Рекомбинантная дуплекс-специфическая нуклеаза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Анисимова, Вероника Евгеньевна

• Анисимова, Вероника Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Анисимова, Вероника Евгеньевна

1 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

2 ВВЕДЕНИЕ

3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1 «ДСН - член семейства РНК, ДНК-неспецифических эндонуклеаз»

3.2 Классификация нуклеаз

3.3 Источники РНК, ДНК - неспецифических эндонук-леаз

3.4 Характеристика РНК, ДНК - неспецифических эн-донуклеаз

3.4.1 Физико-химические свойства

3.4.1.1 Молекулярная масса и изоэлектрическая точка

3.4.1.2 Процессинг и посттраснсляционная модификация

3.4.1.3 Субъединичная структура

3.4.2 Оптимальные условия катализа

3.4.2.1 рН оптимум

3.4.2.2 Температурный оптимум и стабильность

3.4.2.3 Влияние катионов двухвалентных металлов на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.4 Влияние ионной силы на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.5 Влияние хаотропов и детергентов на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.6 Влияние востановителей и окислителей на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.7 Влияние полиаминов на активность неспецифических РНК, ДНК нуклеаз

3.4.2.8 Влияние нуклеотидов на активность неспецифических РНК, ДНК нуклеаз

3.4.2.9 Специфические ингибиторы РНК, ДНК нуклеаз

3.5 Субстратная специфичность

3.6 Механизм действия

3.7 Активность на разных типах субстратов

3.7.1 Активность на полинуклеотидах

3.7.2 Гидролиз плазмидной ДНК

3.8 Фосфодиэстеразная активность

3.9 Первичная структура

3.9.1 Доменная организация

3.10 Пространственная структура

3.10.1 Модель пространственной структуры Sm-нуклеазы

3.10.2 Модель пространственной структуры нуклеазы Nuc А из Anabaena sp.

3.11 Строение активного центра

3.11.1 Аминокислоты активного центра

3.11.2 Координация ионов металлов

3.11.3 Фермент-субстратные взаимодействия

3.11.4 Механизмы катализа

3.12 Биологическая роль

3.13 Применение

4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1 Материалы

4.1.1 Стандартные растворы

4.1.2 Среды

4.1.3 Штаммы и вектора

4.1.4 Ферменты

4.2 Методы

4.2.1 Клонирование нуклеаз-гомологов ДСН из других видов членистоногих

4.2.1.1 Дизайн вырожденных олигонуклеотидов

4.2.1.2 Выделение РНК

4.2.1.3 Синтез кДНК

4.2.1.4 Амплификация фрагментов кДНК

4.2.1.5 Клонирование ПЦР-продуктов

4.2.1.6 Трансформация клеток E.coli,

Метод с использованием ионов Са и теплового шока

4.2.1.7 Выделение плазмидной ДНК модифицированным методом щелочного лизиса по Бирнбойму и Долли

4.2.1.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК

4.2.2 Клонирование ДСН для экспрессии и мутагенез

4.2.2.1 Клонирование ДСН

4.2.2.2 Получение укороченных фрагментов ДСН

4.2.2.3 Очистка ПЦР-продуктов

4.2.2.4 Внесение точечных замен

4.2.3 Выделение и характеристика рекомбинантной ДСН

4.2.3.1 Культивирование штаммов E.coli - продуцентов рекомбинантной ДСН

4.2.3.2 Выделение рекомбинантной ДСН на кобальт-содержащем сорбенте

4.2.3.3 Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS

4.2.3.4 Перенос разделенных в ПААГ белков на нитроцеллюлозную мембрану

4.2.3.5 Иммуноблоттинг белков после их разделения электрофорезом в ПААГ (Вестерн блоттинг)

4.2.3.6 Ренатурация ДСН

4.2.3.6.1 Метод с использованием одноступенчатого диализа

4.2.3.6.2 Метод с использованием ступенчатого диализа

4.2.3.6.3 Метод ренатурации плавным понижением концентрации денатурирующего агента

4.2.3.6.4 Применение протеин-дисульфид-изомеразы (ПДИ)

4.2.3.7 Активация и очистка ренатурированной ДСН

4.2.3.7.1 При помощи протеиназы К

4.2.3.7.2 При помощи папаина

4.2.3.8 Методы определения ДНКазной активности

4.2.3.8.1 По гиперхромному эффекту (модифицированный метод Кунитца)

4.2.3.8.2 По уменьшению молекулярной массы нуклеиновых кислот

4.2.3.9 Определение субстратной специфичности рекомбинантной ДСН

4.2.3.10 Изучение стабильности ДСП

4.2.3.11 Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на ДСН

4.2.4 Анализ аминокислотной последовательности ДСН

4.2.4.1 Анализ первичной структуры

4.2.4.2 Сравнение аминокислотных последовательностей методом выравнивания

4.2.4.3 Построение древа филогенетического сходства

4.2.4.4 Анализ информационной структуры ДСН

4.2.5 Применение и функциональные пробы рекомбинантной ДСН

4.2.5.1 Детекция точечных нуклеотидных замен

4.2.5.2 Нормализация библиотек полноразмерных кДНК

4.2.5.3 Обработка проб для удаления ДНК

4.2.5.4 ОТ-ПЦР с проб, обработанных ДСН-TJI и контрольных проб

5 РЕЗУЛЬТАТЫ

5.1 Получение и характеристика активной рекомбинантной ДСН

5.1.1 Экспрессия и выделение рекомбинантной ДСН

5.1.2 Ренатурация и очистка рекомбинатной ДСН

5.1.3 Каталитические свойства и стабильность рекомбинантной ДСН

5.1.4 Функциональные пробы рекомбинантной ДСП

5.2 Клонирование кДНК генов - гомологов ДСН

5.3 Изучение структурно-функциональной организации ДСН

5.3.1 Анализ аминокислотной последовательности ДСН

5.3.1.1 Поиск гомологичных структур в международных базах данных

5.3.1.2 Сравнение аминокислотных последовательностей методом выравнивания

5.3.1.3 Построение древа филогенетического сходства

5.3.2 Мутагенез ДСН

5.3.2.1 Делеционный анализ ДСН

5.3.2.2 Точечный мутагенез

5.4 Применение ДСН

5.4.1 Применение рекомбинантной ДСН

5.4.2 Применение мутантной ДСН

5.4.2.1 Свойства ДСН-ТЛ

5.4.2.2 Первичная структура ДСН-ТЛ

5.4.2.3 Удаление ДНК из проб с использованием ДСН-ТЛ

5.4.2.4 Сравнение свойств ДСН-ТЛ с другими нулеазами

6 ОБСУЖДЕНИЕ

7 ВЫВОДЫ:

8 БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантная дуплекс-специфическая нуклеаза»

Значение нуклеаз для современной биологии сложно переоценить. С одной стороны, нуклеазы представляют собой очень интересный и важный объект исследования. Любой живой организм содержит несколько разных нуклеаз, играющих существенную роль в его жизни. В настоящее время известно множество типов нуклеаз от высокоспецифичных эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последовательности ДНК, до ДНК, РНК-неспецифичных экзо- эндо- нуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но и нуклеозид-три-фосфаты. Ферменты этой группы являются ключевыми участниками таких биологически важных процессов как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а также пищеварение. Ученые, изучающие любой из перечисленных процессов, уделяют немало внимания различным нуклеазам. Но, помимо этого, изучение самих нуклеаз, их молекулярной организации, механизмов взаимодействия с субстратом, основ специфичности очень интересная научная работа. С другой стороны, именно использование нуклеаз произвело настоящую революцию в методах молекулярной биологии. Молекулярное клонирование, позволившее на много порядков увеличить наши знания о живой природе, основано на применении высоко специфичных нуклеаз эндонуклеаз рестрикции. Также на основе использования различных нуклеаз были созданы широко распространенные изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и другие. Ранее в нашей лаборатории была выделена и охарактеризована нуклеаза из гепатоианкреаса гибридах. Для камчатского краба, впоследствии ей названная дуплекс-специфической минимум 10 идеально нуклеазой (ДСН). Она гидролизует только двуцепочечную ДНК или цепь ДНК в ДНК-РНК осуществления гидролиза необходимо комплиментарных пар оснований. Кроме того, ДСН обладает высокой стабильностью. Эти свойства позволили разработать несколько молекулярно-биологических методик на основе применения ДСН. Также был клонирован ген этого фермента. Оказалось, что его аминокислотная последовательность гомологична ДНК, РНК неспецифическим эндонуклеазам ферментам, гидролизующим, как ДНК, так и РНК, как дву так и одноцепочечную. Поэтому изучение структурно-функциональной организации ДСН является очень интересной научной задачей.Данная работа посвящена изучению рекомбинантной ДСН. Мы разработали метод получения активного рекомбинантного фермента, который необходим для исследования структурно-функциональных связей в белке. Для аккуратного сравнения ДСН с другими ДНК, РНК неспецифическими эндонуклеазами мы клонировали несколько нуклеаз из представителей класса Ракообразных. Филогенетический анализ выявил две эволюционно различающихся группы нуклеаз ДСН подобные и Serratia подобные («классические»). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей этих белков показало наличие существенных структурных различий представителей упомянутых групп. Мы создали ряд мутантных вариантов ДСН, содержащих как точечные замены, так и лишенных определенных концевых участков. Анализ свойств этих мутантов показал, что «дополнительные» (по сравнению с Sm-нуклеазой) участки ДСН обеспечивают ее необычные свойства, в том числе субстратную специфичность. Исходя из этих результатов, мы выделили новое семейство ферментов дуплекс-специфические нуклеазы. Кроме того, рекомбинантная ДСН была успешно применена в ранее разработанной методике нормализации библиотек полноразмерных кДНК, а термолабильный вариант ДСН был успешно использован для удаления примесей ДНК из проб перед синтезом кДНК. Обзор литературы 3.1 «ДСН член семейства неспецифических эндонуклеаз» РНК, ДНК- Недавно в нашей лаборатории была выделена и охарактеризована новая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба (позже названная дуплекс-специфической нуклеазой, или ДСН). Этот фермент оказался очень необычным: с одной стороны, он обладает уникальной субстратной специфичностью гидролизует только двуцепоченые ДНК-содержащие молекулы; с другой стороны, его аминокислотная последовательность гомологична последовательностям ДНК, РНК неспецифичных эндонуклеаз. Кроме того, на основе этого белка были разработаны новые молекулярно-биологические методики. Данный обзор посвящен дуплекс-специфической нуклеазе камчатского краба (ДСН) и ее структурным гомологам ДНК, РНК неспецифичным эндонуклеазам. 3.2 Классификация нуклеаз Современная классификация учитывает следующие параметры нуклеаз [1-3] (Рис. 1): 4- Тип субстрата ДНК или РНК; -i- Положение атакуемой нуклеотидной связи крайнее в цепи ДНК (РНК) (экзонуклеазы) или в середине цепи (эндонуклеазы); 4- Тип продукта реакции мононуклеотиды или олигонуклеотиды; Тип гидролизуемой связи между 5- или З-атомом сахарного остатка и 4 фосфатом Большая часть ДНК, РНК неспецифичных нуклеаз может быть

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Анисимова, Вероника Евгеньевна

7 Выводы:

1. Разработан метод экспрессии, ренатурации и выделения активной рекомбинантной дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН).

2. Клонированы кДНК новых нуклеаз (гомологов ДСН) из стеклянной креветки, манящего краба и рачка - бокоплава.

3. Проведен сравнительный анализ ДСН и ее гомологов с ДНК,РНК-неспецифическими нуклеазами. На основании выявленных функциональных, филогенетических и структурных отличий ДСН и ее гомологи выделены в отдельное независимое семейство дуплекс - специфических нуклеаз.

4. Получен и охарактеризован термолабильный мутант дуплекс-специфической нуклеазы -ДСН-TJl, полностью инактивирующийся при температуре 55°С.

5. Разработан метод удаления примесей ДНК из образцов РНК, основанный на использовании ДСН-ТЛ. Показано преимущество ДСН-ТЛ по сравнение с другими нуклеазами, использующимися для удаления ДНК.

8 Благодарности

Я хотела бы поблагодарить:

Профессора Н.Б. Гусева за многочисленные ценные советы и неоценимую помощь при написании статей;

Е. Богданову и А. Некрасова за помощь в изучении структурно-функциональной организации ДСН;

Д. Ребрикова за помощь в клонировании кДНК копии генов-гомологов ДСН.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Анисимова, Вероника Евгеньевна, 2008 год

1. Laskowski М: Enzymes hydrolyzing DNA. Ann NY Acad Sci 1959, 81:776-783.

2. Laskowski S: Nucleases: historical perspectives. In: Nucleases. New York.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1982.

3. Bernard EA: Ribonucleases, vol. 38; 1969. >

4. Chen LY, Ho HC, Tsai YC, Liao TH: Deoxyribonuclease of Syncephalastrum racemosum— enzymatic properties and molecular structure. Arch Biochem Biophys 1993, 303(1):51-56.

5. Chow TY, Resnick MA: Purification and characterization of an endo-exonuclease from Saccharomyces cerevisiae that is influenced by the RAD52 gene. J Biol Chem 1987, 262(3 6): 1765 9-17667.

6. Cunningham L, Catlin, B.W. and Privat de Gar'lhe, M. . A deoxyribonuclease of Micrococcus pyogenes., vol. 78: J. Am. Chem. Soc.; 1956.

7. Eaves GN, Jeffries CD: Isolation and Properties of an Exocellular Nuclease of Serratia Marcescens. J Bacteriol 1963, 85(2):273-278.

8. Ho HC, Shiau PF, Liu FC, Chung JG, Chen LY: Purification, characterization and complete amino acid sequence of nuclease CI from Cunninghamella echinulata var. echinulata. Eur J Biochem 1998, 256(1 ):112-118.

9. Kanamori N, Sakabe, K. and Okazaki, R.: Extracellular nucleases of Bacillus subtilis. Purification and properties. Biochim Biophys Acta 1973, 335:172.

10. Maeda M, Taga N: Extracellular nuclease produced by a marine bacterium. II. Purification and properties of extracellular nuclease from a marine Vibrio sp. Can J Microbiol 1976, 22(10):1443-1452.

11. Mittra В, Sadhukhan PK, Majumder HK: A novel endonuclease from kinetoplastid hemoflagellated protozoan parasite Leishmania. JBiochem (Tokyo) 1998, 124(6): 1198-1205.

12. Dake E, Hofmann TJ, Mclntire S, Hudson A, Zassenhaus HP: Purification and properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1988, 263(16):7691-7702.

13. Chow TY, Fraser MJ: Purification and properties of single strand DNA-binding endo-exonuclease ofNeurospora crassa. J Biol Chem 1983, 258(19): 12010-12018.

14. Koa H, Fraser MJ, Kafer E: Endo-exonuclease of Aspergillus nidulans. Biochem Cell Biol 1990, 68(l):387-392.

15. Martin CE, Wagner RP: Two forms of a mitochondrial endonuclease in Neurospora crassa. Can J Biochem 1975, 53(7):823-825.

16. Matousek JaT: Purification and properties of extracellular nuclease from tobacco pollen. J Biol Plant 1984, 26:62-73.

17. Vischi MaM, S.: Strong extracellular nuclease activity displayed by barley (Hordeum vulgare L.) uninucleate microspores. Theor Appl Genet 1997, 95:185-190.

18. Siwecka MA: Purification and some properties of a novel dsRNA degrading nuclease bound to rye germ ribosomes. Acta Biochim Pol 1997, 44(l):61-68.

19. Siwecka MA, Rytel M, Szarkowski JW: Purification and characterization of nuclease I associated with rye germ ribosomes. Acta Biochim Pol 1989, 36(l):45-62.

20. Kuligowska EK, D.; Szarkowski, J. W.: Purification and properties of endonuclease from wheat chloroplasts, specific for single-stranded DNA. Phytochemistry 1988, 27:1275-1279.

21. Holstcin SEH, Kobert, В., Hillmer, S„ Brown, P.H., Ho, T.-H.D. and Robinson, D.G.: Subcellular localization of nuclease in barley alcurone. Physiol Plant 1991, 83:255-265.

22. Cordis GA, Goldblatt PJ, Deutscher MP: Purification and characterization of a major endonuclease from rat liver nuclei. Biochemistry 1975, 14(12):2596-2603.

23. Chou MY, Liao TH: Shrimp hepatopancreatic deoxyribonuclease—purification and characterization as well as comparison with bovine pancreatic deoxyribonuclease. Biochim BiophysActa 1990, I036(2):95-100.

24. Harosh I, Mezzina M, Harris PV, Boyd JB: Purification and characterization of a mitochondrial endonuclease from Drosophila melanogaster embryos. Eur J Biochem 1992, 210(2):455-460.

25. Cote J, Ruiz-Carrillo A: Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G. Science 1993, 261(5122):765-769.

26. Cuatrecasas P, Fuchs S, Anfinsen CB: Catalytic properties and specificity of the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. J Biol Chem 1967, 242(7): 1541-1547.

27. Heins JN, Suriano JR, Taniuchi H, Anfinsen CB: Characterization of a nuclease produced by Staphylococcus aureus. J Biol Chem 1967, 242(5): 1016-1020.

28. Stevens A, Hilmoe, R.J.: Studies on a nuclease from Azotobacter agilis. Isolation and mode of action. J Biol Chem 1960, 235:3016-3022.

29. Yonemura K, Matsumoto K, Maeda H: Isolation and characterization of nucleases from a clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958. J Biochem (Tokyo) 1983, 93(5):1287-1295.

30. Kanamori N, Cozzarelli, N.R. and Okazaki, R.: Extracellular nucleases of Bacillus subtilis. The nucleases as 5P-end-group reagents. Biochim Biophys Acta 1974, 335:173-184.

31. Iwasaki M, Igarashi H, Yutsudo T: Mitogenic factor secreted by Streptococcus pyogenes is a heat-stable nuclease requiring His 122 for activity. Microbiology 1997, 143 ( Pt 7):2449-2455.

32. Linn S, Lehman 1R: An endonuclease from mitochondria of Neurospora crassa. J Biol Chem 1966, 241(11):2694-2699.

33. Ikeda S, Maeda N, Ohshima T, Takata N: Identification and characterization of a mitochondrial endonuclease from yeast, Schizosaccharomyces pombe. Biochem Mol Biol Int 1996, 40(5): 1017-1024.

34. Rangarajan S, Shankar V: Extracellular nuclease from Rhizopus stolonifer: purification and characteristics of single strand preferential - deoxyribonuclease activity. Biochim Biophys Acta 1999, 1473(2-3):293-304.

35. Nomura A, Suno M, Mizuno Y: Studies on З'-nucleotidase-nuclease from potato tubers. I. Purification and some properties of the enzyme. J Biochem (Tokyo) 1971, 70(6):993-l 001.

36. Imagawa H, Toryu, H., Ozawa, T. and Takino, Y.: Purification and characterization of nucleases from tea leaves. Agric Biol Chem 1982, 46:1261-1269.

37. Ruiz-Carrillo A, Renaud J: Endonuclease G: a (dG)n X (dC)n-specific DNase from higher eukaryotes. Embo J 1987, 6(2):401-407.

38. Щеглов AC: Дуплекс-специфическая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба. Диссертах\ия на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва; 2005.

39. Shuai К, Das Gupta СК, Hawlcy RS, Chase JW, Stone KL, Williams KR: Purification and characterization of an endo-exonuclease from adult flies of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 1992, 20(6): 1379-1385.

40. Wei CF, Alianell GA, Bencen GH, Gray HB, Jr.: Isolation and comparison of two molecular species of the BAL 31 nuclease from Alteromonas espejiana with distinct kinetic properties. J Biol Chem 1983, 258(22): 13506-13512.

41. Taniuchi H, Anfinsen CB, Sodja A: The amino acid sequence of an extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. 3. Complete amino acid sequence. J Biol Chem 1967, 242(20):4752-4758.

42. Fraser MJ, Chow TY, Cohen H, Koa H: An immunochemical study of Neurospora nucleases. Biochem Cell Biol 1986, 64(2): 106-116.

43. Kwong S, Fraser MJ: Neurospora endoexonuclease and its inactive (precursor?) form. Can J Biochem 1978, 56(6):370-377.

44. Brown PH, Ho TH: Biochemical properties and hormonal regulation of barley nuclease. Eur J Biochem 1987, 168(2):357-364.

45. Cote J, Renaud J, Ruiz-Carrillo A: Recognition of (dG)n.(dC)n sequences by endonuclease G. Characterization of the calfthymus nuclease. J Biol Chem 1989, 264(6):3301-3310.

46. Franke I, Meiss G, Blecher D, Gimadutdinow O, Urbanke C, Pingoud A: Genetic engineering, production and characterisation of monomeric variants of the dimeric Serratia marcescens endonuclease. FEBSLett 1998, 425(3):517-522.

47. Franke I, Meiss G, Pingoud A: On the advantage of being a dimer, a case study using the dimeric Serratia nuclease and the monomeric nuclease from Anabaena sp. strain PCC 7120 .J BiolChem 1999, 274(2):825-832.

48. Miller MD, Krause KL: Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis. Protein Sci 1996, 5(l):24-33.

49. Ball TK, Suh Y, Benedik MJ: Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity. Nucleic Acids Res 1992, 20(19):4971-4974.

50. Benedik MJ, Strych U: Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiol Lett 1998, 165(1):1-13.

51. Pedersen J, Andersen J, Roepstorff P, Filimonova M, Biedermann K: Characterization of natural and recombinant nuclease isoforms by electrospray mass spectrometry. Biotechnol Appl Biochem 1993, 18 ( Pt 3):389-399.

52. Rangarajan ESaS, V.: Nuclease Rsn from Rhizopus stolonifer : characteristics of associated -adenine speciyc -ribonuclease activity. J Biochem Mol Biol Biophys 2001, 5:99-108. ,

53. Rangarajan ES, Shankar V: Sugar non-specific endonucleases. FEMS Microbiol Rev 2001, 25(5):583-613.

54. Tucker PW, Hazen EE, Jr., Cotton FA: Staphylococcal nuclease reviewed: a prototypic study in contemporary enzymology. IV. The nuclease as a model for protein folding. Mol Cell Biochem 1979, 23(3): 131-141.

55. Fraser MJ: Purification and properties of Neurospora crassa endo-exonuclease, an enzyme which can be converted to a single-strand specific endonuclease. Methods Enzymol 1980, 65(l):255-263.

56. Filimonova MN, Baratova LA, Vospel'nikova ND, Zheltova AO, Leshchinskaia IB: Serratia marcescens endonuclease. Properties of the enzyme. Biokhimiia 1981, 46(9): 1660-1666.

57. Filimonova MN, Balaban, N.P., Sharipova, F.R. and Leshchinskaya, I.В.: Production of Serratia marcescens nuclease in a homogeneous state and study of the physicochemical properties of the enzyme. Biokhimiya 1980, 45:2097-2103.

58. Shishido K: Effect of spermine on cleavage of plasmid DNA by nucleases SI and Bal 31. Biochim Biophys Acta 1985, 826(2-3): 147-150.

59. Frank JJ, Hawk, J.A. and Levy, C.C.: Polyamine activation of staphylococcal nuclease. Biochim Biophys Acta 1975, 390:117-124.

60. Levy CC, Hieter PA, LeGendre SM: Evidence for the direct binding of polyamines to a ribonuclease that hydrolyzes ribonucleic acid at uridylic acid residues. J Biol Chem 1974, 249(21):6762-6769.

61. Suno M, Nomura A, Mizuno Y: Studies on З'-nucleotidase-nuclease from potato tubers. II. Further studies on substrate specificity and mode of action. J Biochem (Tokyo) 1973, 73(6):1291-1297.

62. Hatahet ZaF, M.J.: Specifc inhibitors of Neurospora endo-exonuclease. Biochem Cell Biol 1989, 67:632-641.

63. Meiss G, Franke I, Gimadutdinow 0, Urbanke C, Pingoud A: Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA. Eur J Biochem 1998, 251(3):924-934.

64. Meiss G, Gimadutdinow O, Haberland B, Pingoud A: Mechanism of DNA cleavage by the DNA/RNA-non-specific Anabaena sp. PCC 7120 endonuclease NucA and its inhibition by NuiA. J Mol Biol 2000, 297(2):521 -534.

65. Nestle M, Roberts WK: An extracellular nuclease from Serralia marcescens. II. Specificity of the enzyme. J Biol Chem 1969, 244( 19):5219-5225.

66. Nestle M, Roberts WK: An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties ofthe enzyme. J Biol Chem 1969, 244(I9):5213-5218.

67. Rangarajan ES, Shankar V: Nuclease Rsn from Rhizopus stolonifer: specificity and mode of action. Biochem Biophys Res Commun 2004, 317(l):265-268.

68. Friedhoff P, Meiss G, Kolmes B, Pieper U, Gimadutdinow O, Urbanke C, Pingoud A: Kinetic analysis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia nuclease. Eur J Biochem 1996, 241(2):572-580.

69. П.А. Жулидов ЕАБ, А.С. Щеглов, И.А. Шагипа, Л.Л. Вагнер, Г.Л. Хазпеков, В.В. Кожемяко, С.А. Лукьянов, Д.А. Шагин: Метод создания нормализованных библиотек кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями. Биоорганическая химия 2005,31:1 -9.

70. Cotton FA, Hazen EE, Jr., Legg MJ: Staphylococcal nuclease: proposed mechanism of action based on structure of enzyme-thymidine 3',5'-bisphosphate-calcium ion complex at 1.5-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 1979, 76(6):2551-2555.

71. Pritchard AE, Kowalski D, Laskowski M, Sr.: An endonuclease activity of venom phosphodiesterase specific for single-stranded and superhelical DNA. J Biol Chem 1977, 252(23):8652-8659.

72. Felsenfeld GaS, G.: The dispersion of the hyperchromic effect in thermally induced transitions of nucleic acids. JMol Biol 1962, 5:587-610.

73. Meiss G, Gast, F.-U. and Pingoud, A.M.: The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic acids as substrates. J Mol Biol 1999, 288:377-390.

74. Gray HB, Jr., Winston TP, Hodnett JL, Legerski RJ, Nees DW, Wei CF, Robberson DL: The extracellular nuclease from Alteromonas espejiana: an enzyme highly specific for nonduplex structure in nominally duplex DNA. Gene Amplif Anal 1981, 2:169-203.

75. Ho HC, Liao TH: Protein structure and gene cloning of Syncephalastrum racemosum nuclease. Biochem J 1999, 339 ( Pt 2):261-267.

76. Wang WY, Liaw SH, Liao TH: Cloning and characterization of a novel nuclease from shrimp hepatopancreas, and prediction of its active site. Biochem J 2000, 346 Pt 3:799-804.

77. Miller MD, Cai J, Krause KL: The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster. J Mol Biol 1999, 288(5):975-987.

78. Miller MD, Tanner J, Alpaugh M, Benedik MJ, Krause KL: 2.1 A structure of Serratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA. Nat Struct Biol 1994, 1(7):461-468.

79. Lunin VY, Levdikov VM, Shlyapnikov SV, Blagova EV, Lunin VV, Wilson KS, Mikhailov AM: Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7 A resolution and mechanism of its action. FEBS Lett 1997, 412( 1):217-222.

80. Ghosh M, Meiss G, Pingoud A, London RE, Pedersen LC: Structural insights into the mechanism of nuclease A, a betabeta alpha metal nuclease from Anabaena. J Biol Chem 2005, 280(30):27990-27997.

81. IColmes B, Franke I, Friedhoff P, Pingoud A: Analysis of the reaction mechanism of the nonspecific endonuclease of Serratia marcescens using an artificial minimal substrate. FEBS Lett 1996, 397(2-3):343-346.

82. Friedhoff P, Kolmes B, Gimadutdinow O, Wende W, Krause KL, Pingoud A: Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res 1996, 24(14):2632-2639.

83. Fraser MJ: Alkaline deoxyribonucleases released from Neurospora crassa mycelia: two activities not released by mutants with multiple sensitivities to mutagens. Nucleic Acids Res 1979, 6(l):231-246.

84. Compton MM, Cidlowski JA: Identification of a glucocorticoid-induced nuclease in thymocytes. A potential "lysis gene" product. J Biol Chem 1987, 262(17):8288-8292.

85. Gaido ML, Cidlowski JA: Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes. NUC18 is not histone H2B. J Biol Chem 1991, 266(28): 18580-18585.

86. Matousek J, Trnena L, Oberhauser R, Lichtenstein CP, Nellen W: dsRNA degrading nucleases are differentially expressed in tobacco anthers. Biol Chem Hoppe Seyler 1994, 375(4):261-269.

87. Shapiro J, Machatlie L, Eron L, Ihler G, Ippen K, Beckwith J: Isolation of pure lac operon DNA. Nature 1969, 224(5221):768-774'.

88. Marks A, Spencer JH: Isolation of Escherichia coli transfer RNA-gene hybrids. J Mol Biol 1970, 51(1): 115-130.

89. Joseph DR, Stafford DW: Purification of sea urchin ribosomal RNA genes with a single-strand specific nuclease. Biochim Biophys Acta 1976, 418(2): 167-174.

90. Bartok K, Fraser MJ, Fareed GC: Detection of sequence heterology by use of the N. Crassa nucleases. Biochem Biophys Res Commun 1974, 60(2):507-514.

91. Kacian DL, Spiegelman S: Use of micrococcal nuclease to monitor hybridization reactions with DNA. Anal Biochem 1974, 58(2):534-540.107,108109110111112,113,1141151161. N7118119120

92. Fox KR, Waring MJ: The use of micrococcal nuclease as a probe for drug-binding sites on DNA. Biochim Biophys Acta 1987, 909(2): 145-155.

93. Al'tshuler IM, Zhulidov PA, Bogdanova EA, Mudrik NN, Shagin DA: Application of the duplex-specific nuclease preference method to the analysis of point mutations in human genes. BioorgKhim 2005, 31(6):627-636.

94. Peng RH, Xiong AS, Xue Y, Li X, Liu JG, Cai B, Yao QH: Kamchatka crab duplex-specific nuclease-mediated transcriptome subtraction method for identifying long cDNAs of differentially expressed genes. Anal Biochem 2008, 372(2):148-155.

95. Zhao Y, Hoshiyama H, Shay JW, Wright WE: Quantitative telomeric overhang determinationusing a double-strand specific nuclease. Nucleic Acids Res 2008, 36(3):el4.

96. Strimmer K, von Haeseler A: Likelihood-mapping: a simple method to visualize phylogeneticcontent of a sequence alignment. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94( 13):6815-6819.

97. Yang: The among-site rate variation and its impact on phylogenetic analyses. Trends Ecol Evol1996, 11:367-372.

98. Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, Gusev NB: Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur J Biochem 2004, 271(2):291-302.121. 122.123.124.125.126.127.128.129.130.131.132.133.134.135.

99. John E. Coligan; Ben M. Dunn; David W. Speicher PTW: CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE John Wiley & Sons, Inc.; 2003.

100. Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L, Chenchik A: Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res 1999, 27(6): 1558-1560.

101. Junowicz E, Spencer JH: Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. II. The effect of different bivalent metals on the specificity of degradation of DNA. Biochim Biophys Acta 1973, 312(1):85-102.

102. Junowicz E, Spencer JH: Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. I. General properties and activation with different bivalent metals. Biochim Biophys Acta 1973, 312(l):72-84.

103. Kunitz M: Crystalline desoxyribonuclease; digestion of thymus nucleic acid; the kinetics of the reaction. J Gen Physiol 1950, 33(4):363-377.

104. Kunitz M: Crystalline dcsoxyribonuclease; isolation and general properties; spectrophotometric method for the measurement of desoxyribonuclease activity. J Gen Physiol 1950, 33(4):349-362.

105. Price PA, Liu TY, Stein WH, Moore S: Properties of chromatographically purified bovine pancreatic deoxyribonuclease. J Biol Chem 1969, 244(3):917-923. Thatcher DNaH, A.: Mechanisms of Protein Folding. 1994:242-250.

106. Hlodan R, Craig S, Pain RH: Protein folding and its implications for the production of recombinant proteins. Biotechnol Genet Eng Rev 1991, 9:47-88.

107. Calvo E, Ribeiro JM: A novel secreted endonuclease from Culex quinquefasciatus salivary glands. J Ex/? 5Ы2006, 209(Pt 14):2651-2659.