Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Юдина, Ольга Сергеевна

• Юдина, Ольга Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юдина, Ольга Сергеевна

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

1.4. Апробация работы

1.5. Структура и объем работы

1.6. Публикации

1.7. Вклад автора

1.8. Благодарности

1.9. Список использованных сокращений

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Онкогенез и тумор-супрессоры

2.2. Нейрофиброматоз 2 типа

2.3. Характеристика белкового семейства ERM

2.3.1. Функциональная организация

2.3.2. Регуляция активности ERM белков

2.4. MERLIN - особый член семейства ERM

2.4.1. Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования

2.4.2. Структурные особенности мерлина в сравнении с ERM белками

2.4.3. Модельные организмы для изучения белка мерлин

2.4.4. Локализация белка мерлин в органах и тканях

2.4.5. Гомология дрозофилиного и человеческого мерлина

2.4.6. Участие белка мерлин в сигнальных путях и его тумор-супрессорные свойства

2.4.7. Характеристика мутаций гена Merlin у дрозофилы

2.4.8. Функциональные домены белка мерлин, необходимые для его активности и правильной внутриклеточной локализации

2.4.8.1. Внутриклеточая локализация усеченных форм мерлина

2.4.8.2. Способность усеченных форм мерлина спасать летальный эффект мутации Мег

2.4.8.3. Фенотипы, наблюдаемые при сверхэкспрессии 30 усеченных и мутантных форм мерлина

2.5. Основные этапы сперматогенеза у дрозофилы

2.6. Использование системы GAL4-UAS для изучения функций продуктов генов 38 Заключение по обзору литературы:

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Линии дрозофилы, использованные в работе, и работа с ними

3.2. Выделение геномной ДНК дрозофилы

3.3. Проведение полимеразной цепной реакции

3.4. Очистка продуктов ПНР

3.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и ее очистка

3.6. Трансформация E.coli плазмидной ДНК

3.7. Выделение плазмидной ДНК

3.8. Лигирование ДНК

3.9. Трансформация компетентных клеток E.coli лигазной смесью

3.10. Отбор клонов, содержащих плазмиду со встройкой гена, кодирующего мутантную форму белка мерлин

3.11. Рестрикционный анализ плазмид, выделенных из клонов E.coli после трансформации лигазной смесью

3.12. Определение нуклеотидной последовательности полученных конструкций

3.13. Трансформация клеток зародышевого пути D. melanogaster

3.14. Иммуноцитохимическое окрашивание крыловых имагинальных дисков и семенников

3.15. Окраска семенников DAPI

3.16. Окраска семенников MitoTracker Red (Invitrogen)

3.17. Окраска семенников ацетоорсеином

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Аномалии сперматогенеза у мутантов по гену Merlin

4.2. Локализация белка мерлин в сперматогенезе дрозофилы

4.3. Нарушение поляризации цист у мутантов Мег3 и Мег

4.4. Электронномикроскопические исследования семенников

4.5. Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp

4.5.1. Анализ эктопической экспрессии мутантных вариантов белка мерлин в соматической ткани

4.5.2. Восстановление сперматогенеза у мутантов Мег4 с помощью экспрессии усеченных копий гена Merlin

4.6. Нерасхождение хромосом в линиях дрозофилы, мутантных по тещ Merlin

4.7. Эктопическая экспрессия усеченных копий тепа Merlin в сперматогенезе на фоне нормального белка мерлин

4.7.1. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer+ и UASp-7пусМег345'635 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин

4.7.2. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer3, UASp-mycMerи UASp-mycMerна сперматогенез на фоне нормального белка мерлин

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Восстановление жизнеспособности мутации Мег4 в соматической ткани

5.2. Отличие усеченной формы мерлина шусМег1"330 от шусМег1"

5.3. Восстановление сперматогенеза у самцов Мег4 при эктопической экспрессии различных форм мерлина

5.4. Роль белка мерлин в соматической и генеративной тканях

5.5. Значение С-концевого домена мерлина в сперматогенезе дрозофилы

5.6. Значение мерлина в стабилизации структуры небенкерна

5.7. Участие мерлина в цитокинезе

5.8. Сравнительный анализ нарушений, вызванных мутациями гена Merlin, и нарушений, возникающих в результате эктопической экспрессии

5.9. Внутриклеточная локализация мерлина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster»

1.1. Актуальность проблемы

Способность к регуляции пролиферации - важнейшее свойство многоклеточных организмов, необходимое им, чтобы контролировать свой размер и форму, поэтому нарушения в контроле деления клетки могут иметь тяжелые последствия для организма в целом. Ошибочная активация пролиферации часто заканчивается формированием опухоли и развитием рака. Многие гены, как непосредственно контролирующие пролиферацию, так и косвенно вовлеченные в контроль клеточного цикла, были идентифицированы в качестве онкогенов и тумор-супрессоров.

Среди известных тумор-супрессоров интересен открытый в 1993 году ген Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий белок мерлин (или шванномин), принадлежащий к суперсемейству р4.1 - большой группе цитоплазматических белков, связанных с мембраной. Наибольшую степень сходства он имеет с белками подсемейства ERM (EZRIN- RADIXIN-MOESIN). Отсюда название MERLIN - MOESIN-EZION-RADIXIN-Iike-protein. Мутация этого гена вызывает у человека заболеванием нейрофиброматоз второго типа, характеризующееся формированием билатеральной акустической шванномы, поражающей восьмую пару черепно-мозговых нервов, а также других опухолей, ассоциированных с центральной нервной системой, таких как менингиомы и эпендимомы (Martuza, Eldridge, 1988; Trofatter et al., 1993; Rouleau et al., 1993).

Чтобы исследовать клеточные функции белка мерлин, используют его гомологи у мыши и у дрозофилы. У обоих видов особи, гомозиготные по мутации, не выживают, что свидетельствует о жизненно важных функциях мерлина (McClatchey et al., 1997; Fehon et al., 1997). В отличие от человека у мышей, гетерозиготных по Nf2 мутации, не образуются шванномы и другие характерные опухоли. У них развиваются злокачественные остеосаркомы и фибросаркомы, причем метастатического характера (McClatchey et al., 1998).

Что касается дрозофилы, то она тоже подходит для изучения функций белка мерлин, несмотря на отсутствие шванновских клеток - мишени болезни у человека. Эксперименты с использованием мутаций с потерей функций мерлина и FLP-FRT системы для получения соматических мозаичных клонов мутантных эпителиальных клеток показали, что, как и у млекопитающих, мерлин-дефицитные клетки дрозофилы характеризуются гиперплазией. Таким образом, мерлин выполняет функцию тумор-супрессора и у дрозофилы (LaJeunesse et al., 1998).

К настоящему времени описаны четыре мутации гена Merlin у дрозофилы. Ни один из аллелей не вызывает эмбриональной гибели, три из этих мутаций, Мег1, Мег2, Мег4 , вызывают гибель на стадии личинки и куколки. Единственный жизнеспособный аллель - Мег3. Мухи, гомозиготные по Мег3, доживают до взрослого состояния, но стерильны, их крылья более широкие, для глаз характерна нерегулярность фасеток, а на голове образуются аномальные кутикулярные структуры (Fehon et al., 1997).

Чтобы выяснить, каким образом мутация Мег3 вызывает стерильность самцов, нами были проведены исследования сперматогенеза. Drosophila melanogaster. Сперматогенез объединяет в себе два типа клеточных делений: митотическое и мейотическое, а также процессы клеточного роста и дифференцировки. Таким образом, он является удобной экспериментальной моделью для изучения функций белков на клеточном и молекулярном уровнях. Нами было обнаружено, что мутация Мег3 влияет на процессы компактизации ядер и поляризации цисты, что приводит к серьезным нарушениям сперматогенеза на стадии индивидуализации спермиев, что и вызывает стерильность самцов.

Ранее было показано, что мутация Мег3 затрагивает особый участок белка - «Blue Box» (170YQMTREM177), который идентичен у человеческого и дрозофилиного гомологов белка. Он имеет важное значение для правильного функционирования белка (LaJeunesse et al., 1998). Для изучения этого района, а также других функциональных доменов мерлина, были созданы конструкции, кодирующие различные мутантные и усеченные копии белка на основе вектора pUAST, который позволяет экспрессировать копии генов в соматической ткани в системе GAL4-UAS (LaJeunesse et al., 1998). Спецификой нашей работы является использование модифицированного UAS-вектора — pUASp, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии белков в генеративных тканях дрозофилы (Rorth, 1998).

Чтобы определить функционально значимые районы белка, необходимые для правильного протекания сперматогенеза дрозофилы, мы создали конструкции на основе вектора pUASp, кодирующие различные мутантные формы мерлина. Нами было показано, что белок мерлин, который является тумор-супрессором в соматических тканях дрозофилы, играет существенную роль в процессах сперматогенеза. В частности, открытая форма белка участвует в агломерации митохондрий на стадии «луковицы», а закрытая влияет на цитокинез в мейозе. Таким образом, в соматической и генеративной тканях мерлин функционирует по-разному.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Юдина, Ольга Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что мутации гена Merlin приводят к нарушениям цитокинеза в мейозе самцов, поляризации и элонгации сперматид и аномалиям в формировании митохондриального деривата.

2. Изучена локализация белка мерлин в клетках зародышевого пути самцов D. melanogaster. Показано, что белок в сперматоцитах имеет кортикальную локализацию, которая в мейозе сменяется на митохондриальную. Такая локализация далее сохраняется и на последующих стадиях сперматогенеза. В зрелых спермиях также обнаруживается локализация белка на акросомах.

3. Получены линии дрозофилы, содержащие встройки последовательностей, кодирующих различные усеченные формы белка мерлин, в векторе pUASp, который позволяет экспрессировать целевой трансген в клетках зародышевой линии самцов D. melanogaster (UASp-mycMer+, UASp-mycMer345'635, UASp-mycMer3, UASp-mycMer^8, UASp-mycMer1' 379, UASp-mycMer1'169).

4. Показано, что данные конструкции позволяют эктопически экспрессировать полноразменую и усеченные копии белка в клетках зародышевого пути самцов и в соматической ткани.

5. Анализ нарушений сперматогенеза, произошедших в результате эктопической экспрессии полученных конструкций в зародышевой линии клеток самцов D. melanogaster, выявил два различающихся доминантных фенотипа:

1) сверх-экспрессия генов тусМег1'379, тусМег3 и тусМегАВВ, кодирующих мутантные белки вызывает нарушения цитокинеза в предмейотических митозах и в мейозе. Этот фенотип хорошо согласуется с фенотипом изученных мутаций гена Merlin.

2) сверх-экспрессия генов тусМег345'635 и тусМег+ вызывает нарушения элонгации цист и структуры митохондриальных дериватов. Последнее хорошо согласуется с полученными сведениями о локализации белка на митохондриальном деривате. 6. Предложена модель функционирования белка мерлин, основанная на конформационных внутримолекулярных переходах между открытой и закрытой формами, обобщающая полученные нами результаты и ранее известные литературные данные.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Ген Merlin дрозофилы, гомолог гена человека Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий супрессор опухолей мерлин, играет важную роль в процессе клеточной пролиферации и у дрозофилы. Особи, несущие мутацию Мег3

1ПП

Met1 "-»lie) в этом гене, жизнеспособны, но стерильны (LaJeunesse, 1998). Учитывая, что сперматогенез является удачной моделью, сочетающей пролиферацию клеток, их морфологическую дифференцировку, а также два типа клеточных делений, мы решили сконцентрироваться на исследовании функционирования этого супрессора опухолей в зародышевой линии самцов D. melanogaster.

У самцов, гемизиготных по мутации Мег3, образуется лишь небольшое количество зрелых, но неподвижных спермиев. Головки спермиев'в пределах одной цисты рассеяны, в то время как в норме все головки спермиев выглядят как один большой пучок. Были обнаружены нарушения на разных этапах сперматогенеза у самцов Мег3 такие как: нарушения цитокинеза на стадии предмейотического митоза и в мейозе, трехполюсные и четырехполюсные веретена деления в сперматоцитах в течение второго деления мейоза, которые являются результатом неполного цитокинеза в предыдущем мейотическом делении. Были обнаружены дефекты поляризации мутантных цист, следствием которого является фенотип «разбросанных» головок спермиев. Ранее процесс поляризации цист был описан и назван таковым в работе (Cross and Shellenbarger, 1979), где проводилось прижизненное изучение сперматогенеза. В обзоре (Lindsley, Tokyuasu 1978) также имеется описание этого процесса, исходя из данных электронной микроскопии, причем название «поляризация» цист не было использовано. Каких- либо данных о генетическом контроле этого процесса до выполнения настоящей работы не было.

Для того, чтобы определить каким образом функционирует белок мерлин в клетке и для того, чтобы понять каким образом отсутствие нормального белка мерлин в клетке вызывает весь вышеописанный каскад нарушений сперматогенеза, мы создали конструкции на основе вектор pUASp, позволяющие экспрессировать трансгенные конструкции, а именно, различные усеченные копии белка мерлин, в зародышевой линии дрозофилы. Усеченные копии гена Merlin были созданы на основе уже существующих и описанных в работе (LaJeunesse et al., 1998) конструкций клонированных ранее в векторе pUAST, который обеспечивает экспрессию только в соматической ткани.

Наши конструкции позволяют эктопически экспрессировать полноразменую и усеченные копии белка, как в клетках зародышевого пути самцов, так и в соматической ткани. Полученная нами эктопическая экспрессия в соматической ткани более интенсивна по сравнению с таковой у исходных конструкций на основе pUAST вектора. j л

Мы показали, что фертильность мутантов Мег и Мег полностью восстанавливается при экспрессии в зародышевой линии самцов нормального гена Merlin. Этот факт свидетельствует о том, что наблюдаемый фенотип не является вторичным эффектом мутации, а наблюдаемые нарушения в сперматогенезе самцов, мутантных по гену Merlin, вызваны мутацией именно в этом гене.

Проанализировав нарушения сперматогенеза, которые происходили в результате эктопической экспрессии полученных конструкций в зародышевой линии клеток самцов D. melanogaster, мы выявили два различающихся доминантных фенотипа: нарушение цитокинеза в предмейотических митозах и в мейозе при сверх-экспрессии генов mycMer1'379, mycMer3 и тусМегмв (при сверх-экспрессии генов mycMer345'635 и тусМег+ нарушений цитокинеза обнаружено не было) и нарушение структуры митохондриального деривата в процессе элонгации цист при сверх-экспрессии генов mycMer345'635 и тусМег+ (в случае эктопической экспрессии других конструкций такого фенотипа мы не наблюдали).

Усеченные формы белка mycMer345"635 и mycMer+ имеют одну общую структурную особенность, это наличие нормального функционального Сконцевого участка белка. Вероятно, этот участок играет важную роль в формировании и правильном функционировании митохондрий на поздних этапах сперматогенеза, а именно, в процессе элонгации цист. Возможно, С-концевой участок белка при эктопической экспрессии в зародышевой линии на фоне нормального белка мерлин в клетке, способен вступать в конкурентные взаимодействия с нормальным мерлином за определенные сайты связывания с другими белками, например, за фосфорилирование РАК и РКА киназами. Однако, mycMer3 и тусМеглвв также имеют нормальный С-концевой участок. Следовательно, в этих формах белка С-концевой домен должен быть нефункциональным. Это возможно, если конформация этих форм белка закрытая, то есть N- и С- концевые домены белка связаны.

Таким образом, исходя из сходного спектра нарушений, вызванных сверхэкспрессией mycMer1"379, mycMer3 и mycMer^0, мы приходим к выводу, что эти формы белка: находятся в закрытой конформации и прочно связаны с мембраной. Закрытая форма мерлина нефосфорилированная по положению 559 (соответствует положению 518 в белке человека), связывается с кортикальным актином и участвует в формировании кортекса (Curto, 2007). Избыток такой формы белка, приводит к тому, что в результате прочного связывания плазматической мембраны клетки и кортикального актинового цитоскелета, затрудняется процесс цитокинеза и разделения мембран.

Полученные нами результаты и литературные данные свидетельствуют о том, что разные формы мерлина в разных тканях и процессах функционируют по-разному (схема возможных внутримолекулярных ассоциаций в мерлине представлена на Рис. 23). У дрозофилиного гомолога белка не было описано альтернативного сплайсинга гена Merlin и не было обнаружено существования различных изоформ, как это было показано для белка человека. Но были показаны конформационные переходы и внутримолекулярные взаимодействия внутри молекулы белка (Curto et al., 2007; Muränen et al., 2007). Стабилизация форм осуществляется путем фосфорилирования двух сайтов на N- и на Сконцевых доменах. Открытая и фосфорилированная форма белка по положению 559 (518) способна образовывать гетеродимеры с эзрином и давать сигнал к пролиферации клеток. Открытая и нефосфорилированная форма белка участвует в стабилизации и полимеризации микротрубочек путем связывания с ними. В мерлине есть два сайта связывания с микротрубочками на N- и на С- конце белка, которыми мерлин, как линкер, может соединять соседние микротрубочки (Muränen et al., 2007). В такой форме мерлин участвует в агломерации митохондрий и формировании компактной структуры небенкерна на стадии «луковицы» в сперматогенезе дрозофилы. Закрытая и нефосфорилированная по положению 559 (518) форма мерлина участвует в связывании с кортикальным актином и контролирует пролиферацию клеток (Curto et al., 2007). Избыток такой формы мерлина в клетке приводит к нарушениям цитокинеза, как в мейозе, так и в митозе.

В настоящей работе удалось найти ранее неизвестную функцию белка в процессе морфогенеза митохондриального тельца — небенкерна. В связи с этим возникает вопрос, есть ли подобный эффект у млекопитающих? Найденный нами дефект цитокинеза в мейозе самцов возникает как под действием мутаций гена, так и при эктопической экспрессии. Изучение более широкого спектра мутаций, затрагивающих формирование небенкерна, позволит ответить на вопрос - имеется ли причинная связь между эффектом мутаций на формирование митохондриального тельца и на цитокинез.

Другим важным аспектом функционирования белка мерлин является роль отдельных белковых доменов в выполнении различных функций. Наше исследование позволило выявить особую роль района «Blue Box» и С-концевого участка белка в сперматогенезе. Исходя из результатов, полученных на клетках млекопитающих, для объяснения роли этих доменов в регуляции активности белка необходимо предполагать наличие конформационных переходов между открытой и закрытой формой белка. Известно, что такие конформационные переходы связаны с фосфорилированием белка мерлин. Потому в дальнейшем мы планируем создать конструкции, кодирующие константно фосфорилированную по положению 559 (518) и константно нефосфорилированную по этому же положению формы белка мерлин, и проанализировать влияние их эктопической экспрессии на процесс сперматогенеза и на развитие соматических тканей. Такие эксперименты позволят глубже понять связь функций и конформаций белка мерлин, предложенную в диссертации. Также планируется провести более детальные электронномикроскопические исследования нарушений в агломерции митохондрий, вызванных эктопической экспрессией С-концевого участка белка и полноразмерного белка мерлин, в генеративной ткани самцов дрозофилы.

Рис.23. белке мерлин,

Схема конформационных внутримолекулярных иллюстрирующая предлагаемую нами гипотезу. переходов в

Конформации мерлина в клетке в норме

С-конси

Ы-конеч 'ЫЫ-соИ ¿опта л

1а к рыгн я

11 рфпсфо]! II-1IIР П ВЯ1111И Я

Открытая нсфосфорилнровэнная

Открытая фосфор н л н ро ыа нн ая

При эктопической экспрессии разных аллелей гена МегНп возникает: туе Мег1 тусМегАВВ

С-тус

Избыток белка в «закрытой» конформации

В!ие Вох»

Нарушения цитокинеза тусМег'

Избыток белка в закрытой конформации, т.к. эта -1 кон формация белка аналогична закрытой форме

Нарушения цитокинеза туе Мег34*

Избыток мерлина в открытой нефосфорилирован ной форме

Нарушения структуры мнтохондриального деривата шусМег+

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юдина, Ольга Сергеевна, 2009 год

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки // Издательство «Мир», Москва. 1987. Т.З. С. 92.

2. Бурнашева С.А., Габаева Н.С., Данилова Л.В. Современные проблемы сперматогенеза // Издательство «Наука», Москва. 1982. С. 60.

3. Чадов Б.Ф. От феномена нерасхождения к проблеме коориентации хромосом // Генетика. 1991. Т. 27. № 11. С. 1877-1903.

4. Шилова И.Э., Омельянчк Л.В. Метод трансформации клеток зародышевого пути дрозофилы высококонцентрированной экзагенной ДНК // Генетика. 2007. Т. 43 №1. С. 1-4.

5. Amieva M. R., Wilgenbus К. K., Furthmayr H. Radixin is a component of hepatocyte microvilli in situ // Exp. Cell Res. 1994. V.210. P. 140-144.

6. Antinheimo J., Sankila R., Carpen O., Pukkala E., Sainio M., Jaaskelainen J. Population-based analysis of sporadic and type 2 neurofibromatosis-associated meningiomas and schwannomas // Neurology. 2000. V. 54. P. 71-76.

7. Ashburner M., Golic K.G., Hawley R.S. Drosophila a laboratory handbook // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2005. P. 1409.

8. Baser M.E., Friedman J.M., Aeschliman D., Joe H., Wallace A J., Ramsden R.T., Evans D.G. Predictors of the risk of mortality in neurofibromatosis 2 // Am J Hum Genet. 2002. V. 71. P. 715-723.

9. Bender W., Pierre S., Hognes D.S. et ah, Chromosomal walking and jumping to isolate DNA from Ace and rosy loci of bithorax loci in Drosophila melanogaster I I J. Mol. Biol. 1983. V. 168. P. 17-33.

10. Berryman M., Gary R., Bretscher A. Ezrin oligomers are major cytoskeletal components of placental microvilli: a proposal for their involvement in cortical morphogenesis // J Cell Biol. 1993. V. 131. P. 12311242.

11. Brand A.H., Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes // Development. 1993. V.118. P.401-415.

12. Bretscher A. Purification of an 80,000-dalton protein that is a component of the isolated microvillus cytoskeleton, and its localization in nonmuscle cells // J Cell Biol. 1983. V. 97. P. 425-432.

13. Bretcher A., Edwards K., Fehon R. G. ERM proteins and Merlin: integrators at the cell cortex // Nature. 2002. V.3. P.586-599.

14. Brick D., Lifschitz E., Friedlander M. Mitochondria Differentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Ultrastructural Analysis in the Male Sterile Mutant ms (1) 413 // Journal of Ultrastructure Research. 1979. V. 66. P. 151-163.

15. Brook W.J., Diaz-Benjumea F.J., Cohen S.M. Organizing spatial pattern in limb development // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996 V. 12. P. 161180.

16. Capdevila J., Guerrero I. Targeted expression of the signaling molecule decapentaplegic induces pattern duplications and growth alterations in Drosophila wings // EMBO J. 1994. V.13. p.4459-4468.

17. Claudio J.O., Lutchman M., Rouleau G.A. Widespread but cell type-specific expression of the mouse neurofibromatosis type 2 gen // Neuroreport. 1995. V. 6. P. 1942-1946.

18. Cross D.P., Shellenbarger D.L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures // J. Embryol. Exp. Morph. 1979. 53:345-351.

19. Curto M., Cole B.K., Lallemand D., Liu C.H., McClatchey A.I. Contact-dependent inhibition of EGFR signaling by Nf2/Merlin // The Journal of Cell Biology. 2007. Vol. 177, No. 5. P. 893-903.

20. Dalmay T., Edwards D.R. MicroRNAs and the hallmarks of cancer// Oncogene. 2006. V. 25. P.6170-6175.

21. Edgar B.A. From cell structure to transcription: Hippo forges a new path // Cell. 2006. 124: 267-273.

22. Fabrizio J, Hime G., Lemmon S., Bazinet C. 1998. Genetic Dissection of sperm individualization in Drosophila melanogaster. Development 125: 1833-1843.

23. Franck Z, Gary R, Bretscher A. Moesin, like ezrin, colocalizes with actin in the cortical cytoskeleton in cultured cells, but its expression is more variable//J Cell Sci. 1993. V. 105 (Ptl). P.219-31.

24. Fuller M., Bate M. and Arias AM. Spermatogenesis. In The Development of Drosophila melanogaster //Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. 1993. P.71-147.

25. Gary R., Bretscher A. Heterotypic and homotypic associations between ezrin and moesin, two putative membrane-cytoskeletal linking proteins // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.10846-10850.

26. Gary R., Bretscher A. Ezrin self-association involves binding of an N-terminal domain to a normally masked C-terminal domain that includes the F-actin binding site // Mol. Biol. Cell. 1995. V.6. P.1061-1075.

27. Gatt M.K., Glover D.M. The Drosophila phosphatidylinositol transfer protein encoded by vibrator is essential to maintain cleavage-furrow ingression in cytokinesis // Journal of Cell Science. 2006. V. 119. P. 22252235.

28. Gautreau A., Manent J., Fievet B., Louvard D., Giovannini M., Arpin M. Mutant products of the NF2 tumor suppressor gene are degraded by the ubiquitin-proteasome pathway 11 J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 3127931282.

29. Giansanti M.G., Farkas R.M., Bonaccorsi S. et al. Genetic Dissection of Meiotic Cytokinesis in Drosophila Males // Molecular Biology of the Cell. Vol. 15. P. 2509-2522.

30. Golovnina K., Blinov A., Akhmametyeva E.M., Omelyanchuk L.V., Chang L.S. Evolution and origin of merlin, the product of the

31. Neurofibromatosis type 2 (NF2) tumor-suppressor gene // BMC Evol Biol. 2005. V. 5. P. 69.

32. Gonzalez-Agosti C., Xu L., Pinney D., Beauchamp R., Hobbs W., Gusella J., Ramesh V. The merlin tumor suppressor localizes preferentially in membrane ruffles // Oncogene. 1996. V.13. P. 1239-1247.

33. Gould K. L., Cooper J. A., Bretscher A. & Hunter T. The protein-tyrosine kinase substrate, p81, is homologous to a chicken microvillar core protein // J. Cell Biol. 1986. V.102. P.660-669.

34. Grossniklaus U., Bellen H.J., Wilson C., Gehring WJ. P-element-mediated enhancer detection applied to the study of oogenesis in Drosophila // Development 1989. Oct; 107(2): 189-200.

35. Gutmann D. H. et al The NF2 interactor, hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS), associates with merlin in the 'open' conformation and suppresses cell growth and motility // Hum. Mol. Genet 2001. V. 10. P. 825-834.

36. Hara T., Bianchi A.B., Seizinger B.R., Kley N. Molecular cloning and characterization of alternatively spliced transcripts of the mouse neurofibromatosis 2 gene // Cancer Res. 1994. V. 54. P.330-335.

37. Hemann M.T., Narita M. Oncogenes and senescence: breaking down in the fast lane // Genes Dev. 2007. V. 21. P. 1-5.

38. Huynh D.P., Tran T.M., Nechiporuk T., Pulst S.M. Expression of neurofibromatosis 2 transcript and gene product during mouse fetal development // Cell Growth Differ. 1996. V. 7. P. 1551-1561.

39. Huang A.M., Rubin G.M. Amisexpression screen identi fies genes that can modulate RAS1 pathway signaling in Drosophila melanogaster // Genetics. 2000. V. 156. P. 1219-1230.

40. Jin H, Sperka T, Herrlich P. Tumorigenic transformation by CPI-17 through inhibition of a merlin phosphatase. // Nature. 2007. 442:576-579.

41. Jindal H.K., Yoshinaga K., Seo P.S., Lutchman M., Dion P.A., Rouleau G.A., Hanada T., Chishti A.H. Purification of the NF2 tumor suppressor protein from human erythrocytes // Can J Neurol Sci. 2006. V. 33. P. 394-402.

42. Kang B. S., Cooper D. R., Devedjiev Y., Derewenda U., Derewenda Z. S. The structure of the FERM domain of merlin, the neurofibromatosis type 2 gene product // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2002. V.58. P.381-391.

43. Kastan M. B. Wild-type p53: tumors can't stand it //Cell. 2007. V.128. P.837-840.

44. Kissil J. L., Johnson K. C., Eckman M. S., Jacks T. Merlin phosphorylation by p21-activated kinase 2 and effects of phosphorylation on merlin localization // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.10394—10399.

45. Knudson A.G.Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proc Natl Acad Sci USA. 1971. V. 68. P. 820-823.

46. Kraut R., Menon K., Zinn K. A gain-of-iunction screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila // Curr Biol. 2001. V. 11(6). P. 417-430.

47. LaJeunesse D. R., McCartney B. M. & Fehon R. G. Structural analysis of Drosophila merlin reveals functional domains important for growth control and subcellular localization // J. Cell Biol. 1998. V.141. P.1589-1599.

48. LaJeunesse D. R., McCartney B.M., Fehon R.G. A systematic screen for dominant second site modifiers of Merlin/NF2 phenotypes reveals an interaction with blistered/DSRF and scribbler.// Genetics. 2001. 158:667679.

49. Lallemand D., Curto M., Saotome I., Giovannini M., McClatchey A.I. NF2 deficiency promotes tumorigenesis and metastasis by destabilizing adherens junctions // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 1090-1100.

50. Lankes W., Griesmacher A., Grunwald J., Schwartz-Albiez R., Keller R. A heparin-binding protein involved in inhibition of smooth-muscle cell proliferation // Biochem. J. 1988. V.251. P.831-842.

51. Lasota J., Fetsch J.F., Wozniak A., Wasag B., Sciot R., Miettinen M. The neurofibromatosis type 2 gene is mutated in perineurial cell tumors: a molecular genetic study of eight cases // Am J Pathol. 2001. V. 158. P. 12231229.

52. Laulajainen M., Muranen T., Carpen O., Gronholm M. Protein kinase A-mediated phosphorylation of the NF2 tumor suppressor protein merlin at serine 10 affects the actin cytoskeleton // Oncogene. 2007 Dec 10. Epub ahead of print.

53. Li Q., Nance M.R., Kulikauskas R., Nyberg K., Fehon R., Karplus P.A., Bretscher A. and Tesmer J.J.G. Self-masking in an Intact ERMmerlin Protein: An Active Role for the Central a-Helical Domain // J. Mol. Biol. (2007) 365, 1446-1459.

54. Lindsley D. L., Tokuyasu K. T. Spermatogenesis 11 In: Genetics and biology of Drosophila, 2nd edition. Academic Press, 1978. P. 225-94.

55. Lomas J., Bello M.J., Aijona D., Alonso M.E. et al. Genetic and epigenetic alteration of the NF2 gene in sporadic meningiomas // Genes Chromosomes Cancer. 2005. V. 42. P. 314-319.

56. Lunde K., Biehs B., Nauber U., Bier E. The knirps and knirpsrelated genes organize development of the second wing vein in Drosophila II Development. 1998. V.125. p.4145-4154.

57. Martuza R.L., Eldridge R. Neurofibromatosis 2 (bilateral acoustic neurofibromatosis) II N. Eng. J. Med. 1988. V.318. P.684-688.

58. McCartney B. M., Fehon R. G. Distinct cellular and subcellular paterns of expression imply distinct functions for the Drosophila homologues of Moesin and the Neurofibromatosis 2 tumor suppressor, merlin // J. Cell Biol. 1996. V.133. P.843-852.

59. McClatchey A. I., Saotome I., Ramesh V., Gusella J. F., Jacks T. The Nf2 tumor suppressor gene product isessential for extraembryonic development immediately prior to gastrulation // Genes Dev. 1997. V.ll. P. 1253-1265.

60. McClatchey A. I., Saotome I, Mercer K, Crowley D, Gusella JF, Bronson RT, Jacks T. Mice heterozygous for a mutation at the Nf2 tumorsuppressor locus develop a range of highly metastatic tumors // Genes Dev. 1998. V.12. P.l 121-1133.

61. McClatchey A, Giovannini M. Membrane organization and tumorigenesis-the NF2 tumor suppressor, Merlin. // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 2265-2267.

62. Miklos G.L, Rubin G.M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms // Cell. 1996. V. 86(4). P.521-529.

63. Morrison H., Sherman LS, Legg J, Banine F, Isacke C, Haipek CA, Gutmann DH, Ponta H, Herrlich P. The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates contact inhibition of growth through interactions with CD44 // Genes Dev. 2001. V.15. P.968-980.

64. Muranen T., Gronholm M., Lampin A., Lallemand D., Zhao F., Giovannini M., Carpen O. The tumor suppressor merlin interacts with microtubules and modulates Schwann cell microtubule cytoskeleton // Hum Mol Genet. 2007. V.16. P. 1742-1751.

65. Muranen T. The Neurofibromatosis 2 tumor suppressor merlin in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Academic dissertation. Helsinki Graduate School in Biotechnology and Molecular Biology. 2007.

66. Murray A., Hunt T. The Cell Cycle. New York: Oxford Univ. Press, 1993.

67. Nakamura F., Amieva M. R. & Furthmayr H. Phosphorylation of threonine 558 in the carboxyl-terminal actin-binding domain of moesin by thrombin activation of human platelets // J. Biol. Chem. 1995. V.270. p.31377-31385.

68. Noguchi T, Miller KG. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. II Development. 2003. V. 130. P. 1805-1816.

69. Obremski V.J., Hall A.M., Fernandez-Valle, C. Merlin, the neurofibromatosis type 2 gene product, and betal integrin associate in isolated and differentiating Schwann cells II J. Neurobiol. 1998. V. 3. P. 487-501.

70. Okada T, You L, Giancotti FG. Shedding light on Merlin's wizardry. II Trends Cell Biol. 2007. 17:222-229.

71. Pakkanen R., Hedman K., Turunen O., Wahlstrom T. & Vaheri A. Microvillus-specific Mr 75,000 plasma membrane protein of human choriocarcinoma cells // J. Histochem. Cytochem. 1987. V.35. P.809-816.

72. Perrimon. N. New advances in Drosophila provide opportunities to study gene functions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P.9716-9717.

73. Phelps B.C., Brand H.A. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system // METHODS. 1998. V.14. P.367-379.

74. Pineau P., Marchio A., Cordina E., Tiollais P., Dejean A. Homozygous deletions scanning in tumor cell lines detects previously unsuspected loci II Int J Cancer. 2003. V. 106. P. 216-223.

75. Rong R., Surace E.I., Haipek C.A., Gutmann D.H., Ye K. Serine 518 phosphorylation modulates merlin intramolecular association and binding to critical effectors important for NF2 growth suppression // Oncogene. 2004. V. 23. P. 8447-8454.

76. Rorth P. A modular misexpression screen in Drosophila detecting tissue-specific phenotypes. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. Oct 29;93(22): 12418-12422.

77. Rorth P. Gal4 in the Drosophila female germline // Mechanisms of Development. 1998. V.78. P. 113-118.

78. Rouleau G. A. et al. Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neurofibromatosis type 2 // Nature. 1993. V.363. P.515-521.

79. Rubin G.M., Spradling A.C. Vectors for P element-mediated gene transfer in Drosophila.il Nucleic Acids Res. 1983 Sep 24;11(18):6341-51.

80. Sainio M, Zhao F, Heiska L, Turunen O et al. Neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein colocalizes with ezrin and CD44 and associates with actin-containing cytoskeleton. // J Cell Sci. 1997. V. 110 ( Pt 18). P. 2249-2260.

81. Sato N., Funayama N., Nagafuchi A., Yonemura S., Tsukita S., Tsukita S. A gene family consisting of ezrin, radixin and moesin. Its specific localization at actin filament/plasma membrane association sites // J Cell Sci. 1992. V. 103 (Pt 1). P. 131-143.

82. Schmucker B., Tang Y., Kressel M. Novel alternatively spliced isoforms of the neurofibromatosis type 2 tumor suppressor are targeted to the nucleus and cytoplasmic granules // Hum Mol Genet.1999. V. 8. P. 1561 -1570.

83. Sekido Y., Pass H.I., Bader S., Mew D.J., Christman M.F., Gazdar A.F., Minna J.D. Neurofibromatosis type 2 (NF2) gene is somatically mutated in mesothelioma but not in lung cancer // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 1227-1231.

84. Sheikh H.A., Tometsko M., Niehouse L., Aldeeb D., Swalsky P., Finkelstein S., Barnes E.L., Hunt J.L. Molecular genotyping of medullary thyroid carcinoma can predict tumor recurrence // Am J Surg Pathol. 2004. V. 28. P. 101-106.

85. Sherr C.J., McCormick F. The RB and p53 pathways in cancer // Cancer Cell. 2002. V. 2. P. 103-112.

86. Sherr CJ. Principles of tumor suppression // Cell. 2004. V. 116. p. 235-246.

87. Shimizu T.3 Seto A., Maita N., Hamada K. Structural basis for Neurofibromatosis type 2. Crystal structure of the merlin FERM domain // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.10332-10336.

88. Stickney J.T., Bacon W.C., Rojas M., Ratner N., Ip W. Activation of the tumor-suppressor merlin modulates its interaction with lipid rafts // Cancer Res. 2004.V. 64. P. 2717-2724.

89. Stewart S.A., Weinberg R.A. Telomeres: cancer to human aging // Annu Rev Cell Dev Biol. 2006. V. 22. P. 531-557.

90. Takeuchi K., Sato N., Kasahara H., Funayama N., Nagafuchi A., Yonemura S., Tsukita S. Perturbation of cell adhesion and microvilliformation by antisense oligonucleotides to ERM family members // J Cell Biol. 1994. V. 125. P. 1371-1384.

91. Toby G.G., Gherraby W., Coleman T.R., Golemis E.A. A novel RING finger protein, human enhancer of invasion 10, alters mitotic progression through regulation of cyclin B levels // Mol Cell Biol. 2003. V. 23. P. 2109-2122.

92. Tokuyasu, K.T. Peacock, W.J., Hardy, R.W. Dinamics of spermatogenesis in Drosophila melanogaster. I. Individualization process // Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 1972. V.124. N.4.p. 479-506.

93. Trofatter J. A., MacCollin M. M., Rutter J. L., Murrell J. RA novel moesin-, ezrin-, radixin-like gene is a candidate for the neurofibromatosis 2 tumor suppressor // Cell. 1993. V.75. P.826.

94. Tseng A.S., Hariharan I.K. An overexpression screen in Drosophila for Genes That Restrict Growth or Cell-Cycle Progression in the Developing Eye // Genetics. 2002. V.162. P. 229-243.

95. Tsuda M., Sasaoka Yu., Kiso M., Abe K., Haraguchi S., Kobayashi S., Saga Yu. Conserved Role of nanos Proteins in Germ Cell Development// Science. 2003. V. 301. P. 1239-1241.

96. Tsukita S., Hieda Y., Tsukita S. A new 82-kD barbed endcapping protein (radixin) localized in the cell-to-cell adherens junction: purification and characterization // J. Cell Biol. 1989. V.108. P.2369-2382.

97. Turunen O, Wahlstrom T, Vaheri A. Ezrin has a COOH-terminal actin-binding site that is conserved in the ezrin protein family.// J Cell Biol. 1994. Sep; 126(6): 1445-53.

98. Van Vactor D.L. Jr., Cagan R.L., Kramer H., Zipursky S.L. Induction in the developing compound eye of Drosophila: multiplemechanisms restrict R7 induction to a single retinal precursor cell. // Cell. 1991. V. 67(6). P. 1145-55.

99. Wikman H., Kettunen E. Regulation of the Gl/S phase of the cell cycle and alterations in the RB pathway in human lung cancer // Expert Rev Anticancer Ther. 2006. V. 6. P. 515-530.

100. Xu H. M. and Gutmann D. H. Merlin differentially associates with the micro tubule and actin cytoskeleton // J. Neurosci. Res. 1998. V.51. P.403-415.

101. Zhang B., Pan X., Cobb G.P., Anderson T.A. microRNAs as oncogenes and tumor-suppressors // Dev Biol. 2007. V. 302. P.l-12.