Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Воронцова, Юлия Евгеньевна

• Воронцова, Юлия Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Воронцова, Юлия Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Генетический контроль ранней поляризации терминальной цисты и ооцита у дрозофилы.

1.1.1. Ранний оогенез у дрозофилы.

1.1.2. Формирование поляризованной цисты.

1.1.3. Следствие полярности фьюсомы: детерминация трофоцита против детерминации ооцита.

1.1.4. Ранняя поляризация ооцита.

1.1.5. Ориентация ооцита является связующим звеном между ранней и поздней поляризацией яйцевой камеры.

1.1.6. Сравнение ранних этапов оогенеза дрозофилы и ксенопуса.

1.2. Характеристика гена leg-arista-wing complex.

1.2.1. Взаимодействие leg-arista-wing complex с различными генами.

1.2.2. Характеристика различных аллелей гена lawc.

1.3. Фактор базовой транскрипции TRF2.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование Drosophila melanogaster.

2.2. Генетические методы.

2.3. Приготовление препаратов для микроскопии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Восстановление жизнеспособности особей с летальными mvc-мутациями (rescue-тест).

3.1.1. Анализ музейных летальных /awe-мутаций.

3.1.2. Анализ лабораторных летальных /awe-мутаций.

3.1.3. Восстановление фенотипа у мутантных гетерозиготных самок lawc?1/1(l)EF520.

3.2. Исследование причин нерасхождения хромосом у 1а\\>с-мутантов

3.3. Нарушения в репродуктивной системе самок /аи>с-мутантов.

3.3.1. Анализ слабофертильных и стерильных самок.

3.3.2. Анализ материнского эффекта гена 1<теНгр.

3.4. Взаимодействие 1аюсЛг/2с генами митоза, мейоза и оогенеза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster»

Актуальность проблемы. Создание и совершенствование мощных технологий, позволяющих детализировать молекулярные процессы, регулирующие развитие, привело к тесному сплетению генетики, клеточной биологии и биологии развития, и многие гены, которые, считалось, выступают в роли регуляторов основных биологических функций клетки (гены домашнего хозяйства), оказалось, обладают специфическими регуляторными функциями в развитии. Поэтому изучение особенностей проявления генов, кодирующих эволюционно консервативные факторы транскрипции, является актуальной проблемой.

Инсерционная мутация leg-arista-wing complex (lawc) дрозофилы, нарушающая правильную экспрессию многих локусов, была обнаружена в 1992 году в лаборатории Т.И. Герасимовой (ИОГен РАН) (Симонова и др, 1992). Район исследуемой инсерции был клонирован и картирован. Позднее в 1999 году в лаборатории Тиджена (Tjan, США) у дрозофилы был открыт ген, гомологичный гену человека и кодирующий фактор базовой транскрипции ТВР related factor 2 (TRF2), который принадлежит к эволюционно консервативному семейству белков ТВР (TATA-box binding protein) (Rabenstein et al., 1999). Однако границы этого гена не были установлены. В первую очередь эти трудности обуславливались отсутствием мутаций, локализованных в этой области. И только к 2003 году, когда полностью расшифровали геном дрозофилы, стало ясно, что клонированная часть последовательности lawc лежит на расстоянии примерно 15 т.п.н. от открытой рамки считывания гена trf2. Открытие и клонирование инсерционной мутации lawif1 сыграло важную роль в установлении границ гена trf2, в частности, района начала его транскрипции (совместная работа лабораторий П.Г. Георгиева, Ю.В. Ильина, Л.И. Корочкина, ИБГ РАН) (Копытова и др., 2005). В результате оказалось, что с одной мРНК trfl могут синтезироваться две изоформы белка (полноразмерная и укороченная), отличающиеся N-концевыми последовательностями. 4

Район локализации lawc (7Е район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких летальных мутаций разной природы. Поэтому стало актуально изолировать аллели, нарушающие экспрессию конкретных изоформ TRF2.

Некоторые /от ус-мутации вызывают стерильность самок, другие аллели приводят к раннему старению организма. В настоящее время старение предположительно связывают с нарушением самовоспроизведения стволовых клеток в репродуктивной системе. Гаметогенез у дрозофилы исследован очень хорошо. Однако его генетический контроль изучен недостаточно. Например, неизвестно, каким образом происходит выбор ооцита среди шестнадцати клеток цисты, хотя уже ясно, что за его спецификацию отвечает недавно открытая цитоплазматическая структура, возникающая в стволовых клетках полового пути, названная фыосомой. Поэтому изучение генетической регуляции процессов идентификации ооцита и поддержания его статуса, а также самовоспроизведения стволовых герминативных клеток и старения предполагает исследование стерильных и слабофертильных мутантов у хорошо изученных модельных организмов.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в идентификации мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию каждой из изоформ фактора транскрипции TRF2, и изучении их влияния на оогенез у Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) провести серию генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые изоформы гена trf2, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе lawc-trf2;

2) провести цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития в поисках причин нерасхождения хромосом в мейозе у lawc-мутантов;

3) исследовать особенности распределения белка TRF2 на политенных хромосомах слюнных желёз личинок дрозофилы;

4) изучить функциональные особенности lawc/trf2 в репродуктивной системе самок дрозофилы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания яичников стерильных и слабофертильных мутантов ооцитспецифичными и другими маркерами;

5) исследовать материнский эффект летальных аллелей lawc с помощью клонального анализа и флуоресцентного окрашивания.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были изолированы летальные аллели lawc с нарушенной экспрессией полноразмерной и укороченной изоформ белка TRF2. Установлено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Обнаружено, что нерасхождение хромосом в мейозе у /awc-мутантов вызвано нарушением структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития. Впервые показано, что продукт ген lawc/trfl участвует в формировании клеточного цитоскелета и связанного с ним транспорта ооцитспецифичного белка Orb. Обнаружено влияние, уровня экспрессии lawc/trfl на организацию актина в эпителиальных клетках яичника. Установлено, что стерильность /Wc-мутантов вызвана нарушением механизма дифференцировки герминативных и соматических фолликулярных клеток. Обнаружено, что у мутантов с сокращенной продолжительностью жизни отсутствует самовоспроизведение герминативных стволовых клеток.

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена lawc/trfl, а также помогут решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимосвязей сигнальных путей в оогенезе у дрозофилы. Учитывая, что у позвоночных, в том числе у млекопитающих и человека, присутствуют гомологичные гены, то можно предположить, что полученные данные будут иметь универсальное значение.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на XIV школе по биологии развития (Звенигород, 2005), VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород,

2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва,

2006), международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое применение» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2007) и на 46-й, 47-й и 49-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сан-Диего, 2005; Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, их них 3 статьи в рецензируемых журналах и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (91 источник). Содержит 21 рисунок и 10 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Воронцова, Юлия Евгеньевна

Выводы

1. Показано, что большинство летальных мутаций lawc являются аллелями гена trß, кодирующего фактор базовой транскрипции. Идентифицированы 10 летальных мутаций lawc, которые вызваны снижением экспрессии укороченной изоформы TRF2, и три летальные мутации lawc, вызванные снижением экспрессии полноразмерной изоформы TRF2. Обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой домен TRF2 D. melanogaster обладает самостоятельной функциональной активностью.

2. Впервые показано, что во время мейоза у самок /mvc-мутантов происходит нерасхождение половых хромосом. Установлено, что причиной нерасхождения является нарушение структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита. Преимущественная локализация TRF2 в хромоцен-тре подтверждает его специфическую функцию в организации структуры хромоцентра.

3. Установлено, что продукт гена lawc/trß участвует в организации актино-вых филаментов фолликулярного эпителиального слоя яичников и герминативных клеток цисты.

4. Показано, что нарушение дифференцировки ооцитов у слабофертильных самок /ан'с-мутантов происходит из-за аномальных структур цитоскелета, обеспечивающих транспорт ооцитспецифичного белка Orb.

5. Было установлено, что большинство аномалий, выявленных в оогенезе при помощи клонального анализа, затрагивают регуляцию клеточного цикла и связаны с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2, однако, в эндомитозе трофоцитов могут участвовать обе изоформы, и при нехватке одной из них другая может её компенсировать.

6. Впервые обнаружено, что сильные мутации гена lawc/trß могут нарушать циклическое деление герминативных стволовых клеток и соматических фолликулярных стволовых клеток репродуктивной системы самок дрозофилы.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из литературных данных известно, что укороченная изоформа TRF2 входит в состав макромолекулярного комплекса, включающего в себя DREF (DNA-replication-related element factor), и может контролировать транскрипцию генов клеточного цикла, клеточной пролиферации и генов, ответственных за репликацию ДНК, например, гена PCNA (the proliferating cell nuclear antigen) и гена, кодирующего а-субъединицу ДНК-пол имеразы (Hochheimer et al., 2002). Для полноразмерной изоформы подобной информации нет. К тому же, мало известно о конкретных генах-мишенях фактора транскрипции TRF2, функция которого исследовалась в основном биохимическими методами, и до последнего времени не было известно ни одной гипоморфной мутации этого гена.

В результате проделанной работы мы показали, что большинство мутаций lawc являются аллелями trf2, т.к. мутанты восстанавливают фенотип на фоне дополнительной экспрессии TRF2. Мы изолировали и исследовали ги-поморфные летальные аллели lawdtrfl с нарушенной экспрессией каждого из его продуктов. Впервые было обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Исследование фенотипа погибших эмбрионов из линии с пониженной экспрессией N-концевого района выявил у них недоразвитие трахейной системы, связанное с нарушением финальных этапов её формирования: слияния трахейных ветвей в единую сеть (Симонова, Бур дина, в печати). Природа этих мутаций в настоящее время исследуется.

При том, что плейотропный эффект /awe-мутаций уже хорошо описан, нам удалось обнаружить его новое проявление: нерасхождение хромосом, вызванное, очевидно, нарушением компактной структуры хромоцентра. Локализация белка TRF2 в хромоцентре подтверждает выдвинутую другими авторами гипотезу о том, что этот белок может не только участвовать в транскрипции, но и может также выполнять структурные функции в организации хроматина.

Исследуя репродуктивную систему мозаичных самок, мы обнаружили, что снижение экспрессии каждой из двух изоформ la\vc/trf2 в соматических фолликулярных клетках приводит к нарушению структурированности их эпителиального слоя, вызванного неправильной организацией актиновых микрофиламентов. Этот факт стал для нас неожиданным, т.к., ранее было показано, что этот белок локализуется преимущественно в ядрах герминативных, а не соматических фолликулярных клеток.

Важным компонентом, контролирующим организацию актина в различных видах эпителия, включая фолликулярные клетки яичника, является киназа Abelson (Abi) (Grevengoed Е.Е. et al. 2001). По нашим данным гапло-копия гена АЫ способна усиливать фенотип lawc-мутантов, что говорит о взаимодействие этих генов (Модестова, Симонова, не опубл.). Свидетельством взаимодействия lawc/trf2 с компонентами цитоскелета могут служить и другие наши генетические данные: жизнеспособные /т^оаллели гибнут на фоне гетерозиготных делеций генов lamininA, laminin у, Paramyosin, ответственного за формирование миофибрилл, и rliea, кодирующего талин - компонент цитоскелета, необходимый для прикрепления актина к плазматической мембране и связывания интегринов (Модестова, Симонова, не опубл.).

Исследование мутантных клонов обнаружило участие короткой изоформы lawdtrfl в контроле циклического деления стволовых соматических клеток, дающих начало фолликулярному эпителию, так как снижение экспрессии этой изоформы приводило к полному отсутствию фолликулярного слоя и формированию «длинных» гермариев. Низкая экспрессии этой изоформы также вызывала нарушение самовоспроизведения стволовых герминативных клеток, о чём свидетельствуют «пустые» гермарии и отсутствие ранних цист. Анализируя яичники слабофертильных мутантов мы впервые показали, что отсутствие дифференцировки ооцита в гермарии сопровождается аномальной структурой кольцевых каналов и вызывается нарушением ооцитспецифичного транспорта, обеспечивающего ооциту его статус. Аномальные кольцевые каналы, нарушающие рост и созревание ооцита, были характерны и более зрелым мутантным яйцевым камерам, исследованным нами в ходе клонального анализа.

У мутантных клонов было выявлено много нарушений, связанных с регуляцией клеточного цикла. В основном они были в линиях с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2. Однако лишний раунд деления и формирование 32-клеточных цист был характерен и для клонов линий с пониженной экспрессией полноразмерной изоформы.

Интересно проявил себя факт разноплоидности трофоцитов. Этот признак возникал при снижении экспрессии укороченной изоформы, но только при повышенной температуре развития мозаиков, и при снижении экспрессии полноразмерной изоформы, но в условиях пониженной температуры развития. Возможно, контролируя данный процесс, обе изоформы могут заменять друг друга.

В настоящее время известно несколько мутаций {Hii-li tai shao, Dynein, a-spectrin и др.), нарушающих формирование фьюсомы и ооцита. Результаты последних исследований показали, что дифференцировку ооцита также контролируют гены-регуляторы клеточного цикла {encore, stonewall, string/cdc25, tribbless и др.), так как единственная клетка, которая проходит мейоз полностью, - это ооцит, а остальные (трофоциты) подвергаются поли-плоидизации в процессе эндомитоза. Другая группа генов - гены веретена {spindle, obra, aubergine, vasa, armitage и др.) - нарушают формирование ан-териопостериальных и дорзовентральных осей и останавливают дифференцировку ооцита путём ареста формирования кариосомы, мислокализации ооцита, неспособности удерживать цитоплазматические компоненты на заднем полюсе ооцита и дифференцировки второго проооцита в ооцит. Эта группа генов участвует либо в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, либо в регуляции трансляционного сайленсинга при помощи микро-РНК и

РНК-интерференции. Обнаружено, что поляризацию могут контролировать ряд нейроспецифических генов (Notch, Delta, neuralized, big brain, mastermind и др.). Кроме того, известно, что при контакте ооцита с соматическими фолликулярными клетками происходит его реполяризация (ген Dystroglycan).

Эти процессы были исследованы благодаря наличию мутаций в контролирующих их генах, постановке иммунохимических экспериментов и клонального анализа клеток полового пути.

Результаты данной работы лягут в основу для дальнейшего исследования функциональных особенностей сложно устроенного генного комплекса lawc-trf2, чтобы установить, какую группу генов в сложной иерархии процесса регуляции гаметогенеза дрозофилы он контролирует.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Воронцова, Юлия Евгеньевна, 2008 год

1. Инге-Вечтомов С.Г., Введение в молекулярную генетику. М., Высшая школа, 1983, 343 с.

2. Копытова Д.В., Краснов А.Н. Семейство белков TRF (ТВР-подобных факторов) // Генетика. 2007. Т. 43, №3. С. 317-322.

3. Копытова Д.В., Краснов А.Н., Симонова О.Б., Модестова Е.А., Корочкин Л.И., Георгнева С.Г. Изучение гена lawc-trfl Drosophila melanogaster и его белкового продукта// ДАН. 2005. Т.405. №1. С.125-127.

4. Лилли Р.Д. Патологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 645 с.

5. Модестова Е.А. Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster II Автореферат канд. дис. М. 2005.

6. Модестова Е.А., Воронцова Ю.Е.,. Корочкин Л.И, Симонова О.Б. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster II ДАН, 2005. Т. 403, №4. С. 564-565.

7. Модестова Е.А., Копытова Д.В., Георгнева С.Г., Симонова О.Б. Использование генетической системы химерного белка P-Ph для репрессии транскрипции гена leg-arista-wing complex у дрозофилы // Генетика. 2003. Т. 39. №5. С. 713-716.

8. Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Солдатов A.B., Симонова О.Б. Клонирование гена гена leg-arista-wing complex (lawc) и анализ его мутантных производных у дрозофилы. // Генетика, 1998, 34, №3, с. 446-448.

9. Симонова О.Б. Новый транс-регуляторный локус дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N11. С.1464 1474.

10. Чубыкин В.Л. Структура и функция хромоцентра в клетках яичников Drosophila melanogaster II Доктор, диссерт., Новосибирск. 2001

11. Ashburner M., Drosophila. A laboratory handbook. II Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a. P. 1331.

12. Ashburner M., Drosophila. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 b., P. 434.

13. Boyd L., Guo S., Levitan D., Stinchcomb D.T., and Kemphues K.J. PAR-2 is asymmetrically distributed and promotes association of P granules and PAR-1 with the cortex in C. elegans embryos // Development. 1996. V. 122. P. 3075-3084.

14. Bullock S.L., and Ish-Horowicz D. Conserved signals and machinery for RNA transport in Drosophila oogenesis and embryogenesis // Nature. 2001. Y. 414. P. 611-616.

15. Carpenter A. Egalitarian and the choice of cell fates in Drosophila melanogaster oogenesis // In Germline development. J. Marsh and J. Goode /Eds. Chichester: John Wiley & Sons. 1994. P. 223-246.

16. CookH.A., Koppetsch B.S., Wu, J., and Theurkauf W.E. The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification // Cell. 2004. V. 116. P. 817-829.

17. Chou T. and Perrimon N. Use of a Yeast Sitespecific Recombinase to Produce Female Germline. // Genetics. 1992, V. 131, P. 643-653.

18. Escudero L.M., Caminero E, Schidze K.L., Bellen H.J., Modolell J. Charlatan, a Zn-finger transcription factor, establishes a novel level of regulation of the proneural achaete/scute genes of Drosophila // Development. 2005. V. 132 № 6 P. 1211-1222.

19. Januschke J., Gervais L., Dass S., Kaltschmidt J.A., Lopez-Schier H., St Johnston D., Brand A.H., Roth S., and Guichet A. Polar transport in the Drosophila oocyte requires Dynein and Kinesin I cooperation // Curr. Biol. 2002. V. 12. P. 1971-198.

20. Jones D.L. Aging and the germ line: where mortality and immortality meet // Stem Cell Rev. 2007 V. 3 № 3 P: 192-200.

21. Godt D. and Tepass U. Drosophila oocyte localisation is mediated by differential cadherin-based adhesion //Nature. 1998. V. 395. P. 387-391.

22. AO.Hawkins N.C., Thorpe J., and Schüpbach T. encore, a gene required for the regulation of germ line mitosis and oocyte differentiation during Drosophila oogenesis //Development. 1996. V. 122. P. 281-290.

23. Al.Hochheimer A., Zhou S., Zheng S., Holmes MC, Tjian R. TRF2 associares with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila // Nature. 2002. V.420. P.439-445.

24. Hochheimer A. and Tijan R. Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissuespecific gene expression // Genes & Dev. 2003, V. 17.P.1309-1320.

25. Hong A., Lee-Kong S., Iida T., Sugimura L, and Lilly M.A. The p27(cip/kip) ortholog dacapo maintains the Drosophila oocyte in prophase of meiosis I // Development. 2003. V. 130. P. 1235-1242.

26. Hoogenraad C.C., Wulf P., Schiefermeier N., Stepanova T., Galjart N., Small J.V., Grosveld F., de Zeeuw C.I., and Akhmanova A. Bicaudal D induces selective dynein-mediated microtubule minus end-directed transport // EMBO J. 2003. V. 22. P. 6004-6015.

27. Hurov, J.B., Watkins, J.L., and Piwnica- Worms, H. Atypical PKC phosphorylates PAR-1 kinases to regulate localization and activity // Curr. Biol. 2004 V. 14. P. 736-741.

28. Huynh J.R., Shulman J.M., Benton R., and St Johnston D. PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila // Development 2001 V. 128. P. 1201-1209.

29. Huynh J.R. and St Johnston D. The role of BicD, Egl, Orb and the microtubules in the restriction of meiosis to the Drosophila oocyte // Development. 2000. V. 127. P. 2785-2794.

30. Huynh J.R. and St Johnston D. The Origin of asymmetry: Early polarisation of the Drosophila germline cyst and oocyte // Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 438-449

31. King R.C., Rubenson A.C., Smith R.F. Oogenesis in adult Drosophila melanogaster // Growth. 1956. V. 20. P. 121-157.

32. Lambert J.D. and Nagy L.M. Asymmetric inheritance of centrosomally localized mRNAs during embryonic cleavages // Nature 2002. V. 420. P. 682-686

33. Lehmann R. Egalitarian binds dynein light chain to establish oocyte polarity and maintain oocyte fate //Nat. Cell Biol. 2004 V. 6. P. 427^135.

34. Lin H. and Spradling A.C. Fusome asymmetry and oocyte determination in Drosophila //Dev. Genet. 1995. V. 16. P. 6-12.

35. Lin H., Yue L. and Spradling A.C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation // Development. 1994. V. 120. P. 947-956.

36. Lindsley, D.M., Zimm, G., The genome of Drosophila melanogaster NY: Academic Press, Inc. 1992 P. 1134.

37. Lighthouse DV, Buszczak M, Spradling AC. New components of the Drosophila fusome suggest it plays novel roles in signaling and transport // Dev Biol. 2008. V. 317 № l. P. 59-71.

38. Lyczak R., Gomes J.E. and Bowerman B. Heads or tails: cell polarity and axis formation in the early Caenorhabditis elegans embryo // Dev. Cell 2002. V. 3. P. 157-166.

39. McGrail M. and Hays T.S. The microtubule motor cytoplasmic dynein is required for spindle orientation during germline cell divisions and oocyte differentiation in Drosophila//Development. 1997. V. 124. P. 2409-2419.

40. Navarro C., Puthalakath H., Adams J.M., S tras ser A. and Lehmann R. Egalitarian binds dynein light chain to establish oocyte polarity and maintain oocyte fate. //Nat. Cell Biol. (2004). V. 6. P. 427-435.

41. Neumann C. J. and Cohen S. M. A heirarchy of cross-regulation involving Notch, wingless, vestigial and cut organizes the dorsal/ventral axis of the Drosophila wing // Development. 1996. V. 122. P. 3477-3485.

42. Puro J., Nokkala S. Meitic segregation of chromosomes in Drosophila melanogaster oocytes. A cytological approach // Chromosoma. 1977. V. 63. P. 273-286.

43. Rabenstein M. D, Zhou S, Lis J. T., Tjian R. TATA box-binding protein (TBP)-related factor 2 (TRF2), a third member of the TBP family. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96 № 9. P. 4791-4796.

44. Riechmann V., and Ephrussi A. Axis formation during Drosophila oogenesis // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. V. 11. P. 374-383.

45. Roper K., and Brown N.H. A Spectraplakin is enriched on the fusome and organizes microtubules during oocyte specification in Drosophila II Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 99-110.

46. TLP/TRF2/TLF) negatively regulates cell cycle progression and is required forthe stress-mediated G(2) checkpoint // Mol Cell Biol. 2003. V. 23 P. 4106-4120.

47. Shulman J.M., Benton, R. and St. Johnston D. The Drosophila homolog of C.elegans PAR-1 organizes the oocyte cytoskeleton and directs oskar mRNAlocalisation to the posterior pole // Cell. 2000. V. 101. P. 1-20.

48. Spradling A. Developmental genetics of oogenesis // In The Development of

49. Drosophila melanogaster, 1993. V. 1, 1 Edition, M Bate and A. Martinez-Arias,eds. (New York: Cold Spring Harbor Laboratory press), P. 1-70.

50. Spradling A., Drummond-Barbosa D. and Kai T. Stem cells find their niche //

51. Kl.Theurkauf W.E. Microtubules and cytoplasm organisation during Drosophila oogenesis //Dev. Biol. 1994. V. 165. P. 352-360.- 105

52. Theurkauf W., Alberts M., Jan, Y. and Jongens T. A central role for microtubules in the differentiation of Drosophila oocytes // Development 1993. V. 118. P. 1169-1180.

53. Vaccari T., and Ephrussi A. The fusome and microtubules enrich Par-1 in the oocyte, where it effects polarization in conjunction with Par-3, BicD, Egl, and dynein // Curr. Biol. 2002 V. 12. P. 1524-1528.

54. Vas sin H., Vielmetter, Campos-Ortega J. A. Genetic interactions in early neurogenesis of Drosophila melanogaster II J. Neurogenet. 1985. V. 2. № 5. P. 291-308.

55. Vinot S., Le T., Maro B., and Louvet-Valle'e S. Two PAR6 Proteins Become Asymmetrically Localized during Establishment of Polarity in Mouse Oocytes // Curr Biol. 2004. V. 14. P. 520-525.

56. Xie T. and Spradling A.C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 1998 V. 94 № 2 P: 251-260.

57. Yamashita Y., Fuller M., Jones D. Signaling in stem cell niches: lessons from the Drosophila germline. // Journal of Cell Science. 2005. V. 118, P. 665-672

58. Wharton R.P., and Struhl G. Structure of the Drosophila Bicaudal-D protein and its role in localizing the posterior determinant nanos // Cell. 1989. V. 59. P. 881-892.

59. Написание этой работы было бы невозможным без поддержки множества людей. Я бесконечно благодарна своему научному руководителю, Ольге Борисовне Симоновой, за предложенную тему, ценные рекомендации, постоянное внимание и проявленное терпение.

60. Также выражаю благодарность безвременно ушедшему Леониду Ивановичу Корочкину и Галине Валерьевне Павловой за предоставленную возможность выполнить данную работу в их лаборатории, за проявленный интерес к работе и поддержку.

61. Особую благодарность хочу выразить Валерию Леонидовичу Чубыкину за любезно предоставленную методику приготовления давленых препаратов и обсуждение полученных результатов.

62. Неоценимую помощь в освоении методов иммунофлуоресцентного окрашивания мне оказали Марина Робертовна Копанцева, Александр Владимирович Ревищин, Татьяна Тимошенко и Дмитрий Пантелеев.

63. С особой признательностью благодарю Павла Васильевича Гулак за «уроки волшебства» по конфокальной микроскопии.

64. Я искренне благодарна Елене Модестовой за критические замечания при написании данной работы и Илье Мерцалову за ценные советы.

65. Выражаю благодарность Павлу Георгиевичу Георгиеву и Софье Георгиевной Георгиевой за любезно предоставленные трансгенные линии, а также Александру Владимировичу Ревищину и Евгению Цитрину за подаренные антитела.

66. И в заключение, хотелось бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории нейрогенетики и генетики развития (ИБГ РАН), своих родных, близких и друзей, которые оказывали моральную поддержку и вдохновляли меня на «великие научные открытия».