Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Федянина, Ольга Сергеевна

• Федянина, Ольга Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Федянина, Ольга Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Schizosaccharomyces pombe как модельный объект исследований.

1.2 Клеточный цикл делящихся дрожжей S. pombe.

1.3 Регуляция клетбчного цикла у S. pombe.

1.4 Митотическое деление клетки.

1.4.1 Особенности митотического деления S. pombe.

1.4.2 Инициация митоза у S. pombe.

1.4.3 Система клеточного контроля (checkpoint) и инициация анафазы.

1.5 Строение микротрубочек.

1.5.1 Формирование тубулиновых димеров. Роль тубулин-свертывающих кофакторов.

1.5.2 Кофактор D высших эукариот.

1.5.3 Мутации alpl-1315 и alpl-tl/tsml-512.

1.6 Центромера-связывагощие белки (CENPs).

1.6.1 CENP-B и CENP-B-подобные белки.

1.6.2 Abplp - CENP-B подобный белок.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Среды и условия роста S. pombe.

Генетические методы.

Метод случайных спор.

Метод тетрадного анализа.

Тест на определение температурной чувствительности.

Тест на определение типа спаривания.

Методы клеточной биологии.

Трансформация клеток S. pombe.

Измерение частоты потери минихромосомыpSp(cenl)-7L-sup3E.

Обработка результатов теста по определению частоты потери минихромосомы.

Синхронизация клеток S. pombe в Gi/Go-фазе методом азотного голодания.

Иммунофлуоресценция.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

Часть I Сегрегация хромосом у делящихся дрожжей с мутациями кофактора

Сравнение температурочувствительности alpl-1315 и alpl-tl, мутантыых аллелей кофактора D.

Стабильность минихромосомы в мутантах кофактора D зависит от условий роста клеток.

Рост клеток alpl-tl на богатой среде контролируется белками митотического контроля (чекпойнта).

Неравная сегрегация хромосом в клетках с мутациями в гене, кодирующем кофактор D, сопровождается отсутствием метафазы в митозе.

Мутации в гене, кодирующем кофактор D, чувствительны к повышению уровня экспрессии CENP-B-подобного белка Abplp.

Генетические взаимодействия между компонентами кинетохора и веретена деления предполагают их существенную роль в установлении оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой.

Часть II Тубулиновые димеры при нарушении функции кофактора D остаются функциональными в течение одного клеточного цикла.

Клетки с мутациями cdclOи клетки alpl-1315 имеют похожую кинетику гибели.

Клетки с мутацией alpl-1315 гибнут в первом митозе при 36°С после синхронизации в Gi-фазе.

Выживаемость клеток с мутацией alpl-1315 остается высокой на протяжении сс/с25-22-зависимой блокировки митотического деления.

Микротрубочки в клетках с мутацией alpl-1315 становятся сильно поврежденными через 3 часа инкубации при 36°С независимо от прохождения Gi-фазы.:.

Часть III Клетки cdc25-22 alpl-1315, освобожденные после cdc25-22-зависимон блокировки митотического деления, имеют примерно часовую задержку в инициации митоза.

Появление на полюсе Plol-GFP задерживается и имеет медленную кинетику в клетках cdc25-22 alpl-1315, освобожденных после cdc25-22-зависимой блокировки митотического деления.

В клетках cdc25-22 alpl-1315, освобожденных после cdc25-22- зависимой блокировки митотического деления, не наблюдается изменений ни в количестве, ни в длине микротрубочек, но есть изменения в их яркости.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

Генетический анализ функции кофактора D S. ротЪе.

Анализ сегрегации хромосом в клетках с мутациями кофактора D.

Продолжительность функциональности тубулиновых димеров при нарушении функции кофактора D.

Инициация митоза после cdc25-22 - зависимой блокировки митотического деления.".

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe»

Понимание механизмов клеточного деления - это одна из важнейших задач современных биомедицинских исследований. Одной из ключевых фаз клеточного цикла является митоз. В процессе митоза происходит разделение генетической информации. Это осуществляется путем конденсации хроматина, "созревания" кинетохоров и образования веретена деления из микротрубочек. Взаимодействие микротрубочек с кинетохорами обеспечивает правильное закрепление и сегрегацию хромосом в процессе митоза. Неправильная сегрегация хромосом может привести к возникновению тяжелых заболеваний и гибели. Поэтому во время клеточного деления процесс сегрегации хромосом тщательно контролируется системой митотического контроля, называемым чекпойнтом веретена деления. Функция этой системы заключается в задерживании стадии расхождения хромосом до тех пор, пока все хромосомы не будут правильным образом прикреплены к микротрубочкам и биориентированы относительно полюсов деления.

Микротрубочки являются важнейшим компонентом цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании формы клетки, в транспорте органелл, и становятся жизненно необходимы в митозе. Именно поэтому они являются одними из главных мишеней для противоопухолевых препаратов. Микротрубочки это динамичные биополимеры, состоящие из сф-гетеродимеров тубулина. Повышение уровня свободного а- и р-тубулина токсично для клеток и жестко регулируется (Cleveland et al. 1981). В формировании оф-гетеродимеров тубулина участвует пять кофакторов: А, В, С,

D, E (Szymanski 2002). Кофакторы сборки тубулиновых сф-гетеродимеров это эволюционно консервативные белки у эукариот от дрожжей до человека (Lewis et al. 1997; Szymanski 2002). Было показано, что мутации в гене, кодирующем кофактор Е, который является партнером кофактора D в пути сборки тубулиновых димеров. приводит к возникновению у человека тяжелых синдромов, приводящих к гипопаротироидизму, задержке умственного развития и лицевому дисморфизму (Parvari et al. 2002). Эти заболевания вызваны нарушениями димеризации тубулина и недостатком микротрубочек. Лучше всего биохимический путь формирования димеров изучен in vitro на выделенных белках быка (Tian et al. 1996; Tian et al. 1997; Tian et al. 1999). Кофакторы действуют на финальном этапе образования третичной структуры а- и Р-тубулинов, способствуя формированию собственно сф-гетеродимера. Кофакторы В и А связываются с а- и Р-тубулипом соответственно (Tian et al. 1996), затем они передают а- и р-тубулины кофакторам Е и D (Tian et al. 1997) соответственно, которые вместе с тубулинами образуют тетрамерный комплекс. Присоединение кофактора С и последующий гидролиз ГТФ завершают сборку димера (Tian et al. 1999).

Изучение пути свертывания тубулиновых димеров у различных организмов показало, что есть вариации в его работе. Например, у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), как и высших эукариот, кофакторы жизненно необходимы для сборки тубулиновых димеров. А у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) шапероны сборки тубулиновых димеров не является жизненно необходимым и это указывает на то, что формирование димеров у высших эукариот и у S. pombe имеют больше общего, чем у S. cerevisiae. Основным отличием пути формирования у S. pombe от высших эукариот является ведущая роль кофактора D в сворачивании тубулиновых димеров (Radcliffe et al. 1999). Достоинством делящихся дрожжей, как объекта исследования, является простота различных генетических манипуляций, в отличие от клеток высших эукариот. Хотя у S. pombe путь формирования димеров жизненно необходим, однако были получены мутации в генах, кодирующих кофакторы сборки тубулиновых димеров, приводящие к температурочувствительности клеток: клетки с такими мутациями жизнеспособны в определенном диапазоне температур и не жизнеспособны либо при повышении (температурная чувствительность), либо при понижении (холодочувствительность) температуры. Подобные мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к исчезновению микротрубочек в клетках при росте на запрещающей температуре (Grishchuk and Mcintosh 1999; Hirata et al 1998; Radcliffe et al.1999; Radcliffe et al. 2000a). Есть основания думать, что тубулин-свертывающие кофакторы помимо сворачивания димеров, обладают и рядом других функций в клетке. Так было показано, что кофакторы D, Е и В в клетках животных при переизбытке обладают способностью разрушать димеры тубулина (Kortazar et al. 2006, 2007). Также, температурочувствительная мутация tsml-512 в гене, кодирующем кофактор D у S. pombe, генетически взаимодействует с мутациями в генах, кодирующих компоненты Комплекса Инициирующего Анафазу и протеасомы (Grishchuk et al. 1998). Мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к разрушениям структур микротрубочек, что впоследствии приводит к неправильному делению клетки. Однако какие стадии митоза нарушаются при отсутствии функции кофакторов до настоящего времени не было известно. Этот вопрос являлся целью данной работы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа выполнялась с целью выявить роль кофактора D, участвующего в формировании нативной конформации тубулинового димера, в митозе.

Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач:

1. Определить частоту возникновения дефектов сегрегации хромосом в клетках S. pombe с мутациями кофактора D при помощи минихросомы, и определить, зависит ли она от условий роста клеток и функционального состояния кинетохорных комплексов.

2. С помощью генетических методов определить возможных "партнеров" кофактора D в клетке среди белков кинетохорного комплекса.

3. С помощью методов флуоресцентной микроскопии определить какие митотические процессы нарушены в клетках с мутациями кофактора D.

4. Исследовать причины, приводящие к медленному развитию митотических нарушений в клетках с мутациями кофактора D, используя различные методы синхронизации клеточного цикла.

Научная новизна. В работе показано, что клетки с мутациями кофактора D имеют повышенную частоту потери минихромосомы. Мутанты кофактора D генетически взаимодействует с компонентами кинетохора Disl, Mad2, MpHl, Abpl, что предполагает существенную роль кофактора D в установлении оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой. Оба мутанта кофактора D имеют дефекты в прохождении метафазы. Также показано, что температурочувствительный фенотип alpl-1315 не связан с прохождением определенной фазы клеточного цикла при запрещенной температуре, белок Alpl-1315 перестает выполнять свою функцию уже после 2 часов пребывания при 36°С независимо от стадии клеточного цикла. Это означает, что в клетках с мутацией в гене, кодирующем кофактор D ар-тубулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла при 36°С. Практическая значимость. Сбой в контроле клеточного деления приводит к таким событиям для клетки, как гибель или неконтролируемый рост. Исследование различных аспектов клеточного деления позволяет продвинуться в понимании фундаментальных механизмов, обеспечивающих правильность клеточного делениям. Кроме этого, было показано, что нарушение димеризации тубулина и недостаток микротрубочек приводит к возникновению у человека тяжелых заболеваний, таких как синдромы Sanjad-Sakati и Kenny-Caffey (Parvari et al. 2002). Поэтому исследование функции шаперонов тубулина является важной задачей, которая может иметь практическое значение для лечения подобных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мутации в кофакторе D приводят к повышению частоты потери минихромосомы. Степень этого эффекта зависит от условий роста клеток, от нарушений функционирования кинетохора, вызванного изменением уровня CENP-B-подобного белка Abplp, а также от нормального функционирования митотического чекпойнта.

2. Генетические взаимодействия мутантов кофактора D указывают на то, что - возможными партнерами кофактора D среди белков кинетохорного комплекса являются белки Abp 1 и Dis 1.

3. Нарушение функции кофактора D приводит к неправильной сегрегации хромосом скорее всего из-за отсутствия нормальной метафазной конфигурации. Этот дефект может быть вызван проблемами с поддержанием метафазной структуры веретена и/ или нарушениями кинетохор-микротрубочковых взаимодействий.

4. Гибель мутантов кофактора D через 4 часа после перевода клеток в условия, нарушающие работу этого белка, скорее всего, связана с тем, что при отсутствии функции кофактора D, оф-тубулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении только одного клеточного цикла.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Федянина, Ольга Сергеевна

выводы

1. Кофактор D необходим для правильной сегрегации хромосом, и, возможно, имеет дополнительную функцию, связанную с установлением оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой.

2. Возможными партнерами кофактора D среди белков кинетохорного комплекса являются белки Abpl и Dis 1.

3. Причиной гибели клеток с мутацией кофактора D alpl-1315 после переноса на 36°С во втором клеточном делении (через 4-5 часов) является исчезновение неповрежденных микротрубочек (через 3 часа) вследствие инактивации мутантного белка Alpl-1315 (через 2 часа).

4. ар-тубулиновые гетеродимеры при нарушении функции кофактора D способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла.

Благодарности

За предоставленные штаммы и плазмиды благодарю: Т. Toda, М. Baum and L. Clarke, К. Gould, P. Russel, Т. E. Patterson and S. Sazer, M. Yanagida, I. Hagan. 3a помощь в выполнении генетических скрещиваний к.б.н. Е. JI. Грищук, к.б.н.П. Марданов, А. Тикуиов, А. Пивоварова, L. Tran, Е. Токареву, A. Book за выполнение эксперимента по синхронизации alpl-1315 в Ог-фазе, Е. Токареву за помощь в обработке фотографий клеток. За критическое прочтение манускрипта к.б.н. Пантелеева М.А., к.б.н. Молодцова М.И., к.б.н. Сударикова А.Б. Благодарю к.б.н. Куренную О.Н. и к.б.н. Бериташвили Д.Р. за поддержку, предоставление рабочего места и оборудования в ИБГ РАН. Огромная благодарность научным руководителям к.б.н. Е. JI. Грищук и д.б.н.Ф.И.

Атауллаханову.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Федянина, Ольга Сергеевна, 2008 год

1. Alberts В., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, К. Roberts and J. D. Watson (1994) Molecular Biology of Cell. Garland publishing, USA.

2. Alfa C, Fantes P, Hyams J, Mcleod M, Warbrick E (1993) Experiments With Fission Yeast. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

3. Amor DJ, Kalitsis P, Sumer H, Choo KH (2004) Building the centromere: from foundation proteins to 3D organization. Trends Cell Biol 14:359-368

4. Armas-Portela R, Kremer L, Avila J (1991) The centromere protein CENP-B behaves as a microtubule-associated protein. Acta Histochem Suppl 41:37-43

5. Balczon RD, Brinkley BR (1987) Tubulin interaction with kinetochore proteins: analysis by in vitro assembly and chemical cross-linking. J Cell Biol 105:855-62

6. Baum M, Clarke L (2000) Fission yeast homologs of human CENP-B have redundant functions affecting cell growth and chromosome segregation. Mol Cell Biol 20:28522864

7. Bahler J, Steever AB, Wheatley S, Wang Y, Pringle JR, Gould KL, McCollum D (1998) Role of polo kinase and Midlp in determining the site of cell division in fission yeast. J Cell Biol. 143:1603-16.

8. Bernard P, Hardwick K, Javerzat JP (1998) Fission yeast bubl is a mitotic centromere protein essential for the spindle checkpoint and the preservation of correct ploidy through mitosis. J Cell Biol 143:1775-1787

9. Bhamidipati A, Lewis SA, Cowan NJ (2000) ADP ribosylation factor-like protein 2 (Arl2) regulates the interaction of tubulin-folding cofactor D with native tubulin. J Cell Biol 149:1087-1096

10. Booher RN, СЕ Alfa, JS Hyams and DH Beach (1989) The fission yeast cdc2/cdcl3/sucl protein kinase: regulation of catalytic activity and nuclear localization. Cell. 58(3):485-97

11. Brenner S, Pepper D, Berns MW, Tan E, Brinkley BR (1981) Kinetochore structure, duplication, and distribution in mammalian cells: analysis by human autoantibodies from scleroderma patients J Cell Biol. 91(1):95-102.

12. Caplow M, Fee L (2002) Dissociation of the tubulin dimer is extremely slow, thermodynamically very unfavorable, and reversible in the absence of an energy source. Mol Biol Cell 13:2120-2131

13. Chen C, Hong YK, Ontiveros SD, Egholm M, Strauss WM (1999) Single base discrimination of CENP-B repeats on mouse and human Chromosomes with PNA-FISH. Mamm Genome. 10(1): 13-8.

14. Chretien D, Flyvbjerg H, Fuller SD (1998) Limited flexibility of the inter-protofilament bonds in microtubules assembled from pure tubulin. Eur Biophys J. 27(5):490-500.

15. Ciosk R, Zachariae W, Michaelis C, Shevchenko A, Mann M, Nasmyth K(1998) An ESP1/PDS1 complex regulates loss of sister chromatid cohesion at the metaphase to anaphase transition in yeast. Cell. 93(6):1067-76.

16. Clarke L, Baum MP, 1990 Functional analysis of a centromere from fission yeast: a role for centromere-specific repeated DNA sequences. Mol Cell Biol 10:1863-1872

17. Cleveland DW, Lopata MA, Sherline P, Kirschner MW (1981). Unpolymerized tubulin modulates the level of tubulin mRNAs. Cell. 25:537-546.

18. Craig JM, Earnshaw WC, Vagnarelli P (1999) Mammalian centromeres: DNA sequence, protein composition, and role in cell cycle progression. Exp Cell Res. 246(2):249-62. Review.

19. Cunningham LA, Kahn RA. 2008. Cofactor D functions as a centrosomal protein and is required for the recruitment of the gamma -tubulin ring complex at centrosomes and organization of the mitotic spindle. J Biol Chem. Epub ahead of print.

20. Decottignies A, Zarzov P, Nurse P (2001) In vivo localization of fission yeast cyclin-dependent kinase cdc2p and cyclin В cdcl3p during mitosis and meiosis. J Cell Sci 114:2627-2640

21. Dhonukshe P, Barqmann BO, Gadella TW (2006) Arabidopsis tubulin folding cofactor В interacts with alpha-tubulin in vivo. Plant Cell Physiol. 47(10): 1406-1411.

22. Ding R, West RR, Morphew DM, Oakley BR, Mcintosh JR (1997) The spindle pole body of Schizosaccharomyces pombe enters and leaves the nuclear envelope as the cell cycle proceeds. Mol Biol Cell 8:1461-1479

23. Earnshaw WC, Machlin PS, Bordwell В J, Rothfield NF, Cleveland DW (1987) Analysis of anticentromere autoantibodies using cloned autoantigen CENP-B. Proc Natl Acad Sci USA. 84(14):4979-83.

24. Ekwall K, Olsson T, Turner BM, Cranston G, Allshire RC (1997) Transient inhibition of histone deacetylation alters the structural and functional imprint at fission yeast centromeres. Cell 91:1021 -1032

25. Elledge SJ (1996) Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science. 274(5293):!664-72. Review.

26. Fankhauser С, Reymond A, Cerutti L, Utzig S, Hofmann K, Simanis V (1995) The S. pombe cdcl5+ gene is a key element in the reorganization of F-actin at mitosis. Cell 82:435-444

27. Fankhauser C, Marks J, Reymond A, Simanis V (1993) The S. pombe cdcl6* gene is required both for maintenance of p34cdc2 kinase activity and regulation of septum formation: a link between mitosis and cytokinesis? EMBO J 12:2697-2704

28. Fitzgerald-Hayes M, Clarke L, Carbon J (1982) Nucleotide sequence comparisons and functional analysis of yeast centromere DNAs. Cell. 29(l):235-44.

29. Forsburg SL, Nurse P (1991) Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol. 1991;7:227-56. Review.

30. Fowler KJ, Hudson DF, Salamonsen LA, Edmondson SR, Earle E, Sibson MC, Choo KH (2000) Uterine dysfunction and genetic modifiers in centromere protein B-deficient mice. Genome Res. 10(1):30-41.

31. Furuya K, Takahashi K, Yanagida M (1998) Faithful anaphase is ensured by Mis4, a sister chromatid cohesion molecule required in S phase and not destroyed in Gi phase. Genes Dev. 12(21):3408-3418.

32. Gao Y, Thomas JO, Chow RL, Lee GH, Cowan NJ (1992)A cytoplasmic chaperonin that catalyzes beta-actin folding. Cell. 69(6): 1043-50.

33. Gao Y, Vainberg IE, Chow RL, Cowan NJ (1993) Two cofactors and cytoplasmic chaperonin are required for the folding of alpha- and beta-tubulin. Mol Cell Biol. 13(4):2478-85.

34. Glover, D.M., Hagan, I.M., and Tavares, A. (1998). Polo kinases: a team that plays throughout mitosis. Genes Dev. 12,3777-3787

35. Gordon С, McGurk G, Dillon P, Rosen C, Hastie ND (1993) Defective mitosis due to a mutation in the gene for a fission yeast 26S protease subunit. Nature. 366:355-357

36. Gordon C, McGurk G, Wallace M, Hastie ND (1996) A conditional lethal mutant in the fission yeast 26 S protease subunit mts3+ is defective in metaphase to anaphase transition. J Biol Chem 271:5704-5711

37. Goshima G, Saitoh S, Yanagida M (1999) Proper metaphase spindle length is determined by centromere proteins Mis 12 and Mis6 required for faithful chromosome segregation. Genes Dev 13:1664-1677

38. Grishchuk EL, Mcintosh JR (1999) Stolp, a fission yeast protein similar to tubulin folding cofactor E, plays an essential role in mitotic microtubule assembly. J Cell Sci 112:1979-1088.

39. Grishchuk EL, Howe JL, Mcintosh JR (1998) A screen for genes involved in the anaphase proteolytic pathway identifies tsml+, a novel Schizosaccharomyces pombe gene important for microtubule integrity. Genetics 149:1251-1264

40. Grynberg M, Jaroszewski L, Godzik A (2003) Domain analysis of the tubulin cofactor system: a model for tubulin folding and dimerization. BMC Bioinformatics 4:46у

41. Hagan IM (1998) The fission yeast microtubule cytoskeleton. J Cell Sci 111:16031612

42. Hahnenberger KM, Baum MP, Polizzi CM, Carbon J, Clarke L (1989) Construction of functional artificial minichromosomes in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Proc Natl Acad Sci U S A 86:577-581

43. Halverson D, Baum M, Stryker J, Carbon J, Clarke L (1997) A centromere DNA-binding protein from fission yeast affects chromosome segregation and has homology to human CENP-B. J Cell Biol 136:487-500

44. Hansen WJ, Cowan NJ, Welch WJ (1999) Prefoldin-nascent chain complexes in the folding of cytoskeletal proteins. J Cell Biol. 145(2):265-77.

45. Hardwick KG, RC Johnston, DL Smith, and AW Murray 2000 MAD3 encodes a novel component of the spindle checkpoint which interacts with Bub3p, Cdc20p, and Mad2p. J Cell Biol. 148(5):871-82.

46. Hardwick KG, Weiss E, Luca FC, Winey M, Murray AW (1996) Activation of the budding yeast spindle assembly checkpoint without mitotic spindle disruption. Science 273: 953-956.

47. He X, Patterson ТЕ, Sazer S (1997) The Schizosaccharomyces pombe spindle checkpoint protein Mad2p blocks anaphase and genetically interacts with the anaphase-promoting complex. Proc Natl Acad Sci U S A 94:7965-7970

48. He X, Jones MN, Winey M, Sazer S (1998) Mphl, a member of the Mpsl-like family of dual specificity protein kinases, is required for the spindle checkpoint in S. pombe. J Cell Sci 111:1635-1647

49. Hirano T, Hiraoka Y, Yanagida M (1988) A temperature-sensitive mutation of the Schizosaccharomyces pombe gene nuc2+ that encodes a nuclear scaffold-like protein blocks spindle elongation in mitotic anaphase. J Cell Biol 106:1171-1183

50. Hiraoka Y, Toda T, Yanagida M (1984) The NDA3 gene of fission yeast encodes beta-tubulin: a cold-sensitive nda3 mutation reversibly blocks spindle formation and chromosome movement in mitosis. Cell 39:349-358

51. Hirata D, Masuda H, Eddison M, Toda T (1998) Essential role of tubulin-folding cofactor D in microtubule assembly and its association with microtubules in fission yeast. EMBO J 17:658-666

52. Hoffmann I, PR Clarke, MJ Marcote, E Karsenti, and G Draetta (1993) Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2~cyclin В and its involvement in the self-amplification of MPF at mitosis. EMBO J. 12(l):53-63.

53. Hoffman DB, CG Pearson, TJ Yen, В J Howell, and ED Salmon (2001) Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins atPtKl kinetochores. Mol Biol Cell. 12(7):1995-2009.

54. Hoyt MA, L Totis and ВТ Roberts (1991) S. cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function. Cell. 66(3):507-17.

55. Hoyt MA, Маске JP, Roberts ВТ, Geiser Ж (1997) Saccharomyces cerevisiae PAC2 functions with CIN1, 2 and 4 in a pathway leading to normal microtubule stability. Genetics 146:849-857

56. Hoyt MA, Stearns T, Botstein D (1990) Chromosome instability mutants of Saccharomyces cerevisiae that are defective in microtubule-mediated processes. Mol Cell Biol 10:223-234

57. Hwang LH, Lau LF, Smith DL, Mistrot CA, Hardwick KG, Hwang ES, Amon A, Murray AW (1998) Budding yeast Cdc20: a target of the spindle checkpoint. Science. 279(5353): 1041-4.

58. Ikui AE, Furuya K, Yanagida M, Matsumoto T (2002) Control of localization of a spindle checkpoint protein, Mad2, in fission yeast. J Cell Sci 115:1603-1610

59. Irelan J T, Gutkin GI, Clarke L (2001) Functional redundancies, distinct localizations and interactions among three fission yeast homologs of centromere protein-B. Genetics 157:1191-1203

60. Izumi T, JL Mailer (1993) Elimination of cdc2 phosphorylation sites in the cdc25 phosphatase blocks initiation of M-phase. Mol Biol Cell. 4(12):1337-50.

61. Izumi T, JL Mailer (1995) Phosphorylation and activation of the Xenopus Cdc25 phosphatase in the absence of Cdc2 and Cdk2 kinase activity. Mol Biol Cell. 6(2):215-26.

62. Kim SH, Lin DP, Matsumoto S, Kitazono A, Matsumoto T (1998) Fission yeast Slpl: an effector of the Mad2-dependent spindle checkpoint. Science. 79(5353):1045-7.

63. King RW, J-M Peters, S Tugendreich, M Rolfe, P Hieter and MW Kirschner (1995) A 20S complex containing CDC27 and CDC 16 catalyzes the mitosis-specific conjugation of ubiquitin to cyclinB. Cell. 81(2):279-88.

64. Kitagawa К, H Masumoto, M Ikeda, and T Okazaki (1995) Analysis of protein-DNA and protein-protein interactions of centromere protein В (CENP-B) and properties of the DNA-CENP-B complex in the cell cycle. Mol Cell Biol. 15(3):1602-12.

65. Kitamura К, H Maekawa, and С Shimoda (1998) Fission yeast Ste9, a homolog of Hctl/Cdhl and Fizzy-related, is a novel negative regulator of cell cycle progression during Gl-phase. Mol Biol Cell. 9(5): 1065-80.

66. Kobayashi Y, S Saitoh, Y Ogiyama, S Soejima, К Takahashi (2007) The fission yeast DASH complex is essential for satisfying the spindle assembly checkpoint induced by defects in the inner-kinetochore proteins. Genes Cells. 12:311-328

67. Kovelman Rand P Russell (1996) Stockpiling of Cdc25 during a DNA replication checkpoint arrest in Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol. 16(l):86-93.

68. Kortazar D, Carranza G, Bellido J, Villegas JS, Fanarraga ML, Zabala JS (2006) Native tubulin-folding cofactor E purified from baculovirus-infected Sf9 cells dissociates tubulin dimers. Protein Expr Purif. 49(2): 196-202.

69. Kortazar D, Fanarraga ML, Carranza G, Bellido J, Villegas JS, Avila J, Zabala JS (2007) Role of cofactors В (TBCB) and E (TBCE) in tubulin heterodimer dissociation. Exp Cell Res. 313(3):425-436

70. Kumada К, T Nakamura, К Nagao, H Funabiki, T Nakagawa and M Yanagida (1998) Cutl is loaded onto the spindle by binding to Cut2 and promotes anaphase spindle movement upon Cut2 proteolysis. Curr Biol. 8(11):633-41.

71. Kumagai A, Dunphy WG. (1996). Purification and molecularcloningof Plxl, a Cdc25-regulatory kinase fromXenopus egg extracts. Science 273, 1377-1380

72. Lee Ж, Huberman JA, Hurwitz J (1997) Purification and characterization of a CENP-B homologue protein that binds to the centromeric K-type repeat DNA of Schizosaccharomyces pombe. Proc Natl Acad Sci U S A 94:8427-8432

73. Le Goff X, Woollard A, Simanis V (1999) Analysis of the cpsl gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262(l):163-72.

74. Lew DJ, Burke DJ (2003) The spindle assembly and spindle position checkpoints. Annu. Rev. Genet. 37: 251-282

75. Lewis SA, G Tian and NJ Cowan (1997) The alpha- and beta-tubulin folding pathways. Trends Cell Biol. 7(12):479-84.

76. Li R and AW Murray (1991) Feedback control of mitosis in budding yeast. Cell. 66(3):519-31.

77. Li Y and R Benezra (1996) Identification of a human mitotic checkpoint gene: hsMAD2. Science. 274(5285):246-8.

78. Locovei AM, M-G Spiga, К Tanaka, Y Murakami, and G D'Urso (2006) The CENP-B homolog, Abpl, interacts with the initiation protein Cdc23 (MCM10) and is required for efficient DNA replication in fission yeast. Cell Div. 1:27.

79. Lopez-Fanarraga M, Avila J, Guasch A, Coll M, Zabala JC (2001) Review: postchaperonin tubulin folding cofactors and their role in microtubule dynamics. J Struct Biol 135:219-229

80. Lopez-Girona А, В Furnari, О Mondesert and P Russell (1999) Nuclear localization of Cdc25 is regulated by DNA damage and a 14-3-3 protein. Nature. 97(6715):172-5.

81. Lytle BL, Peterson FC, Qiu SH, Luo M, Zhao Q, Markley JL, Volkman BF (2004) Solution structure of a ubiquitin-like domain from tubulin-binding cofactor B. J Biol Chem 279:46787-46793

82. McKay GJ and LR Cooke (1997) A PCR-based method to characterise and identify benzimidazole resistance in Helminthosporium solani. FEMS Microbiol Lett. 152(2):371-8.

83. Maclver FH, К Tanaka, AM Robertson and IM Hagan (2003) Physical and functional interactions between polo kinase and the spindle pole component Cutl2 regulate mitotic commitment in S. pombe. Genes Dev 17(12):1507-23.

84. Mallavarapu A, Sawin K, Mitchison T (1999) A switch in microtubule dynamics at the onset of anaphase В in the mitotic spindle of Schizosaccharomyces pombe. Curr Biol 9:1423-1426

85. Maiato H, DeLuca J, Salmon ED, Earnshaw WC (2004) The dynamic kinetochore-microtubule interface. J Cell Sci 117:5461-5477

86. Martin L, Fanarraga ML, Aloria K, Zabala JC (2000) Tubulin folding cofactor D is a microtubule destabilizing protein. FEBS Lett 470:93-95

87. Matsumoto T (1997) A fission yeast homolog of CDC20/p55CDC/Fizzy is required for recovery from DNA damage and genetically interacts with p34cdc2. Mol Cell Biol. 17(2):742-50.

88. Masumoto H, Masukata H, Muro Y, Nozaki N, Okazaki T (1989) A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109(5): 1963-73.

89. Mcintosh JR (1991) Structural and mechanical control of mitotic progression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 56:613-9. Review.

90. Mcintosh JR, Grishchuk EL, West RR (2002) Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol 18:193-219

91. Melki R, Vainberg IE, Chow RL, Cowan nJ (1993) Chaperonin-mediated folding of vertebrate actin-related protein and gamma-tubulin. J Cell Biol. 122(6):1301-10.

92. Michaelis C, R. Ciosk, K. Nasmyth (1997) Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell. 91(l):35-45.

93. Millband DN, Hardwick KG (2002) Fission yeast Mad3p is required for Mad2p to inhibit the anaphase-promoting complex and localizes to kinetochores in a Bublp-, Bub3p-, and Mph 1 p-dependent manner. Mol Cell Biol 22:2728-2742.

94. Mitchison and Nurse (1985) Growth in cell length in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 75:357-76.

95. Mondesert О, McGowan CH, Russel P (1996) Cig2, a B-type cyclin, promotes the onset of S in Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol. 16(4): 1527-33.

96. Moreno S, J Hayles and P Nurse (1989) Regulation of p34cdc2 protein kinase during mitosis. Cell. 58(2):361-72.

97. Moreno S, Klar A, Nurse P (1991) Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe, pp. 795-823 in Methods in Enzymology, edited by C. guthrie and g. Fink. Academic Press, Inc., New York.

98. Moser BA and P Russell (2000) Cell cycle regulation in Schizosaccharomyces pombe. Curr Opin Microbiol. 3(6):631-6. Review.

99. Mulvihill DP Mulvihill, J Petersen, H Ohkura, David M. Glover,1" and IM Hagan (1999) Plol kinase recruitment to the spindle pole body and its role in cell division in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell.l0(8):2771-85.

100. Murakami Y, Huberman JA, Hurwitz J (1996) Identification, purification, and molecular cloning of autonomously replicating sequence-binding protein 1 from fission yeast Schizosaccharomyces pombe. ProcNatl Acad Sci U S A 93:502-507

101. Nakagawa H, Lee JK, Hurwitz J, Allshire RC, Nakayama J, Grewal SI, Tanaka K, Murakami Y (2002) Fission yeast CENP-B homologs nucleate centromeric heterochromatin by promoting heterochromatin-specific histone tail modifications. Genes Dev 16:1766-1778

102. Nakaseko Y, Goshima G, Morishita J, Yanagida M (2001) M phase-specific kinetochore proteins in fission yeast: microtubule-associating Disl and Mtcl display rapid separation and segregation during anaphase. Curr Biol 11:537-549

103. Nasmyth K, Peters JM, Uhlmann F (2000) Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science. 288(5470): 1379-85. Review.

104. Nigg, E.A. (1998). Polo-like kinases: positive regulators of cell division from start to finish. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 776-783.

105. Novak B, Mitchison JM (1989) The first transition point of the mutant cdc2.33 in the fission yeast S. pombe. J Cell Sci. 94: 657-662

106. Ohkura H, Adachi Y, Kinoshita N, Niwa O, Toda T, Yanagida M (1988) Cold-sensitive and caffeine-supersensitive mutants of the Schizosaccharomyces pombe dis genes implicated in sister chromatid separation during mitosis. EMBO J 7:1465-1473

107. Syndrome Consortium, Mutation of TBCE causes hypoparathyroidism-rand and autosomal recessive Kenny-Caffey syndrome, Nat. Genet. 32: 448^152.

108. Perez-Castro AV, Shamanski FL, Meneses JJ, Lovato TL, Vogel KG, Moyzis RK, Pedersen R (1998) Centromeric protein В null mice are viable with no apparent abnormalities. Dev Biol.201(2):135-43.

109. Petersen J and IM Hagan (2005) Polo kinase links the stress pathway to cell cycle control and tip growth in fission yeast. Nature. 435(7041):507-12.

110. Polizzi С and L Clarke, (1991) The chromatin structure of centromeres from fission yeast: differentiation of the central core that correlates with function. J Cell Biol. 112(2):191-201.

111. Radcliffe PA, Hirata D, Vardy L, Toda T (1999) Functional dissection and hierarchy of tubulin-folding cofactor homologues in fission yeast. Mol Biol Cell 10:2987-3001

112. Radcliffe PA, Garcia MA, Toda T (2000a) The cofactor-dependent pathways for alpha- and beta-tubulins in microtubule biogenesis are functionally different in fission yeast. Genetics 156:93-103

113. Radcliffe PA, Vardy L, Toda T (2000b) A conserved small GTP-binding protein Alp41 is essential for the cofactor-dependent biogenesis of microtubules in fission yeast. FEBS Lett 468:84-88

114. Radcliffe P, Hirata D, Childs D, Vardy L, Toda T (1998) Identification of novel temperature-sensitive lethal alleles in essential beta-tubulin and nonessential alpha 2-tubulin genes as fission yeast polarity mutants. Mol Biol Cell 9:1757-1771

115. Ren Y, Zhao J, Feng J (2003) Parkin binds to alpha/beta tubulin and increases their ubiquitination and degradation. J Neurosci 23:3316-3324

116. Rieder CL, Cole RW, Khodjakov A, Sluder G (1995) The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130(4):941-8.

117. Ritzi M and Knippers R (2000) Initiation of genome replication: assembly and disassembly of replication-competent chromatin. Gene. 245(l):13-20. Review.

118. Saitoh S, Takahashi K, Yanagida M (1997) Mis6, a fission yeast inner centromere protein, acts during Gl/S and forms specialized chromatin required for equal segregation. Cell. 90(1): 131-143

119. Samejima I, Yanagida M (1994) Bypassing anaphase by fission yeast cut9 mutation: requirement of cut9+ to initiate anaphase. J Cell Biol 127:1655-1670

120. Sawin KE, Nurse P (1998) Regulation of cell polarity by microtubules in fission yeast. J Cell Biol.l42(2):457-471

121. Shern JF, Sharer JD, Pallas DC, Bartolini F, Cowan NJ, Reed MS, Pohl J, Kahn RA (2003) Cytosolic Arl2 is complexed with cofactor D and protein phosphatase 2A. J Biol Chem 278:40829-40836

122. Shultz T, Shmuel M, Hyman T, Altschuler Y. 2008. Beta-tubulin cofactor D and ARL2 take part in apical junctional complex disassembly and abrogate epithelial structure. FASEB J. 22:168-182.

123. Stearns T, Hoyt MA, Botstein D (1990) Yeast mutants sensitive to antimicrotubule drugs define three genes that affect microtubule function. Genetics 124:251-262

124. Stern В and P Nurse (1996) A quantitative model for the cdc2 control of S phase and mitosis in fission yeast. Trends Genet. 12(9):345-50. Review.

125. Symchen G (1978) Cell cycle mutants. Ann. Rev. Genet. 12:161-191

126. Szymanski D (2002) Tubulin folding cofactors: half a dozen for a dimer. Curr Biol 12:R767- R769

127. Takahashi K, S Murakami, Y Chikashige, H Funabiki, О Niwa, and M Yanagida, (1992) A low copy number central sequence with strict symmetry and unusual chromatin structure in fission yeast centromere. Mol Biol Ceil. 3(7):819-35.

128. Takahashi K, Yamada H, Yanagida M (1994) Fission yeast minichromosome loss mutants mis cause lethal aneuploidy and replication abnormality. Mol Biol Ceil 5:11451158

129. Taveres AA, DM Glover, and CE Sunkel (1996) The conserved mitotic kinase polo is regulated by phosphorylation and has preferred microtubule-associated substrates inDrosophila embryo extracts. EMBO J. 15(18):4873-83.

130. Tian G, Huang Y, Rommelaere H, Vandekerckhove J, Ampe C, Cowan NJ (1996) Pathway leading to correctly folded beta-tubulin. Cell 86:287-296

131. Tian G, Bhamidipati A, Cowan NJ, Lewis SA (1999) Tubulin folding cofactors as GTPase-activating proteins. GTP hydrolysis and the assembly of the alpha/beta-tubulin heterodimer. J Biol Chem 274:24054-24058

132. Tian G, Lewis SA, Feierbach B, Stearns T, Rommelaere H, Ampe C, Cowan NJ (1997), Tubulin subunits exist in an activated conformational state generated and maintained by protein cofactors. J Cell Biol 138:821-832

133. Toda T, Adachi Y, Hiraoka Y, Yanagida M (1984) Identification of the pleiotropic cell division cycle gene nda2+ as one of two different alpha-tubulin genes in Schizosaccharomycespombe. Cell 37:233-242

134. Toda T, Umesono K, Hirata A, Yanagida M (1983) Cold-sensitive nuclear division arrest mutants of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Mol Biol 168:251270

135. Tyson JJ, A Csikasz-Nagy, В Novak (2002) The dynamics of cell cycle regulation. Bioessays. 24(12): 1095-109. Review.

136. Uhlmann F, D Wemic, M Poupart, E Koonin, К Nasmyth, (2000) Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 103(3):375-86.

137. Umesono K, Toda T, Hayashi S, Yanagida M (1983) Cell division cycle genes nda2+ and nda3+ of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe control microtubular organization and sensitivity to anti-mitotic benzimidazole compounds. J Mol Biol 168:271-284

138. Uzawa S, Samejima I, Hirano T, Tanaka K, Yanagida M (1990) The fission yeast cutl+ gene regulates spindle pole body duplication and has homology to the budding yeast ESP1 gene. Cell 62:913-925

139. Vainberg, S. Lewis, H. Rommelaere, C. Ampe, J. Vandekerckhove, H. Klein, N. Cowan (1998) Prefoldin, a chaperone that delivers unfolded proteins to cytosolic chaperonin. Cell. 93(5):863-73. •

140. Vardy L, Toda T (2000) The fission yeast gamma-tubulin complex is required in G(l) phase and is a component of the spindle assembly checkpoint. EMBO J. 19(22):6098-6111к

141. Waters JC, R-H Chen, AW Murray, and ED Salmon (1998) Localization of Mad2 to kinetochores depends on microtubule attachment, not tension. J Cell Biol. 141(5):1181-91.

142. Weiss E and M Winey (1996) The Saccharomyces cerevisiae spindle pole body duplication gene MPS1 is part of a mitotic checkpoint. J Cell Biol. 132(1-2): 111-23.

143. Yamada H, Kumada K, Yanagida M (1997) Distinct subunit functions and cell cycle regulated phosphorylation of 20S APC/cyclosome required for anaphase in fission yeast. J Cell Sci 110:1793-1804

144. Yamashita YM, Nakaseko Y, Samejima I, Kumada K, Yamada H, Michaelson D, Yanagida M (1996) 20S cyclosome complex formation and proteolytic activity inhibited by the cAMP/PKA pathway. Nature 384:276-279

145. Yanagida M (2000) Cell cycle mechanisms of sister chromatid separation; roles of Cutl/separin and Cut2/securin. Genes Cells 5:1-8

146. Yoda K, S Ando, A Okuda, A Kikuchi, T Okazaki, (1998) In vitro assembly of the CENP-B/alpha-satellite DNA/core histone complex: CENP-B causes nucleosome positioning. Genes Cells. 3(8):533-48.

147. Yokota S, Yanagi H, Yura T, Kubota H (1999) Cytosolic chaperonin is up-regulated during cell growth. Preferential expression and binding to tubulin at G(l)/S transition through early S phase. J Biol Chem. 274(52): 37070-37078.