Разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Сокурова, Алла Михайловна

• Сокурова, Алла Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сокурова, Алла Михайловна

Перечень сокращений и условных обозначений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Краткие сведения о вирусном гепатите В

1.1.1 Вирус гепатита В, его морфология, биологические и антигенные свойства

1.1.2 Открытие первого маркера вируса гепатита В

1.1.3 Строение поверхностного антигена вируса гепатита В '.

1.1.4 Цикл репродукции вируса гепатита В

1.2 Диагностика вирусного гепатита В

1.2.1 Серологические маркеры инфекции

1.2.2 Методы иммунологической диагностики поверхностного антигена вируса гепатита В

1.3 Обоснование выбора птиц в качестве донора биологического сырья

1.4 Диагностическая и практическая ценность иммуноглобулинов желтков яиц в различных областях биологической науки

1.4.1 Гуморальный иммунитет птиц

1.4.2 Область применения желточных иммуноглобулинов

2 Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение соответствия перепелов статусу животных, свободных от специфических патогенов вирусной и микробной этиологии

2.2.2 Способ подготовки к стерилизации и стерилизация комбикорма

2.2.3 Способ забора крови у перепелов

2.2.4 Особенности приготовления препаратов для иммунизации

2.2.5 Способ иммунизации перепелов

2.2.6 Процесс выделения иммуноглобулинов из желточной массы яиц и их очистка

2.2.7 Определение титра специфических иммуноглобулинов к поверхностному антигену вируса гепатита В

2.2.8 Статистические методы исследования

3 Подготовка биологической модели (перепелов) для проведения экспериментальных исследований

3.1 Особенности содержания перепелов в условиях эксперимента

3.2 Схема иммунизации перепелов

3.3 Результаты определения соответствия перепелов статусу животных, свободных от специфических патогенов

3.4 Влияние факторов окружающей среды и условий эксперимента на физиологические показатели перепелов

3.5 Влияние схемы иммунизации на морфометрические показатели перепелиных яиц

3.6 Динамика изменений титров специфических иммуноглобулинов к НВз

§ в Сыворотке крови и желтках яиц перепелов при использовании различных препаратов для иммунизации

4 Формирование опытного образца тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов и оценка его эффективности

4.1 Определение чистоты желточных иммуноглобулинов

4.2 Оценка эффективности разработанной тест-системы для индикации НВз

§ на основе желточных иммуноглобулинов

4.3 Схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg»

Актуальность темы- исследования. В связи с увеличением численности населения планеты, все более масштабнымстановится распространение различных- инфекционных заболеваний, особенно вирусной природы. (£воевременная4 индикация возбудителей или маркеров-инфекций у людей и животных способна предотвратить возникновение эпидемий- и эпизоотий.

Глобальную проблему для- населения Земли представляют вирусные гепатиты, в частности-вирусный-гепатит В* (BFB); которым* инфицировано» около в млрд. человек, при этом около 350*млн. человек имеют хроническую форму заболевания. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, более 600-тыс. человек-ежегодно-умирает от острой или хронической формы-гепатита Вг[32; 37, 88, 89, 91, 134, 159]:

В'Российской Федерации непрерывность эпидемического процесса гепатита-В в. основном обеспечивается'недиагностируемыми. формами инфекции: Из , материалов Государственного'статистического наблюдения 19942003 гг., только среди населения групп высокого риска заражения выявлено 1158258- HBsAg-позитивных лиц, в этот же период зарегистрировано 475824 больных острыми-манифестными, формами, инфекции, т.е. в 2,4 раза меньше; Только используя доступный и информативный метод определения HBsAg в сыворотке крови, медицина будет располагать возможностью оценить интенсивность основного скрыто развивающегося эпидемического процесса гепатита В [4-9, 29, 45, 90]. Особенно важен данный аспект в отношении внутрибольничного инфицирования' вирусом гепатита В медицинских работников и доноров крови [13, 19-21,^24, 49, 59, 74, 159].

Установлено, что в последние годы на фоне снижения заболеваемости острой формой гепатита В увеличилось количество больных с хроническими формами заболевания [4-8, 88-91, 111, 150].

В* Российской Федерации основным* методом1 этиологической лабораторной диагностики. ВГВ является- серо л огиче с ки й метод. В настоящее время-«золотым стандартом» в диагностике ВГВ; помимо- клинико-биохимических признаков, является выявление поверхностного антигена ВГВ - HBsAg.

За последние 5-10 лет значительно возросла чувствительность и специфичность существующих* тест-систем. В'качестве диагностического-средства используются моноклональные антитела, полученные с помощью! гиб-ридомной технологии, и сывороточные поликлональные антитела, полученные от животных-доноров.

Разработчики диагностических тест-систем учли многие рекомендации клиницистов в процессе их применения^, обеспечили устранение выявленных недостатков для повышения уровня качества проведения диагностических исследований. Вместе с тем следует отметить, что развитие.этиологической лабораторной диагностики шло в экстенсивном» направлении, не затрагивая особенностей; получения биологического сырья:

Производство диагностических антител к HBsAg является* длительным и дорогостоящим. Эти особенности'побудили нас рассмотреть возможность использования других, более рентабельных, биологических моделей ч для получения диагностических иммуноглобулинов. Особого внимания, заслуживает возможность получения- диагностических препаратов на основе желточных иммуноглобулинов (IgY, от англ. yolk) от различных видов птиц (гусей, уток, кур, перепелов и др.). Иммуноглобулины, птиц не обладают неспецифическим взаимодействием с компонентами сыворотки крови человека, т.к. птицы эволюционно представляют собой отдельную ветвь развития. Кроме того, взятие крови у лабораторных животных представляет сложную, болезненную процедуру, а получение яиц от иммунизированных птиц, которые содержат специфические иммуноглобулины, является физиологичным и неинвазивным.

Помимо вышеперечисленных преимуществ и особенностей, используя птиц в качестве продуцентов биологического сырья, для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов, становится возможным круглогодичное получение недорогих диагностических иммуноглобулинов, а также осуществление быстрой замены продуцента с минимальным сроком восстановления его продуктивности.

Кроме того, в настоящее время в медицине ощущается большой? недостаток в специфических сорбентах, в частности иммуноглобулинового происхождения. В медицинской практике довольно часто приходится проводить аферез, т.е. удаление из периферической крови различных антител и антигенов^ В этом* направлении весьма перспективным специфическим сырьём с неограниченным материальным ресурсом могут выступить желточные антитела [76].

Цель исследования: разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов'иммунизированных перепелов {Coturnix coturnix japónica) для индикации HBsAg.

Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи.

1. Разработать биологическую модель — продуцента диагностических иммуноглобулинов.

2. Определить влияние препаратов для иммунизации и факторов окружающей среды на биологическую модель.

3. Сформировать опытный образец тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов и разработать схему его получения.

4. Провести лабораторные испытания разработанной тест-системы на основе желточных антител для индикации HBsAg и оценить её чувствительность и специфичность.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые для нужд медицины для получения диагностических иммуноглобулинов были использованы, перепела вида Coturnix coturnix japónica. Впервые разработана методика иммунизации самок перепелов HBsAg с последующим получением в качестве конечного продукта специфических антител. Впервые создана тест-система-на основе желточных иммуноглобулинов для индикации HBsAg с высокой чувствительностью и специфичностью и-разработана схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.

Практическая значимость. На основании проведённых исследований разработана тест-система для» этиологической? лабораторной диагностики ВГВ. Разработана биологическая модель и экспериментально обоснована её биологическая и диагностическая целесообразность. Разработана схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.

Разработаны* методические рекомендации «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов» (2009); предназначенные для вирусологов, микробиологов и других специалистов, работающих в области создания иммунодиагностических средств медицинского-и ветеринарного назначения;,

Разработанные рекомендации и фактический материал используются в качестве теоретического обоснования и практического воплощения при проведении научно-исследовательских работ в.Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии), а также при обучении слушателей и курсантов Федерального государственного образовательного« учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» (ФГОУ ВПО «ВМА им. С.М. Кирова»).

Положения, выносимые на защиту:

1. Применение перепелов вида Coturnix coturnix japónica для получения специфических диагностических иммуноглобулинов к HBsAg, исходя из их иммунофизиологических показателей и возможности поддержания статуса

SPF (specific pathogen free — свободный- от специфических патогенов), является обоснованным.

2. Тест-система на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов является высоко эффективной для диагностики ВГВ.

3. Разработанная схема производства диагностической тест-системы,для индикации HBsAg на основе" Ig Y иммунизированных перепелов применима для практического использования:

Апробация работы и реализация- полученных результатов. Основные результаты исследования« были, доложены и обсуждены на двух Всероссийских конференциях: «Современные проблемы здоровья населения и военнослужащих» (СПб:, 2007 г.), «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (СПб., 2008'г.), IV международной конференции «Идеи Пастера в^ борьбе с инфекциями» (СПб., 2008 г.), на научной конференции Северо-западного научно-методического1 центра Российской академии сельскохозяйственных наук «Нанотехнологии в зоотехнии и ветеринарной медицине: реализация и перспективы» (СПб:, 2008 г.), V съезде общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (М., 2008 г.), XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Современное производство:. исследования и инновации» (М., 2009 г.), заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (СПб., 2009 г.) и XIV Европейском конгрессе по биотехнологии (Барселона, Испания, 2009 г.).

В настоящее время в Федеральном институте промышленной собственности рассматривается заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение: «Способ получения диагностических иммуноглобулинов для выявления HBsAg» (вх. № 009557, per. № 2009107142 от 27.02.2009 г.).

Реализовано'три рационализаторских предложения, направленные на существенное упрощение процедуры выделения и очистки Ig Y, принятые к использованию в ФГОУ ВПО «BMA им. С.М. Кирова»:

- способ подготовки поверхности оболочки желточного шара яиц птиц и повышения её прочности» (№ 11522/11 от 13 ноября 2008 г.);

- способ депротеинизации оболочки желточного шара для выделения желточных иммуноглобулинов (№ 11523/11 от 13 ноября 2008 г.);

- устройство для механического разделения массы белка и желточного шара яиц птиц (№ 11524/11 от 13 ноября 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный- вклад автора. Автором лично сформулированы цель и задачи исследования, составлен план» экспериментов, осуществлён сбор и анализ научной информации по. теме исследования. Самостоятельно-спланированы и проведены исследования, систематизация; обработка и анализ полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного набора, состоит из введения, четырёх глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Список литературы включает 207 источников, из них: 92'отечественных и 115 иностранных. Текст диссертации содержит 22 таблицы, 29 рисунков, 2 приложения.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Сокурова, Алла Михайловна

100 Выводы

1. По своим иммунофизиологическим показателям и возможности поддержания статуса SPF применение в качестве биологической модели перепелов вида Coturnix coturnix japónica для получения диагностических желточных иммуноглобулинов является обоснованным.

2. Иммунизация перепелов- HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия- и введённым в обратную эмульсию «вода-масло», приводит к статистически значимому (р<0,001) снижению морфометрических показателей перепелиных яиц. В то же время не отмечено влияния препаратов, используемых для иммунизации, на динамику яйцекладки перепелов. Основным лимитирующим фактором внешней среды, влияющим на динамику яйцекладки перепелов, а соответственно и количество получаемых диагностических иммуноглобулинов, является долгота дня.

3. Использование для иммунизации перепелов'HBsAg, сорбированного на гидроокиси алюминия и введённого в обратную эмульсию «вода-масло», позволяет получать более высокие титры, специфических антител^ по сравнению с иммунизацией перепелов HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия.

4. Повышение уровня антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных перепелов является критерием повышения уровня специфических антител в желтках яиц (р<0,001).

5. Применение специфических желточных антител в опытном образце диагностической тест-системы для индикации HBsAg позволяет получать результаты, сопоставимые с результатами тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и ЗАО «ЭКОлаб» (Россия).

6. Разработанная схема получения и выделения специфических диагностических иммуноглобулинов из желтков яиц иммунизированных перепелов для индикации HBsAg является эффективной и позволяет получать их в необходимых объёмах.

Практические рекомендации

1. В качестве продуцента диагностических иммуноглобулинов для индикации HBsAg могут быть использованы перепела вида Coturnix coturnix japónica.

2. Для проведения эффективной иммунизации перепелов целесообразно применять препарат в виде HBsAg, сорбированного на гидроокиси алюминия и заключённого в обратную эмульсию «вода-масло».

3. Для создания биологической модели и получения диагностических иммуноглобулинов следует руководствоваться практическими рекомендациями «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов», утверждёнными в марте 2009 г. академиком-секретарём отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым, которые предназначены для вирусологов, микробиологов и других специалистов, работающих в области создания иммунодиагностических средств медицинского и ветеринарного назначения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сокурова, Алла Михайловна, 2009 год

1. Болотских JI.A. Питание безмикробных животных/ JI.A. Болотских // Теоретические и практические проблемы гнотобиологии; Под ред. В.П. Шишкова, Ю.Ф. Исакова. М.: Агропромиздат, 1986. - С. 79-81.

2. Ветеринарная энциклопедия. М.: Сов. энциклопедия, 1976. — 1032 с.

3. Ветеринарно-санитарные требования к перепелиным СПФ-фермам, продающим биопредприятиям инкубационное яйцо / Р.Н. Коровин, В.П. Зеленский, C.B. Борисенко и др. Л.: ВНИВИП, 1989. - 18 с.

4. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 2 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. СПб.: НИИЭМ имени Пастера,1999.-264 с.

5. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 3 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. — СПб.: НИИЭМ имени Пастера,2000.-256 с.

6. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 4 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. — СПб.: НИИЭМ имени Пастера, 2003.-200 с.

7. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 5 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. СПб.: НИИЭМ имени Пастера,2005.-160 с.

8. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 6 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. — СПб.: НИИЭМ имени Пастера,2006.- 110 с.

9. Вирусные гепатиты / А.Г. Рахманова, В.К. Пригожина, В.А. Неверов и др. СПб.: ССЗ, 1995. - 40 с.

10. Воронин Е.С. Способы получения СПФ-эмбрионов птиц для производства живых вирусных вакцин / Е.С. Воронин // Теоретические и практические проблемы гнотобиологии; Под ред. В.П. Шишкова,

11. Ю.Ф. Исакова. -М.: Агропромиздат, 1986. С. 37-42.

12. ГОСТ Р 50258-92. Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия, Введ. 1994-01-01.- М.: Изд-во стандартов, 1992. - 8 с.

13. ГОСТР 52249-2004. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. -Введ. 2005-01-01. -М.: Изд-во стандартов, 2004. -100 с.

14. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. Введ. 2002-11-01. - М.: Изд-во стандартов, 2002. — 32 с.

15. Динамика распространения/HBs-антигена: в контингентах с. различным риском инфицирования? в; г. Москве: в; 2001-2003 гг. / П.Г. Богуш,

16. A.A. Потапова; Е.Б. Редченко и др. // Вирусный гепатит В — диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HBs Ag). Российская научно-практическая конференция с международным участием. - Тезисы докладов. -М-РАМН, 2004; - С: ЮЭД.

17. Дифференциальная лабораторная; иммунодиагностика вирусных гепатитов. Методические рекомендации / A.A. Новик, В;Н. Цыган,

18. B.Ю. Никитин и др. -М.: ГВМУ Минобороны России, 2002. 80 с.

19. Жданов В.М; Вирусные гепатиты / В.М. Жданов, В.А. Ананьев, В.М. Стаханова. М.: Медицина, 1986. - 256 с.

20. Иммунологические методы: Пер. с нем. А.П. Тарасова / Под ред Г. Фримеля: М.: Медицина, 1987. - 472 с.

21. Иммунология. Методы исследований: Пер. с англ. А.Н. Маца/ М. Трукко, С. де Петрис, Б. Такач и др.; Под общ. ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1983. - 349 с.

22. Кишкун A.A. Руководство по лабораторным методам диагностики / A.A. Кишкун. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -800 с.

23. Колабская JI.C. Иммуноглобулины птицы / JI.C. Колабская // Птицеводство. 1987. - № 9. - С. 35-36.

24. Куликов JI. Как образуется яйцо / Л. Куликов // Птицеводство. — 1998. -№3.- С. 43-45.

25. Лабораторные методы исследования в ветеринарии. М.: Гос. изд-во сельскохоз. лит-ры, 1953. - 587 с.i

26. Лопаткина Т.Н. Клиника гепатитаг С / Т.Н. Лопаткина // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 1997. — № 1. — С. 12-16;

27. Маркеры гепатитов В и С у больных острым лейкозом/107 :

28. Медуницын Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын. М.: Триада-X, 1999.-272 с.

29. Научные основы производства диагностических препаратов> (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В. Смирнов, В.Я-. Чаплинский, З.М. Андреева, Л.Б. Богоявленская. Киев: Наукова думка, 1980.-196 с.

30. НетесовС.В. Вирусные гепатиты / C.B. Нетесов// Биология.-1997.-№2.-С. 35-43.

31. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека: Пр. Минздрава РФ от 21.10.2002 г. № 322. М.: Минздрав РФ, 2002. - 8 с.

32. ОвиноваЕ.В. Значение диагностики гепатитов различными лабораторными методами / Е.В. Овинова, Е.И. Глухова, И.А. Мисевич // Вирусные гепатиты- эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика.

33. УПТоссийскаяшаучно-практическая конференция с международным участием. Материалы конференции. - М.: РАМН, 2007. - С. 52-54.

34. Пелконен К. Применение концепции SPF в конструировании помещений для лабораторных животных / К. Пелконен // Современные методы в выращивании^ и содержании лабораторных животных. — Мат. симпозиума И мая 1988 г.-Mi: 1988.-С. 22-27.

35. ПигареваМ.Д. Разведение перепелов / М.Д. Пигарева. М.: Рос-сельхозиздат, 1978. - 79 с.

36. Правила бактериологического исследования кормов: утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 10 июня 1975 г. -М.: Министерство сельского хозяйства, 1975. 10 с.

37. Практическое пособие по иммуноферментному анализу / Н.В. Иванская, Е.Н. Кислых, Е.В. Максименок и др.; Под ред. А.Л. Гураля, Н.Я. Спивака. Киев: НАНУ, 2003. - 68 с.

38. Пшеничнов В.А-. Стандартизация методов вирусологических исследований/ В.А. Пшеничнов, Б.Ф.Семенов, Е.Г. Зезеров. М.: Медицина, 1974. - 168 с.

39. Рахманова А.Г. Хронические вирусные гепатиты / А.Г. Рахманова, A.A. Яковлев, E.H. Виноградова. СПб., 1997. - 29 с.

40. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных: Национальный; научно-исследовательскит совет. Комиссия по наукам о: жизни. Институт ресурсовлабораторных животных: RussiamVersion: -Washington; National Academy Press, 1996; 138 с.

41. Санитарные правила1 по устройству, оборудованию:-и содержанию экспериментально-биологических клиник: (вивариев) № 1045-73 (Утверждены Главным санитарным врачом СССР 06 апреля 1973 г.). М.: Минздрав СССР, 1973.- 13 с.

42. Современная характеристика внутрибольничных парентеральных вирусных гепатитов и пути совершенствования их профилактики/

43. Создание биологической модели для получения-диагностических иммуноглобулинов (методические рекомендации) / В.Б. Сбойчаков, C.B. Борисенко, А'.М. Сокурова и др. — М.: Россельхозакадемия, 2009. 16 с.

44. Соринсон С.Н: Вирусные гепатиты в клинической практике / С.Н. Соринсон. СПб.: ТЕЗА, 1996. - 304 с.

45. Специфические иммуноглобулины из желтков яиц японских перепелов, иммунизированных вирусами гриппа и HIV-1 / A.A. Ковган, Е.И. Исаева, З.И. Ровнова, A.A. Шилов // ДАН. Вирусология. - 1989. -Т. 307.-№1.-С. 229-233.