белковые кандидатуры на роль сопрягающих устройств между хромосомами и микротрубочками в клетках дрожжей и животных. Эти потенциальные сопрягающие устройства (белки комплекса Daml и полноразмерный белок CENP-E), были впервые экспрессированы рекомбинантно и очищены для работы in vitro, что позволяет осуществить прямое экспериментальное исследование их свойств. С другой стороны, за последние 10 лет в различных лабораториях, включая лабораторию профессора Ф.И.Атауллаханова, были разработаны уникальные биофизические методы исследования свойств моторных белков и взаимодействия кинетохорных белков с динамическими концами микротрубочек in vitro. Применение этих методов к изучению очищенного полноразмерного белка CENP-E и белкового комплекса Daml сегодня дает беспрецедентную возможность исследовать их взаимодействие с динамическими микротрубочками и таким образом лучше понять механизмы их работы в клетке.

Цель работы: исследование взаимодействия кинетохорного белка CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек.

Задачи исследования:

1. Измерить максимальную силу, которую микротрубочка может развивать через сопрягающее устройство в виде Daml комплекса.

2. Охарактеризовать движение индивидуальных молекул полноразмерного белка CENP-E и его фрагментов вдоль микротрубочек in vitro. Определить зависимость моторных характеристик белка CENP-E от приложенной внешней силы.

3. Экспериментально исследовать взаимодействие индивидуальных молекул белка CENP-E с динамическими концами микротрубочек in vitro. Определить роль различных доменов белка CENP-E в этом взаимодействии.

4. Построить математическую модель взаимодействия белка CENP-E с динамическими концами микротрубочек. Сформулировать представления о механизме работы CENP-E как плюс-концевого белка (т.е. белка способного следовать за плюс-концами микротрубочек).

Научная новизна

В данной работе была впервые измерена сила, которую может развивать деполимеризующаяся микротрубочка с помощью дрожжевого белкового комплекса Оат1. Показано, что геометрия закрепления микрогруза за конец микротрубочки критически важна для эффективности передачи силы. Кроме того, в данной работе были впервые изучены характеристики движения полноразмерной молекулы СЕЫР-Е по микротрубочкам. Показано, что наличие немоторных доменов СЕЫР-Е не влияет на его движение по стенке микротрубочки в широком диапазоне приложенных внешних сил. Впервые продемонстрирована способность белка СЕ№-Е следовать за динамическими концами микротрубочек и сопрягать динамику микротрубочек с движением микрогрузов. Обнаружено, что для данной активности достаточно одного димера полноразмерной молекулы СЕЫР-Е. Впервые охарактеризовано на одномолекулярном уровне поведение хвостового домена белка СЕИР-Е на микротрубочке. Данный белковый фрагмент обладает необычно большим коэффициентом диффузии на стенке микротрубочки при относительно большом времени жизни: 0.5 с. Показано, что ни моторный домен, ни хвостовой домен не способны автономно следовать за динамическими концами микротрубочек, в то время как их комбинация необходима и достаточна для данной активности. На основе экспериментальных данных предложен механизм работы СЕИР-Е как плюс-концевого белка и разработана компьютерная модель, количественно подтверждающая эти представления. Данная модель является первой количественной попыткой объяснить способность моторных белков следовать за концами динамических микротрубочек, и может быть распространена и на моторные белки из других семейств, например, семейство кинезинов-8.

Научно-практическая значимость

Данное исследование вносит вклад в изучение фундаментальной проблемы организации взаимодействия хромосом и митотического аппарата клетки. В частности, эксперименнтально обосновывается возможность развития большой силы микротрубочкой с помощью кольцевого Оаш1 комплекса и формулируются представления о роли и конкретном молекулярном механизме работы белка СЕОТ-Е как стабилизатора взаимодействия между микротрубочками и хромосомами на различных стадиях митоза.

Изучение принципов работы клеточного деления в целом и кинетохорного мотора СЕИР-Е в частности может также привести к созданию новых анти-раковых препаратов. Ингибиторы моторной активности СЕЫР-Е уже прошли клинические испытания, и возможно, в

скором времени будут применяться как антираковые агенты. Данное исследование проливает свет на механизм действия уже существующих ингибиторов в клетках и расширяет список возможных мишеней для новых ингибиторов, указывая на важность С-концевого домена CENP-Е.

Методология и методы исследования

Для исследования взаимодействия белкового комплекса Daml и кинетохорного кинезина CENP-E с микротрубочками применялись методы флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), биохимические протоколы и лазерные ловушки. Часть методик, использованных в работе, являются полностью оригинальными, и были разработаны автором в ходе выполнения диссертационной работы специально для исследования взаимодействия кинетохорных белков и разбирающихся микротрубочек.

Положения, выносимые на защиту:

1. Измерена сила, развиваемая деполимеризующейся микротрубочкой при ее сопряжении с микрогрузом с помощью белкового комплекса Daml.

2. Измерены моторные характеристики N-концевого фрагмента CENP-E, содержащего моторный домен, и полноразмерной молекулы CENP-E в диапазоне внешних сил от -6 пН до 6 пН.

3. Обнаружена способность полноразмерной молекулы CENP-E следовать за динамическими концами микротрубочек. Продемонстрирована способность полноразмерных молекул CENP-E сопрягать разборку микротрубочек с движением искусственных микрогрузов, имитирующих хромосомы.

4. На уровне отдельных молекул исследовано взаимодействие С-концевого фрагмента CENP-E с микротрубочками.

5. Построена математическая модель взаимодействия CENP-E с динамическими концами микротрубочек. Предложен и подтвержден компьютерными расчетами и экспериментами принципиально новый механизм следования за динамическими концами микротрубочек.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

По теме диссертационной работы было опубликовано три статьи и тезисы в сборниках шести конференций:

1. Gudimchuk, N. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Kiyatkin, A; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Nature Cell Biology. -2013. -V. 15. -Issue 9. -P. 1079-1088.

2. Gudimchuk, N. Long tethers provide high-force coupling of the Daml ring to shortening microtubules / Volkov, VA; Zaytsev, AV; Gudimchuk, N; Grissom, PM; Gintsburg, AL; Ataullakhanov, FI; Mcintosh, JR; Grishchuk, EL // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2013. -V. 110. -Issue 19.-P. 7708-7713.

3. Gudimchuk, N. The Daml ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion / Grishchuk, EL; Efremov, A; Volkov, VA; Spiridonov, IS; Gudimchuk, N; Westermann, S; Drubin, D; Barnes, G; Mcintosh, JR; Ataullakhanov FI // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2008. -V. 105. -Issue 40. -P. 15423-15428.

4. Gudimchuk, N. Kinesin-like protein CENP-E adopts a folded conformation while exhibiting high motor activity / Gudimchuk, N; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Molecular Biology of the Cell. -2010. -V.21. -Abstract 1939.

5. Gudimchuk, N. Coiled-Coil Stalk of Active Kinesin-Like Protein CENP-E is Stably Folded / Gudimchuk, N; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Biophysical Journal. -2011. - V. 100. -Issue 3. -Abstract 123.

6. Gudimchuk, N. Mitotic Kinesin CENP-E is a Robust Tracker of Dynamic Microtubule ends / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Biophysical Journal. -2012. - V. 102. - Abstract 703.

7. Gudimchuk, N. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive tracker of dynamic microtubule tips / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Molecular Biology of the Cell. -2012. -V.23 (suppl). -Abstract 210.

8. Gudimchuk, N. A tethered Daml ring suffices for a minimal force-bearing unit of a kinetochore / Volkov, VA; Zaytsev, AV; Gudimchuk, N; Grissom, PM; Ataullakhanov, FI; Mcintosh, JR; Grishchuk, EL // Molecular Biology of the Cell. -2012. -V.23 (suppl). -Abstract 1954.

9. Gudimchuk, N. Kinetochore Kinesin CENP-E Tracks the Tips of Dynamic Microtubules via the "Tethered Motor" Mechanism / Gudimchuk, N; Vitre, B; Kim, Y; Cleveland, DW; Ataullakhanov, FI; Grishchuk, EL // Biophysical Journal. -2012. - V. 104. - Abstract 326.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о клеточном делении

1.1.1. Фазы митоза и общий план строения митотического аппарата

Жизненный цикл типичной клетки млекопитающих состоит из фазы деления (т.н. М-фазы) и интерфазы, в течение которой клетка подготавливается к делению. В процессе подготовки к делению клетка должна удвоить свой генетический материал, основные клеточные структуры и белки. В фазе деления клетка распределяет удвоенный генетический материал и цитоплазму между дочерними клетками. Интерфаза млекопитающих длится около суток, а фаза деления значительно короче и протекает всего за один час [1].

М-фаза подразделяется еще на пять фаз: профазу, прометафазу, метафазу, анафазу и телофазу (рис.1). В профазе удвоенные хромосомы, состоящие из пар соединенных между

Интерфаза Профаза Прометафаза Метафаза Анафаза Телофаза ,/ ._ wïv4 ifr^sfa ШчР* 1(<щ ( й л U

Рис.1. Фазы митоза. Хромосомы выделены яркими цветами. Микротрубочки и центросомы показаны серым цветом (иллюстрация адоптирована из [Encyclopédie Larousse]).

собой идентичных сестринских хроматид, компактизируются внутри клеточного ядра. В то же время между двух органелл, называемых центросомами, образуется веретено деления (рис. 2) -специализированная динамическая структура, состоящая из микротрубочек. Микротрубочки веретена деления взаимодействуют между собой посредством моторных белков. Прометафаза начинается в момент разрушения ядерной оболочки вокруг хромосом. Хромосомы при этом становятся доступными для взаимодействия с микротрубочками веретена деления. Это взаимодействие опосредуется кинетохорами - специальными белковыми комплексами, расположенными на центромерном участке каждой хромосомы. В результате множества перемещений в метафазе хромосомы выстраиваются в районе экватора клетки, образуя так называемую метафазную пластинку.

После образования

метафазной пластинки и соединения каждой парной хромосомы с обоими полюсами веретена деления, начинается анафаза. В этот период хромосомы синхронно движутся к полюсам клетки, следуя за концами укорачивающихся микротрубочек. При этом полюса деления также раздвигаются между собой. После того как хромосомы распределяются по полюсам клетки, веретено деления разрушается, и образуются новые ядерные оболочки вокруг

центросома

кинетохор

хромосома Моторные . белки

Астральные микротрубочки

Кинетохорные микротрубочки

Интерполярные микротрубочки

Рис. 2. Структура митотического аппарата клетки. Плюсами отмечены плюс-концы микротрубочек (иллюстрация адаптирована из книги [Molecular Biology of the Cell, 5th ed.]

каждого набора разделенных сестринских хроматид. В районе экватора клетки формируется перетяжка, разделяющая цитоплазмы двух новых клеток.

правило, из уложенных Микротрубочки нестабильны,

1.1.2. Микротрубочки

Микротрубочки представляют собой полимеры белка тубулина. Гетеродимеры тубулина образуют цилиндрическую структуру, как 13-ти параллельно протофиламентов. динамически т.е. находятся

попеременно в состоянии удлинения и укорачивания (рис. 3). Удлиняются микротрубочки за счет присоединения к их концам новых димеров тубулина из раствора. Новоприсоединенные димеры тубулина связаны с двумя молекулами ГТФ. Одна из этих молекул гидролизуется до ГДФ вскоре после присоединения к микротрубочке, а

Удлинение микротрубочки

спасение

'•••»Л

Укорочение микротрубочки

Рис. 3. Структура динамических микротрубочек Иллюстрация адаптирована из статьи [Al Bassam & Chang. Trends in Cell Biology, 2011].

другая молекула ГТФ не гидролизуется никогда[2]. Поэтому несмотря на присутствие хотя бы одной негидролизуемой молекулы ГТФ в каждом димере тубулина, димеры тубулина, в которых гидролизуемая молекула ГТФ еще не гидролизовалась, называются ГТФ-связанными, а димеры тубулина, в которых гидролиз уже произошел, называются ГДФ-связанными. ГТФ-связанные тубулины имеют относительно прямую форму, а ГДФ-связанные тубулины более изогнуты[3], [4]. Из-за того, что гидролиз ГТФ происходит лишь через некоторое время после присоединения к микротрубочке, нуклеотидный состав тубулинов на удлиняющемся конце микротрубочки отличен от состава основной части тела микротрубочки. ГТФ-связанные субъединицы на конце образуют так называемую ГТФ-шапочку, которая стабилизирует микротрубочку, скрепляя протофиламенты между собой. При стохастической потере ГТФ-шапочки протофиламенты начинают выгибаться наружу, теряя латеральные связи между собой, что приводит к укорачиванию (деполимеризации) микротрубочки. Переход от удлинения к укорачиванию принято называть катастрофой микротрубочек, а обратный процесс - спасением. Примечательно, что в силу свойств димеров тубулина, микротрубочка имеет полярность. Динамические свойства концов микротрубочек различны. Так называемые плюс-концы быстрее удлиняются, но медленнее укорачиваются, чем минус-концы[5]. В делящейся клетке минус концы микротрубочек более стабильны и расположены в районе полюсов веретена деления. Плюс-концы микротрубочек более динамичны и осуществляют взаимодействие с хромосомами (рис. 2). Множество микротрубочек, взаимодействующих с кинетохорами, называется кинетохорными микротрубочками. Часть микротрубочек, называемых интерполярными, образуют каркас веретена деления, необходимый для поддержания его структуры. Астральные микротрубочки направлены в стороны от экватора клетки и участвуют в позиционировании веретена деления относительно клеточной мембраны.

1.1.3. Кинетохоры

Кинетохоры представляют собой белковые суперкомплексы на хромосомах. На сегодняшний день известно около сотни белков, входящих в состав кинетохоров позвоночных животных[6]. Эти комплексы прикреплены к хромосомам в районе их центромерного участка, который расположен в месте соединения спаренных хромосом друг с другом (рис. 4). Количество микротрубочек, которые могут связаться с одним кинетохором, варьирует от организма к организму. Так, у почкующихся дрожжей каждый кинетохор связывается только с одной микротрубочкой, тогда как в человеческих клетках с кинетохором одновременно может взаимодействовать 15-20 микротрубочек[7].

С помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии было установлено, что кинетохор имеет трёхслойную структуру[8] (рис. 4, справа). Хотя данная морфология оказалась

менее выражена при анализе кинетохора методом замораживания при высоком давлении[9], исторически наблюдения с помощью трансмиссионной микроскопии определили разделение кинетохорных белков и комплексов на группы по принадлежности к определенному «слою». Так, выделяют белки внутреннего слоя кинетохора, закрепляющиеся за центромерный участок ДНК; белки промежуточного слоя; и белки внешнего слоя, осуществляющие взаимодействие с микротрубочками (рис 4). На внешнем кинетохоре находится множество длинных фибриллярных белков, которые в отсутствие микротрубочек, связанных с кинетохором,

Внутренний слой кинтохора

Внешний слой кинтохора

микротрубочка

Рис. 4. Устройство кинетохора. Слева схема центромерного участка хромосомы и кинетохора.

Справа соответствующая электронная микрофотография. Иллюстрации адаптированы из статьи

[Cheeseman & Desai. Nat. Rev., 2008]

простираются из кинетохора в виде фибриллярной «короны».

Внутренний слой кинетохора содержит ряд белков, которые на протяжении всего клеточного цикла локализованы в районе центромеры хромосом. Это прежде всего гистоноподобный белок CENP-A[10], который способен встраиваться центромерный участок ДНК подобно гистонам и таким образом осуществляет закрепление за хромосому. Кроме того, в эту группу входят белки сети CCAN (aHra.:constitutive centromere-associated network), включающие в себя белок CENP-C и 13 ассоциированных белков (CENPG1H, CENP0I, CENP Ш K-U)[6].

Ряд белков промежуточного и верхнего слоев кинетохора отвечают непосредственно за присоединение кинетохора к микротрубочкам. Центральным белковым комплексом, несущим эту функцию, является так называемая сеть KMN, состоящая из трех белковых субкомплексов: KNL-1, Misl2, and Ndc80[ll], Установлено, что данные белки имеют гомологи в различных организмах и абсолютно необходимы для формирования нормальных взаимодействий между хромосомами и микротрубочками в клетках[11]-[13]. Эксперименты in vitro также демонстрируют способность комплекса NDC80 двигаться за укорачивающимися концами микротрубочек, подобно тому как хромосомы движутся за микротрубочками во время анафазы[14]-[16]. Несмотря на важное значение белков сети KMN, и NDC80 комплекса, в

частности известно, что эти белки являются необходимыми, но не достаточными для осуществления закрепления кинетохоров за динамические микротрубочки. Известно, что у дрожжей в качестве сопрягающего устройства выступает кольцевой белковый комплекс Бат 1 (подробнее о нем в следующем разделе). Комплекс Оат1, однако, отсутствует у растений и животных. Наиболее близким структурным гомологом Оаш 1 комплекса у животных является комплекс Бка1 [17]. Хотя данный комплекс и не образует колец вокруг микротрубочек, олигомеры 8ка1 могут следовать за укорачивающимися концами микротрубочек подобно олигомерам Баш1[16], [18]—[20]. Возможно, Эка1 комплекс участвует в прикреплении микротрубочек к кинетохору, образуя на микротрубочках комплексы с МОС80[16]. Интересно, что данное взаимодействие подтверждает функциональную аналогию между Оат1 и 8ка1, поскольку и Оаш1 у дрожжей также взаимодействует с N0080 на микротрубочках[21], [22]. На сегодняшний день остается непонятным, насколько функциональный интерфейс между хромосомой и динамическим концом микротрубочки формируют Бка1 и ККШ, и достаточны ли эти компоненты для автономного сопряжения динамики микротрубочек с движением кинетохора.

Кроме вышеперечисленных комплексов в состав кинетохорных белков, напрямую связывающихся с микротрубочками, входят такие белки как СЕ№-Р[23], [24], ряд плюс-концевых белков[25], включая ЕВ1[26], [27], моторные белки СЕОТ-Е[28, р. 19] и динеин[29], [30], а также ряд белков-регуляторов динамики микротрубочек: полимеразы СЬА8Р1/2[31], ХМАР215[32] и деполимеразы МСАК[33], [34] и К1П8А[35].

1.1.4. Проблема сопряжения кинетохора с динамическими микротрубочками

Одной из удивительных особенностей кинетохора является его способность удерживаться за динамические плюс-концы микротрубочек, которые интенсивно обмениваются субъединицами тубулина с цитозолем[36]-[38]. Каким образом должен быть устроен кинетохор, чтобы удерживаться за столь динамические структуры? Было предложено множество моделей кинетохора как сопрягающего устройства (рис. 5). Исторически одной из первых была сформулирована модель Хилла[39], который предположил, что кинетохорные белки образуют нечто вроде плотного рукава вокруг плюс-конца микротрубочки. Этот рукав имеет определенное число сайтов связывания со стенкой микротрубочки, соответственно потеря субъединиц тубулина с плюс-конца микротрубочки приводит к тому, что рукав передвигается к минус-концу микротрубочки, стремясь восполнить разорванные связи. Таким образом рукав Хилла сопрягается с динамикой микротрубочки. С открытием раскрытой структуры плюс-концов микротрубочек с выгибающимися наружу протофиламентами стало понятно, что эта структура несовместима с механизмом, предложенным Хиллом. В 1988 году

Рис.5. Модели сопрягающих устройств для динамического плюс-конца микротрубочки.

За основу взята иллюстрация из статьи [Е^етоу е! а!., РМАБ 2007]_________

Кошландом и коллегами была предложена новая модель сопряжения кинетохора с плюс концом микротрубочки - кинетохор представлялся в виде простого кольца, на которое давили выгибающиеся протофиламенты[40]. На момент формулировки этой модели не существовало конкретных белковых кандидатов на роль кольцевого сопрягающего устройства, поэтому модель простого кольца рассматривалась абстрактно. Однако, в 2005 году было обнаружено, что дрожжевой гетеродекамерный комплекс Оаш1 способен формировать кольца вдоль микротрубочек[41], [42]. Исследования с очищенным рекомбинантным комплексом Оагп1 показали, что кольцевые комплексы Оаш1 способны процессивно двигаться за динамическими концами микротрубочек[43]-[45]. Кольцевой Оагп1 комплекс имеет диаметр 35-40 нанометров, положительно заряжен и имеет выросты, направленные к центру кольца[46]. Это позволило сформулировать две альтернативные модели, объясняющие механизм его движения: модель заряженного кольца и модель кольца с мостиками (рис.5). Модель заряженного кольца предполагает, что Оаш1 электростатически взаимодействует с раскрытой частью венчика на конце микротрубочки[47]. Недостатком модели являлось требование для движения кольца синхронной потери терминальных субъединиц тубулина со всех протофиламентов микротрубочки, что не выполняется в реальности. Модель кольца с мостиками опиралась на предположение о том, что Оаш1 кольцо взаимодействует с микротрубочкой посредством выростов или мостиков, специфически связывающихся с димерами тубулина. Такое кольцо под нагрузкой со стороны выгибающихся протофиламентов «шагает» вдоль микротрубочки, переваливаясь из одного углового положения в другое, позволяя эффективно использовать энергию деформации протофиламентов[48].

В дрожжевых клетках присутствие Оаш1 комплекса даже без всех остальных кинетохорных белков уже достаточно для прохождения процесса сегрегации хромосом[49]. Тем не менее, в животных и растительных клетках не было обнаружено гомологов комплекса Оагп1, что может свидетельствовать, о том, что в этих царствах сформировались альтернативные способы закрепления кинетохора за динамические микротрубочки. Так, анализ электронных микрофотографий микротрубочек, соединенных с кинетохором, указывает на то, что у

животных концы микротрубочек сопрягаются с кинетохором посредством некого фибриллярного компонента, возможно связывающегося с изогнутой поверхностью протофиламентов укорачивающихся концов микротрубочек[15]. Данное наблюдение привело к созданию фибриллярной модели кинетохора как сопрягающего устройства (рис.5, справа). На сегодняшний день не установлено, какой именно фибриллярный белок осуществляет это закрепление. Электронная микроскопия указывает на наличие у этого компонента существенной длины. В связи с этим перспективными кандидатами на роль сопрягающих белков у животных являются компоненты короны кинетохора, фибриллярные белки СЕЫР-Р и СЕЫР-Е.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гудимчук, Никита Борисович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] В. Alberts, "Molecular biology of the cell" II New York: Garland Science, 2008.

[2] H. P. Erickson and E. T. O'Brien, "Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis," // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., vol. 21, pp. 145-166, 1992.

[3] H.-W. Wang and E. Nogales, "Nucleotide-dependent bending flexibility of tubulin regulates microtubule assembly" // Nature, vol. 435, no. 7044, pp. 911-915, Jun. 2005.

[4] T. Milller-Reichert, D. Chrétien, F. Severin, and A. A. Hyman, "Structural changes at microtubule ends accompanying GTP hydrolysis: information from a slowly hydrolyzable analogue of GTP, guanylyl (alpha,beta)methylenediphosphonate" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 95, no. 7, pp. 3661-3666, Mar. 1998.

[5] T. Horio and H. Hotani, "Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy" // Nature, vol. 321, no. 6070, pp. 605-607, Jun. 1986.

[6] I. M. Cheeseman and A. Desai, "Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface" II Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 9, no. 1, pp. 33-46, Jan. 2008.

[7] B. F. McEwen, G. K. Chan, B. Zubrowski, M. S. Savoian, M. T. Sauer, and T. J. Yen, "CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells" // Mol. Biol. Cell, vol. 12, no. 9, pp. 2776-2789, Sep. 2001.

[8] B. R. Brinkley and E. Stubblefield, "The fine structure of the kinetochore of a mammalian cell in vitro" // Chromosoma, vol. 19, no. 1, pp. 28-43, 1966.

[9] B. F. McEwen, Y. Dong, and K. J. VandenBeldt, "Using electron microscopy to understand functional mechanisms of chromosome alignment on the mitotic spindle" Methods Cell Biol., vol. 79, pp. 259-293, 2007.

[10] D. K. Palmer, K. O'Day, H. L. Trong, H. Charbonneau, and R. L. Margolis, "Purification of the centromere-specific protein CENP-A and demonstration that it is a distinctive histone" // Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 88, no. 9, pp. 3734-3738, May 1991.

[11] I. M. Cheeseman, J. S. Chappie, E. M. Wilson-Kubalek, and A. Desai, "The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore" // Cell, vol. 127, no. 5, pp. 983-997, Dec. 2006.

[12] J. G. DeLuca, W. E. Gall, C. Ciferri, D. Cimini, A. Musacchio, and E. D. Salmon, "Kinetochore microtubule dynamics and attachment stability are regulated by Heel" // Cell, vol. 127, no. 5, pp. 969-982, Dec. 2006.

[13] P. A. Wigge and J. V. Kilmartin, "The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation" // J. Cell Biol., vol. 152, no. 2, pp. 349-360, Jan. 2001.

[14] A. F. Powers, A. D. Franck, D. R. Gestaut, J. Cooper, B. Gracyzk, R. R. Wei, L. Wordeman, T. N. Davis, and C. L. Asbury, "The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion" // Cell, vol. 136, no. 5, pp. 865-875, Mar. 2009.

[15] J. R. Mcintosh, E. L. Grishchuk, M. K. Morphew, A. K. Efremov, K. Zhudenkov, V. A. Volkov, I. M. Cheeseman, A. Desai, D. N. Mastronarde, and F. I. Ataullakhanov, "Fibrils connect microtubule tips with kinetochores: a mechanism to couple tubulin dynamics to chromosome motion" // Cell, vol. 135, no. 2, pp. 322-333, Oct. 2008.

[16] J. C. Schmidt, H. Arthanari, A. Boeszoermenyi, N. M. Dashkevich, E. M. Wilson-Kubalek, N. Monnier, M. Markus, M. Oberer, R. A. Milligan, M. Bathe, G. Wagner, E. L. Grishchuk, and I. M. Cheeseman, "The kinetochore-bound Skal complex tracks depolymerizing microtubules and binds to curved protofilaments" // Dev. Cell, vol. 23, no. 5, pp. 968-980, Nov. 2012.

[17] J. P. I. Welburn, E. L. Grishchuk, C. B. Backer, E. M. Wilson-Kubalek, J. R. Yates 3rd, and I. M. Cheeseman, "The human kinetochore Skal complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility" // Dev. Cell, vol. 16, no. 3, pp. 374-385, Mar. 2009.

[18] J. P. I. Welburn, E. L. Grishchuk, C. B. Backer, E. M. Wilson-Kubalek, J. R. Yates 3rd, and I. M. Cheeseman, "The human kinetochore Skal complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility" II Dev. Cell, vol. 16, no. 3, pp. 374-385, Mar. 2009.

[19] E. L. Grishchuk, I. S. Spiridonov, V. A. Volkov, A. Efremov, S. Westermann, D. Drubin, G. Barnes, F. I. Ataullakhanov, and J. R. Mcintosh, "Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 105, no. 19, pp. 6918-6923, May 2008.

[20] D. R. Gestaut, B. Graczyk, J. Cooper, P. O. Widlund, A. Zelter, L. Wordeman, C. L. Asbury, and T. N. Davis, "Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Daml complex do not require ring formation" II Nat. Cell Biol., vol. 10, no. 4, pp. 407-414, Apr. 2008.

[21] J. F. Tien, N. T. Umbreit, D. R. Gestaut, A. D. Franck, J. Cooper, L. Wordeman, T. Gonen, C. L. Asbury, and T. N. Davis, "Cooperation of the Daml and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B" // J. Cell Biol., vol. 189, no. 4, pp. 713-723, May 2010.

[22] F. Lampert, P. Hornung, and S. Westermann, "The Daml complex confers microtubule plus end-tracking activity to the Ndc80 kinetochore complex" // J. Cell Biol., vol. 189, no. 4, pp. 641-649, May 2010.

[23] P. Bomont, P. Maddox, J. V. Shah, A. B. Desai, and D. W. Cleveland, "Unstable microtubule capture at kinetochores depleted of the centromere-associated protein CENP-F" // EMBO J., vol. 24, no. 22, pp. 3927-3939, Nov. 2005.

[24] J. Feng, H. Huang, and T. J. Yen, "CENP-F is a novel microtubule-binding protein that is essential for kinetochore attachments and affects the duration of the mitotic checkpoint delay" // Chromosoma, vol. 115, no. 4, pp. 320-329, Aug. 2006.

[25] A. Akhmanova and M. O. Steinmetz, "Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips" II Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 9, no. 4, pp. 309-322, Apr. 2008.

[26] X. Wang, X. Zhuang, D. Cao, Y. Chu, P. Yao, W. Liu, L. Liu, G. Adams, G. Fang, Z. Dou, X. Ding, Y. Huang, D. Wang, and X. Yao, "Mitotic regulator SKAP forms a link between kinetochore core complex KMN and dynamic spindle microtubules" // J. Biol. Chem., vol. 287, no. 47, pp. 39380-39390, Nov. 2012.

[27] J. S. Tirnauer, J. C. Canman, E. D. Salmon, and T. J. Mitchison, "EB1 targets to kinetochores with attached, polymerizing microtubules" II Mol. Biol. Cell, vol. 13, no. 12, pp. 4308—4316, Dec. 2002.

[28] T. J. Yen, G. Li, B. T. Schaar, I. Szilak, and D. W. Cleveland, "CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis" // Nature, vol. 359, no. 6395, pp. 536-539, Oct. 1992.

[29] E. R. Steuer, L. Wordeman, T. A. Schroer, and M. P. Sheetz, "Localization of cytoplasmic dynein to mitotic spindles and kinetochores" // Nature, vol. 345, no. 6272, pp. 266-268, May 1990.

[30] D. A. Starr, B. C. Williams, T. S. Hays, and M. L. Goldberg, "ZW10 helps recruit dynactin and dynein to the kinetochore" II J. Cell Biol., vol. 142, no. 3, pp. 763-114, Aug. 1998.

[31]H. Maiato, A. Khodjakov, and C. L. Rieder, "Drosophila CLASP is required for the incorporation of microtubule subunits into fluxing kinetochore fibres" // Nat. Cell Biol., vol. 7, no. 1, pp. 42—47, Jan. 2005.

[32] G. J. Brouhard, J. H. Stear, T. L. Noetzel, J. Al-Bassam, K. Kinoshita, S. C. Harrison, J. Howard, and A. A. Hyman, "XMAP215 is a processive microtubule polymerase" // Cell, vol. 132, no. 1, pp. 79-88, Jan. 2008.

[33] S. B. Domnitz, M. Wagenbach, J. Decarreau, and L. Wordeman, "MCAK activity at microtubule tips regulates spindle microtubule length to promote robust kinetochore attachment" // J. Cell Biol., vol. 197, no. 2, pp. 231-237, Apr. 2012.

[34] L. Wordeman and T. J. Mitchison, "Identification and partial characterization of mitotic centromere-associated kinesin, a kinesin-related protein that associates with centromeres during mitosis" II J. Cell Biol., vol. 128, no. 1-2, pp. 95-104, Jan. 1995.

[35] J. Stumpff, G. von Dassow, M. Wagenbach, C. Asbury, and L. Wordeman, "The kinesin-8 motor Kifl 8A suppresses kinetochore movements to control mitotic chromosome alignment" // Dev. Cell, vol. 14, no. 2, pp. 252-262, Feb. 2008.

[36] T. Mitchison, L. Evans, E. Schulze, and M. Kirschner, "Sites of microtubule assembly and disassembly in the mitotic spindle" // Cell, vol. 45, no. 4, pp. 515-527, May 1986.

[37] G. J. Gorbsky, P. J. Sammak, and G. G. Borisy, "Chromosomes move poleward in anaphase along stationary microtubules that coordinately disassemble from their kinetochore ends" // J. Cell Biol., vol. 104, no. 1, pp. 9-18, Jan. 1987.

[38] G. J. Gorbsky, P. J. Sammak, and G. G. Borisy, "Microtubule dynamics and chromosome motion visualized in living anaphase cells" // J. Cell Biol., vol. 106, no. 4, pp. 1185-1192, Apr. 1988.

[39] T. L. Hill, "Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 82, no. 13, pp. 4404-4408, Jul. 1985.

[40] D. E. Koshland, T. J. Mitchison, and M. W. Kirschner, "Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro" // Nature, vol. 331, no. 6156, pp. 499-504, Feb. 1988.

[41] J. J. L. Miranda, P. De Wulf, P. K. Sorger, and S. C. Harrison, "The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules" // Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 12, no. 2, pp. 138-143, Feb. 2005.

[42] S. Westermann, A. Avila-Sakar, H.-W. Wang, H. Niederstrasser, J. Wong, D. G. Drubin, E. Nogales, and G. Barnes, "Formation of a dynamic kinetochore- microtubule interface through assembly of the Daml ring complex" // Mol. Cell, vol. 17, no. 2, pp. 277-290, Jan. 2005.

[43] C. L. Asbury, D. R. Gestaut, A. F. Powers, A. D. Franck, and T. N. Davis, "The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 103, no. 26, pp. 9873-9878, Jun. 2006.

[44]-S-. Westermann, H.-W. Wang, A. Avila-Sakar, D. G. Drubin, E. Nogales, and G. Barnes, "The Daml kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends" // Nature, vol. 440, no. 7083, pp. 565-569, Mar. 2006.

[45] E. L. Grishchuk, A. K. Efremov, V. A. Volkov, I. S. Spiridonov, N. Gudimchuk, S. Westermann, D. Drubin, G. Barnes, J. R. Mcintosh, and F. I. Ataullakhanov, "The Daml ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 105, no. 40, pp. 15423-15428, Oct. 2008.

[46] H.-W. Wang, V. H. Ramey, S. Westermann, A. E. Leschziner, J. P. I. Welburn, Y. Nakajima, D. G. Drubin, G. Barnes, and E. Nogales, "Architecture of the Daml kinetochore ring complex and implications for microtubule-driven assembly and force-coupling mechanisms" // Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 14, no. 8, pp. 721-726, Aug. 2007.

[47] J. Liu and J. N. Onuchic, "A driving and coupling 'Pac-Man' mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 103, no. 49, pp. 18432-18437, Dec. 2006.

[48] A. Efremov, E. L. Grishchuk, J. R. Mcintosh, and F. I. Ataullakhanov, "In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 104, no. 48, pp. 19017-19022, Nov. 2007.

[49] E. Kiermaier, S. Woehrer, Y. Peng, K. Mechtler, and S. Westermann, "A Daml-based artificial kinetochore is sufficient to promote chromosome segregation in budding yeast" // Nat. Cell Biol., vol. 11, no. 9, pp. 1109-1115, Sep. 2009.

[50] R. Vale, "The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport" // Cell, vol. 112, no. 4, pp. 467-480, Feb. 2003.

[51] J. T. Yang, R. A. Laymon, and L. S. Goldstein, "A three-domain structure of kinesin heavy chain revealed by DNA sequence and microtubule binding analyses" // Cell, vol. 56, no. 5, pp. 879889, Mar. 1989.

[52] N. Hirokawa, K. K. Pfister, H. Yorifuji, M. C. Wagner, S. T. Brady, and G. S. Bloom, "Submolecular domains of bovine brain kinesin identified by electron microscopy and monoclonal antibody decoration" // Cell, vol. 56, no. 5, pp. 867-878, Mar. 1989.

[53] W. O. Hancock and J. Howard, "Processivity of the Motor Protein Kinesin Requires Two Heads" II J. Cell Biol., vol. 140, no. 6, pp. 1395-1405, Mar. 1998.

[54] A. Yildiz, M. Tomishige, R. D. Vale, and P. R. Selvin, "Kinesin Walks Hand-Over-Hand" // Science, vol. 303, no. 5658, pp. 676-678, Jan. 2004.

[55] N. J. Carter and R. A. Cross, "Mechanics of the kinesin step" II Nature, vol. 435, no. 7040, pp. 308-312, May 2005.

[56] C. J. Lawrence, R. K. Dawe, K. R. Christie, D. W. Cleveland, S. C. Dawson, S. A. Endow, L. S.

B. Goldstein, H. V. Goodson, N. Hirokawa, J. Howard, R. L. Malmberg, J. R. Mcintosh, H. Miki, T. J. Mitchison, Y. Okada, A. S. N. Reddy, W. M. Saxton, M. Schliwa, J. M. Scholey, R. D. Vale,

C. E. Walczak, and L. Wordeman, "A standardized kinesin nomenclature" // J. Cell Biol., vol. 167, no. 1, pp. 19-22, Oct. 2004.

[57] J. P. I. Welburn, "The molecular basis for kinesin functional specificity during mitosis" // Cytoskeleton, vol. 70, no. 9, pp. 476-493, 2013.

[58] K. E. Sawin, K. LeGuellec, M. Philippe, and T. J. Mitchison, "Mitotic spindle organization by a plus-end-directed microtubule motor" II Nature, vol. 359, no. 6395, pp. 540-543, Oct. 1992.

[59] V. Mountain, C. Simerly, L. Howard, A. Ando, G. Schatten, and D. A. Compton, "The Kinesin-Related Protein, Hset, Opposes the Activity of Eg5 and Cross-Links Microtubules in the Mammalian Mitotic Spindle" II J. Cell Biol., vol: 147, no. 2, pp. 351-366, Oct. 1999.

[60] A. A. Levesque and D. A. Compton, "The chromokinesin Kid is necessary for chromosome arm orientation and oscillation, but not congression, on mitotic spindles" // J. Cell Biol., vol. 154, no. 6, pp. 1135-1146, Sep. 2001.

[61] I. Vernos, J. Raats, T. Hirano, J. Heasman, E. Karsenti, and C. Wylie, "Xklpl, a chromosomal Xenopus kinesin-like protein essential for spindle organization and chromosome positioning" // Cell, vol. 81, no. 1, pp. 117-127, Apr. 1995.

[62] M. K. Gardner, M. Zanic, C. Gell, V. Bormuth, and J. Howard, "Depolymerizing kinesins Kip3 and MCAK shape cellular microtubule architecture by differential control of catastrophe" // Cell, vol. 147, no. 5, pp. 1092-1103, Nov. 2011.

[63] V. Bormuth, B. Nitzsche, F. Ruhnow, A. Mitra, M. Storch, B. Rammner, J. Howard, and S. Diez, "The highly processive kinesin-8, Kip3, switches microtubule protofilaments with a bias toward the left" // Biophys. J., vol. 103, no. 1, pp. L4-6, Jul. 2012.

[64] V. Varga, J. Helenius, K. Tanaka, A. A. Hyman, T. U. Tanaka, and J. Howard, "Yeast kinesin-8 depolymerizes microtubules in a length-dependent manner" // Nat. Cell Biol., vol. 8, no. 9, pp. 957-962, Sep. 2006.

[65] M. I. Mayr, S. Hümmer, J. Bormann, T. Grüner, S. Adio, G. Woehlke, and T. U. Mayer, "The human kinesin Kifl 8A is a motile microtubule depolymerase essential for chromosome congression" // Curr. Biol. CB, vol. 17, no. 6, pp. 488^98, Mar. 2007.

[66] L. Wordeman, M. Wagenbach, and G. von Dassow, "MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover" // J. Cell Biol., vol. 179, no. 5, pp. 869-879, Dec. 2007.

[67] Y. Oguchi, S. Uchimura, T. Ohki, S. V. Mikhailenko, and S. Ishiwata, "The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends" // Nat. Cell Biol., vol. 13, no. 7, pp. 846-852, Jul. 2011.

[68] K. Visscher, M. J. Schnitzer, and S. M. Block, "Single kinesin molecules studied with a molecular force clamp" II Nature, vol. 400, no. 6740, pp. 184-189, Jul. 1999.

[69] H. Yardimci, M. van Duffelen, Y. Mao, S. S. Rosenfeld, and P. R. Selvin, "The mitotic kinesin CENP-E is a processive transport motor" // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., vol. 105, no. 16, pp. 6016-6021, Apr. 2008.

[70] M. T. Valentine, P. M. Fordyce, T. C. Krzysiak, S. P. Gilbert, and S. M. Block, "Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro" II Nat. Cell Biol., vol. 8, no. 5, pp. 470-476, May 2006.

[71] R. Mallik, B. C. Carter, S. A. Lex, S. J. King, and S. P. Gross, "Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load" // Nature, vol. 427, no. 6975, pp. 649-652, Feb. 2004.

[72] A. K. Rai, A. Rai, A. J. Ramaiya, R. Jha, and R. Mallik, "Molecular adaptations allow dynein to generate large collective forces inside cells" // Cell, vol. 152, no. 1-2, pp. 172-182, Jan. 2013.

[73] E. L. Grishchuk and J. R. Mcintosh, "Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast" // EMBO J., vol. 25, no. 20, pp. 4888-4896, Oct. 2006.

[74] K. Tanaka, E. Kitamura, Y. Kitamura, and T. U. Tanaka, "Molecular mechanisms of microtubule-dependent kinetochore transport toward spindle poles" // J. Cell Biol., vol. 178, no. 2, pp. 269-281, Jul. 2007.

[75] Z. Yang, U. S. Tulu, P. Wadsworth, and C. L. Rieder, "Kinetochore dynein is required for chromosome motion and congression independent of the spindle checkpoint" // Curr. Biol. CB, vol. 17, no. 11, pp. 973-980, Jun. 2007.

[76] M. A. Jordan, R. J. Toso, D. Thrower, and L. Wilson, "Mechanism of mitotic block and inhibition of cell proliferation by taxol at low concentrations" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 90, no. 20, pp. 9552-9556, Oct. 1993.

[77] M. Coue, V. A. Lombillo, and J. R. Mcintosh, "Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro" // J. Cell Biol., vol. 112, no. 6, pp. 1165-1175, Mar. 1991.

[78] M. Dogterom and B. Yurke, "Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules" // Science, vol. 278, no. 5339, pp. 856-860, Oct. 1997.

[79] E Grishchuk, M. I. Molodtsov, F. I. Ataullakhanov, and J. R. Mcintosh, "Force production by disassembling microtubules" II Nature, vol. 438, no. 7066, pp. 384-388, Nov. 2005.

[80] R. V. Skibbens, V. P. Skeen, and E. D. Salmon, "Directional instability of kinetochore motility during chromosome congression and segregation in mitotic newt lung cells: a push-pull mechanism" II J. Cell Biol., vol. 122, no. 4, pp. 859-875, Aug. 1993.

[81] C. E. Walczak, S. Cai, and A. Khodjakov, "Mechanisms of chromosome behaviour during mitosis" // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 11, no. 2, pp. 91-102, Feb. 2010.

[82] M. A. Lampson and I. M. Cheeseman, "Sensing centromere tension: Aurora B and the regulation of kinetochore function" // Trends Cell Biol., vol. 21, no. 3, pp. 133-140, Mar. 2011.

[83] M. A. Lampson, K. Renduchitala, A. Khodjakov, and T. M. Kapoor, "Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division" // Nat. Cell Biol., vol. 6, no. 3, pp. 232237, Mar. 2004.

[84] T. J. Yen, D. A. Compton, D. Wise, R. P. Zinkowski, B. R. Brinkley, W. C. Earnshaw, and D. W. Cleveland, "CENP-E, a novel human centromere-associated protein required for progression from metaphase to anaphase" // EMBO J., vol. 10, no. 5, pp. 1245-1254, May 1991.

[85] F. R. Putkey, T. Cramer, M. K. Morphew, A. D. Silk, R. S. Johnson, J. R. Mcintosh, and D. W. Cleveland, "Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E" II Dev. Cell, vol. 3, no. 3, pp. 351-365, Sep. 2002.

[86] J. K. Yucel, J. D. Marszalek, J. R. Mcintosh, L. S. Goldstein, D. W. Cleveland, and A. V. Philp, "CENP-meta, an essential kinetochore kinesin required for the maintenance of metaphase chromosome alignment in Drosophila" // J. Cell Biol., vol. 150, no. 1, pp. 1-11, Jul. 2000.

[87] K. W. Wood, R. Sakowicz, L. S. Goldstein, and D. W. Cleveland, "CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment" // Cell, vol. 91, no. 3, pp. 357-366, Oct. 1997.

[88] D. K. Nag, I. Tikhonenko, I. Soga, and M. P. Koonce, "Disruption of four kinesin genes in dictyostelium" // BMC Cell Biol., vol. 9, p. 21, 2008.

[89] R. ten Hoopen, T. Schleker, R. Manteuffel, and I. Schubert, "Transient CENP-E-like kinetochore proteins in plants" // Chromosome Res. Int. J. Mol. Supramol. Evol. Asp. Chromosome Biol., vol. 10, no. 7, pp. 561-570, 2002.

[90] Y. Kim, J. E. Heuser, C. M. Waterman, and D. W. Cleveland, "CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether" // J. Cell Biol., vol. 181, no. 3, pp. 411-419, May 2008.

[91] M. A. Seeger, Y. Zhang, and S. E. Rice, "Kinesin tail domains are intrinsically disordered" // Proteins, vol. 80, no. 10, pp. 2437-2446, Oct. 2012.

[92] H. Liao, G. Li, and T. J. Yen, "Mitotic regulation of microtubule cross-linking activity of CENP-E kinetochore protein" // Science, vol. 265, no. 5170, pp. 394-398, Jul. 1994.

[93] J. Espeut, A. Gaussen, P. Bieling, V. Morin, S. Prieto, D. Fesquet, T. Surrey, and A. Abrieu, "Phosphorylation relieves autoinhibition of the kinetochore motor Cenp-E" // Mol. Cell, vol. 29, no. 5, pp. 637-643, Mar. 2008.

[94] G. K. Chan, B. T. Schaar, and T. J. Yen, "Characterization of the kinetochore binding domain of CENP-E reveals interactions with the kinetochore proteins CENP-F and hBUBRl" // J. Cell Biol., vol. 143, no. 1, pp. 49-63, Oct. 1998.

[95] K. D. Brown, R. M. Coulson, T. J. Yen, and D. W. Cleveland, "Cyclin-like accumulation and loss of the putative kinetochore motor CENP-E results from coupling continuous synthesis with specific degradation at the end of mitosis" II J. Cell Biol., vol. 125, no. 6, pp. 1303-1312, Jun. 1994.

[96] C. A. Cooke, B. Schaar, T. J. Yen, and W. C. Earnshaw, "Localization of CENP-E in the fibrous corona and outer plate of mammalian kinetochores from prometaphase through anaphase" // Chromosoma, vol. 106, no. 7, pp. 446-455, Dec. 1997.

[97] X. Yao, K. L. Anderson, and D. W. Cleveland, "The microtubule-dependent motor centromere-associated protein E (CENP-E) is an integral component of kinetochore corona fibers that link centromeres to spindle microtubules" // J. Cell Biol., vol. 139, no. 2, pp. 435-447, Oct. 1997.

[98] K. D. Brown, K. W. Wood, and D. W. Cleveland, "The kinesin-like protein CENP-E is kinetochore-associated throughout poleward chromosome segregation during anaphase-A" // J. Cell Sci., vol. 109 ( Pt 5), pp. 961-969, May 1996.

[99] D. Liu, X. Ding, J. Du, X. Cai, Y. Huang, T. Ward, A. Shaw, Y. Yang, R. Hu, C. Jin, and X. Yao, "Human NUF2 interacts with centromere-associated protein E and is essential for a stable spindle microtubule-kinetochore attachment" II J. Biol. Chem., vol. 282, no. 29, pp. 21415-21424, Jul. 2007.

[100] Y. Kim, A. J. Holland, W. Lan, and D. W. Cleveland, "Aurora kinases and protein phosphatase 1 mediate chromosome congression through regulation of CENP-E" // Cell, vol. 142, no. 3, pp. 444-455, Aug. 2010.

[101] S. Maffini, A. R. R. Maia, A. L. Manning, Z. Maliga, A. L. Pereira, M. Junqueira, A. Shevchenko, A. Hyman, J. R. Yates 3rd, N. Galjart, D. A. Compton, and H. Maiato, "Motor-independent targeting of CLASPs to kinetochores by CENP-E promotes microtubule turnover and poleward flux" // Curr. Biol. CB, vol. 19, no. 18, pp. 1566-1572, Sep. 2009.

[102] Y. Huang, W. Wang, P. Yao, X. Wang, X. Liu, X. Zhuang, F. Yan, J. Zhou, J. Du, T. Ward, H. Zou, J. Zhang, G. Fang, X. Ding, Z. Dou, and X. Yao, "CENP-E kinesin interacts with SKAP protein to orchestrate accurate chromosome segregation in mitosis" // J. Biol. Chem., vol. 287, no. 2, pp. 1500-1509, Jan. 2012.

[103] T. M. Kapoor, M. A. Lampson, P. Hergert, L. Cameron, D. Cimini, E. D. Salmon, B. F. McEwen, and A. Khodjakov, "Chromosomes can congress to the metaphase plate before biorientation" // Science, vol. 311, no. 5759, pp. 388-391, Jan. 2006.

[104] S. Cai, C. B. O'Connell, A. Khodjakov, and C. E. Walczak, "Chromosome congression in the absence of kinetochore fibres" II Nat. Cell Biol., vol. 11, no. 7, pp. 832-838, Jul. 2009.

[105] B. T. Schaar, G. K. Chan, P. Maddox, E. D. Salmon, and T. J. Yen, "CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment" // J. Cell Biol., vol. 139, no. 6, pp. 13731382, Dec. 1997.

[106] X. Yao, A. Abrieu, Y. Zheng, K. F. Sullivan, and D. W. Cleveland, "CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint" // Nat. Cell Biol., vol. 2, no. 8, pp. 484-491, Aug. 2000.

[107] K. W. Wood, L. Lad, L. Luo, X. Qian, S. D. Knight, N. Nevins, K. Brejc, D. Sutton, A. G. Gilmartin, P. R. Chua, R. Desai, S. P. Schauer, D. E. McNulty, R. S. Annan, L. D. Belmont, C. Garcia, Y. Lee, M. A. Diamond, L. F. Faucette, M. Giardiniere, S. Zhang, C.-M. Sun, J. D. Vidal, S. Lichtsteiner, W. D. Cornwell, J. D. Greshock, R. F. Wooster, J. T. Finer, R. A. Copeland, P. S. Huang, D. J. Morgans Jr, D. Dhanak, G. Bergnes, R. Sakowicz, and J. R. Jackson, "Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 107, no. 13, pp. 5839-5844, Mar. 2010.

[108] B. A. A. Weaver, Z. Q. Bonday, F. R. Putkey, G. J. P. L. Kops, A. D. Silk, and D. W. Cleveland, "Centromere-associated protein-E is essential for the mammalian mitotic checkpoint

to prevent aneuploidy due to single chromosome loss" // J. Cell Biol., vol. 162, no. 4, pp. 551— 563, Aug. 2003.

[109] V. A. Lombillo, C. Nislow, T. J. Yen, V. I. Gelfand, and J. R. Mcintosh, "Antibodies to the kinesin motor domain and CENP-E inhibit microtubule depolymerization-dependent motion of chromosomes in vitro" // J. Cell Biol., vol. 128, no. 1-2, pp. 107-115, Jan. 1995.

[110] R. L. Shrestha and V. M. Draviam, "Lateral to end-on conversion of chromosome-microtubule attachment requires kinesins CENP-E and MCAK" // Curr. Biol. CB, vol. 23, no. 16, pp. 15141526, Aug. 2013.

[111] H. S. Sardar, V. G. Luczak, M. M. Lopez, B. C. Lister, and S. P. Gilbert, "Mitotickinesin CENP-E promotes microtubule plus-end elongation" // Curr. Biol. CB, vol. 20, no. 18, pp. 1648— 1653, Sep. 2010.

[112] S. Shastry and W. O. Hancock, "Interhead tension determines processivity across diverse N-terminal kinesins" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 108, no. 39, pp. 16253-16258, Sep. 2011.

[113] D. L. Coy, W. O. Hancock, M. Wagenbach, and J. Howard, "Kinesin's tail domain is an inhibitory regulator of the motor domain" // Nat. Cell Biol., vol. 1, no. 5, pp. 288-292, Sep. 1999.

[114] E. J. Ambrose, "A Surface Contact Microscope for the study of Cell Movements" // Nature, vol. 178, p. 1194, Nov. 1956.

[115] D. Axelrod, "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence." // J. Cell Biol., vol. 89, no. l,pp. 141-145, Apr. 1981.

[116] T. Funatsu, Y. Harada, M. Tokunaga, K. Saito, and T. Yanagida, "Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution" // Nature, vol. 374, no. 6522, pp. 555-559, Apr. 1995.

[117] X. Zhuang, L. E. Bartley, H. P. Babcock, R. Russell, T. Ha, D. Herschlag, and S. Chu, "A single-molecule study of RNA catalysis and folding" // Science, vol. 288, no. 5473, pp. 20482051, Jun. 2000.

[118] A. Yildiz, J. N. Forkey, S. A. McKinney, T. Ha, Y. E. Goldman, and P. R. Selvin, "Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization" // Science, vol. 300, no. 5628, pp. 2061-2065, Jun. 2003.

[119] A. Ashkin, J. M. Dziedzic, and T. Yamane, "Optical trapping and manipulation of single cells using infrared laser beams" // Nature, vol. 330, no. 6150, pp. 769-771, Dec. 1987.

[120] K. Svoboda and S. M. Block, "Force and velocity measured for single kinesin molecules" // Cell, vol. 77, no. 5, pp. 773-784, Jun. 1994.

[121] A. Hyman, D. Drechsel, D. Kellogg, S. Salser, K. Sawin, P. Steffen, L. Wordeman, and T. Mitchison, "Preparation of modified tubulins" // Methods Enzymol., vol. 196, pp. 478-485, 1991.

[122] V. A. Volkov, A. V. Zaytsev, N. Gudimchuk, P. M. Grissom, A. L. Gintsburg, F. I. Ataullakhanov, J. R. Mcintosh, and E. L. Grishchuk, "Long tethers provide high-force coupling of the Daml ring to shortening microtubules" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 110, no. 19, pp. 7708-7713, May 2013.

[123] A. Abrieu, J. A. Kahana, K. W. Wood, and D. W. Cleveland, "CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro" // Cell, vol. 102, no. 6, pp. 817-826, Sep. 2000.

[124] N. Gudimchuk, B. Vitre, Y. Kim, A. Kiyatkin, D. W. Cleveland, F. I. Ataullakhanov, and E. L. Grishchuk, "Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips" II Nat. Cell Biol., vol. 15, no. 9, pp. 1079-1088, Sep. 2013.

[125] J. Helenius, G. Brouhard, Y. Kalaidzidis, S. Diez, and J. Howard, "The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends" // Nature, vol. 441, no. 7089, pp. 115-119, May 2006.

[126] R. F. Luduena, A. Fellous, J. Francon, J. Nunez, and L. McManus, "Effect of tau on the vinblastine-induced aggregation of tubulin" // J. Cell Biol., vol. 89, no. 3, pp. 680-683, Jun. 1981.

[127] R. M. Simmons, J. T. Finer, S. Chu, and J. A. Spudich, "Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap" // Biophys. J., vol. 70, no. 4, pp. 1813-1822, Apr. 1996.

[128] E. A. Abbondanzieri, W. J. Greenleaf, J. W. Shaevitz, R. Landick, and S. M. Block, "Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase" // Nature, vol. 438, no. 7067, pp. 460465, Nov. 2005.

[129] K. Svoboda and S. M. Block, "Biological applications of optical forces" // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., vol. 23, pp. 247-285, 1994.

[130] E. L. Grishchuk and F. I. Ataullakhanov, "In vitro assays to study the tracking of shortening microtubule ends and to measure associated forces" // Methods Cell Biol., vol. 95, pp. 657-676, 2010.

[131] E. D. Salmon, W. M. Saxton, R. J. Leslie, M. L. Karow, and J. R. Mcintosh, "Diffusion coefficient of fluorescein-labeled tubulin in the cytoplasm of embryonic cells of a sea urchin: video image analysis of fluorescence redistribution after photobleaching" // J. Cell Biol., vol. 99, no. 6, pp. 2157-2164, Dec. 1984.

[132] M. K. Gardner, B. D. Charlebois, I. M. Jânosi, J. Howard, A. J. Hunt, and D. J. Odde, "Rapid microtubule self-assembly kinetics" // Cell, vol. 146, no. 4, pp. 582-592, Aug. 2011.

[133] M. C. Alonso, D. R. Drummond, S. Kain, J. Hoeng, L. Amos, and R. A. Cross, "An ATP gate controls tubulin binding by the tethered head of kinesin-1" // Science, vol. 316, no. 5821, pp. 120-123, Apr. 2007.

[134] P. C. Nelson, C. Zurla, D. Brogioli, J. F. Beausang, L. Finzi, and D. Dunlap, "Tethered particle motion as a diagnostic of DNA tether length" II J. Phys. Chem. B, vol. 110, no. 34, pp. 1726017267, Aug. 2006.

[135] A. Jannasch, V. Bormuth, M. Storch, J. Howard, and E. Schaffer, "Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state" // Biophys. J., vol. 104, no. 11, pp. 2456-2464, Jun. 2013.

[136] L. C. Kapitein, E. J. G. Peterman, B. H. Kwok, J. H. Kim, T. M. Kapoor, and C. F. Schmidt, "The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks" // Nature, vol. 435, no. 7038, pp. 114-118, May 2005.

[137] F. Berger, C. Keller, S. Klumpp, and R. Lipowsky, "Distinct transport regimes for two elastically coupled molecular motors" // Phys. Rev. Lett., vol. 108, no. 20, p. 208101, May 2012.

[138] M. J. Schnitzer, K. Visscher, and S. M. Block, "Force production by single kinesin motors" // Nat. Cell Biol., vol. 2, no. 10, pp. 718-723, Oct. 2000.

[139] A. Kunwar, M. Vershinin, J. Xu, and S. P. Gross, "Stepping, strain gating, and an unexpected force-velocity curve for multiple-motor-based transport" // Curr. Biol. CB, vol. 18, no. 16, pp. 1173-1183, Aug. 2008.

[140] R. Marantz and M. L. Shelanski, "Structure of microtubular crystals induced by vinblastine in vitro" II J. Cell Biol., vol. 44, no. 1, pp. 234-238, Jan. 1970.

[141] J. Stumpff, Y. Du, C. A. English, Z. Maliga, M. Wagenbach, C. L. Asbury, L. Wordeman, and R. Ohi, "A tethering mechanism controls the processivity and kinetochore-microtubule plus-end enrichment of the kinesin-8 Kifl8A" // Mol. Cell, vol. 43, no. 5, pp. 764-775, Sep. 2011.

[142] L. S. Burrack, S. E. Applen, and J. Berman, "The requirement for the Daml complex is dependent upon the number of kinetochore proteins and microtubules" // Curr. Biol. CB, vol. 21, no. 10, pp. 889-896, May 2011.

[143] J. Thakur and K. Sanyal, "The essentiality of the fungus-specific Daml complex is correlated with a one-kinetochore-one-microtubule interaction present throughout the cell cycle, independent of the nature of a centromere" // Eukaryot. Cell, vol. 10, no. 10, pp. 1295-1305, Oct. 2011.

[144] A. R. R. Maia, Z. Garcia, L. Kabeche, M. Barisic, S. Maffini, S. Macedo-Ribeiro, I. M. Cheeseman, D. A. Compton, I. Kaverina, and H. Maiato, "Cdkl and Plkl mediate a CLASP2 phospho-switch that stabilizes kinetochore-microtubule attachments" II J. Cell Biol., vol. 199, no. 2, pp. 285-301, Oct. 2012.

[145] R. Dixit, B. Barnett, J. E. Lazarus, M. Tokito, Y. E. Goldman, and E. L. F. Holzbaur, "Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 2, pp. 492-497, Jan. 2009.

(^V

[146] M. I. Mayr, M. Storch, J. Howard, and T. U. Mayer, "A non-motor microtubule binding site is essential for the high processivity and mitotic function of kinesin-8 Kifl8A" // PloS One, vol. 6, no. 11, p. e27471, 2011.

[147] X. Su, W. Qiu, M. L. Gupta Jr, J. B. Pereira-Leal, S. L. Reek-Peterson, and D. Pellman, "Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8" II Mol. Cell, vol. 43, no. 5, pp. 751-763, Sep. 2011.

[148] L. N. Weaver, S. C. Ems-McClung, J. R. Stout, C. LeBlanc, S. L. Shaw, M. K. Gardner, and C. E. Walczak, "Kifl 8A uses a microtubule binding site in the tail for plus-end localization and spindle length regulation" // Curr. Biol. CB, vol. 21, no. 17, pp. 1500-1506, Sep. 2011.