Роль индикации отдельных специфических маркеров вируса гепатита B в обеспечении вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Моисеева, Марина Александровна

• Моисеева, Марина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Моисеева, Марина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Серологические маркеры вируса гепатита В. 1.2. Методы определения серологических маркеров вируса гепатита В.

1.2.1. Метод иммуноферментного анализа.

1.2.2. Метод полимеразной цепной реакции.

1.3. Основные этапы обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1.1.Определение антигенных и антительных маркеров вируса гепатита В.

2.2.1.2. Количественное определение HBsAg.

2.2.2. Методы получения компонентов тест-системы для количественного определения анти-HBs.

2.2.2.1. Получение очищенного HBsAg.

2.2.2.2. Получение иммуносорбента.

2.2.2.3. Получение конъюгата.

2.2.2.4. Получение контрольного отрицательного образца (К') и контрольных положительных образцов (К+ю, К+50} K+ioo). 2.2.3.1.Выявление ДНК ВГВ методом ПЦР.

2.2.3.2. Определение ДНК ВГВ методом ПЦР в режиме реального времени.

2.2.4. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности выявления HBsAg в пулах плазмы для ф фракционирования. ч 3.2. Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами.

3.3. Сравнение методов ИФА и ПЦР при оценке маркеров вируса гепатита В в модельных опытах.

3.4. Разработка тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.

3.5. Применение формулы для расчёта концентрации анти-HBs.

3.6. Определение уровня анти-HBs в плазме для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль индикации отдельных специфических маркеров вируса гепатита B в обеспечении вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов»

Актуальность проблемы

Вирусная безопасность препаратов из плазмы крови обеспечивается многоступенчатым комплексом мер, включающих: отбор доноров; проверку индивидуальных порций плазмы на отсутствие вирусных маркеров; введение в технологический процесс стадий инактивации вирусов и контроль готовых продуктов. Для обнаружения маркеров вирусных инфекций в плазме и препаратах крови в настоящее время используется иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы основаны на разных принципах обнаружения возбудителя и взаимно дополняют друг друга.

Однако несмотря на такой контроль сохраняется риск инфицирования пулов плазмы вирусом гепатита В (Kleinman S.H. et al., 2005; Alvarez do Barrio M. et al., 2005; Soldan K. et al. 2005). Это связано с широким распространением заболевания, малой инфицирующей дозой и высокой устойчивостью вируса гепатита В (ВГВ). Для снижения этого риска рекомендовано расширить перечень обязательных тестов при обследовании доноров и контроле готовых продуктов, в частности Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) рекомендовано проводить контроль уровня антител к HBsAg (анти-HBs), концентрация которых в препаратах иммуноглобулинов нормируется. Введение этого дополнительного контроля в нашей стране сдерживается отсутствием отечественных тест-систем для количественного определения анти-HBs. Как показал многолетний опыт, анти-HBs являются фактором защиты. Однако связывание анти-HBs с HBsAg может влиять на результаты анализа, экранируя HBsAg в составе иммунных комплексов.

Учитывая погрешности лабораторной диагностики (Джумагулова А.Б. и др., 2001; Нетёсова И.Г. и др., 2005) нерешённой остаётся также проблема по созданию алгоритма тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов. В монографии «Плазма человека для фракционирования» в Европейской фармакопее 4-го издания предусмотрено тестирование первого гомогенного пула плазмы на HBsAg. Пул плазмы считается пригодным для дальнейшей работы, если в нём не выявлен HBsAg. Национальная фармакопейная статья этого требования не предусматривает. Поэтому усовершенствование алгоритма обследования на присутствие маркеров вируса гепатита В пулов плазмы для фракционирования, используемых для получения препаратов иммуноглобулинов, является актуальным.

Цель работы - разработка оптимального алгоритма обеспечения вирусной безопасности готовых препаратов в отношении гепатита В на основе изучения эффективности тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов на HBsAg, анти-HBs и ДНК ВГВ.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние иммунной нейтрализации на обнаружение HBsAg методом ИФА и количественно охарактеризовать способность специфических антител экранировать HBsAg в пулах плазмы для фракционирования и в препаратах иммуноглобулинов.

2. Изучить влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs на возможность выявления ДНК ВГВ.

3. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения анти-HBs.

4. Исследовать уровень анти-HBs в индивидуальных образцах плазмы крови, пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.

Научная новизна.

Изучена эффективность выявления HBsAg в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов.

Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления HBsAg методом ИФА в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов является иммунная нейтрализация HBsAg антителами.

В опытах in vitro показано, что в оптимальных температурных условиях при равновесной концентрации антигена и антител в системе достигается наиболее полная иммунная нейтрализация. В этом случае анти-HBs в количестве 1 ME способны связывать не менее 50 нг HBsAg.

Исследовано влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/aHra-HBs на особенности выявления HBsAg и ДНК ВГВ. Продемонстрировано, что процесс формирования иммунных комплексов не влиял на эффективность выявления генома вируса гепатита В методом ПЦР.

Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-HBs и рабочий стандарт для калибровки с концентрациями 10, 50 и 100 МЕ/л, для стабилизации которого использована мальтоза.

Разработан оригинальный способ очистки HBsAg из сформированного иммунного комплекса HBsAg/aHTH-HBs.

Практическая значимость и внедрение результатов.

В результате проведённых исследований разработана технология производства иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Для упрощения расчета количественного содержания антител наряду с традиционным использованием калибровочного графика предложена формула, позволяющая определять содержание анти-HBs только по одному контрольному образцу с концентрацией антител (50 МЕ/л). Тест-система успешно прошла апробацию на базе цеха гаммаглобулинов Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» и государственные испытания в ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Проект нормативной документации находится на утверждении в Фармакопейном Государственном комитете. На изобретение «Тест-система для определения анти-HBs в биологическом образце» получена приоритетная справка № 2005107749 от 21.03.05. Сравнение разработанного диагностического набора с зарубежными аналогами показало высокую специфическую активность разработанной тест-системы и целесообразность её использования для количественного определения анти-HBs в плазме (сыворотке) крови при обследовании доноров, для определения напряжённости иммунитета, а также для определения соответствия препаратов иммуноглобулинов стандартам ВОЗ.

В фармакопейную статью предприятия на «Имбиоглобулин» (ФСП 420504-4266-04) внесены дополнительные показатели, улучшающие безопасность препарата: контроль уровня антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.

Основываясь на изученных закономерностях «экранирования» HBsAg специфическими антителами, показано, что определение HBsAg не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов. Рекомендовано внести дополнение в алгоритм мониторинга препаратов иммуноглобулинов - определение анти-HBs. В случае выявления концентрации антител, не соответствующей международным требованиям, необходимо проводить тестирование препаратов иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР.

Положения, выносимые на защиту

1. Определение HBsAg, являющееся обязательным при тестировании пулов плазмы для фракционирования, не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов в отношении вируса гепатита В, что позволяет внести дополнение в алгоритм их контроля — определение уровня анти-HBs.

2. Создана иммуноферментная тест-система для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В.

Апробация работы.

Результаты работы представлены на 10-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2002); на II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (С.-Петербург, 2003); на Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004); на научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (Н.Новгород, 2004); на VI Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблема эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005).

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной с участием сотрудников Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» 24 ноября 2005 г.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Моисеева, Марина Александровна

выводы.

1. Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления HBsAg в пулах плазмы для фракционирования является присутствие анти-HBs.

2. В модельных опытах показано, что процесс нейтрализации HBsAg специфическими антителами зависит от концентрации антигена в смеси. В оптимальных условиях анти-HBs в количестве 1 ME способны связывать не менее 50 нг HBsAg.

3. На основе изученных закономерностей «экранирования» HBsAg анти-НВз-антителами следует считать недостаточным критерием отсутствие HBsAg в препаратах иммуноглобулинов. В связи с этим в алгоритм мониторинга препаратов необходимо ввести определение анти-HBs. В случае несоответствия уровня анти-HBs международным требованиям проводить тестирование иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР.

4. Экспериментально продемонстрировано, что формирование иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs не оказывает влияния на способность метода ПЦР выявлять ДНК ВГВ в препаратах иммуноглобулинов.

5. Разработан оригинальный способ получения HBsAg осаждением из иммунных комплексов.

6. Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-HBs в плазме (сыворотке) крови и препаратах иммуноглобулинов. Стабилизация жидкого рабочего стандарта для калибровки с концентрацией анти-HBs 10, 50 и 100 МЕ/л мальтозой позволила сохранять его активность на протяжении срока наблюдения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Необходимость контроля пулов плазмы для фракционирования на присутствие HBsAg и исключения из производства контаминированной плазмы не вызывает сомнений. Эта процедура позволяет контролировать качество скрининга индивидуальных донаций плазмы, поступающей на предприятия фракционирования, минимизировать присутствие вируса гепатита В в производственных пулах плазмы и снизить вероятность попадания его в конечные препараты иммуноглобулинов. Однако связывание HBsAg со специфическими антителами может влиять на результаты анализа, экранируя HBsAg в иммунных комплексах. Прямым показанием к отбраковке плазмы является присутствие в ней структурных единиц вируса, в том числе фрагментов нуклеиновых кислот, что касается продуктов иммунного обмена -антител, то здесь нет однозначных решений. В связи с трудностями обнаружения в плазме структурных единиц вирусов гепатита С и ВРИ, отбраковка проводится по наличию антител к этим вирусам и по фрагментам нуклеиновых кислот. Для гепатита В, как показал многолетний опыт, антитела к поверхностному антигену гепатита В являются фактором защиты и в то же время, вызывая иммунную нейтрализацию вирусов в плазме, они могут влиять на результаты анализа.

Учитывая погрешности лабораторной диагностики [Джумагулова А.Б. и др., 2001; Нетёсова И.Г. и др., 2005], усовершенствование алгоритма обследования на присутствие маркеров вируса гепатита В мини-пулов плазмы для фракционирования, используемых для получения препаратов крови, прежде всего иммуноглобулинов, является чрезвычайно актуальной задачей. Нами преследовалась цель повысить вирусную безопасность препаратов иммуноглобулинов в отношении гепатита В.

Предварительный анализ состояния рынка тест-систем показал, что, несмотря на имеющийся широкий выбор иммуноферментных тест-систем, отсутствуют наборы с декларированной возможностью определения поверхностного антигена гепатита В в пулах плазмы для фракционирования, количественного определения анти-НВs-антител для оценки потенциала иммунной нейтрализации в пулах плазмы и иммуноглобулинах.

Последовательность действий при выполнении этой задачи включала модификацию производимых Нижегородским филиалом «НПО Микроген» тест-систем таким образом, чтобы сделать их пригодными для определения HBsAg в пулах плазмы для фракционирования, и с этой целью в модельных опытах установить факторы, влияющие на специфичность и чувствительность тест-систем.

На первом этапе необходимо было установить, влияет ли смешивание индивидуальных донаций на специфичность тест-систем «ИФЛ-HBsAg». За мини-пул был принят объем плазмы 5,0+0,5л от 20-28 доноров. Объем минимального плазменного пула, подлежащего тестированию на маркеры ВГВ, был обоснован особенностями технологического процесса, а также тем, что часть плазмы поступает на предприятие в пятилитровых пластиковых емкостях. Для оценки специфичности ИФА-тест-систем при тестировании пулов смешивали предварительно проверенные и негативные по HBsAg индивидуальные образцы плазмы от 20-28 доноров. Смешивание проводили в равных объемах, формируя производственные пулы в пятилитровых емкостях и аналогичные модельные пулы. Показано, что смешивание индивидуальных образцов плазмы, предварительно проверенных и не содержащих HBsAg, не приводило к появлению неспецифических реакций при тестировании пулов, т.е. не оказывало влияния на специфичность тест-систем «ИФА-HBsAg». В то же время, как и следовало ожидать, смешивание одного заведомо положительного по HBsAg индивидуального образца донорской плазмы с 19 или 27 нормальными (негативными) образцами влияло на возможность выявления HBsAg в пулах. Показано, что эффективность выявления HBsAg для всех пулов, контаминированных HBsAg-содержащими образцами с концентрацией HBsAg более 100 нг/мл, и для пулов из 19 донаций, контаминированных положительными образцами плазмы с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл, составляла 100 %. При внесении плазмы с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл в пул из 27 донаций, HBsAg обнаруживался только в 80 % случаев.

Как показали наши исследования, основной причиной этого явления было присутствие в плазме анти-HBs, которые при формировании пулов нейтрализовали HBsAg, тем самым исключая его из реакционной смеси. Чтобы определить степень риска контаминации пулов плазмы, необходимо было определить, насколько часто встречаются донации, с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл. Как показали наши исследования, среди отбракованных по HBsAg донаций в более чем 85 % случаев концентрация HBsAg была выше 100 нг/мл и только 9,3 % доноров-вирусоносителей имели концентрацию HBsAg в плазме менее 100 нг/мл. Таким образом, по результатам распределения концентрации HBsAg у доноров-вирусоносителей, а также, учитывая, что на предприятия фракционирования обычно поступает плазма, прошедшая первичный скрининг, нами рассчитан риск получения плазмы с концентрацией HBsAg менее 100 нг/мл. Он является достаточно низким и составляет 1 случай на 92150 индивидуальных донаций. Учитывая, что эффективность выявления таких образцов в пулах плазмы от 24+4 доноров находится на уровне 80 %, риск контаминации плазменного пула поверхностным антигеном вируса гепатита В ниже уровня детекции составлял по нашим данным приблизительно 1 случай на 19197 мини-пулов.

Для исключения экранирования антигена антителами мы попытались использовать метод ПЦР. Однако результаты предварительного исследования модельных пулов, контаминированных HBsAg- и ДНК ВГВ-позитивными образцами с невысокой концентрацией антигена (менее 1000 нг/мл), показали, что эффективность выявления маркеров ВГВ не улучшилась. При тестировании модельных пулов методом ИФА и ПЦР выявление HBsAg в пробах составило 85 %, а выявление ДНК ВГВ менее 30 %. Это можно объяснить ингибированием полимеразы, а также тем, что концентрация HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей обычно многократно превышает концентрацию полных вирусных частиц [Майер К.-П., 1999]. Это привело к тому, что ПЦР-тестирование пулов плазмы на ДНК ВГВ в большинстве стран мира не является обязательным и применяется только отдельными производителями [Carol К., Meirione С., 2003].

Таким образом, в результате выполненной работы установлено, что метод иммуноферментного анализа (ИФА) может быть использован для контроля пулов плазмы при условии, что лицензированные коммерческие наборы дополнительно валидированы, а размеры плазменных пулов и стратегия их тестирования определена. Стратегия мини-пул тестирования обычно определяется производителями препаратов крови, исходя из технологических особенностей производства и чувствительности метода. С учетом рекомендаций Европейского агентства медицинских продуктов и официальной медицинской контрольной лаборатории (Official Medicines' Control Laboratory - OMCL) размер плазменного пула, подлежащего контролю на HBsAg, должен быть таким, чтобы позволять в 100 % случаях выявлять образцы плазмы с исходным титром HBsAg выше 1:250000 (с учетом чувствительности ИФА тест-системы концентрация HBsAg в таких образцах должна составлять около 12500-25000 нг/мл) и в 59% случаев выявлять образцы плазмы с исходным титром HBsAg менее 1:10000 (концентрация HBsAg менее 500-1000 нг/мл) [EMEA/CPMP/BWP/1737/02]. По результатам наших исследований размер плазменного пула от 20-28 донаций объемом 5,0+0,5 л можно признать оптимальным, а тест на HBsAg обязательным для оценки вирусной безопасности пулов плазмы.

Как уже упоминалось выше, одной из основных причин снижения эффективности выявления HBsAg явилось присутствие вируснейтрализующих анти-НВБ-антител. Поэтому перед нами стояла задача в опытах in vitro изучить динамику образования иммунных комплексов HBsAg/aHTH-HBs и количественно охарактеризовать способность специфических антител экранировать HBsAg в пулах плазмы и препаратах иммуноглобулинов. Для этой цели в качестве источника антител были использованы препараты иммуноглобулинов с содержанием анти-HBs (770+20 МЕ/л), предварительно разбавленные нормальной донорской плазмой до содержания анти-HBs 10 МЕ/л, а в качестве источника HBsAg использован отраслевой стандарт «ОСО-HBsAg» (ОСО 42-28-311-03П), приготовленный в соответствии с инструкцией по применению. Затем растворы иммуноглобулина и ОСО смешивали в соотношении 1/10. Эффективность нейтрализации оценивали по ингибированию иммуноферментной реакции. Как свидетельствовали полученные результаты, нейтрализация антигена зависела от концентрации HBsAg в системе и времени инкубации исследуемых проб. Наиболее полно нейтрализация HBsAg происходила через 24 часа при температуре 37 °С при условии равновесной концентраций антигена и антител в системе, в этом случае 1 ME анти-HBs был способен связывать до неопределяемого методом ИФА уровня не менее 50 нг HBsAg. При избытке антигена в системе, несмотря на иммунную нейтрализацию, HBsAg выявлялся в растворах.

Аналогичные результаты были получены с препаратами иммуноглобулинов, в которые добавляли вируссодержащую плазму. В соответствии с классическими закономерностями процесса формирования иммунных комплексов при низкой концентрации HBsAg (менее 49 нг) и существенном избытке специфических антител происходила полная его нейтрализация до неопределяемого методом ИФА уровня. Дальнейший рост концентрации антигена (от 49 до 1562-3125 нг) способствовал увеличению количества сформированных иммунных комплексов до тех пор, пока не достигал зоны эквивалентности: количество антигена примерно равнялось количеству доступных мест связывания на антителах. При существенном избытке антигена (более 25 мкг/мл) процесс нейтрализации был неэффективным и не приводил к статистически значимому изменению концентрации HBsAg в реакционной смеси.

Учитывая, что в процессе выделения иммуноглобулинов происходит концентрирование анти-НВБ-антител и, одновременно, очистка от вирусов и HBsAg [Анастасиев В.В., 2000] ставится под сомнение корректность применения теста на HBsAg в ИФА для контроля вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов согласно отечественных Фармакопейных статей.

Нами были проведены сравнительные исследования определения HBsAg в ИФА и ДНК ВГВ в препаратах иммуноглобулинов, контаминированных вируссодержащей плазмой с высоким содержанием HBsAg (около 1 мг/мл) и о

ДНК ВГВ (9,3*10 копий/мл). В препараты иммуноглобулинов вносили плазму донора-вирусоносителя, разведенную в 50000 - 400000 раз. Тестирование опытных проб проводили через 15 минут и после 24 часов инкубации при 37°С. ДНК ВГВ была обнаружена во всех пробах. В то же время через 24 часа HBsAg не выявлялся ни в одной из проб, а при немедленном тестировании только в пробах с меньшими разведениями вируссодержащей плазмы. Таким образом, моделируя искусственно контаминацию препаратов иммуноглобулинов маркерами вируса гепатита В, выявлено, что специфические антитела в иммуноглобулинах находились в избытке и активно связывали HBsAg. В то же время процесс формирования иммунных комплексов не влиял на возможность выявления ДНК ВГВ методом ПЦР. Поэтому введение мониторинга анти-HBs и ДНК ВГВ в готовых препаратах даст большую информацию о вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

Кроме того, опыт производства и применения иммуноглобулинов свидетельствовал, что присутствие анти-HBs является обязательным фактором защиты против инфицирования вирусом гепатита В. В соответствии с требованиями Европейской фармакопеи иммуноглобулиновые препараты должны содержать анти-HBs в концентрации не менее 0,5 МЕ/г белка.

Поэтому для определения уровня анти-HBs в сыворотке (плазме) крови человека и в препаратах иммуноглобулинов была разработана иммуноферментная тест-система, в основу которой положен принцип одностадийного прямого «сэндвич»-анализа. Особенностью тест-системы явилось то, что для изготовления иммуносорбента и конъюгата использован высокоочищенный плазменный антиген (HBsAg), свободный от ДНК вируса гепатита В, позволяющий с максимальной чувствительностью и специфичностью выявлять анти-HBs. Для этого разработан оригинальный способ приготовления очищенного HBsAg из плазмы крови доноров-вирусоносителей. Он включал инактивацию вирусов в плазме пастеризацией, очистку HBsAg физико-химическими методами, выделение комплекса HBsAg/aHTH-HBs, очистку HBsAg из комплекса с помощью гидролиза пепсином и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

При изготовлении иммуносорбента была проведена сравнительная оценка чувствительности тест-систем при нанесении на планшеты антигенов в трех вариантах: только HBsAg, выделенного из плазмы крови доноров-вирусоносителей; «плазменного» HBsAg в сочетании с рекомбинантным HBsAg субтипа ad; рекомбинантного HBsAg субтипов ау и ad в разных соотношениях. Чувствительность тест-системы оценивали по калибровочным кривым, построенным по отраслевому стандартному образцу иммуноглобулина человека против вируса гепатита В (ОСО 42-28-320-00). Чувствительность тест-системы, изготовленной с использованием только «плазменного» HBsAg была достоверно выше, чем при использовании «плазменного» антигена в комбинации с рекомбинантным или только рекомбинантного. Чтобы выбрать оптимальные условия сорбции, оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях антигена в растворе. Концентрация 2 мкг/мл была сочтена оптимальной и использована в дальнейшей работе.

На следующем этапе работы подбирали оптимальные разведения конъюгата - HBsAg - пероксидаза хрена. Контрольные образцы должны были иметь следующие показатели оптической плотности: ОП К+ не ниже 0,500 о.е., ОП К' - не выше 0,150 о.е. Первоначально для приготовления конъюгата использовали тот же антиген, что и для приготовления иммуносорбента. Однако при оптимальном рабочем разведении конъюгата 1:20 значение ОП К+ составило менее 0,300 о.е., что не соответствовало заданным условиям. Вероятно, это было связано с тем, что при физико-химическом способе очистки HBsAg могли повреждаться участки связывания с пероксидазой хрена. В связи с этим нами был использован HBsAg, очищенный оригинальным способом осаждения иммунного комплекса. При исследовании конъюгата, приготовленного с использованием очищенного данным способом антигена, результаты, соответствующие заданным условиям были получены при рабочем разведении 1:500.

Для изготовления контрольных положительных образцов (К+ю, К+50, К+10о) нами предложен состав стабилизирующего матричного раствора, содержащий нормальную донорскую плазму и мальтозу в концентрации 2-10%, позволивший сохранять их активность на протяжении срока наблюдения (9 месяцев). В матричный раствор добавляли иммуноглобулин человека нормальный (ФСП 42-0504-4266-04), откалиброванный по ОСО 42-28-320-00 до концентраций анти-HBs 10, 50, 100 МЕ/л соответственно.

При определении концентрации анти-HBs с целью упрощения интерпретации результатов предложено использование формулы. При сравнении двух способов определения концентрации анти-HBs: с помощью построения графика и с использованием предложенной формулы показано, что относительная разность между значениями концентраций анти-HBs, полученных по графику и по формуле, была статистически не значима и не превышала для плазмы крови 5,3 % (t=0,698; р=0,05), а для препаратов иммуноглобулинов 1,84 % (t=l,394; р=0,05).

С целью апробации разработанной тест-системы мы исследовали уровень поствакцинального иммунитета в образцах сыворотки крови здоровых вакцинированных против гепатита В детей й сравнивали полученные данные с результатами, полученными на тест-системе для количественного определения антител к HBsAg «MONOLISA ANTI-HBs 3.0». При тестировании на двух тест-системах были получены совпадающие результаты.

Таким образом, по результатам оценки специфической активности с использованием ОСО иммуноглобулина человека, а также по результатам сравнительных испытаний с тест-системой «MONOLISA ANTI-HBs 3.0» показано, что разработанная тест-система может быть использована для количественного определения анти-HBs в сыворотке, плазме крови и препаратах иммуноглобулинов. В настоящее время тест-система успешно прошла государственные испытания в ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Далее с помощью разработанной тест-системы была определена концентрация анти-HBs в индивидуальных образцах донорской плазмы крови, мини-пулах плазмы для фракционирования объёмом 5,0±0,5 л, в производственных пулах плазмы и в препаратах иммуноглобулинов отечественного и зарубежного производства.

Показано, что анти-НВв-позитивными были 32,4 % индивидуальных образцов плазмы крови, концентрация анти-HBs в которых распределялась следующим образом: 23 % имели низкую концентрацию анти-HBs - от 2-5 до 10 МЕ/л, 32 % - среднюю концентрацию (от 10 до 100 МЕ/л), 42 % высокую концентрацию (от 101 до 1000 МЕ/л) и 3 % - концентрацию анти-HBs более 1000 МЕ/л. Анти-HBs были выявлены в 96,16 % мини-пулах плазмы для фракционирования. Все производственные пулы, как и следовало ожидать, также содержали анти-HBs, но в разной концентрации - от 99 до 1655 МЕ/л (средняя концентрация 431±311 МЕ/л).

Учитывая, что концентрация специфических антител к вирусу гепатита В при производстве иммуноглобулинов увеличивается в 2,6 - 6,2 раза, в зависимости от вида препарата, было закономерным, что все исследованные серии иммуноглобулинов содержали анти-HBs в концентрации более 0,5 МЕ/г белка. Кроме того, показано, что уровни анти-HBs в отечественных препаратах практически не отличались от аналогичных показателей качества зарубежных препаратов и соответствовали требованиям Европейской фармакопеи. Однако, существенные колебания концентрации анти-HBs в производственных пулах, а также риск, связанный с возможностью контаминации исходной плазмы и формирования иммунных комплексов анти-HBs/HBsAg, свидетельствовали о том, что для того, чтобы гарантировать это соответствие, необходимо в алгоритм контроля качества иммуноглобулинов ввести обязательный тест на анти-HBs.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Моисеева, Марина Александровна, 2006 год

1. Аммосов А.Д. Гепатит В.- Кольцово: Институт средств медицинской диагностики ЗАО «Вектор-Бест», 2003.-127 с.

2. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения.-Н.Новгород: НГМА, 2000.- 166 с.

3. Балаян М.С., Михайлов М.И. Вирусные гепатиты с парентеральной передачей возбудителя (гепатиты В, С, Д, G, TTV и SEN) // Мир вирусных гепатитов.- 2003.- №2.- С.3-11.

4. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты.- 2-е издание, переработанное и дополненное.- М.: Амипресс, 1999.-302 с.

5. Богач В.В. и др. Распространённость маркёров гепатитов В и С среди потребителей наркотиков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2000.- № 4.- С.46-49.

6. Гловацкая Е.Г., Кабанчук Н.А. Опыт исследования донорской крови методом иммуноферментного анализа // Новое в трансфузиологии.-2000,- Выпуск 26.- С.80-83.

7. Голосова Т.В., Туполева Т.А., Сомова А.В. Ещё раз о концепции вирусной безопасности гемотрансфузий // Вестник службы крови.-1998.-№ 1.- С.6-9.

8. Джумагулова А.Б., Калашникова Т.В., Дробенюк Ж.А. и др. Качество лабораторной диагностики вирусных гепатитов и выявление причин, влияющих на достоверность получаемых результатов // Клиническая лабораторная диагностика.-2001.- № 12.- С.41-43.

9. Дроздова О.М. О роли медицинских учреждений в распространении ВГВ // VI Всероссийская научно-практическая конференция «Вирусные гепатиты проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов. - М., 2005. - С.81-82.

10. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарёв Е.Г., Рюмин Д.В. ПЦР в реальном времени. http://www.pcr.ru.

11. Жданов В.М.и др. Вирусные гепатиты / В.М. Жданов, В.А.Ананьев, В.М.Стаханова.- М., 1986. 256 с.

12. Жибурт Е.Б. Повышение вирусной безопасности препаратов крови // Вопросы вирусологии.- 2004.-Т.49.-№ 4.-С.46-48.

13. Ильина Е.Н. Особенности генодиагностики трансфузионных вирусных гепатитов // Гепатология (приложение к журналу «Эксперим. и клин, гастроэнтерология»). 2003. - № 1. - С.28-36.

14. Ильина Е.Н., Говорун В.М., Иваников И.О. и др. Хронические вирусные заболевания печени: Пособие для врачей.- Москва, 2001.

15. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Сер. техн. докл. Женева, 1992. -786. -Докл.39. -с. 168.

16. Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф. и др. Этиология острых гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А,

17. В, С и Е в трёх регионах Сибири // VI Всероссийская научно-практическая конференция «Вирусные гепатиты проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов. - М., 2005. - С. 160-161.

18. Лобзин Ю.В. и др. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение / Ю.В. Лобзин, К.В.Жданов, В.М.Волжанин, Д.А.Гусев. СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2003182 с.

19. Львов Д.К. Вирусные гепатиты от А до G и далее // Журн. микробиол. -1997.- №1.- с. 70-77.

20. Майер К.-П. Гепатит и последствия гепатита. / Пер. с нем. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 423 с.

21. Медицинские лабораторные технологии: Справочник / Под ред. А.И. Карпищенко. Т.2. - С.-Пб.: Интермедика, 1999.

22. Мигунов В.Н. Оценка риска заражения пациентов вирусами гепатита при лечении препаратами крови // Конференции «Производственная трансфузиология на рубеже XXI века»: Тезисы докладов.- Н.Новгород: НГМА, 1999. С.46-47.

23. Минакова JI.B., Козлова Н.Е., Шалунова Н.В., Бочарова Н.Г. Проблема качества препаратов иммуноглобулинов и пути их совершенствования // В сб. научных трудов «Иммуноглобулины и другие препараты крови». -Горький: ГМИ им. С.М.Кирова, 1986. С.5-10.

24. Михайлов М.И. Получение очищенного препарата поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) и высокоактивной антисыворотки к нему: Автореф. канд. мед. наук. М., 1980. - с.5-7.

25. Мукомолов C.JI. и др. Вирусные гепатиты / C.JI. Мукомолов, Н.А. Валькова, Н.А. Чайка. С.-Пб., 1992. - 96 с.

26. Мукомолов C.JI., Михайлов М.И. Место и значение простых и быстрых методов определения маркеров вирусных гепатитов в системе лабораторной диагностики этих инфекций // Мир вирусных гепатитов.-1999.-№ 1.-С.З-4.

27. Приказ №229 от 27.06.2001. О национальном календаре профилактических прививок и календаре прививок по эпидемическим показаниям. М., 2001.

28. Приказ № 322 от 21.10.2002. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека. М., 2002.

29. Рахманова А.Г. с соавт. Вирусные гепатиты (этиопатогенез, эпидемиология, клиника, диагностика и терапия). Кольцово: Институт средств медицинской диагностики ЗАО «Вектор-Бест», 2003.

30. Русанов В.М., Левин И. Лечебные препараты крови. М., 2004. -283 с.

31. Сомова А.В., Багрянцева С.Ю., Голосова Т.В., Мигунов В.Н. Специфические антитела к HBsAg в препаратах иммуноглобулинов // Конференции «Производственная трансфузиология на рубеже XXI века»: Тезисы докладов. Н.Новгород: НГМА, 1999. - С.57-58.

32. Сомова А.В. и др. Исследование сывороток крови доноров на вирусные гепатиты В и С с использованием ИФА и ПЦР // Новое в трансфузиологии. 2002. Вып.30. - С.30-37.

33. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. С.-Пб.: Теза, 1997. - 325 с.

34. Стендифер Д.К. Иммуноферментный анализ гаптенов и антигенов с разделением компонентов (гетерогенный анализ) // Иммуноферментный анализ / Пер. с англ.; Под ред. Нго Т.Т., Ленхоффа Г. М.: Мир, 1988. -С.172-189.

35. Теория и практика иммуноферментного анализа: Учебное пособие / A.M. Егоров, А.П.Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова.- М.: Высш. шк., 1991.-288 С.

36. Тефанова В. и др. Эпидемиологические особенности вирусных гепатитов В и С в Эстонии // VI Всероссийская научно-практическая конференция

37. Вирусные гепатиты — проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов. М., 2005. - С.328-331.

38. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика).- М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003.- 3 84 с. .

39. Широнина H.JI. и др. Гепатит В у медицинских работников. Эпидемиологические особенности и методы профилактики // Мир вирусных гепатитов.- 2002 № 10. - С. 2-6.

40. Ярославцева Н.Г. и др. ДНК вируса гепатита В в плазме крови HBsAg-негативных доноров и пациентов ГНЦ // Новое в трансфузиологии.-2002. Вып. 30. - С. 23-29.

41. Alhababi F., Sallam Т.А., Tong C.Y. The significance of 'anti-HBc only' in the clinical virology laboratory // J Clin Virol. 2003. - 27 (2). - P. 162-169.

42. Allaine JP. Occult hepatitis В virus infection: implications in transfusion // Vox Sang. 2004. - 86 (2). - P. 83-91.

43. Allaine JP, Hewitt PE, Tedder RS, et al. Evidence that anti-HBc but not HBV DNA testing may prevent some HBV transmission by transfusion // Brit J Haematol. 1999. - 107.-P. 186-195.

44. Allain JP, Reeves I, Kitchen AD, et al. Feasibility and usefulness of an efficient anti-HBc screening programme in blood donors // Transfus Med. -1995.-5(4).-P. 259-265.

45. Alvarez do Barrio M., Gonzalez Diez R., Hernandez Sanchez J.M., Oyonarte Gomez S. Residual risk of transfusion-transmitted viral infections in Spain, 1997-2002, and impact of nucleic acid testing // Euro Surveill. 2005. - 10. -2. - P.20-22.

46. Arauz-Ruiz P. Norder H., Robertson B.H., Magnius L.O. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis В virus revealed in Central America // J.Gen.Virol. 2002. - 83. - P. 2059-2073.

47. Badur S., Grangeot-Keros L., Pillot J. HBsAg in urine: a new approach for the detection of urinary antigen // Clin Exp Immunol. 1992. - 87(2). - P. 298303.

48. Barcena Marugan R et all. Risk of hepatitis В virus transmission from hepatitis В core antibody-positive liver donors // Med Clin (Bare). 2001. - 116 (4). -P. 125-128.

49. Barin F. Viruses and unconventional transmissible agents: update on transmission via blood // Transfus Clin Biol.-2000.-7(1).- P.5-10.

50. Bourbonnais R., Guevin R.M., Delvin E.E. Australia antigen 'ad' and 'ay' subtypes // Vox Sand. 1975. - V.29. - № 4.- P. 269-279.

51. Brummeihuis H., Over J. Virus inactivation by addition of neutralizing antibodies // In MorgenthalerJ-J (ed): "Virus inactivation in plasma products". Basel: Karger., 1989 - P. 128-137.

52. Bucholc В., Slusarczuk J., Banach W., Swiderska H. Serological markers of Hepatitis viruses in therapeutic immunoglobulin preparations // Centr.Eur J Immunol.-2001.- 26(1). P. 5-11.

53. Burbach GJ, Bienzle U, Neuhaus R and other. Intravenous or intramuscular anti-HBs immunoglobulin for the prevention of hepatitis В reinfection after orthotopic liver transplantation // Transplantation.-1997.-15(63).-P.478-480.

54. Busch M.P. Should HBV DNA NAT replace HbsAg and/or anti-HBc screening of blood donors? // Transfiis Clin Biol. 2004. -11(1). - P. 26-32.

55. Cao Т., Lazdina U., Desombere I. et al. Hepatitis В viru core antigen binds and activates naive human В cell in vivo: studies with a human PBL-NOD/SCID mouse model // Journal of Virology. 2001. - Vol.75. - № 14. -P.6359-6366.

56. Carol K., Meirione C. Registry of clotting factor concentrates/ Fourth Edition. -2003.

57. CDC. Inactivated hepatitis В virus vaccine // MMWR. 1982. - Vol.31. -P.317-322; 327-328.

58. Colomina-Rodrigues J. et al. Significance of hepatitis В core antibody as the only marker of hepatitis В infection. // Enferm Infecc Microbiol Clin.- 2005. -23(2).-P. 80-85.

59. Consensus statement. Are booster immunization needen for lifelong hepatitis В immunity? // Lancet.- 2000. Vol 355. - P. 561-565.

60. CPMP/BWP/268/95 (revised): Note for guidance on viral validation studies: The design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removed of viruses.

61. CPMP/BWP/269/95, rev/2: Note for guidance on plasma-derived medical products.

62. Cuypers H.T., Bresters D., Winkel I.N. et al. Storage conditions of blood samples and primer selection affect the yield of cDNA polymerase chain reaction products of hepatitis С virus // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. -№12. - P.3220-3224.

63. Department of Health Advisory Group on Hepatitis. Protecting health care workers and patients from hepatitis B. Recommendations of the Advisory Group on Hepatitis. HMSO, 1993, London.

64. Dodd RY. Infectious risk of plasma donations: relationship to safety of intravenous immune globulins // Clin Exp Immunol. 1996. - 104. - Suppl 1. -P.31-34.

65. Dreier J., Kroger M., Diekmann J. et al. Low-level viraemia of hepatitis В virus in an anti-HBc- and anti-HBs-positive blood donor // Transfiis Med. -2004.- 14(2).-P. 97-103.

66. Eijk AA, Niesters HG, Gotz HM. et al. Paired measurements of quantitative hepatitis В virus DNA in saliva and serum of chronic hepatitis В patients:implications for saliva as infectious agent // J Clin Virol. 2004. - 29 (2). -92-94.

67. EMEA/CPMP/BWP/1737/02. EMEA Workshop on the plasma master file.91 .European Pharmacopee /2002.

68. European Pharmacopee. Monogr 0338: Human Normal immunoglobulin/ 01/2004.

69. Francis D.P., Hadler S.C., Thompson S.E. at al. The prevention of hepatitis В with vaccine: report of the Centers for Disease Control multicenter efficacy trial among homosexual men // Ann. Inter. Med. 1982. - Vol.97. - P.362-366.

70. Frisch-Niggemeyer W., Afnbrosch F., Hofmann H. The assessment of immunity against hepatitis В after vaccination // J. Biol. Stand. 1986. -Vol.14. - № 3. -P.255-258.

71. Garcia Llop L, Asensi Alcoverro A, Coll Mas P, Ramada Benedito MA, Grafia Juan C. Anti-HBs titers after a vaccination program in children and adolescents. Should a booster dose be given? . // An Esp Pediatr. 2001. -54(1).-P. 32-37.

72. Ge J.H., Liu H.M., Sun J. et al. Antigenic and immunogenic changes due to mutation of S gene of HBV // World J Gastroenterol. 2004. - 10(21). - P. 3137-3140.

73. Ghendon Y.Z. World health organization strategy for control of hepatitis B. -In: Control of virus disease. Ed.E.Kurstak 2nd ed. Marcel Dekker Inc., N-Y., 1993.-P. 141-164.

74. Grazi G. et al. Prevalenza del markers HBV e HCV in un campione di operatori sanitari // Ther. Infect. Diseases.-1991.-6. № 3-4.- P.263.

75. Greub G., Frei P.C. Presence of low levels of anti-HBs antibody in socalled anti-HBc alone subjects // Liver. 2001. - Vol.6. - P.380-383.

76. Greub G., Zysset F., Genton B. et al. Absence of anti-hepatitis В surface antibody after vaccination does not necessarily mean absence of immune response // Med Microl Immunol (Berl). 2001. - 198(3). - P. 165-168.

77. Hall AJ. Hepatitis В vaccination: protection for how long and against what? // BMJ. 1993. - 307. - P.176.

78. Heijtink RA, et al. Anti-HBs after hepatitis В immunization with plasma-derived and recombinant DNA-derived vaccines: binding to mutant HBsAg // Vaccine. 2001. -19(27). - P. 3671-3680.

79. Hellstern P. Clinical experience with the viral safety of immunoglobulins // Blood Coagul Fibrinolysis.-1994.-5 (3).- P.35.

80. Hennig H., Puchta I., Luhm J. et al. Frequency and load of hepatitis В virus DNA in first-time blood donors, with antibodies to hepatitis В core antigen // Blood. 2002. - Vol.100 - №.7. - P.2637-2641.

81. Hollinger F.B. Hepatitis В virus // Fields Virology 3rd Edition. -1996. -V.2 Philadelphia. P. 2739-2807.

82. Howard CR, Allison LM. Hepatitis В surface antigen variation and protective immunity // Intervirology.- 1995. 38(1-2). - P.35-40.

83. Ireland D., Samuel D. Enhanced chemiluminescence ELISA for the detection of antibody to hepatitis В virus surface antigen // J. Biolumin. Chemilumin.-1989.-Vol.4.-№ 1.-P.159-163.

84. Karthigesu VD et al. A hepatitis. В virus variant found in the sera of immunised children induces a conformational change in the HBsAg "a" determinant //J Med Virol.- 1999. 58(4). - P.346-352.

85. Kasper K.C., Silva C.M. Registry of clotting factor concentrates/ Fourth Edition.-2003.

86. Kassler H.A., Harris A.A., Payne J.A. et al. Antibodies to hepatitis В surface antigen as the sole hepatitis В marker in hospital personnel // Ann. Inter. Med. 1985. - Vol.103. - P.21-26.

87. Khurana V., Kar P., Mansharamani N. et al. Differences in hepatitis В markers between clinical and preclinical health care personnel // Trop Gastroenterol. 1997. - 18 (2). - P. 69-71.

88. Kidd-Ljunggren K.,Miyakawa Y., Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis В viruses // J.Gen.Virol. 2002. - 83. - P. 1267-1280.

89. Kilic G et all. Hepatitis В marker seropositivity in prostitutes using ELISA // Mikrobiyol Bui. 1993. - 27(1). - P.52-55.

90. Kleinman S.H., Kuhns M.C., Todd D.S. et al. Frequency of HBV DNA detection in US blood donors testing positive for the presence of anti-HBc: implications for transfusion transmission and donor screening // Transfusion. -2003.-43(6).-P. 696-704.

91. Knutsson M, Kidd-Ljunggren K. Urine from chronic hepatitis В virus carries: implications for infectivity // J Med Virol. -2000.- 60(1). P. 17-20.

92. Koch Т., Heller S., Weber K. et al. Effekte von humanem i.v. Immunoglobulin auf die Bakterien-Clearance und Granulozytenfunktion bei Endotoxinamie // Anasthesiol. Intensivmed. Notfallmed. Schmerzther. 1997. - 32. - № 7. - P.420-425.

93. Kottiri B.J., Friedman S.R., Euler G.L. et al. Community-based study of hepatitis В infection and immunization among young adults in a high-drug-use neighborhood in New York city // J. Urban.Health. 2005. - 29.

94. Kralj N, Hofmann F, Michaelis M, Berthold H. Current hepatitis В epidemiology in Germany // J Gesundheitswesen. 1998. - 60(7). - P. 450455.

95. Kreil Т., Eibl M. Pre- and postexposure protection by passive immunoglobulin but no enhancement of infection with a flavivirus in a mouse model // J. Virol. 1997. - 71. - № 4. - P.2921-2927.

96. Kuhns M.C., Kleinman S.H., McNamara A.L. Lack of correlation between HBsAg and HBV DNA levels in blood donors who test positive for HBsAg and anti-HBc: implications for future HBV screening policy // Transfusion. -2004. -44. -P.1332-1339.

97. Lee H.S., Rajagopalan M.S., Chien D. Specificity of enzyme immunoassay for hepatitis В core antibody used in screening blood donors // Transfusion.-1987.-Vol.27. №1.-P.103-106.

98. Lopez V.A., Bourne E.J., Lutz M.W., Condreay L.D. Assessment of the COBAS Amplicor HBV Monitor Test for quantitation of serum hepatitis В virus DNA levels // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - № 6. - P. 19721976.

99. Lu G et all. Study on the hepatitis virus infection among medical professionals // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2000. - 21 (2). -P. 103-105.

100. Maillard P, Pillot J At least three epitopes are recognized by the human repertoire in the hepatitis В virus group a antigen inducing protection; possible consequences for seroprevention and serodiagnosis // Res Virol. 1998. -149(3). -P.153-161.

101. Margeridon S., Lachaux A., Trepo C. et al. A quasi-monoclonal anti-HBs response can lead to immune escape of 'wild-type' hepatitis В virus // J Gen Virol. 2005. - 86 (Pt 6). - P.1687-1693.

102. Martelli CM et all. Methodological considerations in the interpretation of serologic screening for hepatitis В virus among blood donors // Rev Saude Publica. 1991. - 25 (1). - P. 11-16.

103. Mizuochi Т., Okada Y., Umemori K. et al. Reactivity of genotypically distinct hepatitis В virus surface antigens in 10 commercial diagnostic kits available in Japan // Jpn. J. Infect. Dis. 2005. - 58. - P.83-87.

104. Moerman В., Moons V., Sommer H. et al. Evaluation of sensitivity for wild type and mutant forms of hepatitis В surface antigen by four commercial HBsAg assays // Clin Lab. 2004. - 50 (3-4). - P. 159-162.

105. Morgan DR. A code of practice for implementation of the UK hepatitis В immunization guidelinesfor the protection of patients and staff.// London: British Medical Association, 1995.

106. Morgenthaler J.J, Omar A. Partitioning and inactivation of viruses during isolation of albumin and immunoglobulins by cold ethanol fractionation//Dev Biol Stand.-1993.-81.-P. 185-190.

107. Mosley JW et all. Donor screening for antibody to hepatitis В core antigen and hepatitis В virus infection in transfusion recipients // Transfusion. 1995.-35(1).-P. 5-12.

108. Muhlbacher A, Zdunek D, Melchior W, et al. Is infective blood donation missed without screening for antibody to hepatitis В core antigen and/or hepatitis В virus DNA? // Vox Sang. 2001. - 81. - P. 139.

109. Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci Am. 1990. -262. - P.56-61.

110. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. - 155.-P. 335-350.

111. Nath N., Fang C.T., Dodd R.Y. Specificity of an assay for antibodies to hepatitis В surface antigen // Transfusion. 1982. - Vol.22. - № 4. - P.300-301.

112. Nelles M.J., Taylor L., Filer S. et al. Detection of antibody to hepatitis В core antigen (anti-HBc) using a direct (antiglobulin) format and development of a confirmatory assay for anti-HBc // Virol. Methods. 1988. - Vol.20. -№3.- P.219-226.

113. Oliveira ML et all. Prevalence and risk factors for HBV, HCV and HDV infections among injecting drug users from Rio de Janeiro, Brazil // Braz J Med Biol Res. 1999. - 32(9). - P.l 107-1114.

114. Ottolini M.G., Porter. D.D., Hemming V.G. et al. Effectiveness of RSVIG prophylaxis and therapy of respiratory syncytial virus in an immunosuppressed animal model // Bone Marrow. Transplant. 1999. - 24. -№1. -P.41-45.

115. Prakash C, Bhatia R, Kumari S, Verghese T, Datta KK. Response to hepatitis В vaccination in high risk population // J Commun Dis. 2000. -32(1). -P.17-21.

116. Robinson W.S. Вирус гепатита В // «Вирусология» / Пер. с англ.; Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989. - Т.З. - С. 287-330.

117. Rogers M.N., Saldanha J., Allain J. Report of EPFA/NIBSC workshop Nucleic acid amplification test (NAT) for detection of blood borne viruses // Vox Sang.-1997.-72(4).-P. 199-200.

118. Roth W.K., Weber Mi, Petersen D. et al. NAT for HBV and anti-HBc testing increase blood safety // Transfusion. 2002.- 42(7). - P. 869-875.

119. Santana RO et all. Prevalence of serologic markers of HBV, HDV, HCV and HIV in non-injection drug users compared to injection drug users in Gran Canaria, Spain // Eur. J. Epidemiol. 1998. - 14. - № 6. -P. 555-561.

120. Senturker Guldas N., Abacioglu Y.H. S-gene sequences and genotype-related restriction sites in hepatitis В virus carriers in Turkey // Infection. -2004.-32.-P. 24-29.

121. Shokrgozar M.A., Shokri F. Subtype specificity of anti-HBs antibodies produced by human B-cell lines isolated from normal individuals vaccinated with recombinant hepatitis В vaccine // Vaccine. 2002. - 20(17-18). -P.2215-2220.

122. Silva C.M., Costi C., Costa C. et al. Low rate of occult hepatitis В virus infection among anti-HBc positive blood donors living in a low prevalence region in Brasil // J. Infect. 2005. 51. - №1. - P.24-29.

123. Singh B. et al. Markers for transfusion-associated hepatitis in North Indian blood donors: prevalence and trends // Jpn. J. Infect. Dis. 2004. - 57. -P.49-51.

124. Sitnik R., Pinho J.R., Bertolini D.A. et al. Hepatitis В virus genotypes and precore and core mutants in Brasilian patients // J Clin Microbiol. 2004.- 42 (6). P.2455-2460.

125. Soldan К., Davison К., Dow В. Estimates of the frequency of HBV, HCV and HIV infectious donations entering the blood supply in the United Kingdom, 1996 to 2003 // Euro Surveill. 2005. - 10(2).

126. Tabor E., Aronson D.L., Gerety R. Removal of hepatitis В infectivity from factor-IX complex by hepatitis В immune-globulin // Lancet 1980. — 11.-P. 68-70.

127. Thomas H.J. Relative functional affinity of specific anti-core IgG in different categories of hepatitis В virus infection // J.Med. Virol.- 1997. -V.51. № 3. - P.189-198.

128. Tordjeman M., Rabillon V., Abouth D. et al. Specific detection of anti-HBc antibodies with an enzyme immunoassay using recombinant HBcAg and monoclonal antibodies // J. Virol. Methods.-1993.-Vol.43, №1.- P.21-30.

129. Tran T.-T. H., Ushijima H., Ngoc T.T. et al. Recombination of genotypes В and С in hepatitis В virus isolated from a Vietnamese patient with fulminant hepatitis // Jpn. J. Infect. Dis. -2003. 56. - P.35-37.

130. Valasek M.A., Repa J.J. The power of real-time PCR // ADV PHYSIOL EDUC. 2005. - 29. - P. 151 -159.

131. Vanthiel D.H. Polymerase Chain-Reaction for the detection of HCV-RNA-cryoglobulinemia as a cause for false-negative results // Italian Journal of Gastroenterology and Hepatology. 1.997. - Vol.29. - №3. - P.273-274.

132. Viazov S.O., Doroshenko N.V., Zairov G.K. et al. Radioimmunoassay for the detection of antibody to the surface antigen of hepatitis В // Vopr. Virusol. 1980. - №2. - P.236-238.

133. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact // J Clin Virol. 2005.- 32(2). - P. 102-112.

134. Weber В et all. Hepatitis В virus markers in anti-HBc only positive individuals // J Med Virol. 2001. - 64(3). - P.312-319.

135. Weber В. et al. Detection of an acute asymptomatic HbsAg negative hepatitis В virus infection in a blood donor by HBV DNA testing // J Clin Virol. 2005. - 32(1). - P. 67-70.

136. Werner B.G., Dienstag J.L., Kuter B.J. et al. Isolated antibody to hepatitis В surface antigen and response to hepatitis В vaccination // Ann. Inter. Med. 1985. - Vol.103. - P.201-205.

137. Weusten J.J. et al. Mathematic modeling of the risk of HBV, HCV and HIV transmission by window-phase donations not detected by NAT // Transfusion.- 2002. 42(5). - P. 537-548.

138. WHO. 1-st International Reference Preparation, 1977.

139. WHO Guidelines Document on Viral Inactivation and Removal Procedure Intended to Assure the Viral Safety of Blood Plasma Products. WHO HQ, Geneva, 2001.

140. WHO/VSQ/97.02. Good manufacturing practice requirements/ Part 2 Validation.

141. World Health Organization. Expanded Programme on Immunization. Global Advisory Group.// Wkly Epidemiol. Rep. 1992. - №.3.- P. 11-16.

142. Yalcin K., Degertekin H., Bachecioglu I. et al. Hepatitis В virus genotype D prevails in patients with persistently elevated or normal ALT levels in Turkey // Infection. 2004. - 32. - P.24-29.

143. Yalcinkaya K.T., Ucar H., Uzun M. et al. Subtypes of hepatitis В surface antigen in Turkey // Jpn. J. Infect. Dis. 2005. - 58.

144. Yoshikawa A., Gotanda Y., Itabashi M. et al. HBV NAT positive corrected. blood donors in the early and late stages of HBV infection: analyses of the window period and kinetics of HBV DNA // Vox Sang. -2005.- 88(2). -P.77-86.

145. Yukimasa N, Ohkushi H, Fukasawa K, Fukuchi K, Takagi Y, Gomi K. Hepatitis В virus gene mutations in the sera of three patients with coexisting1. Г'hepatitis В surface antigen and anti-surface antibody I I Rinsho Byori. 2000.48(2).-P. 184-188. *