Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Модестова, Елена Андреевна

• Модестова, Елена Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Модестова, Елена Андреевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проблемы мутагенеза у дрозофилы.

1.1.1. Радиационный мутагенез.

1.1.2. Химический мутагенез.

1.1.3. УФ-индуцированный мутагенез.

1.1.4. Мобильные элементы как мутагенные факторы.

1.1.5. Р-М-гибридный дисгенез.

1.1.6. Система продленной нестабильности.

1.1.7. Супернестабильность.

1.1.8. «Горячие точки» при мутагенезе.

1.2. Использование генетической системы химерного белка P-Ph для репрессии транскрипции гена.

1.3. Характеристика гена leg-arista-wing complex.

1.3.1. Фенотип и картирование lawc-мутаций.

1.3.2. Исследование вкусовой и ольфакторной чувствительности у гомеозисных мутантов гена leg-aristae-wing complex у дрозофилы.

1.3.3. Взаимодействие leg-aristae-wing complex с различными генами.

1.4. Краткая характеристика различных аллелей гена lawc

1.5. Использование делеционного картирования для локализации мутаций и поиска межгенных взаимодействий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование Drosophila melanogaster.

2.2. Генетические методы.

2.3. Биохимические методы.

2.4. Приготовление препаратов для микроскопии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Поиск мутаций в мировой коллекции и их анализ.

3.2. Результаты мутагенеза.

3.3. Установление генотипа полученных леталей.

3.4. Дупликационное картирование.

3.5. Молекулярная природа полученных мутаций.

3.6. Получение и анализ реинверсий и спонтанных мутаций.

3.7. Репрессия экспрессии гена-мишени при помощи химерного белка P-Ph.

3.8. Нарушения в репродуктивной системе самок.

3.9. Нарушения в репродуктивной системе самцов.

3.10. Поиск межгенных взаимодействий.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster»

Актуальность работы. Проблема получения достаточного количества мутаций при изучении функционирования генома дрозофилы много лет не теряет своей актуальности. Активное секвенирование генома дрозофилы и компьютерный анализ показывают наличие множества открытых рамок считывания, выявляют гомологии последовательностей. Но эти методы в настоящий момент позволяют лишь строить предположения, какие процессы затрагиваются ими in vivo. Мутагенез с одной стороны и молекулярные данные о структуре ДНК, синтезе белков и регуляции экспрессии позволяют соединить молекулярный и организменный уровни изучения работы генов.

Ранее был открыт новый гарсшс-регуляторный ген дрозофилы - leg-arista-wing complex (lawc), мутации которого нарушают правильную экспрессию многих локусов, в частности, пронейральных achaete и scute генов и гомеобокссодержащего локуса cut. Ряд фактов указывает на непосредственную роль нового локуса как в органогенезе, так и в раннем эмбриогенезе дрозофилы: одним из многочисленных фенотипических признаков его мутаций явилась гомеозисная трансформация аристы в элементы тарзуса; небольшая делеция в области экзона вызывает нарушение финальных этапов пролиферации клеток крылового имагинального диска, приводя к сильным аномалиям развития торакса дрозофилы.

Район локализации гена lawc (7Е район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких леталей, порядок и функциональная значимость которых до сих пор не установлена. Все они являются точечными, что сильно осложняет клонирование соответствующих генов. Поэтому открытие видимых, инсерционных мутаций в "летальных зонах" генома дает возможность молекулярно и генетически исследовать структуры и функции подобных областей.

По предварительным молекулярным данным, основной транскрипт гена lawc имеет большие размеры (более 9 т.н.). В настоящий момент у дрозофилы известно мало локусов, имеющих транскрипты подобного размера, и все они имеют очень сложную структуру. Поэтому новый локус является уникальной моделью для изучения функциональных особенностей сложно организованных локусов.

Цель и задачи исследования. С учётом изложенного целью настоящей работы явилось получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у drosophila melanogaster.

Достижение указанной цели основывалось на решении следующих задач:

• Создание генетической системы скрещиваний, позволяющей эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

• Получение коллекции мутантов в исследуемом районе и её молекулярно-генетический скрининг.

• Выявление генетических взаимодействий lawc с другими генами и районами генома дрозофилы.

• Подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка P-Ph.

• Детализация фенотипического проявления /awe-мутаций.

Научная новизна и практическая ценность. В данной работе помимо сугубо прикладной задачи - создания коллекции мутаций, была решена более глобальная проблема - увеличение эффективности мутагенеза у дрозофилы. Разработанная генетическая система позволяет с высокой частотой проводить мутагенез у Drosophila melanogaster в X-хромосоме. Она была с успехом опробована для получения мутаций в гене leg-arista-wing complex, в то время как стандартными методами добиться успеха не удавалось. С помощью Саузерн-блот анализа мы установили молекулярную природу полученных мутаций. Впервые выявлены межгенные взаимодействия lawc с рядом генов и делециями, для чего применялась коллекция линий Deficiency Kit. Также с успехом применена пионерская методика инактивации генов при помощи химерного белка Р-Ph, разработанная в лаборатории П.Г. Георгиева (ИБГ РАН), и проведено снижение транскрипции в исследуемом нами районе, подтверждающее эффективность метода.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 40-й, 41-й, 42-й, 44-й, 46-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сиэтл, 1999 г., Питтсбург, 2000 г., Вашингтон, 2001, Чикаго, 2003 г., Сан-Диего, 2005 г.), на I и II Международных симпозиумах (Новосибирск, 1999, 2000 гг.), на 16th Европейской исследовательской конференции по дрозофиле (Цюрих, 1999 г.), VI и VII Всероссийских школах молодых учёных «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1999, 2000 гг.), Международном симпозиуме памяти академика Павлова «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, 1999г), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», (Москва-Минск, 2001) и международной конференции «Молекулярная генетика эукариот» (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (3 статьи и 13 тезисов).

Структура диссертации. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста и состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов и обсуждения», «Выводов», «Заключения» и «Списка цитируемой литературы» (69 ссылок). Диссертация содержит 25 рисунков, 6 таблиц и 1 приложение.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Модестова, Елена Андреевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана генетическая система скрещиваний, позволяющая эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

2. Получена коллекция летальных мутаций (33 линии) в районе гена leg-arista-wing complex, а также осуществлен молекулярно-генетический скрининг делеций и инверсий.

3. Выявлены 15 цитологических зон генома дрозофилы, содержащих локусы, взаимодействующие с геном lawc.

4. Обнаружены генетические взаимодействия lawc с базовыми и специфическими факторами транскрипции TFIIH (Ssll, МАТ1, Tfb4, Tfb2, hay), e(y)2, e(y)3, Ta/60, Tafl50, Tafl 10, Tq/ЗОа, e(y)l/Taf40).

5. Проведено подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка Р-Ph.

6. Показано, что стерильность самок, мутантных по гену lawc, вызвана нарушением структуры яйцевых камер и созреванием ограниченного числа овоцитов без их воспроизводства.

7. Установлено, что стерильность самцов law<f'e(y)l/Y вызвана нарушением формирования сперматоцитов второго порядка.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Припступая к циклу работ по организации и функционированию гена lawc, мы предполагали: изучить нарушения транскрипции в различных линиях со слабыми мутациями, в модельной системе на основе сайтспецифической рекомбинации дрожжей (система FLP-FRT) получить мозаичных особей, исследовать материнский эффект гена lawc и в заключение получить несколько сильных и летальных мутаций для дальнейших исследований.

Результаты первых экспериментов показали, что ранее полученные мутации фенотипически близки к дикому типу, и их проявление наблюдается лишь во взаимодействии с мутациями в других генах. Использованная при получении гомозиготных соматических клонов деталь l(l)EF520 оказалась комплексом никем не картированных мутаций, поэтому мы не могли объяснить наблюдавшиеся аномалии каким-либо одним фактором. Таким образом, проведение мутагенеза стало для нас жизненной необходимостью.

В основу работы легли рутинные и довольно объемные эксперименты по получению мутаций. Но совершенно неожиданно они выявили несколько новых и очень интересных направлений возможных исследований. Во-первых, примененная нами схема скрещиваний имеет самодостаточную ценность. Она оказалась настолько эффективной, что мы планируем опробовать её еще на нескольких генах, по которым в мировой коллекции нет удобных мутаций.

Во-вторых, в линиях с мутациями по гену lawc была крайне высока частота нерасхождения хромосом. С одной стороны, это создавало проблемы при синтезе линий, потому что, не имея маркеров в каждой хромосоме, мы не могли даже заменить одну балансерную хромосому другой, испытывали затруднения в корректном дупликационном картировании. С другой стороны, эти генетические данные служат прекрасным подтверждением наблюдавшихся на клеточном уровне аномалий: да, процесс деления нарушен, и нерасхождение хромосом типично для разных мутаций гена lawc. В «летальных» зонах генома дрозофилы, гетерозиготные делеции которых при совмещении со слабой /mvc-мутацией вызывают гибель особей, расположено много генов, контролирующих деление клеток. Получение из мировой коллекции мутантов по этим генам и детализация межгенных взаимодействий будет следующим этапом исследований в этом направлении.

В-третьих, летальные мутации из полученной коллекции мутантов исследуются фенотипически, для них установлены стадии летальности (как правило, эмбриональная), у погибших эмбрионов изучаются возникающие морфологические нарушения. Полученные данные позволяют нам предположить нарушение полярности эмбриона, недостаток белков, создающих передне-задний и дорзо-вентральный градиенты. Мы предполагаем продолжить исследования в этом направлении. На основе изучения фенотипов летальных эмбрионов уже написаны 1 курсовая и 2 дипломные работы.

В-четвертых, летальные мутации из полученной коллекции мутантов сейчас активно изучаются в rescue-тестах с применением трансгенных конструкций (совместная работа с группой С.Г. Георгиевой). Обнаружено несколько линий, в которых мутантные особи становятся жизнеспособными при введении трансгенных конструкций с последовательностью, кодирующей транскрипционный фактор TRF2. Но крайне низкая выживаемость особей во всех rescue-тестах, как с трансгенными конструктами, так и с протяженными дупликациями, указывают на выраженный материнский эффект. В пользу этого предположения свидетельствуют такие косвенные данные, как различия в транскрипции между самцами и самками, нарушения оогенеза у мутантов.

Мы планируем провести получение мозаиков в системе FLP-FRT по несколько видоизмененнной схеме с применением полученных летальных мутаций и трансгенных конструкций.

В целом настоящая диссертационная работа, решая ряд задач, ставит множество вопросов, одновременно давая средства к их разрешению и открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Модестова, Елена Андреевна, 2005 год

1. Ауэрбах, ILL, Проблемы мутагенеза, М., «Мир», 1978

2. Георгиев П.Г., Елагин В.А. Супернестабильные системы у Drosophila melanogaster. Анализ мутаций в локусе ocelliless. // Генетика. 1990. 26, №8, с.1416

3. Георгиев П.Г., Елагин В.А., Буфф Е.М., Колягин Н.П. Свойства супернестабильных мутаций в локусе yellow у Drosophila melanogaster.il Генетика. 1992. 28, №4, с.98

4. Георгиев П.Г., Симонова О.Б., Герасимова Т.И. Новый тип нестабильности генома у Drosophila melanogaster.ll Генетика, 26, №5, 1988, с. 867-876.

5. Головнин А.К., Георгиева С.Г., Георгиев П.Г. Механизм возникновения химерных мобильных элементов, вызывающих супернестабильные мутации у Drosophila melanogaster.И ДАН, 2000, 370, №3, с.420-424.

6. V 6. Дубинин Н.П., Пашин Ю.В. Мутагенез и окружающая среда, М., «Наука», 1978. 167 с.

7. Дубинин Н.П., Молекулярная генетика и действие излучений на наследственность. М., Госатомиздат, 1963. 231 с.

8. Елизаров Ю. А. Хеморецепция. В кн.: Руководство по физиологии органов чувств насекомых// М., Изд-во МГУ, 1977, С. 81-135.

9. Инге-Вечтомов С.Г., Введение в молекулярную генетику. М., Высшая школа, 1983, 343 с.

10. Ю.Ладвшценко А.Б., Могила В.А., Георгиев П.Г., и др. Супернестабильные системы у Drosophila melanogaster. Анализ мутаций в локусах singed и scute. // Генетика. 1990. 26, №7, с. 1133.

11. Лобашев М.Е., Генетика. Изд-во ДОЛГУ им. А.А. Жданова, 1967., 752с.

12. Медведев Н.Н. Практическая генетика. М., «Наука», 1966, 238с.

13. Окладнова О.В., Куфиттиг Ш., Новый тип локусспецифичной нестабильности у Drosophila melanogaster , не зависящий от Р-М гибридного дисгенеза.//Генетика, 1995, 31, №1, с. 54-59.

14. Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Солдатов А.В., Симонова О.Б. Клонирование гена гена leg-arista-wing complex (lawc) и анализ его мутантных производных у дрозофилы. // Генетика, 1998, 34, №3, с. 446448.

15. Свидерский В. JL Основы нейрофизиологии насекомых // JI., Изд-во Наука, 1980.

16. Симонова О.Б., Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Корочкин Л.И. Роль мутации lawc?1 в регуляции экспрессии локуса white у дрозофилы.// Генетика, 1998, т.34, №3, с. 349-354.

17. П.Симонова О.Б. Новый транс-регуляторный локус дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N11. С. 1464- 1474.

18. Симонова О.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г., Герасимова Т.И. Новая регуляторная мутация Drosophila melanodaster // Генетика. 1992. № 2. Т.28. С.164-167.

19. Симонова О.Б., Петрук С.Ф., Герасимова Т.И., Корочкин Л.И. Температурочувствительный период lawc?1-мутации у Drosophila melanodaster // Генетика. 1995. № 9. Т.31. С. 1243-1248.

20. Симонова О.Б., Суховерхова Т.И., Джансугурова Л.Б., Корочкин Л.И. Исследование вкусовой чувствительности у гомеозисных мутантов гена leg-aristae-wing complex у дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N5. С.657 -665.

21. Ashburner М., Drosophila. A laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a. P. 1331.

22. Ashburner M., Drosophila. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 b., P. 434.

23. De Vries, H. The mutation theory/ Experiments and Observations on the Origin of Species in the Vegetable Kingdom // Open Court Publ. Co., Chicago, 1909, цит. по: Ауэрбах, 1978.

24. Demerec M. The behavior of mutable gene // Proc. V Intern. Congr. Genet. Berlin, 1927 P. 183, процитировано Окладновой и Куффитиг, 1995.

25. Engels W.R. The P family of transposable elements in Drosophila // Ann. Rev. Genet. 1983. V. 17. 315-344

26. Engels W.R., Benz W.K., Preston C.R., Graham P.L., Phillis R.W., Robertson H.M. Somatic effects of P element activity in Drosophila melanogaster: pupal lethality. //Genetics. 1987 Dec;l 17(4):745-57.

27. Evans D. R., Mellon D. Stimulation of primary tasreceptor by salt // J. gen. Physiol., 1962. V. 45. P. 651-661.

28. Engels W.R., Preston C.R. Formation of chromosome rearrangements by P factors in Drosophila. //Genetics. 1984 Aug;107(4):657-78.

29. Georgiev P.G., Kiselev S.L., Simonova O.B., Gerasimova T.I. A novel transposition system in Drosophila melanogaster depending on the Stalker mobile genetic element // EMBO J. 1990. V.9. N.7. P.2037-2034.

30. Golic K.G., Golic M M. Engineering the Drosophila genome: chromosome rearrangements by design. //Genetics. 1996 Dec; 144(4): 1693-711.

31. Hiraizumi Y. Spontaneous recombination in Drosophila melanogaster males.// Proc Natl Acad Sci USA. 1971 Feb;68(2):268-70.

32. Huynh J.-R., Johnston D.S. The origin of asymmetry: early polarisation of the Drosophila germline cyst and oocyte. // Curr. Biol. 2004, Vol. 14, pp. R438-R449.

33. Johnson and Judd. Analysis of the cut locus of Drosophila melanogaster II Genetics. 1979. V. 92. P. 485-502.

34. Jack J. W. Molecular organization of the cut locus of Drosophila melanogaster II Cell. 1985. V. 42. P. 869-876.

35. Karess R.E., Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila.// Cell. 1984 Aug;38(l): 135-46.

36. Kidwell M.G. Reciprocal differences in female recombination associated with hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. //Genet Res. 1977 Aug;30(l):77-88.

37. Kidwell M.G. Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes. //Genetica. 2002 May;115(l):49-63.

38. Lim J.K., Simmons M.J. Gross chromosome rearrangements mediated by transposable elements in Drosophila melanogaster.il BioEssays, 16, 4-April,1994, 269-275.

39. Lindsley, D.M., Grell, E.H. Genetic Variations of Drosophila melanogaster. Carnegie Institution of Washington Publication, Washington, 1972; P. 568.

40. Lindsley, D.M., Zimm, G., The genome of Drosophila melanogaster NY: Academic Press, Inc. 1992 P. 1134.

41. Morita H., Hidaka Т., Shiraihi A. Excitatory and inhibitory effects of salts on the sugar receptor of the flesnfly // Mem. Fac. Sci., Kyushu Univ. Series E (Biol.), 1966. V. 3. P. 81-87.

42. Neumann C. J. and Cohen S. M. A heirarchy of cross-regulation involving Notch, wingless, vestigial and cut organizes the dorsal/ventral axis of the Drosophila wing // Development. 1996. V. 122. P. 3477-3485.

43. Perrimon N, Engstrom L, Mahowald AP. Zygotic lethals with specific maternal effect phenotypes in Drosophila melanogaster. I. Loci on the X chromosome. //Genetics. 1989aFeb; 121(2):333-52.

44. Perrimon N, Smouse D, Miklos GL. Developmental genetics of loci at the base of the X chromosome of Drosophila melanogaster. И Genetics. 1989b Feb;121(2):313-31.

45. Pirrotta V. Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states // Results Probl. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

46. Rasmusson K.E., Raymond J.D., Simmons M.J. Repression of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster by individual naturally occurring P elements. // Genetics. 1993 Mar; 133(3):605-22.

47. Roiha H., Rubin G.M., O'Hare К. P element insertions and rearrangements at the singed locus of Drosophila melanogaster. // Genetics. 1988 May;l 19(1): 75-83.

48. Ronsseray S., Lehmann MAnxolabehere D. The maternally inherited regulation of P elements in Drosophila melanogaster can be elicited by two P copies at cytological site 1A on the X chromosome. // Genetics. 1991 0ct;129(2):501-12.

49. Rubin G.M., Kidwell M.G., Bingham P.M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. // Cell. 1982 Jul;29(3):987-94.

50. Ryder E., Russell S. Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila. // Briefing in Functional Genomic and Proteomic. 2003 Apr; 2(1):57-71.

51. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral and molecular analysis of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // International Simposium on X chromosom Inactivation in Mammals. Novosibirsk, Russia. 1999a. P. 30-31.

52. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // 40th Annual Drosophila Research Conference. 1999b. Sietle, USA. P. 589C.

53. Simonova О., Т. Sukhoverkhova, Е. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, Switzerland. 1999c. P. 118.

54. Simonova O.B., Sukhoverkhova T.I., Jansugurova L.B., Korochkin L.I. Taste perception analysis in the leg-arista-wing complex homeotic mutants of Drosophila И Genetics (Russia). 2000a. V.36. N5 P.657 665.

55. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral analyses of homeotic /mvc-mutants in D. melanogaster // 41st Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, USA. 2000b. P.a267.

56. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral analysis of homeotic /avfc-mutants in D. melanogaster // Second International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk, Russia.2000c. P. 49.

57. Sukhoverkhova Т., О. Simonova, E. Modestova, L. Korochkin A study of olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // Vl-th Russian School on Actual problems of neurobiology. Kazan. Russia. 1999. P. 111-112.

58. Spradling A.C., Rubin G.M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. //Science. 1982 Oct 22;218(4570): 341347.

59. Sved J.A., Blackman L.M., Gilchrist A.S., Engels W.R. High levels of recombination induced by homologous P elements in Drosophila melanogaster. //Mol. Gen. Genet. 1991 Mar; 225(3):443-7.

60. Vassin H., Vielmetter, Campos-Ortega J. A. Genetic interactions in early neurogenesis of Drosophila melanogaster // J. Neurogenet. 1985. V. 2. № 5. P. 291-308.

61. Voelker R.A. The genetics and cytology of a mutator factor in Drosophila melanogaster. // Mutation Res. 1974 Mar;22(3):265-76.

62. Wolbarsht M. L. Electrical activity in the chemoreceptors of the blowfly. II. Responses to electrical stimulation // J. gen. Physiol. 1958. V. 42: P. 413-4.104