Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Зайцев, Анатолий Владимирович

• Зайцев, Анатолий Владимирович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Зайцев, Анатолий Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 2 1 Общие сведения о митозе

211 Фазы митоза и строение митотического аппарата

2 1 2 Микротрубочки

2 13 Общие сведения о кинетохоре

2 2 Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор

2 3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочки и

кинетохора

2 4 Фосфорилирование кинетохорных белков киназой Aurora В играет ключевую

роль в установлении биориентации хромосом

2 5 Комплекс NDC80 - важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3 1 Приготовление проточной камеры, очистка и силанизация покровных стекол

3 1 1 Изготовление многоразовых проточных камер 28 3 1 2 Подготовка покровных стекол

3 2 Приготовление микротрубочек, стабилизированных таксолом и белков NDC80

3 3 Микроскопия полного внутреннего отражения

3 4 Анализ данных микроскопии

3 4 1 Определение кривых связывания комплексов NDC80 и МТ с помощью TIRF

микроскопии

3 4 2 Анализ кооперативности NDC80-MT взаимодействия с использованием

метода восстановления флюоресценции после выжигания (FRAP)

3 5 Теоретические подходы к оценке энергии связывания с МТ

4 РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Описание математической модели сайта связывания микротрубочки с кинетохора

4.2 Математическая модель сайта связывания микротрубочки

4.2.1 Фракция МТ-связанных комплексов определяет время закрепления МТ к сайту

4.2.2 Физиологическая стабильность закрепления МТ за кинетохор обеспечивается крайне короткоживущими взаимодействиями между комплексами и МТ

4.2.3 Кооперативность молекулярных взаимодействий сильно увеличивает влияние молекулярных параметров на стабильность закрепления КМТ

4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro

4.3.1 Взаимодействие NDC80 и МТ определяет полное число фосфомиметических замен, а не их положение в хвосте Heel

4.3.2 Увеличение числа фосфомиметических мутаций в хвосте Heel приводит к градуальному росту коэффициента диффузии комплекса NDC80 по МТ и уменьшению времени взаимодействия с МТ

4.3.3 Увеличение числа фосфомиметических замен в хвосте Heel градуально уменьшает энергию взаимодействия между единичными молекулами NDC80 и МТ

4.3.4 Взаимодействие NDC80-NDC80 слабое по сравнению с взаимодействие NDC80-MT

4.3.5 Кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется при фосфорилировании хвоста Heel

4.4 Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC80

4.4.1 Клетки с мутантным комплексом NDC80, содержащим одну фосфомиметическая мутацию в хвосте Heel комплекса NDC80, имеют нормальный кинетохорный пучок

4.4.2 Модель полного кинетохора со множеством сайтов закрепления

4.4.3 Алгоритм симуляции

4.4.4 Анализ чувствительности сайтовой модели кинетохора

4 5 Модель кинетохора, содержащая сайты связывания КМТ не может описать

наблюдаемые изменения в регуляции кинетохор-МТ взаимодействия при

фосфорилировании

4 6 Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов N0080 с МТ не

ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6 ВЫВОДЫ

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса»

1 ВВЕДЕНИЕ

Митоз является важнейшим этапом в клеточном цикле, в результате которого из одной материнской клетки образуются две дочерние клетки. Митотическое деление клеток лежит в основе развития и роста многоклеточных организмов, обеспечивает обновление тканей на протяжении жизни организма, а также регенерацию после повреждений. Важнейшей задачей митоза является точное распределение генетической информации материнской клетки по двум дочерним клеткам, что обеспечит их нормальное функционирование и последующее деление. Это происходит через распределение сестринских хромосом материнской клетки по двум дочерним клеткам. Хромосомы перемещаются в процессе митоза посредством взаимодействия с митотическим веретеном - сложным митотическим аппаратом, который состоит главным образом из двух полюсов деления и растущих из них микротрубочек. Микротрубочки представляют собой динамические полимеры белка тубулина, которые случайным образом переходят из состояния полимеризации в состояние быстрой деполимеризации. Взаимодействие хромосом и микротрубочек происходит через специальные белковые структуры на хромосомах, называемые кинетохорами. Кинетохор играет ключевую роль в установлении закрепления хромосомы и веретена деления, регуляции этих закреплений в процессе митоза и поддержании этих закреплений в процессе деполимеризации микротрубочки. Механизмы того, как кинетохор взаимодействует с микротрубочками, однако, остаются плохо изученными.

Цель работы:

Исследовать взаимодействие микротрубочки с кинетохорным комплексом NDC80, изучить влияние фосфорилирования белка Heel на это взаимодействие. Построить математическую модель кинетохора, позволяющую описать наблюдаемую in vivo регуляцию закрепления микротрубочек и кинетохора на основе полученных в экспериментах in vitro данных о взаимодействии комплекса NDC80 и микротрубочки.

Задачи исследования:

1. Построить математическую модель кинетохора, в которой взаимодействие микротрубочки и кинетохорных белков будет динамическим.

2. Экспериментально изучить взаимодействие как единичных комплексов NDC80,

так и ансамблей комплексов NDC80 с микротрубочками ш vitro.

5

3. Экспериментально изучить влияние фосфорилирования гибкого N-концевого участка белка Heel на взаимодействие комплекса NDC80 с микротрубочкой и на кооперативность взаимодействия комплекса NDC80.

4. Использовать полученные in vitro молекулярные параметры взаимодействия комплекса NDC80 и его фосфорилированных форм в построенной математической модели для анализа влияния фосфорилирования комплекса NDC80 на регуляцию взаимодействия кинетохора и микротрубочек.

Научная ннвщна:

В данной работе была впервые предложена теоретическая модель закрепления микротрубочки и кинетохора через ансамбль независимо связывающихся с микротрубочкой кинетохорных комплексов, в которой закрепление имеет динамический характер. Теоретически было показано, что для того, чтобы обеспечить закрепление микротрубочки и кинетохора с физиологическим значением характеристического времени взаимодействия 2 - 10 минут, молекулярные времена взаимодействия кинетохорных комплексов и микротрубочки должны составлять доли секунды (50 - 500 мс).

Впервые были экспериментально изучены характеристики взаимодействия комплекса NDC80 с микротрубочкой и его фосфорилированных форм, в том числе и промежуточных форм с неполным числом фосфорилированных сайтов в физиологическом буфере. Показано, что увеличение числа фосфомиметических мутаций в N-терминальном домене белка Heel (часть комплекса NDC80) приводит к постепенному снижению аффинности взаимодействия единичных комплексов NDC80 и микротрубочки. Был разработан новый метод получения кривых связывания белков и микротрубочек на основе флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Через использование данного метода впервые было количественно охарактеризовано влияние фосфорилирования на константу диссоциации Ко комплексов NDC80 и микротрубочки, а также кооперативность взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочки. Также был разработан метод количественного анализа кооперативности взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой на основе метода анализа восстановления флуоресценции после фотовыцветания. С использованием данного метода были получены значения параметра кооперативности для нефосфорилированной и фосфорилировапной формы комплекса NDC80, которые оказались статистически неразличимы. Это хороню согласуется с выводом, сделанным на основе кривых связывания комплекса NDC80 и микротрубочки.

Полученные экспериментально значения скоростей диссоциации код и параметра кооперативное™ для комплексов NDC80 с различной степенью фосфорилирования были использованы для построения математической модели кинетохора человека. Было показано, что наблюдаемая in vivo регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохора фосфорилированием комплексов NDC80 достигается только при определенном способе организации комплексов NDC80 на кинетохоре - в виде «динамического газона».

Научно-практическая значимость

Проведенное исследование вносит вклад в изучение фундаментальной проблемы организации взаимодействия кинетохоров и митотического аппарата клетки. В частности, демонстрируется, что наблюдаемая в клетках регуляция взаимодействия микротрубочек и кинетохоров может быть описана молекулярными параметрами взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочками и их фосфорилированных форм. Причем это возможно достичь только при определенной организации комплексов NDC80 на кинетохоре в виде «динамического газона». Разработанные математические модели взаимодействия микротрубочек и кинетохоров и измеренные in vitro молекулярные параметры кинетохорных белков служат базой для дальнейшего количественного изучения механизмов сегрегации хромосом в здоровых клетках и понимания того, как могут быть предотвращены или исправлены ошибки в клетках с хромосомной нестабильностью.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана математическая модель взаимодействия кинетохора и микротрубочки через ансамбль независимо взаимодействующих с микротрубочкой кинетохорных комплексов, позволяющая описать обмен кинетохорных микротрубочек.

2. Было изучено взаимодействие с микротрубочками кинетохорных комплексов NDC80 на уровне отдельных молекул.

3. Впервые для белков, взаимодействующих с микротрубочками, был охарактеризован механизм плавной регуляции аффинности взаимодействия через множество сайтов фосфорилирования.

4. Полное число фосфорилирований в N-концевом участке белка Hecl, а не конкретное расположение сайтов фосфорилирования, регулирует взаимодействие комплексов NDC80 с микротрубочкой.

5. Фосфорилирование N-концевого участка белка Heel комплекса NDC80 не влияет на кооперативность взаимодействия комплексов NDC80 с микротрубочкой.

6. Предложена новая модель организации комплексов NDC80 на кинетохоре -модель динамического газона, в которой комплексы NDC80 не образуют независимые сайты взаимодействия с микротрубочкой, а распределены по поверхности кинетохора случайным образом. Расчеты, проведенные с помощью данной модели, позволяют описать наблюдаемую in vivo в клетках регуляцию взаимодействия кинетохор-микротрубочка через молекулярные параметры комплексов NDC80, измеренные в экспериментах in vitro.

Список работ опубликованных по теме диссертации

По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 статьи и тезисы в сборниках 6 конференций.

Статьи:

1. Zaytsev, A.V., Sundin L.J.R., DcLuca К.F, Grishchuk E.L. and DeLuca J.G. (2014) Accurate phosphoregulation of kinetochore-microtubule affinity requires unconstrained molecular interactions. J. Cell Biol. 206(1 ):45-59.

2. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Grishchuk E.L. (2014) Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85).

3. Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. (2013) Highly transient molecular interactions underlie stability of kinetochore-microtubule attachment during cell division. Cell Mol. Bioeng. 6(4).

4. Volkov V.A., Zaytsev A.V., Gudimchuk N., Grissom P.M., Gintsburg A.L., Ataullakhanov F.I., Mcintosh J.R., Grishchuk E.L. (2013) Long tethers provide high-force coupling of the Dam 1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 110(19).

Тезисы в сборниках конференций:

1. Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. (2014) Toward quantitative theoretical description of the kinetochore-microtubule interactions and their roles in ensuring

accurate chromosome segregation American Society for Cell Biology Annual Meeting December 6-10, Philadelphia, Pennsylvania, USA

2 Zaytsev A. V., Sundin L J R , Nikashin B , DeLuca K F , Mick J , Guimaraes G J , Ataullakhanov F I, Gnshchuk E L, DeLuca J G (2013) Incremental phosphorylation of a dynamic lawn of NDC80 complexes provides graded control of kinetochore-microtubule affinity Poster presentation The 57lh Annual Biophysical Society Meeting Philadelphia, Pennsylvania, USA

3 Zaytsev A. V., Sundin L J R , Nikashin B , DeLuca K F , Mick J , Guimaraes G J , Ataullakhanov F I, Grishchuk E L, DeLuca J G, (2012) Incremental phosphorylation of competing NDC80 complexes tunes kinetochores for diverse mitotic functions Abstract # 385-Poster American Society for Cell Biology Annual Meeting San Francisco, California, USA

4 Zaytsev A.V., Sundin L J R , Nikashin B , Guimaraes G J , DeLuca K F , Mick J , Gnshchuk E L , DeLuca J G , (2012) Incremental phosphorylation of Heel tunes kinetochore-microtubule binding affinity for diverse mitotic functions Research Retreat and Symposium "Building Cellular Complexity One Molecule at a Time", Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA

5 Zaytsev A.V., Sundin L J R , Nikashin B , Guimaraes G J , DeLuca K F , Mick J , Grishchuk EL, DeLuca J G (2011) Incremental phosphorylation of Heel tunes kinetochore-microtubule binding affinity for diverse mitotic functions Poster presentation American Society for Cell Biology Annual Meeting Denver, Colorado, USA

6 Ataullakhanov F I, Zaytsev A.V., Welburn J , Cheeseman I, Grishchuk E L , (2011) Molecular-Mechanical Model of Kinetochore-Microtubule Interactions Identifies Flexibility of the Kinetochore Mesh as a Key Determinant of Errorless Bi-Orientation Abstract# 862-Poster The 55th Annual Biophysical Society Meeting Baltimore, Maryland, USA

7 Ataullakhanov F I, Zaytsev A.V., Welburn J , Cheeseman I, Grishchuk E L , (2010) Spatial phospho-regulation of microtubule affinity in a flexible kinetochore mesh is necessary and sufficient for expedient error-correction during chromosome segregation Abstract #784 American Society for Cell Biology Annual Meeting Philadelphia, Pennsylvania, USA

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Митотическое деление клеток (митоз) - важнейший процесс, который лежит в основе развития и роста многоклеточных организмов, обеспечивает обновление тканей на протяжении жизни организма, а также регенерацию после повреждений. В процессе митоза из каждой материнской клетки создаются две ее дочерние копии. Важнейшей задачей митоза является точное распределение генетической информации материнской клетки по двум дочерним клеткам, что обеспечит их нормальное функционирование и последующее деление. В фазе митоза генетическая информация клетки представлена в виде плотно упакованных структур ДНК и белков, называемых хромосомами. Передача генетической информации дочерним клеткам происходит через распределение сестринских хромосом материнской клетки по двум образующимся дочерним клеткам.

2.1 Общие сведения о митозе

Сведения о митозе обширны и многообразны. Общее число работ на эту тему, вероятно, превышает десятки тысяч, и в небольшом обзоре рассмотрено быть не может. В данном обзоре литературы будут рассмотрены следующие вопросы:

• Фазы митоза и строение митотического аппарата

• Строение микротрубочек

• Общие сведения о кинетохоре Более подробно будут рассмотрены вопросы

• динамики кинетохор-микротрубочкового взаимодействия и

• теоретические представления об этом процессе.

• Комплекс ЫОС8() занимает особое место в нашей работе и будет рассмотрен отдельно

2.1.1 Фазы митоза и строение митотического аппарата

Обычно выделяют четыре фазы митотического деления: профаза, метафаза, анафаза и телофаза (рис. 2.1). В профазе происходит конденсация хромосом, начинает формироваться веретено деления, происходит распад ядерной оболочки, и хромосомы оказываются случайно расположенными в цитоплазме. Перед переходом клетки в прометафазу каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид, соответствующих двум копиям молекулы ДНК.

02 Профаза

Рис 2.1. Последовательность фаз митотического деления клетки.

Сестринские хроматиды соединены между собой в специальной области, называемой центромерой. На каждой хроматиде есть специальная область, называемая кинетохором, через которую к хромосомам могут присоединяться микротрубочки, тем самым связывая их с веретеном деления. Веретено деления образует сложную пространственную структуру, состоящую из двух полюсов деления и растущих из них микротрубочек, которая самоорганизуется из единичных белков на стадии профазы митоза. Полюса деления образуются из двух центриолей, которые разделяются на начальной стадии митоза, в профазе, и начинают расходиться в противоположные стороны. Каждый полюс деления представляет собой центр роста микротрубочек. В течение прометафазы происходит процесс, называемый биориентацией хромосом - к кинетохорам хромосом присоединяются и отсоединяются микротрубочки от разных полюсов деления. Причем наблюдаются как латеральные, так и концевые взаимодействия микротрубочек с кинетохорами. Этот сложный процесс происходит до тех пор, пока не достигается состояние, в котором к каждой хроматиде подходят микротрубочки только от одного полюса деления. Параллельно происходит движение хромосом в сторону центра клетки, где они начинают выстраиваться и образовывать так называемую метафазную пластинку. Когда процесс образования метафазной пластинки завершается и кинетохоры всех хромосом установят закрепления с микротрубочками, происходит переход в анафазу, в которой происходит ключевой процесс в делении клетки - перемещение хромосом к противоположным полюсам деления. В анафазе кинетохоры сестринских хроматид разъединяются, и хроматиды становятся самостоятельными хромосомами. Микротрубочки веретена деления, прикреплённые к кинетохорам, начинают деполимеризоваться и тянуть за собой хромосомы; таким образом, хроматиды точно расходятся к полюсам клетки. В заключительной стадии - телофазе - хромосомы начинают деспирализоваться, и из обрывков ядерной оболочки формируется два дочерних ядра. Далее, у животных происходит деление на две клетки путем образования перетяжки, у растений - путем образования клеточной стенки в середине клетки. Так, из одной клетки образуется две дочерние, содержащие генетическую информацию материнской клетки. Остановимся подробнее на ключевом аспекте деления клетки - процессе разделения хромосом, который осуществляется через веретено деления.

2.1.2 Микротрубочки

Микротрубочки представляют собой полимеры белка тубулина (рис 2.2). Гетеродимеры тубулина образуют цилиндрическую структуру, как правило, из 13-ти параллельно уложенных протофиламентов. Микротрубочки динамически нестабильны, т.е. находятся попеременно в состоянии удлинения и укорачивания. Процесс перехода в состояние укорачивания из состояния роста называется катастрофой, обратный процесс -из состояния укорачивания в состояние роста, называется спасением. Протофиламенты микротрубочки представляют собой линейные полимеры гетеродимеров тубулина - альфа и бетта тубулинов. Таким образом, микротрубочка имеет полярность - так называемые, плюс и минус конец. Плюс-концы быстрее удлиняются, но медленнее укорачиваются, чем минус-концы (Horio and Hotani, 1986). В делящейся клетке минус-концы микротрубочек более стабильны и расположены в районе полюсов веретена деления. Плюс-концы микротрубочек более динамичны и осуществляют взаимодействие с хромосомами (рис. 2.3). Множество микротрубочек, взаимодействующих с кинетохорами, называется кинетохорными микротрубочками. Часть микротрубочек, называемых интерполярными, образуют каркас веретена деления.

2.1.3 Общие сведения о кинетохоре

Кинетохоры представляют собой белковые супер-комплексы, расположенные в области центромеры хромосомы. Главной функцией кинетохоров является установление закреплений с микротрубочками веретена деления и обеспечение перемещения хромосом с динамическими плюс-концами микротрубочек. На сегодняшний день наиболее хорошо изучен кинетохор почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae's. Кинетохоры в данных организмах содержат примерно 60 различных белков и связываются только с одной микротрубочкой. За некоторыми исключениями, почти все эти белки, от дрожжей до человека, эволюционно консервативны (Musacchio and Salmon, 2007). Обычно различают три слоя организации кинетохора - внутренний, внешни и промежуточный слои кинетохора. Ко внутреннему слою относятся белки, закрепляющиеся за центромерный участок ДНК. Ключевой белок данного слоя - белок CENP-A, который замещает гистон 113 в области центромеры хромосомы (Palmer et al., 1991). Ключевым белковым комплексом промежуточного и внешнего слоев кинетохора является так называемая сеть KMN, состоящая из трех комплексов KNL-1, Mis 12, and NDC80

(Cheeseman et al., 2006). Эти белки отвечают непосредственно за присоединение кинетохора к микротрубочкам.

50 нм

Рис. 2.2 (А) Структурная модель белка гетеродимера а, (3 - тубулина -минимальной структурной единицы микротрубочки. Красным цветом показаны связанные с тубулином молекулы ГТФ. Размер одного димера тубулина - 8 нм. (Б) Димеры тубулина соединяются между собой и образуют протофиламенты. (В) Отдельные протофиламенты соединяются между собой "бок о бок" и образуют микротрубочку с просветом посередине. (Г) Электронная микрофотография микротрубочки. Изображение адаптировано из Alberts et al., 2008.

Рис. 2.3. Схематичное изображение веретена деления клетки. 1 - полюса деления; 2 - микротрубочки (+ обозначает их «плюс-конец»), 3 -хромосомы, состоящие из двух сестринских хроматид; окружности на хромосомах - кинетохоры (белым цветов обозначены кинетохоры, закрепившиеся за плюс-конец микротрубочек). 4 - биориентированная хромосома. Изображение адаптировано из Rieder and Salmon, 1998.

2.2 Динамика закреплений микротрубочка-кннетохор

Ошибки в процессе деления клетки приводят к хромосомной нестабильности, что является серьезной опасностью для здоровья человека (Thompson et al., 2010). Ошибки в процессе митоза могут привести к анеуплоидии - ситуации, когда одна или обе дочерние клетки содержат неправильное число хромосом. В настоящий момент хорошо известно, что хромосомная нестабильность часто обуславливается нарушениями в динамике взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами. Даже низкие дозы веществ, которые влияют на взаимодействие кинетохоров и микротрубочек, приводят к ошибкам в процессе распределения хромосом по дочерним клеткам (Bakhoum et al., 2009). В митозе, МТ присоединяются и отсоедишотся от кинетохоров со средним временем закрепления 3 -4 мин в прометафазе (Bakhoum et al., 2009; Cimini et al., 2006; Zhai et al., 1995). По мере того как число МТ на кинетохорах возрастает, закрепления МТ к кинетохорам становятся более стабильными, и их среднее время закрепления увеличивается до 7 - 10 мин в метафазе (Cimini et al., 2006; DeLuca et al., 2006). Природа связей, которые обеспечивают такое динамическое закрепление МТ и кинетохора остается слабо исследованной.

2.3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочкн и кинетохора

Предыдущие теоретические работы моделировали кинетохор как совокупность отдельных сайтов связывания МТ, каждый из которых содержит МТ-связывающие комплексы, организованные в структуру цилиндра (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002; Shtylla and Keener, 2010) или кольца (Armond and Turner, 2010; Efremov et al., 2007; Liu and Onuchic, 2006; Molodtsov et al., 2005) (рис. 2.4). Эти модели привели к значительному пониманию того, как хромосомы могут перемещаться вместе с разбирающимся концом деполимеризующейся МТ, а также как сила, создаваемая кинетохорными МТ, может передаваться хромосоме. Но все эти модели не рассматривали аспект стабильности закрепления МТ к кинетохору. Классический МТ-связывающий «рукав Хилла» представляет собой структуру, состоящую из 65 комплексов, 90-95% из которых находятся в состоянии связанном с МТ в каждый момент времени в отсутствие внешней силы (Hill, 1985; Joglekar and Hunt, 2002). Таким образом, рукав Хилла, и сопрягающее устройство в виде кольца, состоящее из 15-20 МТ-связывающих комплексов (Efremov et al., 2007), будут формировать очень стабильные закрепления, которые, возможно, будут

открепляться только если на МТ будет действовать сила, направленная от кинетохора и превышающая 5-10 пН. Структурные исследования кинетохоров в различных организмах показали, что, наиболее вероятно, интерфейс кинетохор-МТ состоит из многочисленных фибрилл (Dong et al., 2007; Mcintosh et al., 2013), а не рукавов. В последнее время было разработано несколько теоретических моделей кинетохоров состоящих из независимых МТ-саязывающих белков (Civelekoglu-Scholey et al., 2013; Mcintosh et al., 2008), однако, в этих моделях не исследовался систематически вопрос о том, какие структурные и молекулярные параметры обеспечивают и регулируют стабильность закрепления МТ и кинетохора.

Наиболее изученным простейшим кинетохором в клетках эукариот является кинетохор почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Кинетохоры в данных организмах образуют закрепление с единственной микротрубочкой, и белковая композиция и структурная организация данных кинетохоров хорошо изучена средствами флюоресцентной микроскопии высокого разрешения (Joglekar et al., 2009) и электронной микроскопии (Gonen et al., 2012). В клетках позвоночных число кинетохорным микротрубочек растет в течение прометафазы митоза, и к моменту наступления метафазы кинетохоры содержат примерно 25-30 кинетохорных микротрубочек (McDonald et al., 1992; McEwen et al., 1997). Сайт взаимодейтвия с единичной микротрубочкой на кинетохорах позвоночных содержит во многом похожие белки, что и кинетохор почкующихся дрожжей (Joglekar et al., 2008), поэтому довольно распространено представление о том, что кинетохоры позвоночных организмов состоят из отдельных сайтов связывания с микротрубочкой, где каждый такой сайт аналогичен по строению и по белковому составу близок к простейшему кинетохору почкующихся дрожжей (Zinkowski et al., 1991). Однако важно заметить, что на данный момент анализ кинетохоров позвоночных с помощью электронной микроскопии не обнаружил повторяющихся структурных элементов, которые могли бы быть такими сайтами взаимодействия с микротрубочками (Dong et al., 2007; Mcintosh et al., 2013). Данный факт оставляет открытой возможность того, что кинетохоры, связывающие большое количество КМТ, не содержат структурной организации, а белки, связывающие МТ, распределены но поверхности кинетохора случайным образом (модель молекулярного «газона»), В соответствии с распространенным представлением о субъединичном строении кинетохоров высших эукариот, многие теоретические модели кинетохора

рукав Хилла

« кольцо Оат1

г"

независимо взаимодействующие с МТ белки

Рис. 2.4. Теоретические модели взаимодействия микротрубочки и кинетохора.

предполагают, что кппетохориые микротрубочки могут взаимодействовать с определенным набором специализированных белков, которые объединяются в один сайт. Данный сайт часто представляется как рукав (Hill, 1985), или как кольцо, с которым взаимодействует микротрубочка (Efremov et al., 2007). Ключевым свойством таких моделей является то, что одна микротрубочка может взаимодействовать только с кинетохорными белками, принадлежащими одному сайту (Joglekar and Hunt, 2002), и кинетохорные белки, принадлежищие различным сайтам, не могут взаимодействовать одновременно с одной микротрубочкой.

Динамические взаимодействия между микротрубочками (МТ) и кинетохорами крайне важны для аккуратного деления клетки, но немногое известно о биофизике этих взаимодействий (Grishchuk et al., 2012; Joglekar et al., 2010). Были предложены различные модели, объясняющие закрепления микротрубочки и кинетохоров. Модели, описывающие закрепления кинетохор-микротрубочка, можно разделить на два класса. Одни модели описывают взаимодействия кинетохора и микротрубочки посредством некоторых структурных образований, таких как кольца или рукава (Davis et al., 2007). Другой класс моделей описывает кинетохор-микротрубочковое взаимодействие через множество независимых соединений (Mcintosh et al., 2008; Zaytsev et al., 2013; Civelekoglu-Scholey et al., 2013; Keener and Shtylla et al., 2014). Такая различная организация кинетохора приводит к различным термодинамическим и кинетическим требованиям к индивидуальным кинетохорным белкам, связывающимся с микротрубочками. На данном этапе сложно осуществить предпочтение одной модели другой, потому что немногое известно о количественных характеристиках взаимодействия с микротрубочками индивидуальных кинетохорных белков. По этой причине, крайне актуальной задачей является полное биофизическое исследование молекулярного взаимодействия между ключевыми кинетохорными белками и микротрубочками. Так как стабильность закрепления кинетохорных микротрубочек изменяется в процессе митоза, это исследование должно также затрагивать и молекулярные механизмы регуляции взаимодействий между кинетохорными белками и микротрубочками.

2.4 Фосфорилнрование кинетохорных белков киназой Aurora В играет ключевую роль в установлении биориентаци" хромосом

В прометафазе, начальной стадии митоза, хромосомы ориентированы случайным

образом относительно веретена деления и образуют закрепления с микротрубочками в

различных случайных конфигурациях (рис. 2.5). Для успешной сегрегации хромосом в

19

Рис. 2.5. Схематичное изображение возможных конфигураций закреплений кинетохорных микротрубочек и хромосом в процессе митоза. А -меротельные закрепления; В - биориентированные закрепления; С -монотельные закрепления; О - синтельные закрепления. Красным (синим) цветом показаны кинетохорные микротрубочки растущие из левого (правого) полюса.

процессе анафазы, требуется, чтобы до наступления анафазы все хромосомы находились в биориентированном состоянии. Из эксперимента хорошо известно, что на начальных стадиях митоза образуется большое количество меротельных закреплений (Cimini et al., 2001), которые должны быть исправлены и переведены в биориентированные до наступления анафазы. Ключевую роль в данном процессе играет киназа Aurora В, субстратами которой являются многие кинетохорные белки, такие как комплекс NDC80, комплекс KNL1, кинезин CENP-E, некоторые из которых будут подробно рассмотрены далее (Lampson and Cheeseman, 2011). Киназа Aurora В является частью комплекса Chromosome Passenger Complex (СРС), который включает в себя белки INCENP, Survivin и Borelian (Ruchaud et al., 2007). Комплекс СРС до наступления анафазы находится в связанном с центромерным участком хромосом состоянии (рис. 2.6). После наступления анафазы комплекс СРС делокализуется с хромосом и концентрируется в центральной области веретена деления, где затем участвует в регуляции цитокинеза. В современных исследованиях предложено множетство специфичных ингибиторов киназы Aurora В. В исследования с использованием этих ингибиторов было установлено, что использование ингибитора киназы Aurora В в культуре живых клеток приводит к стабилизации неправильных закреплений микротрубочек и кинетохоров, которые сохраняются вплоть до наступления анафазы (Kallio et al., 2002), что демонстрирует важность ферментативной активности киназы Aurora В в установлении биориентированных закреплений. На настоящий момент считается, что механизм, благодаря которому киназа Aurora В может селективно стабилизировать закрепления микротрубочек и кинетохоров на биориентированных хромосомах и дестабилизировать на хромосомах с неправильными закреплениями, основан на принципе пространственного разделения киназы Aurora В и её субстратов - кинетохорных белков. Действительно, микротрубочки, закрепившиеся за кинетохоры, развивают тянущие силы в направлении полюсов, из которых они растут. Если хромосома находится в небиориентированном состоянии, то это означает, что один из сестринских кинетохоров либо не имеет закреплений с микротрубочками, либо имеет закрепления с микротрубочками растущими из обоих полюсов, либо оба сестренских кинтохора имеют закрепления с микротрубочками, растущими из одного полюса. В небиориентированных конфигурациях, натяжение между сестринскими кинетохорами, создаваемое кинетохорными микротрубочками, не достигает своего максимального значения, и кинетохоры остаются в области высокой активности киназы Aurora В (рис. 2.6). Известно, что фосфорилированное состояние для кинетохорных белков

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зайцев, Анатолий Владимирович, 2015 год

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Akiyoshi B., Sarangapani K.K., Powers A.F., Nelson C.R., Reichow S.L., Arellano-Santoyo H., Gonen T., Ranish J.A., Asbury C.L., and Biggins S., "Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments" // Nature, vol. 468, no. 7323, pp. 576-579. Nov. 2010.

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter. P. "Molecular Biology of the Cell", 5th edition. // Garland Science, 2008.

Alushin G.M., Ramey V.H., Pasqualato S., Ball D.A., Grigorieff N., Musacchio A., Nogales E., "The Ndc80 kinetochore complex forms oligomeric arrays along microtubules" // Nature, vol. 467, no. 7317, pp. 805-810, Oct. 2010.

Alushin G.M., Musinipally V., Matson D., Tooley J., Stukenberg P.T., Nogales E., "Multimodal microtubule binding by the Ndc80 kinetochore complex" // Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 19, no. 11, pp. 1161-1167, Nov. 2012.

Aravamudhan P., Felzer-Kim I., Joglekar A.P. "The budding yeast point centromere associates with two Cse4 molecules during mitosis" // Curr. Biol., vol. 23, no. 9, pp. 770-774, May 2013.

Armond J.W., Turner M.S., "Force transduction by the microtubule-bound Daml ring" // Biophys. J., vol. 98, no. 8, pp. 1598-1607, Apr. 2010.

Bakhoum S.F., Genovese G., Compton D.A., "Deviant kinetochore microtubule dynamics underlie chromosomal instability" // Current Biol., vol. 19, no. 22, pp. 1937-1942, Dec. 2009.

Bormuth V., Varga V., Howard J., Schaffer E., "Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules" // Science, vol. 325, no. 5942, pp. 870873, Aug. 2009.

Bulinski J.C., Odde D.J., Howell B.J., Salmon T.D., Waterman-Storer C.M., "Rapid dynamics of the microtubule binding of ensconsin in vivo" // J. Cell Sci., vol. 114, no. 21, pp. 3885-3897, Nov. 2001.

Cheeseman I M , Chappie J S , Wilson-Kubalek E M , Desai A "The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore" // Cell, vol 127, no 5, pp 983-997, Dec 2006

Ciferri C et al, "Implications for kinetochore-microtubule attachment from the structure of an engineered Ndc80 complex" // Cell, vol 133, no 3, pp 427-439, May 2008

Cimini D ,etal, "Merotelic kinetochore orientation is a major mechanism of aneuploidy in mitotic mammalian tissue cells" // J Cell Biol, vol 153, no 3, pp 517-527, Apr 2001

Cimini D, Wan X, Hirel C B , Salmon E D "Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors" // Current Biol, vol 16, no 17,pp 1711-1718,Sep 2006

Civelekoglu-Scholey, G et al, "Dynamic bonds and polar ejection force distribution explain kinetochore oscillations in PtKl cells"// J Cell Biol, vol 201, no 17, pp 577-593, Sep 2013

Davis T N, Wordeman L "Rings, bracelets, sleeves, and chevrons new structures of kinetochore proteins" // Trends Cell Biol, vol 17, no 8, pp 377-382, Aug 2007

DeLuca J G et al., "Kinetochore microtubule dynamics and attachment stability are regulated by Hec 1" // Cell, vol 127, no 5, pp 969-982, Dec 2006

DeLuca KF, Lens SM, DeLuca JG "Temporal changes in Heel phosphorylation control kinetochore-microtubule attachment stability during mitosis" // J Cell Sci, vol 124, no 4, pp 622-634, Feb 2011

Dong Y , Vanden Beldt K J , Meng X , Khodjakov A , McEwen B F "The outer plate in vertebrate kinetochores is a flexible network with multiple microtubule interactions" // Nat Cell Biol vol 9, no 5, pp 516-522, May 2007

Efremov A , Grishchuk E L, Mcintosh J R , Ataullakhanov F I "In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions" // Proc Natl Acad Sci U S A,vo\ 104, no 48, pp 19017-19022, Nov 2007

Erickson H P, O'Brien E T, "Microtubule dynamic instability and GTP hydrolysis" //

112

Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., vol. 21, pp. 145-166, 1992.

Festa R., Galleani E., "Diffusion coefficient for a brownian particle in a periodic field of force" // PhysicaA: Statistical Mechanics and its Applications, vol. 90, pp. 229-244, 1978.

Gestaut D.R., Graczyk B., Cooper J., Widlund P.O., Zelter A., Wordeman L., Asbury C.L., Davis T.N., "Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Daml complex do not require ring formation" // Nat. Cell Biol., vol. 10, no. 4, pp. 407-414, Apr. 2008.

Gonen S., Akiyoshi B., Iadanza M.G., Shi D., Duggan N., Biggins S., Gonen T. "The structure of purified kinetochores reveals multiple microtubule-attachment sites" // Nat. Struct. Mol. Biol, vol. 19, no. 9, pp. 925-929, Sep. 2012.

Grishchuk E.L., Spiridonov I.S., Volkov V.A., Efremov A., Westermann S., Drubin D., Barnes G., Ataullakhanov F.I., Mcintosh J.R., "Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 105, no. 19, pp. 6918-6923, May 2008.

Grishchuk E.L., Ataullakhanov F.I. "In vitro assays to study the tracking of shortening microtubule ends and to measure associated forces" // Methods Cell Biol., vol., 95, pp. 657-676, 2010.

Grishchuk E.L., Mcintosh J.R., Molodtsov M.I., Ataullakhanov F.I., "Force Generation by Dynamic Microtubule Polymers" // Comprehensive Biophysics, vol. 4, Elsevier, Amsterdam, pp. 97-113,2012.

Guimaraes G.J., Dong Y., McEwen B.F., Deluca J.G., "Kinetochore-microtubule attachment relies on the disordered N-terminal tail domain of Heel" // Curr. Biol., vol. 18, no. 22, pp. 1778-1784, Nov. 2008.

Helenius J., Brouhard G., Kalaidzidis Y., Diez S., Howard J., "The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends" // Nature, vol. 441, no. 7089, pp. 115-119, May 2006.

Hill T.L., "Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 82, no. 13, pp. 4404^1408, Jul. 1985.

Horio T., Hotani H., "Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy" // Nature, vol. 321, no. 6070, pp. 605-607, Jun. 1986.

Hyman A., Drechsel D., Kellogg D., Salser S., Sawin K., Steffen P., Wordeman L.,

Mitchison T. "Preparation of modified tubulins" // Methods Enzymol., vol. 196, pp. 478-485, 1991.

Jiang L., Gao Y., Mao F., Liu Z., Lai L., "Potential of mean force for protein-protein interaction studies"// Proteins, vol. 46, no. 2, pp. 190-196, Feb. 2002.

Joglekar A.P., Hunt A.J., "A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements" // Biophys. J., vol. 83, no. 1, pp. 42-58, Jul. 2002.

Joglekar A.P., Bloom K., Salmon E.D., "In vivo protein architecture of the eukaryotic kinetochore with nanometer scale accuracy" // Curr. Biol., vol. 19, no. 8, pp. 694-699, Apr.

2009.

Joglekar A.P., Bloom K.S., Salmon E.D., "Mechanisms of force generation by end-on kinetochore-microtubule attachments" // Curr. Opin. Cell Biol., vol. 22, no. 1, pp. 57-67, Feb.

2010.

Johnston K. et al, "Vertebrate kinetochore protein architecture: protein copy number" // J. Cell Biol., vol. 189, no. 6, pp. 937-943, Jun. 2010.

Kallio M.J., McCleland M.L., Stukenberg P.T., Gorbsky G.J., "Inhibition of aurora B kinase blocks chromosome segregation, overrides the spindle checkpoint, and perturbs microtubule dynamics in mitosis." // Curr Biol., vol. 12, no. 11, pp. 900-905, Jun. 2002.

Keener J.P., Shtylla B.A., "Mathematical Model of Force Generation by Flexible Kinetochore-Microtubule Attachments" // Biophys. J., vol. 106, no. 5, pp. 998-1007, Mar. 2014.

Lampson M.A., Cheeseman I.M., "Sensing centromere tension: Aurora B and the regulation of kinetochore function." // Trends Cell Biol., vol. 21, no. 3, pp. 133 - 140, Mar. 2011.

Lawrimore J., Bloom K.S., Salmon E.D., "Point centromeres contain more than a single centromere-specific Cse4 (CENP-A) nucleosome" II J. Cell Biol., vol. 195, no. 4, pp. 573-582, Jun. 2011.

Lee C.W., Ferreon J.C., Ferreon A.C., Arai M., Wright P.E., "Graded enhancement of p53 binding to CREB-binding protein (CBP) by multisite phosphorylation" // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 107, no. 45, pp. 19290-19295, Nov. 2010.

Liu J., Onuchic J. N., "A driving and coupling "Pac-Man" mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A" // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 103, no. 49, pp. 18432-18437, Dec. 2006.

McDonald K.L., O'Toole E.T., Mastronarde D.N., Mcintosh J.R., "Kinetochore microtubules in PTK cells" II J. Cell Biol., vol. 118, no. 2, pp. 369-383, Jul. 1992.

McEwen B.F., Heagle A.B., Cassels G.O., Buttle K.F., Rieder C.L. "Kinetochore fiber maturation in PtKl cells and its implications for the mechanisms of chromosome congression and anaphase onset. II J. Cell Biol., vol. 137, no. 7, pp. 1567-1580, Jun. 1997.

McGhee J.D., von Hippel P.H., "Theoretical aspects of DNA-protein interactions: cooperative and non-co-operative binding of large ligands to a one-dimensional homogeneous lattice" II J. Mol. Biol., vol. 86, no. 2, pp. 469-489, Jun. 1974.

Mcintosh J.R. et al., "Fibrils connect microtubule tips with kinetochores: a mechanism to couple tubulin dynamics to chromosome motion" // Cell, vol. 135, no. 2, pp. 322-333, Oct. 2008.

Mcintosh J.R., O'Toole E., Zhudenkov K., Morphew M., Schwartz C., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L., "Conserved and divergent features of kinetochores and spindle microtubule ends from five species" // J. Cell Biol., vol. 200, no. 4, pp. 459-474, Feb. 2013.

Miller S.A., Johnson M.L., Stukenberg P.T., "Kinetochore attachments require an interaction between unstructured tails on microtubules and Ndc80(Hecl)" // Curr. Biol., vol. 18, no. 22, pp. 1785-1791, Nov. 2008.

Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., Mcintosh JR., Ataullakhanov F.I., "Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study" // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 102, no. 12, pp. 4353-4358, Mar. 2005.

Musacchio A., Salmon E.D. "The spindle-assembly checkpoint in space and time" // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 8, no. 5, pp. 379-393, May 2007.

Okada Y., Hirokawa N., "Mechanism of the single-headed processivity: diffusional anchoring between the K-loop of kinesin and the C terminus of tubulin" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 97, no. 2, pp. 640-645, Jan. 2000.

Palmer D. K., O'Day K., Trong H. L., Charbonneau II., Margolis R. L., "Purification of the centromere-specific protein CENP-A and demonstration that it is a distinctive histone" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 88, no. 9, pp. 3734-3738, May 1991.

Powers A.F., Franck A.D., Gestaut D R., Cooper J., Gracyzk B., Wei R.R., Wordeman L., Davis T.N., Asbury C.L., "The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion" // Cell, vol. 136, no. 5, pp. 865-875, Mar. 2009.

Pufall M.A., Lee G.M., Nelson M.L., Kang H.S., Velyvis A., Kay L.E., Mcintosh L.P., Graves B.J., "Variable control of Ets-1 DNA binding by multiple phosphates in an unstructured region" // Science., vol. 309, no. 5731, pp. 142-145, Jul. 2005.

Rieder C. L., Salmon E.D., "The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis" // Trends Cell Biol., vol. 8, no. 8, pp. 310-318, Aug. 1998.

Ruchaud S., Carmena M., Earnshaw W.C., "Chromosomal passengers: conducting cell divisiont" // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 8, no. 10, pp. 798-812, Oct. 2007.

Salazar C., Hofer T., "Multisite protein phosphorylation - from molecular mechanisms to kinetic models" // FEBSJ., vol. 276, no. 12, pp. 3177-3198, Jun. 2009.

Salmon E.D., Saxton W.M., Leslie R.J., Karow M.L., Mcintosh J.R., "Diffusion coefficient of fluorescein-labeled tubulin in the cytoplasm of embryonic cells of a sea urchin:

video image analysis of fluorescence redistribution after photobleaching" II J. Cell Biol., vol. 99, no. 6, pp. 2157-2164, Dec. 1984.

Santaguida S., Musacchio A., "The life and miracles of kinetochores" // EMBO J., vol. 28, no. 17, pp. 2511-2531, Sep. 2009.

Shtylla B., Keener J.P., "A mechanomolecular model for the movement of chromosomes during mitosis driven by a minimal kinetochore bicyclic cascade" II J. Theor. Biol, vol. 263, no. 4, pp. 455^170, Apr. 2010.

Sprague B.L., Pego R.L., Stavreva D.A., McNally J.G., "Analysis of binding reactions by fluorescence recovery after photobleaching" // Biophys. J., vol. 86, no. 6, pp. 3473-3495, Jun. 2004.

Thompson S.L., Bakhoum S.F., Compton D.A., "Mechanisms of chromosomal instability" // Current Biol., vol. 20, no. 6, pp. R285-R295, Mar. 2010.

Tooley J., Stukenberg P.T., "The Ndc80 complex: integrating the kinetochore's many movements"// Chromosome Res., vol. 19, no. 3, pp. 377-391, Apr. 2011.

Umbreit N.T. et ah, "The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics" // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 40, pp. 16113-16118, Oct. 2012.

Volkov V.A., Zaytsev A.V., Grishchuk E.L., "Preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends" // J. Vis. Exp., vol. 85., Mar. 2014.

Wei R.R., Al-Bassam J., Harrison S C., "The Ndc80/HEC1 complex is a contact point for kinetochore-microtubule attachment" II Nat. Struct. Mol. Biol., vol. 14, no. 1, pp. 54-59, Jan. 2007.

Welburn J.P., Vleuge M., Liu D., Yates J.R. 3rd, Lampson M.A., Fukagawa T., Cheeseman I.M. "Aurora B phosphorylates spatially distinct targets to differentially regulate the kinetochore-microtubule interface" // Mol Cell., vol. 38, no. 3, pp. 383-392, May 2010.

Wilson-Kubalek E.M., Cheeseman I.M., Yoshioka C., Desai A., Milligan R.A. "Orientation and structure of the Ndc80 complex on the microtubule lattice" // J. Cell Biol., vol. 182, no. 6, pp. 1055-1061, Sep. 2008.

Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. "Highly Transient Molecular Interactions Underlie the Stability of Kinetochore-Microtubule Attachment During Cell Division" // Cell. Mol. Bioeng., vol. 6, no. 4, Dec. 2013.

Zhai Y., Kronebusch P.J., Borisy G.G. "Kinetochore microtubule dynamics and the metaphase-anaphase transition"// / Cell Biol., vol. 131, no. 3, pp. 721-734, Nov. 1995.

Zinkowski R.P., Meyne J., Brinkley B.R., "The centromere-kinetochore complex: a repeat subunit model" II J. Cell Biol., vol. 113, no. 5, pp. 1091-1110, Jun. 1991.

Zaytsev A.V., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. "Highly Transient Molecular Interactions Underlie the Stability of Kinetochore-Microtubule Attachment During Cell Division" // Cell. Mol. Bioeng., vol. 6, no. 4, Dec. 2013.

Zhai Y., Kronebusch P.J., Borisy G.G. "Kinetochore microtubule dynamics and the metaphase-anaphase transition" II J. Cell Biol., vol. 131, no. 3, pp. 721-734, Nov. 1995.

Zinkowski R.P., Meyne J., Brinkley B.R., "The centromere-kinetochore complex: a repeat subunit model" II J. Cell Biol., vol. 113, no. 5, pp. 1091-1110, Jun. 1991.