РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Андриевская, Ольга Анатольевна

• Андриевская, Ольга Анатольевна
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Андриевская, Ольга Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Каталитически активные антитела

1.1.1. Актитела к стабильным аналогам комплекса переходного

состояния химических реакций

1.1.2. Природные абзимы

1.1.2.1. Антитела с протеолитической функцией

1.1.2.2. ДНК-гидролизующие иммуноглобулины

1.1.2.3. Роль природных абзимов в патогенезе заболеваний

1.1.2.4. Природные абзимы человеческого молока

1.1.2.5. Возможные механизмы возникновения природных абзимов

1.2. Нуклеазы человека

1.2.1. Внеклеточные ДНКазы человека

1.2.1.1. Классификация и биологические функции

1.2.1.2. ДНКаза I человека

1.2.1.3. ДНКаза II человека

1.2.2. Внеклеточные РНКазы человека '

1.2.2.1. Классификация РНКаз человека суперсемейства РНКазы А

1.2.2.2. Механизм реакции гидролиза РНК

1.2.2.3. Субстратная специфичность

1.2.2.4. Взаимодействие с ро1у(А) и дцРНК

1.2.2.5. Эффективность катализа

1.2.2.6. Взаимодействие с низкомолекулярными субстратами

1.2.2.7. Влияние ионной силы и катионов на активность РНКаз

1.2.2.8. Взаимодействие РНКаз с ингибитором

1.2.2.9. Филогенез семейства РНКазы А

1.2.3. Лактоферрин

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Методы

2.2.1. Выделение иммуноглобулинов

2.2.1.1. Выделение ДО

2.2.1.2. Выделение ^М

2.2.2. Аффинная хроматография ^ на ДНК-целлюлозе

2.2.3. Определение концентрации белков 5 О

2.2.4. Электрофоретический анализ белков

2.2.5. Анализ препаратов АТ методом двойной радиальной иммунодиффузии

2.2.6. Получение РаЬ-фрагментов иммуноглобулинов

2.2.7. Получение и очистка [5'-32Р] олигонуклеотидов

2.2.8. Синтез [3Н] олигодезоксирибоаденилатов

2.2.9. Выделение рибонуклеаз из сыворотки крови человека

2.2.10. Методы определения нуклеазной активности АТ и РНКаз

2.2.10.1. Определение активности АТ в реакции гидролиза ДНК рВЛ 322

2.2.10.2. Определение активности АТ и РНКаз в реакции гидролиза 54 полирибонуклеотидов

2.2.10.3. Определение нуклеазной активности препаратов АТ по гидролизу 55 олигонуклеотидов

2.2.11. Определение субстратной специфичности АТ

2.2.12. Определение оптимальных условий гидролиза

2.2.13. Определение кинетических параметров реакции гидролиза

2.2.14. Определение термостабильности абзимов и РНКаз сыворотки

2.2.15.Тестирование нуклеазной активности в геле

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 5

3.1. Выделение каталитически активных иммуноглобулинов из сыворотки крови человека

3.2. Связывание каталитически активных антител аффинными сорбентами

3.3. Рибонуклеазная активность РаЬ-фрагментов антител

3.4. Тестирование РНК- и ДНК-гидролитических активностей препаратов 77 иммуноглобулинов в геле после электрофоретического разделения

3.5. Субстратная специфичность антител и РНКаз сывортки крови человека

3.6. Оптимальные условия гидролиза субстратов антителами и РНКазами 86 сывортки крови

3.7. Сравнение термостабильности абзимов и РНКаз сыворотки крови

3.8. Кинетические характеристики реакции гидролиза ON иммуноглобулинами 95 классаМ

I

3.9. Кинетические характеристики взаимодействия РНКаз сыворотки крови 100 человека с олигорибонуклеотидами

3.10. Взаимодействие моноклональных мышиных СКВ-антител с 101 олигонуклеотидами

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4. ВЫВОДЫ

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой»

ВВЕДЕНИЕ.

Классической функцией иммуноглобулинов, основных специфических факторов гуморального иммунного ответа организма на различные агенты с признаками чужеродной генетической информации, является способность к образованию прочных комплексов с антигеном, являющимся причиной их возникновения. Полингом Л. (1948 г.), а позднее Дженксом В. (1969 г.) [1] была высказана гипотеза, согласно которой антитела, комплементарные структуре переходного состояния химической реакции, должны катализировать эту реакцию, ускоряя достижение переходного состояния. Экспериментальное подтверждение эта гипотеза получила в 1986 году, когда двумя группами исследователей [2, 3] при иммунизации животных стабильными аналогами переходных состояний химических реакций были получены антитела, катализирующие эти реакции. В настоящее время абзимология является интенсивно развивающимся направлением науки, известны более 60 примеров каталитически активных антител (абзимов), способных катализировать химические превращения, для многих из которых не существует природных ферментативных аналогов [4]. Субстратная специфичность абзимов выше, чем ферментов, и в ряде случаев эффективность катализа приближается к ферментативной. Получение антител с заданной каталитической специфичностью имеет огромный практический потенциал в биотехнологии и медицине.

В 1989 году Полом С. и соавт. [5] в сыворотке крови больных астмой были впервые обнаружены природные каталитически активные антитела, обладающие высокоселективной пептид-гидролизующей активностью. В 1991-92 гг. в сыворотке крови больных системной красной волчанкой (СКВ) были найдены антитела к ДНК с дезоксирибонуклеазной активностью [6]. Эти антитела проявляют уникальные каталитические свойства, отличные от свойств известных про- и эукариотических ДНКзз.

Открытие каталитической активности антител существенно изменило традиционные представления о роли и функции иммуноглобулинов в иммунной системе организма, так как ранее считалось, что антитела не способны проявлять ферментативных функций.

Появление каталитических аутоантител у человека, как правило, связано с аутоиммуной патологией, что дает основание предполагать участие каталитически активных антител в патогенезе заболевания. В последнее время ДНК-гидролизующие

антитела были обнаружены в сыворотке крови больных лейкемией, ВИЧ, при лучевой болезни [7], аутоиммунном тиреоидите, полиартрите, рассеянном склерозе [8-10]. Очевидно, что появление абзимов является общей тенденцией ответа иммунной системы организма при тяжелых поражениях.

Системная красная волчанка - заболевание, отличительной особенностью которого является продукция антител к нативной двуцепочечной ДНК, кроме этого в организме образуется широкий спектр антител к различным аутоантигенам: рибонуклеиновым кислотам, нуклеопротеидам, белково-нуклеиновым комплексам, ферментам, участвующим в нуклеиновом обмене, рецепторам клеточных мембран, факторам системы свертывания и т.д. Исчезновение иммунологической толерантности к аутоантигенам определяет огромное разнообразие клинических проявлений СКВ. Для СКВ характерна более высокая, по сравнению с другими аутоиммунными нарушениями, ДНКазная активность поликлональных АТ, опубликованы данные об обнаружении в препаратах поликлональных СКВ-^О протеолитической, гиалуронидазной, пероксидазной активностей [11]. На сегодняшний день крайне мало известно о роли каталитически активных антител в организме, об их участии в патогенезе аутоиммунных заболеваний, о механизмах их генерации. Исследование природных абзимов является актуальным с фундаментальной точки зрения, так как позволяет расширить представления о роли и функции антител в процессах жизнедеятельности человека в норме и при патологиях, а так же может иметь и практическую ценность, поскольку может привести к появлению новых методов диагностики и терапии аутоиммунных заболеваний.

Целью настоящей работы было исследование РНК-гидролизующих антител из сыворотки крови больных СКВ:

- доказательство наличия рибонуклеазной активности у

- локализации расположения активного центра на молекуле иммуноглобулинов;

- определение субстратной специфичности и кинетических параметров реакции расщепления модельных субстратов;

- сравнение эффективности расщепления дезокси- и рибоолигонуклеотидов, сравнение рибонуклеазной активности антител разных классов и РНКаз сыворотки крови человека.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Каталитически активные антитела

1.1.1. Антитела к стабильным аналогам комплекса переходного состояния химических реакций.

Уникальным свойством иммунной системы является способность различать «свое» и «чужое». Иммуноглобулины являются одним из основных специфических факторов иммунитета, направленных против чужеродной субстанции, явившейся причиной их возникновения. Принципиально важным является то, что специфическое узнавание антителом своего антигена основано на выборе из огромного многообразия структур той, которая способна наиболее прочно связывать антиген. Специфическое взаимодействие антитела со своим лигандом напоминает аналогичное взаимодействие фермента с субстратом. Связывание фермента с субстратом также складывается из слабых нековалентных взаимодействий (водородные связи, электростатические, гидрофобные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия). Но основное назначение антитела - максимально прочное связывание антигена с последующим его удалением; назначение фермента -связание субстрата для дальнейшего превращения его в продукт. Отличие функций этих белков обуславливает то обстоятельство, что очень прочное связывание субстрата невыгодно для эффективного катализа. Активный центр фермента комплементарен не исходному субстрату, а переходному состоянию. Главной движущей силой ферментативного катализа является увеличение энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию реакции - именно это усиление связывания субстрата и является причиной снижения энергии активации химической реакции, обеспечиваемого ферментом. Эта гипотеза впервые была выдвинута Полингом Л., а затем развита Дженксом В. (1епкз Р.) [1], который в 1969 году сделал предположение, согласно которому антитела, комплементарные структуре переходного состояния химической реакции, должны катализировать эту реакцию, ускоряя достижение переходного состояния. Экспериментальное подтверждение эта гипотеза получила в 1986 году. К этому времени произошло накопление информации, необходимой для понимания молекулярного механизма химических реакций и синтеза аналогов переходного

состояния, то есть стабильных соединений, структура которых близка к предполагаемой структуре переходного состояния. Кроме того, с развитием гибридомной технологии стало возможным получать антитела одинаковой специфичности, являющиеся продуктом одной клетки. Получение каталитически активных антител (КААТ) явилось блестящим подтверждением теории Полинга-Дженкса о комплементарности активного центра фермента структуре переходного состояния и привело к возникновению нового научного направления, связанного с созданием биологических катализаторов с заранее заданными свойствами. По аналогии с энзимами такие катализаторы получили название абзимы. К настоящему времени описано более 60 реакций, катализируемых абзимами (в их числе перегруппировка Клайзена, гидролиз аминов и эфиров, декарбоксилирование, реакция Дильса-Альдера, причем для ряда реакций нет соответствующих природных ферментов) [2-4, 12, 13]. По каталитической эффективности некоторые абзимы не уступают природным ферментам, а по специфичности даже превосходят их. Основными элементами механизма катализа для известных на сегодняшний день абзимов являются стабилизация отрицательно или положительно заряженного переходного состояния реакции, понижение энтропии переходного состояния реакции, наличие кофактора в связывающем центре. В некоторых случаях абзимы способны имитировать элементы ферментативного катализа, но безусловно являются менее совершенными катализаторами в физиологических условиях. Имеющиеся в настоящее время данные позволяют считать, что в большинстве случаев абзимы можно рассматривать как катализаторы упрощенного типа. Изучение их свойств - один из подходов к пониманию механизмов усовершенствования свойств ферментов в ходе эволюции, обеспечивших их эффективное функционирование. Стимуляция образования КААТ при иммунизации животных стабильными аналогами комплексов переходного состояния химических реакций указывает на возможность существования природной энзиматической функции антител.

1.1.2. Природные абзимы.

1.1.2.1. Антитела с протеолитической функцией.

Первые сведения о существовании природных абзимов появились около десяти лет назад [5]. В крови пациентов, страдающих бронхиальной астмой, были обнаружены аутоантитела, связывающие вазоактивный интестинальный пептид (ВИП, нейропептид из

28 аминокислот, присутствующий в центральной и периферической нервной системе), и часть из них была способна гидролизовать этот пептид [5]. Значение Км для ВИП в

í А

реакции его гидролиза ауто-IgG (1.85 х10' - 3.79 xlO М) [14] была существенно ниже, а эффективность катализа (kcat = 15.6 мин'1) выше, чем у известных пептидаз (величина Км для трипсина составляла 3.8 xlO"4 М, kcat= 1.1 х 10"3 мин"1). При определении положения сайтов гидролиза оказалось, что специфичность ВИП-аутоантител кожет меняться в зависимости от донора, лишь в одном случае антитела гидролизовали единичную пептидную связь Gln-16-Met-17[5], в других - количество гидролизуемых связей равнялось 6-7, и все они были локализованы преимущественно на участке с 14-го по 22-ой аминокислотный остаток [14]. Было установлено, что L-цепь IgG гидролизует ВИП в 32 раза эффективнее, чем Fab- фрагменты этих антител [15], что указывало на локализацию активного центра в легкой цепи. При иммунизации мышей коньюгатом ВИП были получены моноклональные L-цепи с моноспецифичной ВИП-гидролизующей активностью [16], причем при комбинации с Н-цепями наблюдали снижение протеолитической активности, вызванное, по-видимому, образованием нековалентного комплекса. Данные по определению аминокислотной последовательности и сайт-направленному мутагенезу рекомбинантных моноклональных L-цепей позволили предположить наличие активного центра, организованного по типу сериновых протеаз (с каталитической триадой из Asp-1, Ser-27, His-93 и с пространственным расположением, аналогичным активному центру субтилизина) [17, 18]. В пользу одинакового с сериновыми протеазами механизма катализа свидетельствовало ингибирование реакции гидролиза ВИП L-цепями в присутствии традиционных ингибиторов сериновых протеаз -апротонина и диизопропилфторфосфата. С. Пол (Paul S.) и соавт. [19] обнаружили, что белки Бенс-Джонса (моноклональные легкие цепи антител из мочи пациентов со множественной миеломой) имеют выраженную протеолитическую активность в отношении ВИП и коротких метнлкумариновых пептидов. Было предположено, что пептид-гидролизующая активность легких цепей антител больных с множественной миеломой имеет патофизиологическую роль. ВИП-гидролиз может иметь непосредственное отношение к активности раковых клеток in vivo, так как, во-первых, этот пептид участвует в процессах регуляции синтеза антител и интерлейкина лимфоцитами; во-вторых, миеломные клетки экспрессируют рецепторы для ВИП.

Группой С. Пола был обнаружен еще один пример природных абзимов с протеолитической функцией: из сыворотки крови больных тиреоидитом Хашимото были

выделены аутоантитела, гидролизующие тиреоглобулин (предшественник тиреотропных гормонов) по нескольким пептидным связям [20]. Низкое значение Км (3.9 х 10'8 М) свидетельствовало о Ъысокоспецифичном связывании субстрата.

1.1.2.2. ДНК-гидролизующие иммуноглобулины.,

1

АТ, гидролизующие ДНК, обнаружены в сыворотке крови больных аутоиммунными (системная красная волчанка, склеродермия, псориаз, тиреоидит, рассеянный склероз) и некоторыми вирусными (гепатит) заболеваниями [7-10, 16]. Максимальной эффективностью гидролиза ДНК обладают антитела из сыворотки крови больных СКВ -заболеванием, при котором наблюдается наиболее высокий титр антител к ДНК. Антитела к ДНК являются характеристическими маркерами СКВ, и особенности их взаимодействия с природными и синтетическими субстратами подробно изучены [21]. Согласно специфичности связывания, они делятся на три основные группы: антитела к нуклеотидам и взаимодействующие только с денатурированной ДНК; антитела, узнающие конформационные эпитопы двойной спирали и связывающие только нативную ДНК и ее фрагменты, и антитела, взаимодействующие с детерминантами, характерными для обеих форм ДНК (главным образом с сахарофосфатным остовом). При изучении специфичности гидролиза [16, 22] было обнаружено, что СКВ- аутоантитела способны с высокой эффективностью гидролизовать как нативную, так и денатурированную ДНК, основной вклад во взаимодействие антител с ДНК вносит сахарофосфатный остов. Анализ данных гидролиза абзимами модельных дезоксирибо-(Ж показал, что расщепление носит неспецифический характер. РаЬ-фрагменты ауто-АТ проявляли каталитическую активность ( к^ / Км = 3.2 х Ю10 М'1 мин"1), близкую к активности ДНКазы I [23], но специфичность гидролиза фрагмента нативной ДНК длиной 300 пар оснований природными ДНК-абзимами отличалась от специфичности ДНКазы крови и ДНКазы I. Для изучения механизма действия каталитически активных ауто-АТ был сопоставлен характер деградации ДНК РаЬ-фрагментами АТ и другими ДНК-гидролизующими ферментами (микрококковой нуклеазой, фосфодиэстеразой змеиного яда, нуклеазой Б1, ДНКазой I) [22]. Полученные данные показали, что ни одна из указанных нуклеаз не обладала набором свойств (специфичностью, типом активности, характером уходящей группы, необходимыми кофакторами), присущими каталитическим антителам, и

позволяют характеризовать ДНК-абзимы как биологический катализатор с уникальными параметрами и механизмом гидролиза.

Структура активного центра ДНК-гидролюующих моноклональных антител BV04-01.

1

У моноклональных антител к ДНК - BV04-01, полученных от мышей линии (NZB/NZW)F1, характеризующихся развитием аутоиммунных процессов, схожих с СКВ человека, была обнаружена ДНК-гидролизующая активность [13]. Эти данные подтвердили существование природных ДНК-гидролизующих антител, а их изучение дало возможность понять механизмы возникновения каталитически активных Ig. Рентгеноструктурный анализ структуры AT в комплексе с <3(Т)з показал, что центральное тиминовое основание размещено в гидрофобном кармане, интеркалируя между Tyr-32L и Trp-ЮОаН, водородные связи N3 с карбонильной группой основной цепи и 04 с гидроксильной боковой группой Ser-91L дополнительно стабилизируют тимин-2 [24]. Инсерция His-27L между вторым и третьим нуклеотидами вызывает напряжение в сахаро-фосфатном остове, причем фосфатная группа тимина-3 находится в непосредственной близости от His-27L. Вызванное за счет этих взаимодействий напряжение в структуре субстрата, а так же близость His к наиболее напряженной фосфодиэфирной связи, позволили предположить возможность гидролиза ДНК [13]. Действительно, AT оказались способными катализировать гидролиз как одноцепочечной, так и двуцепочечной ДНК со сравнительно высокой эффективностью (kcat / Км = 5.2 х 105 М'1 мин"1 для реакции релаксации плазмидной ДНК). Следует отметить, что специфичности связывания и катализа для данных антител сильно различались: BV04-01 обладали наиболее высоким сродством к тимин-богатым последовательностям, а гидролиз протекал преимущественно по цитозия-содержащим участкам ДНК. Данные сайт-направленного мутагенеза убедительно показали ключевую роль His-27dL и Tyr-32L в катализе и координации иона металла. Компьютерное моделирование каталитического центра антитела BV04-01 позволило предложить механизм действия этого абзима. Ион магния размещается вблизи расщепляемой связи и координируется боковыми цепями Tyr-32L, His-27dL и, вероятно, His-93L, при этом возможны дополнительные изменения структуры связанного с антителами субстрата. В результате Mg-зависимый катализ гидролиза ДНК под действием BV04-01 может осуществляться по следующему механизму: расщепляемая связь

стабилизируется в необходимой для гидролиза конформации; ион металла координирует молекулу воды, которая может служить нуклеофилом в реакции гидролиза; а так же стабилизирует отрицательный заряд на кислороде уходящей группы. Известные нуклеазы осуществляют гидролиз ДНК аналогичным образом: остаток Шб является медиатором кислотно-основносо катализа, а Туг связывает и стабилизирует субстрат в активном центре. В целом топография активного центра ВУ04-01 отличается от известных нуклеаз отсутствием большого числа структурных элементов. Это можно объяснить тем, что каталитическая функция АТ ВУ04-01 является, по-видимому, не основной, и поэтому структура его активного центра не соответствует требованиям высокой эффективности катализа.

1.1.2.3. Роль природных абзимов в патогенезе заболеваний.

Пол С. [14] предположил, что аутоантитела к ВИП играют важную роль в патофизиологии астмы. Результаты биопсии тканей дыхательных путей пациентов-астматиков показали пониженный уровень содержания ВИП. Исходя из этого факта, Пол преположил, что гидролиз ВИП антителами может провоцировать компенсаторное высвобождение пептида из нейронов, таким образом существенно снижая запасы пептида в нервной ткани. Кроме того, гидролиз пептида антителами приводит к его инактивации,' так как фрагменты ВИП практически не оказывают расслабляющего действия на дыхательные пути. В случае каталитически непродуктивного связывания, антитела могут конкурировать с рецепторами к ВИП клеток-мишеней. Таким образом, дисфункция дыхательных путей может возникать благодаря гидролизу ВИП или его высокоэффективному связыванию антителами.

В тоже время, по мнению Ли Л. (1л Ь.) и соавт. [20], каталитические антитела к тиреоглобулину могут быть полезны для организма, т. к. удаление этого белка из кровообращения и щитовидной железы может минимизировать аутоиммунный ответ к тиреоглобулину и тем самым предотвращать образование очагов отложения аутоиммунных комплексов с тиреоглобулином.

Можно также предположить позитивную роль ДНК-гидролизующих АТ в случае СКВ и других аутоиммунных заболеваний, сопровождающихся повышением содержания ДНК в сыворотке крови и образованием АТ к ДНК. Острая фаза СКВ, как известно, характеризуется воспалительными процессами, вызванными отложением иммунных

комплексов с ДНК в тканях (например, гломерулонефрит). Повышение титра ДНК-гидролизующих антител может способствовать выводу иммуногенной ДНК из кровотока и сглаживать аутоиммунную реакцию организма.

Учитывая повышение ВИП-гидролизующеЙ активности иммуноглобулинов у пациентов с астмой, тиреоглобулин-гидролизующей активности больных аутоиммунным тнреоидитом Хашимото и ДНК-гидролизующей активности антител при СКВ можно предположить, что образование каталитических аутоантител, возможно, представляет запрограммированный механизм элиминации аутоантигенов, но биологический смысл этого явления остается пока не ясным. Очевидно лишь, что такие аутоантитела играют некую роль в патогенезе аутоиммунного заболевания. Аутоиммунные заболевания сопровождаются повышеннным содержанием каталитически активных антител (это показано на примере СКВ) [11]. Тауфик Д. (Та\уйк О.) и соавт. [25] обнаружили, что частота возникновения каталитически активных антител у мышей линий МШ71рг и БХЬ, генетически предрасположенных к аутоиммунным заболеваниям, на два порядка превышает этот показатель у здоровых мышей при индукции иммунного ответа на комплекс переходного состояния эстеразной реакции. На основе этих данных можно предположить, что при аутоиммунных заболеваниях возможно появление антител с широким спектром каталитических активостей.

1.1.2.4. Природные абзимы человеческого молока.

Недавно появились данные о существовании ДНК- и РНК-гидролизующих антител в молоке здоровых по медицинским показателям женщин [26, 27]. С помощью различных методов показано, что гидролиз ДНК и РНК является собственной функцией иммуноглобулинов: нуклеазный центр АТ расположен в легких цепях к-типа. Субстратная специфичность абзимов молока существенно отличается как от таковой для эукариотических ДНКаз, панкреатической рибонуклеазы А и других известных человеческих РНКаз, так и ^С-абзимов из крови больных аутоиммунными заболеваниями. Принимая во внимание защитную функцию антител молока в создании пассивного иммунитета новорожденных в первые месяцы их жизни, сделано предположение о том, что такие абзимы человеческого молока могут играть особую роль (за счет гидролиза антителами чужеродных нуклеиновых кислот) в создании защитного барьера от воздействия на младенцев вирусов и бактерий.

Кит Ю. и соавт. показали, что фракция секреторных иммуноглобулинов человеческого молока обладает протеинкиназной активностью [28, 29]. Субстратами реакции фосфорилирования белков антителами являются АТР и казеин. Большинство известных к настоящему времени природных абзимов катализируют простые односубстратные реакции, связанные с деградацией субстрата, протеинкиназные антитела - первый пример антител, катализирующих двусубстратную (АТР и казеин) реакцию синтеза.

1.1.2.5. Возможные механизмы возникновения абзимов.

В настоящее время существуют две гипотезы о механизме индукции в организме каталитически активных антител. Абзимы могут появляться, во-первых, в результате генерации антител к аналогам комплексов переходного состояния химических реакций [2, 3, 12], во-вторых, как антиидиотипические антитела против антител к активным центрам ферментов [15, 30-33]. Шустер и соавт. выдвинули гипотезу, согласно которой ДНК-гидролизующие антитела являются антиидиотипическими к топоизомеразе I, т. к. в ряде случаев в сыворотке крови больных СКВ отмечался повышенный уровнь содержания антител к этому ферменту [15]. По мнению Пуцетти A. (Puccetti А.) и соавт. ДНК-гидролизующие AT являются антиидиотипами к ДНКазе I [33]. Возможность существования каталитически активных антиидиотипов к активным центрам ферментов подтверждена и в работе [30]. В результате иммунизации мышей моноклональными антителами против активного центра ацетилхолинэстеразы были получены моноклональные антитела 9А8, которые, согласно теории идиотипических сетей, проявляли свойства внутреннего образа первичного иммуногена - активного центра ацетилхолинэстеразы из эритроцитов человека. Гидролитическая активность антиидиотипических антител в отношении ацетилхолина и родственных тиохолиновых эфиров характеризовалась более низким значением kçat (81 s'1) и более высокой величиной Км (0.6 мМ) по сравнению с исходным ферментом (kcat =8000 s"1, Км=0.13 мМ). Тем не

о

менее, величина ускорения реакции (kcat/kuncat = 4.15 х 10) существено превышала таковую для каталитических антител с эстеразной активностью, полученных на аналог комплекса переходного состояния реакции. Результаты химической модификации антител 9А8 дали основание предположить наличие в их активном центре аминокислот, составляющих каталитическую триаду ацетилхолинэстераз (Glu, Ser, His). Но, в отличие

от фермента, антитела не ингибировались избытком субстрата и проявляли более низкую специфичность в отношении субстратов и ингибиторов по сравнению с исходным ферментом.

Антиген-связывающий участок антиидиотипических антител не только имитирует первичную и вторичную структуру первичного антигена, но и, возможно, способен имитировать физиологическую активность антигена. Возможность получения каталитических антител с использованием свойств идиотипических сетей открывает новые возможности в изучении взаимосвязи структуры и функции и в получении новых каталитических активностей. Можно получать различные антиидиотипические антитела, используя активные центры ферментов в качестве антигенов. Такие "копии", обладающие схожей структурой, но различающиеся по аминокислотной последовательности могут проявлять отличия в специфичности каталитической активности, что может иметь и практическое значение в создании абзимов с нужными свойствами.

Так как представленная работа посвящена изучению РНК-гидролизующих иммуноглобулинов человека, сравнению свойств РНК-абзимов с ДНК-гидролизующей активностью иммуноглобулинов и свойствами секреторных рибонуклеаз сыворотки крови, следующая глава обзора посвящена литературным данным по структуре, каталитическим свойствам и биологическим функциям внеклеточных нуклеаз человека.

1.2. Нуклеазы человека.

Нуклеазы высших организмов можно условно разделить на две группы по локализации и биологическим функциям: внутриклеточные и внеклеточные, или секреторные. Внутриклеточные нуклеазы участвуют в синтетических процессах, связанных с делением клетки и ее дифференцировкой, в процессинге нуклеиновых кислот, стимулируют при определенных условиях синтез нуклеиновых кислот в клетке и служат важным звеном в цепи белкового синтеза. Внеклеточные нуклеазы широко распространены в биологических жидкостях (сыворотка крови, моча, слюна, спинномозговая жидкость и т.д.), межклеточном пространстве органов и тканей, к этой группе можно так же отнести и нуклеазы, локализующиеся в лизосомах и эндоплазматическом ретикулуме и выполняющие функции, несвязанные с

взаимодействием с внутриклеточными РНК и ДНК. Эта группа ферментов выполняет следующие функции [34-39]:

-пищеварительную (для панкреатических РНКаз и ДНКаз);

- защитную - антивирусную (благодаря способности расщеплять вирусные НК), так же, благодаря цитотоксической активности, нуклеазы могут препятствовать вторжению про- и эукариотических организмов;

- противоопухолевую;

- иммуносупрессорную.

Нуклеазы играют немаловажную роль и в процессах апоптоза (запрограмированной гибели клетки). Кроме того, существуют нуклеазы, для которых биологическая и физиологическая роль остается на сегодняшний день невыясненной (например, РНКаза 4 человека), и белки, рибонуклеазная активность которых не является очевидно необходимой и не связана с основной физиологической функцией (ЕСР, лактоферрин).

Благодаря многообразию биологических функций, нуклеазы обладают большими перспективами для применения в диагностике и в качестве медицинских препаратов. На сегодняшний день известно, что некоторые формы онкологических и воспалительных заболеваний сопровождаются повышением уровня нуклеаз в сыворотке крови, моче, семенной жидкости, ликворе [36]. Препараты панкреатической РНКазы применяют при лечении острых форм клещевого энцефалита [40], панкреатическая ДНКаза используется при лечении некоторых форм герпеса, для уменьшения вязкости легочных секретов у пациентов с цистным фиброзом [41]. Исследуется возможность применения коньюгатов нуклеаз и молекул, специфично связывающихся с клеточными мембранами, в противовирусной, противогрибковой и противоопухолевой терапии [36,42].

1.2. 2. Внеклеточные ДНКазы человека.

Классификация и биологические функции.

В тканях и биологических жидкостях животных содержатся секреторные дезоксирибонуклеазы двух типов: а) ДНКаза I с оптимумом рН в нейтральной области, активируемая ионами магния и вносящая одноцепочечные разрывы в молекулу ДНК, и б) ДНКаза II с оптимумом рН в кислой области, вносящая парные симметричные разрывы в молекулу ДНК. ДНКаза I расщепляет одно- и двуцепочечную ДНК, гидролизуя связь Р-ОЗ'

с образованием 5' -фосфо-( три- и/или тетра-) олигонуклеотидов. ДНКаза II разрывает 05'-Р-связи в полинуклеотидной цепи, образуя З'-концевые фосфаты [34, 43]. Оба фермента относятся к классу эндонуклеаз. Общепринято считать, что ДНКазы выполняют пищеварительную (панкреатические) и противовирусную (ДНКазы секретов) функции. Помимо этого, ДНКазы I и II, локализованные в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, участвуют в процессах апоптоза, расщепляя ДНК вследствие повышения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и протонов, и, как следствие, изменения морфологии эндоплазматического ретикулума и выхода нуклеаз в клеточное пространство [37-39].

1.2.1.2. ДНКаза I человека. Локализация и множественность изоформ.

ДНКаза I обнаружена в поджелудочной железе [44], дуоденальной жидкости [44], сыворотке крови [45,46], моче [47-49], почках [50], печени [46] и сперме [51] человека. Во всех тканях и биологических жидкостях ДНКаза I существует в виде нескольких изоформ, различающихся по молекулярной массе (благодаря различной органспецифичной посттрансляционной модификации) и по значению изоэлектрической точки. Различия в заряде изоформ ДНКазы I с одинаковой молекулярной массой объясняются различным содержанием сиаловой кислоты в гликозидном компоненте белка. Но помимо этого существуют фенотипы ДНКазы I, различающиеся по значению pl благодаря вариациям в первичной структуре [49, 50]. Так, Ясуда Т. (Yasuda Т.) и соавт. [52] обнаружили, что в позиции 222 аминокислотной последовательности ДНКазы I может находиться Gin или Arg, и это обстоятельство влияет на общий заряд молекулы белка. Результаты популяционных исследований показали, что образование ДНКазы I контролируется, по меньшей мере, четырьмя кодоминантными аллелями в едином аутосомном локусе [53], что дает возможность применения фенотипирования по ДНКазе I в криминалистике.

Первичная структура ДНКазы I.

В настоящее время определена последовательность кДНК дезоксирибонуклеазы I человека и определена аминокислотная последовательность белка ( рис. 1). кДНК из 1039

12 3

12345678901234567 89 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 чДНКаза I ЬК1ААГМ10ТРвВТКН8НАТЬУ8*1У01Ь8 бДНКаза! ЬК I ААГЯ1 ЙТ * 6« 1КН8ЯА.1 Ь А 8 I I УИ I V й

4 5 6

12 3 4 5 6 7 8 9 01^345678901234567890 чДНКаза I В1 АЬ УйЕ УКП 8 Н Ь Т АУ6К Ь ЬВ N ЬНОО А Р

бДНКаза! КУВПЫСЕУКВЗНЬУАУеКЬЬСУЬНЙСОР

7 8 9

123456789012345678901234567890 чДНКаза I ОТУНУУУЗЕРЬОКЫЗУКЕИУЬРУУКРООУЗ бДНКаза1 N Т У Н У УУЭ Е Р Ь вйН в I КЕ Я У Ь Р Ь Г И Р N К V в

10 11 12 123456789012345678901234567890 чДНКаза I АУП8*УТ00вСЕРСвНВТРЫ11ЕРА1У1*ЕЕ8 бДНКаза1 УЬОТУОУВСвСЕЗСвМОЗРЗКЕРАУУКРЗЗ

13 14 15

123456789012345678901234567890 чДНКаза I ЕПЕУКЕРАХУРЬНААРСВАУАЕЮАЫОУ бДНКаза! Н5ТКУКЕРА1УАЬНЗАРБВАУАЕ1К8ЫВУ

16 17 18

123456789012345678901 2 34567890 чДНКаза I УЬВУ0ЕКН6ЬЕБУМЬМ6ОРНА6СЗУУКР82 бДНКаза1 уьоусокинькоумьмепрнАвсзуутБзд

1 9 2 0 2 1

123456789012345678901234567890 чДНКаза I И8 8 1КЬ«Т8РТР()НЫРВ8АОТТАТРТНСА бДНКаза! И881КЬКТ88ТР2ИЫР08АВТТАТЗТМСА

2 2 2 3 2 4

1234567890123 456789012 3 4 5 6 7 8 9 0

чДНКаза I УСЯ1УУА6МЫК6 АУУРОЭАЬР г N РЙАА У в

бДНКаза1 УОЯ1УУА63ЬЬ03 Э УУРС8АР Р т 0 Е О А А У в

2 5 2 6

1234567890123 4 5 6 7 8 9 0

чДНКаза I ЬвООЬАОА18БНУ Р V Е V М Ь К

бДНКаза! Ь8ЫЕМАЪА130НУ РУЕУЫТ

1. Аминокислотная последовательность ДНКаз I человека и быка [41]. Жирным

шрифтом выделены инвариантные остатки аминокислот.

пар оснований кодирует последовательность из 260 аминокислот, которой предшествует гидрофобный сигнальный пептид из 22 аминокислот. Молекулярная масса рекомбинантного белка составляет 30 кДа [41]. Первичная структура ДНКазы I человека имеет достаточно высокую степень гомологии (77%-78%) с ДНКазой I других млекопитающих [38]. Для всего семейства ДНКазы I млекопитающих сохраняются инвариантными аминокислотные остатки, входящие в активный центр (His -134, His-252, Glu-78, Asp-212, Asp-168) [54, 55], нуклеотид-связывающие сайты (Arg-9, Tyr-76, Arg-41) [58], фосфат-связывающие сайты (Arg-9, -41, -111) [57, 60], аминокислоты, обеспечивающие стабилизацию пространственной структуры белка (C^s-íOl, -104,-173 и -209), два потенциальных сайта для N-гликозилирования (Asn-18 и -106) (рис. 1) [41]. ДНКаза I человека активна в присутствии ионов Mg2+ и Са2+ в концентрации 10 и 1 мМ, соответственно; оптимальное значение рН находится в области 6.5-7.5 и специфически ингибируется актином и хелатирующими агентами. На основе рентгеноструктурных данных трехмерной структуры бычьей ДНКазы I была создана пространственная структура человеческой ДНКазы I [41].

Структура активного центра и механизм гидролиза.

Бычья панкреатическая ДНКаза является наиболее хорошо изученным ферментом семейства ДНКазы I и механизм ее действия рассмотрен в ряде работ [55, 60, 61]. С помощью рентгеноструктурного анализа, сайт-направленного мутагенеза, методами химической и аффинной модификаций локализованы активный центр и ДНК-связывающие участки фермента [55-57, 60-61] (рис. 2). Исходя из высокой степени гомологии ДНКазы I человека и бычьей ДНКазы, можно предположить одинаковый механизм катализа реакции гидролиза ДНК этими ферментами. Сак Д. и Оефнер К. (Suck D., Qeffner С.) на основе рентгеноструктурных данных предложили механизм катализа реакции гидролиза ДНК бычьей панкреатической ДНКазой (бДНКаза I) [60]. В процессе кислотно-основного катализа Glu-78 акцептирует протон от His-134, который, в свою очередь, акцептирует протон молекулы воды. Активированная таким образом молекула воды нуклеофильно (по Sn2 механизму) атакует атом фосфора и расщепляет Р-03' - связь. Нуклеофильной атаке гидроксилом воды способствует положительный заряд иона Са2+ (но in vivo, по-видимому, это Mg2+/Mn2+ [62]), взаимодействующего с фосфатом. Цепь акцепторов и доноров протона Glu-His-^O напоминает каталитическую триаду

а

ОЗж

Р

О-р—05'

О би^.н-^Ы N1 • • * 101©

Н \

(Са2

Е 78

N134

3'

Ос

I р

6-0

Н118

а-О

с-6

I

Р

0-6

Э40..... р

¿ьс > р р

О-т д-о

р Т73 '

6-А

I

Р

6-е

I

р

■

О" С в-С J.....У172

Р 9 Р У208

6" б с

Р .....8203

Р ..... N71

Р .....П10в

С-О.....озб

Я9Р

<к>

г

Рис. 2. (а) Механизм реакции гидролиза ДНК бычьей ДНКазой I [ 60]. (б) Схематическое представление основных центров связывания ДНКазы I на основе данных рентгеноструктурного анализа комплекса ДНКазы I с модельным субстратом [61 ].

Asp-His-Ser сериновых протеаз, His-HjO-His рибонуклеаз суперсемейства РНКазы А. Glu-39 и Asp-168 связывают ионы магния, необходимые для катализа гидролиза ДНК [55]. Ионы кальция , для которых в молекуле ДНКазы I существует два дополнительных сайта связывания, являются кофакторами энзиматической активности ДНКазы I, стабилизируют пространственную структуру ДНКазы 1 и предохраняют дисульфидные мостики от окисления. По данным Сака Д. и соавт. (Suck D.) ДНКаза I имеет второй, Мп2+-активируемый каталитический центр, образованный His-252 и Asp-212 на расстоянии 15 нм от первого каталитического сайта [61]. Расщепление фосфодиэфирной связи происходит в противоположной нуклеотидной цепи на расстоянии четырех нуклеотидов от первичного участка расщепления. Наличие второго каталитического центра объясняет данные, согласно которым ДНКаза I может индуцировать двуцепочечные разрывы в молекуле ДНК в присутствии ионов Мп2+.

По данным ренгеноструктурного анализа комплекса бычьей панкреатической ДНКазы I с самокомплементарным олигонуклеотидом, образующим двуцепочечную спираль из четырнадцати пар оснований [61], экспонированная петля белка с центром в Туг-76 взаимодействует с малой бороздкой В-ДНК и два аминокислотных остатка (Туг-76 и Arg-41) размещаются в бороздке. Дополнительно осуществляются контакты между фосфатными группами обеих цепей ДНК и аминокислотами в области экспонированной петли. Молекула ДНК при этом искажается, малая бороздка расширяется до 3 нм, а большая сужается. С большой бороздкой ДНК ДНКаза I не взаимодействует. Именно взаимодействием с обеими цепями ДНК объясняется более высокая эффективность катализа ДНКазы I в реакции гидролиза двуцепочечной ДНК по сравнению с одноцепочечной.

Способность ДНКазы эффективно и неспецифично гидролизовать ДНК отличает ее от других эндонуклеаз. Несмотря на то, что ДНКаза I не является сиквенс-специфичной, скорость расщепления значительно зависит от нуклеотидной последовательности. Это свидетельствует о том, что ДНКаза I "узнает" вариации в геометрии остова ДНК [63].

Белки, гомологичные ДНКазе I.

Ясуда Т. и совт. [52] определили, что ген человеческой ДНКазы I ( ген DNASE 1 или DNL1 ) локализован в 16-й хромосоме. По некоторым данным существует еще три гена, кодирующие белки, гомологичные ДНКазе I.

Недавно были охарактеризованы и клонированы две кДНК, кодирующих белки, гомологичные ДНКазе I человека [64, 65] - DNAS1L2 и DNAS1L3 [65]. DNAS1L2 - кДНК, кодирующая последовательность из 299 аминокислотных остатков, на 56 % гомологичный первичной структуре ДНКазы I. Полная кДНК DNAS1L3 состоит из 1290 пар оснований, 918 из которых кодируют полипептидную цепь длиной 306 аминокислот [64].

v »

Сигнальный пептид, состоящий из 20 аминокислот отщепляется в процессе экспрессии. Урезанная аминокислотная последовательность так называемой nh (novel human) ДНКазы на 45% идентична с ДНКазой I человека. Сохраняются инвариантными два цистеина (Cys-173 и -209), а так же His-134, входящий в активный центр. Рекомбинантная пЪДНКаза с молекулярной массой 33 кДа гидролизует одноцепочечную ДНК в присутствии ионов кальция и магния и, в отличие от ДНКазы I, не ингибируется актином. Из шестнадцати исследованных с помощью гибридизации (Northern Blot) тканей человека высокий уровень экспрессии пЬДНКазы обнаружен только в печени и селезенке [64].

В Х-хромосоме человека (human Xq28) картирована последовательность ДНК, гомологичная по нуклеотидному и, соответственно, аминокислотному составу ДНКазе I [66, 67]. При трансляции кДНК был получен белок из 302 аминокислот, на 37.6 % гомологичный ДНКазе I. мРНК-транскрипт был обнаружен главным образом в скелетных и сердечной мышцах.

Ингибитор ДНКазы I.

Как упоминалось выше, G-актин эффективно ингибирует ДНКазу I (К, = 1.3 пМ) [54], причем сайт связывания с актином удален от каталитического центра, а ингибирование происходит благодаря стерическим затруднениям при взаимодействии с ДНК. Взаимодействие ДНКазы I с G-актином включает гидрофобные, электростатические и водородные связи. В области связывания образуется -складчатая структура из Туг-65, Val-66, Уа1-67 ДНКазы I и Gly-42, Val-43, Met-44 актина. Боковые группы Туг-65 и Val-67 ДНКазы I входят в состав гидрофобного участка взаимодействия с актином, на периферии этого центрального гидрофобного региона в комплексообразовании участвуют полярные боковые цепи His-44, Asp-53 и Glu-69. Методом сайт-направленного мутагенеза была установлена крайне важная роль Туг-65 и А1а-114 человеческой ДНКазы I во взаимодействии с актином [54].

------------- >

Биологическое значение ингибирования ДНКазы I актином остается невыясненным, но потенциально это свойство может играть роль в процессах митоза и апоптоза [38]. Способность связываться с актином, однако, не является общим свойством ДНКаз 1 млекопитающих и родственных ДНКазе I белков (например, nh ДНКаза I), и, в связи с этим, рано говорить о роли этого явления.

!

1.2.1.3. ДНКаза И человека.

Впервые ДНКаза II человека была выделена из мочи [68]. Белок с молекулярной массой 36 кДа может существовать в виде нескольких изоформ, различающихся по значению pi ( 6.4, 6.6 и 6.8). Множественность изоформ ДНКазы II проистекает из различного содержания сиаловой кислоты в углеводном компоненте белка [69].. Этот фермент широко распространен в тканях человека (печень, щитовидная железа), относительно высокий уровень ДНКазной активности отмечен в таких биологических жидкостях, как грудное молоко, семенная жидкость, слюна [69]. Готтлиб P. (Gottlieb R. А.) и соавт. выделили ДНКазу II из нейтрофилов и выдвинули гипотезу о роли ДНКазы II в расщеплении ДНК, сопровождающем апоптоз [70]. Ген ДНКазы II (DNASE2) картирован в 19-й хромосоме, нуклеотидная последовательность длиной 1593 п.о. кодирует пропептид из 360-ти аминокислот, 253 из которых образуют зрелый белок, 16 -гидрофобный сигнальный пептид и 91 - пропептид [71]. Оптимальное значение рН реакции гидролиза ДНК находится в интервале 5.1-5.3, в связи с чем фермент так же называют "кислой" ДНКазой; для проявления активности фермента не требуется присутствия ионов двухвалентных металлов.

Как было уже упомянуто выше (гл. 1.1.2.2.), несколько лет назад в сыворотке крови больных с аутоиммунными нарушениями были обнаружены необычные по происхождению и свойствам внеклеточные дезоксирибонуклеазы - иммуноглобулины класса G с ДНК-гидролизующей активностью [6, 16, 22, 23]. Биологическая роль иммуноглобулинов с такими нетрадиционными свойствами пока неизвестна, возможно, появление каталитических антител представляет собой запрограммированный механизм по элиминации аутоантигенов.

1.2.2. Внеклеточные РНКазы человека.

В настоящее время известно, что рибонуклеазой активностью обладает самый

широкий спектр белков, причем для одних РНКазная активность является основной

#

функцией, другие же обладают и иной > высокоспецифической биологической активностью. Кроме пищеварительной функции панкреатических РНКаз, физиологическая роль других внеклеточных рибонуклеаз является слабо изученной. Большое число этих белков имеет важное биологическое значение: нейротоксическую, иммуносупрессорную, антиопухолевую активности, а также цитотоксическую, сосудопролиферативную и транспортную функции.

1.2.2.1. Классификация РНКаз человека суперсемейства РНКазы А.

Большинство известных внеклеточных рибонуклеаз высших организмов образуют семейство ферментов, наиболее изученным представителем которого является панкреатическая РНКаза А крупного рогатого скота. Белки этого семейства являются пиримидин-специфичными рибонуклеазами, имеют различную степень гомологии с РНКазой А, но во всех случаях сохраняется инвариантным активный центр (рис. 3) [72-74]. Отличия в аминокислотном составе связывающих сайтов обуславливают различия в физико-химических характеристиках реакции гидролиза.

Сиераковская X. и Шугар Д. [Sierakowska Н., Shugar D.] условно разделили пиримидин-специфичные рибонуклеазы млекопитающих на два класса: секреторные и несекреторные РНКазы [43]. Секреторные рибонуклеазы проявляют максимальную энзиматическую активность при щелочных значениях рН (~ 8.0), и poly (С) является для них лучшим субстратом по сравнению с poly (U) и РНК. Панкреатическая РНКаза А -типичный фермент этого класса. Несекреторные рибонуклеазы млекопитающих из различных тканей (печень, селезенка) имеют оптимальное значение рН в нейтральной области (~ 6.5 - 7.0) и гидролизуют poly (С) и poly (U) со сравнимыми скоростями. Ионы

'У л ^х

металлов, такие как Zn и Си ингибируют секреторные РНКазы и практически не влияют на активность несекреторных. Эта классификация не является вполне корректной, т.к. в некоторых несекретирующих тканях (например, в мозге) обнаружены рибонуклеазы так называемого секреторного типа. Более того, гены всех известных внеклеточных РНКаз

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 0 1 2 3 4 5 6 7

РНКаза А к Е т А А А К Г Е Я 0 н м Б Б 3 Т Б А А Б Б Б N У с N

РНКаза 1 - - - к Е Б КАК К р 0 и 0 н м б Б О Б Б Р Б Б Б Б Т У с N

РНКаза 2 К р р 0 Г Т Б А 0 И р т Е н I N М т Б 0 0 - - - - - - с Т

РНКаза 3 И р Р 0 Г т И А 0 и р А I н I Б ь N Р Р И - - - - - - с Т

РНКаза 4 ^ - - - 0 0 С. М У 0 и р Ь Я н V Н Р Е Е Т С - Б О Я У с N

ангиогенин - - 6 0 N 5' рут н р Ь т о н У Б А К Р 0 С Я - Б О Я У с Е

РНКаза кб р к II Ь Т К А Н V р Е I 0 н I 0 Р б Р ь 0 - - - — - - с N

8 9 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8

РНКаза А 0 М М к Б И N Ь Т К О

РНКаза 1 0 М м я Я И N м т 0 й

РНКаза 2 N А м 0 V -I N N У О Я

РНКаза 3 I А м и А I N N У Я я

РНКаза 4 Ь М м <2 И я К М т ь У

ангиогенин Б I м я И я й Ь т Б Р

РНКаза кб И А м Б в I N N У Т О

4 5

9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7

Я С к Р V N Т р V н Е Б Ь А Б V 0 А V

я С к Р V N Т р V н Е Р Ь V О V 0 N V

я С к N 0 N т р ь ь Т Т Г А N V V N V

я с к N О N т р ь я Т Т г А N V V N V

н с к Я Е N т р I н Е В I N I я Б I

- с к Б I N т р I н С N к Я Б I к А I

н с к Н 0 N т р ь н Б Б г О N V А Я V

8 9 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8

РНКаза А С Б 0 К N V А С к N С

РНКаза 1 С Г 0 Е К V Т С к N в

РНКаза 2 С й N Р N М Т С Р Б N

РНКаза 3 С С N 0 Б I Я С Р Н N

РНКаза 4 С Б Т Т N I 0 с к N й

ангиогенин С Е N К N в N - Р Н Я

РНКаза кб С Б Ъ ь Б I V с к N Я

7 8

9 0 - - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5

0 Т - - N С У 0 Б У Б Т М Б I т 0 С я

0 й - - N С У К Б N Б Б М н I т в С я

К т я к N С н н Б С Б 0 V р Ь I н с N

Я т ь N N с н я Б Я Г Я V р ь ь н с в

К м - - N с н Е й V - - V к V т Б с Я

Е - - - N ь я I Б к Б Б г 0 V т т с К

Я - - н N с н 0 Б Б К Р V N м т в с Я

9 10 11

6 7 8 9 0 1 - - 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 *> 0

РНКаза А Е Т С Б Б К. - - У р N С А У к т т 0 А N к Н I I V А С Е С N

РНКаза 1 Ь т N й Б Я - - У р N С А У я т Б Р К Е я Н I I V А С Е в Б

РНКаза 2 Ь т Т Р Б Р 0 N I Б N с Я У А 0 Т Р А N м Е У I V А С Б N Я

РНКаза 3 Ь I N Р С А 0 N I Б N с Я У А Б Я Р С Я я Е У V V А С Б N Я

РНКаза 4 0 т С Б Б Я - - А Р N с Я У Я А I А Б Т я Я V V I А С Е С N

ангиогенин Ь н С С Б Р - - V Р Р с <2 У Я А т А С Е я N V V V А С Е N С

РНКаза кб Ь т — Б в К У Р 0 с я У Б А А А 0 У к Г Е I V А С Б Р Р

4 5 6 7 8 9 1 0 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9

РНКаза А Р У V р V н Г Б А Б V - - - -

РНКаза 1 - - - - - - - - - Р У V р V н г Б А Б V Е Б Б т

РНКаза 2 В Я Я Б Р Р У Р V V р V н ь Б Я I I - - - -

РНКаза 3 в Р - Я Б Б р Я У Р V V р V н ь 0 Т Т I - - - -

РНКаза 4 - - - - - - - - - Р 0 V р V н Е 0 С

ангиогенин - - - - - - - - - - - ь р V н Ь Б Б I Г Я Я р

РНКаза кб 0 - - к Б Б р Р У К ь V Р V н Ь Б Б I ь - — - -

Рис. 3. Аминокислотная последовательность секреторных рибонуклеаз человека и РНКазы А. Жирным шрифтом выделены консервативные остатки аминокислот.

содержат последовательности, кодирующие сигнальные пептиды [75-77], что говорит о секреции белков либо о их локализации в лизосомах или эндоплазматическом ретикулуме. Учитывая основное распространение в тканях организма, Соррентино С. и Либонати М. (Sorrentino S., Libonati М.) секреторные рибонуклеазы называют РНКазами панкреатического типа, а несекреторные - РНКазами непанкреатического типа или печеночно- селезёночногого типа [78].

За последние 15 лет из различных органов и биологических жидкостей человека было выделено и охарактеризовано более десяти РНКаз. Ферменты различаются между собой по молекулярным массам, заряду, субстратной специфичности, антигенным детерминантам и ряду других свойств. Тем не менее все внеклеточные рибонуклеазы являются продуктами шести различных генов, находящихся в 14-й хромосоме, и относятся к суперсемейству РНКазы А [79-80].

Наиболее современной и корректной является предложенная Хамманом К. (Hamann К.) классификация РНКаз человека, основанная на номенклатуре генов, кодирующих соответствующие белки [35, 75, 81]. Согласно этой классификации, РНКазы человека подразделяют на шесть типов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Андриевская, Ольга Анатольевна

выводы.

1. Впервые показано, что электрофоретически гомогенные иммуноглобулины классов в и М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой (СКВ) обладают РНК-гидролизующей активностью. Препараты поликлональных ДО и ^М сохраняют рибонуклеазную и ДНКазную активности в процессе всех хроматографических стадий очистки, обработки кислыми буферами или хаотропными агентами, разрушающими нековалентные взаимодействия белков, а также после электрофореза в денатурирующих условиях.

Нуклеазные центры абзимов расположены на легких цепях антител (АТ), которые активны вне нативных молекул иммуноглобулинов.

2. Проведено сравнение субстратной специфичности, а также кинетических и термодинамических параметров взаимодействия ^М-, абзимов, РНКаз сыворотки крови человека и панкреатической рибонуклеазы А с олиго- и полирибонуклеотидами. Полученные данные свидетельствуют о существенных различиях этих характеристик в случае исследованных абзимов и рибонуклеаз. В то время, как сродство субстратов к АТ на 1-2 порядка выше, чем к рибонуклезам, отношение величин констант скорости реакции гидролиза РНК-субстратов абзимами к соответствующим величинам (кса0 рибонуклеаз варьирует в пределах 0.1 - 100.

3. Показано, что субстратная специфичность, кинетические параметры 1§М и а также диапазон рН-оптимума в реакциях гидролиза субстратов антителами являются индивидуальными характеристиками пациента. При этом, однако, сохраняется ряд общих закономерностей: изменение скорости расщепления в исследуемом ряду РНК-субстратов, влияние ионов одно- и двухвалентных металлов на нуклеазную активность абзимов и др.

4. Впервые показано, что моноклональные СКВ-иммуноглобулины класса в против В-ДНК различной последовательности способны гидролизовать как ДНК, так и РНК, в то время как антитела к 2-форме ДНК не обладают ни РНКазной, ни ДНКазной активностью. Несмотря на то, что эти абзимы являются АТ против ДНК, они гидролизуют рибо-субстраты на 1-2 порядка эффективнее, чем дезоксирибоолигонуклеотиды. г

5. Анализ полученных результатов и литературных данных позволяет предположить, что при аутоиммунных заболеваниях могут реализоваться два пути образования ДНК- и РНК-гидролизующих АТ; как против нуклеиновых-кислот, так и-антиидиотипические (вторичные АТ к активным центрам ферментов), несущие "внутренний образ" активного центра.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе впервые показано, чтоДНК-связывающие антитела из сыворотки крови больных СКВ обладают рибонуклеазной активностью. Это заключение сделано на основе следующих результатов:

1. НК-гидролизующие препараты АТ не содержали детектируемых примесей других белков и являлись электрофоретически чистыми согласно окраске коллоидным серебром.

2. Профиль гель-хроматографии АТ в условиях "кислого шока" и профиль каталитической активности совпадают, основные пики профилей соответствуют по времени выхода ^М (М.м. 970 кДа) и (М.м. 150 кДа)

3. РНКазная активность абсорбируется из реакционной смеси аффинными сорбентами (иммобилизованными белком в, антикв-, анти-^М- и анти-Ьк-антителами, в зависимости от класса анализируемых АТ).

4. Согласно результатам ренатурации АТ в геле, препараты содержали только один белок с РНК- и ДНК-гидролизующий активностью, соответствующими согласно молекулярной массе - 150 кДа (в невосстанавливающих условиях) или Ь-цепи - 20 кДа (в восстанавливающих условиях)

5. РаЬ-фрагменты и ^М сохраняют рибонуклеазную активность, причем каталитическая функция ^ ассоциирована в основном с Ь-цепями к-типа

6. Оптимальные условия (рН, ионная сила, концентрация Ме2+) и кинетические параметры реакции расщепления гОЫ антителами варьируют в широком диапазоне и часто являются индивидуальными характеристиками для каждого препарата СКВ-АТ.

7. АТ отличаются от РНКаз сыворотки крови человека по субстратной специфичности, термостабильности, оптимальным условиям проведения реакции и кинетическим параметрам каталитической реакции.

Следует отметить, что РНК-гидролизующая активность препаратов антител значительно варьировала и была специфичной для каждого донора, в некоторых случаях иммуноглобулины из сыворотки крови больных СКВ не обладали детектируемой рибонуклеазной активностью (из 9 обследованных доноров 2 препарата антител были неактивны в реакции гидролиза НК). Для всех активных препаратов АТ можно было отметить одну отличительную особенность: препараты ^М обладали большей удельной рибонуклеазной активностью по сравнению с одного и того же препарата сыворотки.

Препараты IgM содержали относительно меньшую фракцию высокоаффинных ДНК-связывающих AT по сравнению с IgG. Нуклеазная активность присутствовала в низкоаффинных фракциях как IgG, так и IgM при хроматографии на ДНК-целлюлозе. Этот факт представляет большой интерес, так как на первом этапе иммунного ответа на антиген образуются IgM, кроме того, известно, что V-области генов IgM не подвергаются соматическому мутагенезу и очень близки к фрагментам зародышевого генома, из которого они формируются.

Взаимодействие ДНК-связывающих СКВ-антител с ДНК на сегодняшний день представляет собой одну из хорошо изученных систем "антиген-антитело". Определено более 250 последовательностей анти-ДНК антител, проведено значительное количество иммунохимических и генетических исследований, ведутся работы по кристаллизации комплексов антител и их фрагментов с субстратами, исследуются механизмы потери толерантности и развития аутоиммунного ответа к ДНК.

Некоторые исследователи отмечают важную роль соматических мутаций в образовании аутоантител, например, в гипервариабельном участке тяжелой цепи мышиных моноклональных антител к фосфорилхолину была обнаружена спонтанная замена глутаминовой кислоты на остаток аланина, в результате замены антитела утратили специфичность к фосфорилхолину и приобрели специфичность к ДНК [179]. Согласно другой гипотезе, аутоантитела - это продукты немутировавших генов V-области, экспрессируемых неиммунными лимфоцитами. Мутации и отбор могут привести к переходу от синтеза аутоантител на синтез антител против чужеродного антигена. Ван Эс (van Es J.H) и соавт. проанализировали последовательность элементов VH и VL генов, экспрессирующих моноклональные IgG к оцДНК в линии клеток, полученных от пациентов с активной формой СКВ [180]. Оказалось, что легкая цепь, экспрессированная в этих аутоантителах являеся вариантом соматически мутировавшего зародышевого гена kv325, часто ассоциированного с аутореактивными Ig, продуцируемыми злокачественными В-клетками. Кроме того, DH-сегмент часто обнаруживается в мультиреактивных, низкоаффинных анти-ДНК ауто-IgM пациентов с СКВ, а так же здоровых доноров. По мнению авторов, патогенные анти-ДНК ауто- IgG при СКВ могут возникать в результате антиген-управляемой селекции соматических мутаций зародышевых генетических элементов, кодирующих мультиреактивные низкоаффинные ауто-IgM [180]. Аналогичный вывод о роли антиген-управляемой селекции соматических мутаций зародышевых генетических элементов сделан и в некоторых других работах [181185]

В настоящее время представляется вероятным, что в формировании аутоантител определенную роль играют как мутации в клетках зародышевой линии, так и соматические мутации. Исследователи разделяют анти-ДНК антитела на три качественно различающихся класса [186]. Первый класс - природные аутоантитела, относящиеся к изотипу ^М, которые перекрестно реагируют с широким спектром антигенов и кодируются немутировавшими зародышевыми генами. Эти аутоантитела могут присутствовать как у нормальных индивидуумов, так и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Этот класс антител может продуцироваться при активации поликлональных В-клеток. Второй класс - высокоаффинные узкоспецифичные аутоантитела ДО-изотипа, которые кодируются ^ У-генами, подвергшимися соматическим мутациям. Этот класс антител ассоциирован с аутоиммунными заболеваниями. Третий класс антител представлен высокопецифичными анти-ДНК последовательность которых кодируется немутировавшими генами зародышевой линии.

Можно предположить, что существуют фрагменты зародышевых генов вариабельных участков которые кодируют аминокислотные последовательности, имеющие в своем составе структурные мотивы, способные катализировать нуклеазные реакции. Более низкая нуклеазная активность по сравнению с ^М может объясняться мутациями в фрагментах генов, кодирующих связывающие и каталитические участки иммуноглобулинов, при переключении синтеза изотипов. Более высокое сродство к субстрату (антигену), в направлении которого может идти антиген-направляемый отбор мутаций, в данном случае нивелирует наличие потенциальных нуклезных центров, так как эффективный катализ не может происходить в условиях высокоаффинного связывания, характерного для взаимодействий типа антиген-антитело (К$ ~ 10'9 - Ю"10 М).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Андриевская, Ольга Анатольевна, 1998 год

Список литературы.

1 .Jencks W.P. Catalysis in chemistry and enzymology. N.Y.:McGraw-Hill. 1969. P. 289.

2. PollackS. Т., Jacobs J. F., Schultz P. G. Selective chemical catalysis by an antibody. // Science. 1986. V. 234. P. 1570-1573. _ .... -

¡

3. Tramontano A., Janda K. D., Lerner R. A. Catalytic antibodies.'// Science. 1986. V. 234. P. 1566-1570.

4. Thomas N.R. Hapten design for the generation of catalytic antibodies. // Appl. Biochem. Biotechn. 1994. V. 47. N. 2/3. P. 345-372.

5. Paul S., Voile D. J., Beach C.M., Johnson D. R., Dowell M. J., Massey R. JCatalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. // Science. 1989. V. 244. P. 1158-1162.

6. Shuster A. M., Gololobov G. V., KvashukO. A., BogomolovaA. E., Smirnov I. V., Gabibov A. G. DNA hydrolizing autoantibodies. // Science. 1992. V. 256. P. 665-667.

7. Gololobov G. V., Mikhalap S. V., Starov A. V., Kolesnikov A. F„ Gabibov A. G. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. // Appl. Biochem. Biotechn. 1994. V.47. N.2/3.P. 305-315.

8. Барановский А. Г., Матюшин В. Г., Власов А. В., Забара В. Г., Наумов В. А., Жъеже Р., Бунева В. Н, Невинский Г. А. ДНК- и РНК- гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита. // Биохимия. 1997. 62. 1598-1607.

9. Барановский А. Г., Канышкова Т. Г., Могилъницкий А. С., Наумов В. А., 'Бунева В. Я, Гусев Е. И., Бойко А. Я, Заргарова Т. А., Фаворова О. О., Невинский Г. А. Поликлональные антитела из сыворотки крови и спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют РНК и ДНК.// Биохимия. 1998. Т. 63.

10. Власов А. В., Барановский А. Г., Канышкова Т. Г., Принц А. В., Забара В. Г., Наумов В. А., Бреусов А. А., Жъеже Р., Бунева В. Я, Невинский Г. А. Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом и аутоиммунным тиреоидитом. // Молекулярн. биология. 1997. 31. 1117-1127. 11 .Генералов И. И., Новиков Д. К. Поликлональные каталитические антитела и их возможное биологическое значение.// Усп. совр. биологии. 1998. Т. 118. Вып. 2. С. 178-193.

12. Schultz P. G., Lerner R.A. From molecular diversity to catalyis: Lessons from the immune system. // Science. 1995. V. 269. N. 5232. P. 1835-1842.

13. Щуров Д. В. Каталитические антитела. // Мол.биология. 1997. Т. 32. N. 1. С. 5-15.

14. Paul S. Catalytic activity of anti-ground state antibodies, antibody subunits, and human autoantibodies. // Appl. Biochem. Bioteehn. 1994. V.47. N. 2/3. P. 241-255.

15. Mei S., Mody В., Eklund S. Я, Paul S. Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 15571-15574

16. Sun M., Gao Q. S., Li L„ Paul S. Proteolytic activity of an antibody light chain. // J. Immunol. 1994. V.153.N. 11. P. 5121-5126.

17. Gao Q. S., Sun M„ Tyutyutulkova S., Webster D., Rees A., Tramontano A., Tramontano A., Massey R. J., Paul S. Molecular cloning of proteolytic antibody light chain. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. N. 51. P. 32389-32393.

18. Gao Q. S., Sun M., Rees A. R., Paul S. Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. // J. Mol. Biol. 1995. V. 253. N. 5. P. 658-664.

19. Paul S., Li L., Kalaga R., Wilkins-Stevens P., Stewens F. J., Solomon A. Natural catalytic antibodies: peptid-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. N. 25. P. 15257-15261.

20. Li L., Paul S„ Tyutyulkova S., Kazatchkin M. D., Kaven S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin ahtibodies. // J. Immunol. 1995. V.154. P.3328-3329.

21. Pisetsky D. S. The immunologic properties of DNA.// J. Immunol. 1996. V. 156. N. 2. P. 421423.

22. Щуров Д. В., Макаревич О. К, Лопаева О. А., Бунева В. К, Невинский Г. А., Габибов А. Г. Взаимодействие ДНК гидролизующих аутоантител с низкомолекулярными субстратами. //ДАН. 1994. Т. 337. С. 407-410.

23. Gololobov G. V., Chemova Е. A., Schourov D. V., Smirnov 1. V., Kudelina I. A., Gabibov A. G. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: Application of the flow linear dichroism technique. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. V. 92. P 254-257.

24. Heron J. N., He X. M., Ballard D. V., Blier P. R., Pace P. E, Bothwell A. L M, Voss E. M„ Edmudson A. B. An autoantibody to single-stranded DNA: comparison of the three-dimensional structures of the unliganded Fab and a feoxynucleotide-Fab complex. // Proteins. 1991. V. 11. P. 159-175.

25. Tawfik D. S., Chap R., Green B. S., Sela M., Eshhar Z. Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition-state analog: is there a linkage to autoimmunity? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. V. 92. N. 6. P. 2145-2149

26. Kcmyshkova Т. G„ Semenov D. V., Khlimankov D. Yu., Buneva V. N., Nevinsky G. A. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. // FEBS Lett. 1997. V. 416. P. 23-26.

27.Канышкова Т. Г., Семенов Д. В., Власов А.В., Хлиманков Д.Ю., Барановский А.Г., Шипицын М. В., Ямковой В.И., Бунева В. Н., Невинский Г. ~ А. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из молока человека и их возможная биологическая роль. // Мол. биология. 1997. Т. 31. С. 1086-1096.

28. Кит Ю. Я., Семенов Д. В., Невинский Г. А. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? (Протеинкиназная активность slgA из молока человека). // Молекуляр. биология. 1995. Т.29. Вып. 4. С. 893-905.

29. Kit Yu. Ya., Semenov D. К, Nevinsky G. A. phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. V. 39. N. 3. P. 521-527.

30. Izadyar L., Friboulet A, Remy M. H., Roseto A., Thomas D. Monockonal anti-idiotypic antibodies as functional internal images of enzyme active sites: Production of a catalytic antibody with a cholinesterase activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 93. N. 19. P.8876-8880.

31. Friboulet A., IzadyarL., Avalle В., Thomas D. Abzyme generation using an anti-idiotypic antibody as the "internal image" of an enzyme active site. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47. N. 2-3. P. 229-237.

32. Gabibov A. G., Gololobov G. V., Makarevich O. /., Schourov D. V., Chernova E. A., Yadav R. P. DNA-hydrolyzing autoantibodies. //Appl. Biochem. Biotechn. 1994. V.47. N.2/3. P. 293303.

33. Puzzetti A., Madaio M. P., Bellese G., Migliorini P. Anti-DNA antibodies bind to DNase I. // J. Exp. Med. 1995. V. 181. P. 1797-1804.

34. Шапот В. С. Нуклеазы. // Москва, Медицина, 1968, С. 72-87.

35. Sorrentino S., Libonaty М. Structure-function relationships in human ribonucleases: main distinctive features of major RNase types. // FEBS Lett. 1997. V.404. N.l. P. 1-5.

36. Shein С. H. From housekeeper to microsurgeon: the diagnostic and therapeutic potential of ribonucleases. //Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 529-536.

37. Barry M. A., Eastman A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis. // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 300. N. 1. P. 440-445.

38. Peitsch M. C, Polzar B., Stephan H., Crompton H., MacDonald H. R., Mannherz H. G., TschoppJ. Characterisation of the endogenous deoxyribonuclease involved in nuclear DNA degradation during apoptosis (programmed cell death). // EMBO J. 1993. V. 12. N. 1. P.371-377.

39. Yoshihara K., Ota K., Ide T., Tanaka Y. Anti-Ca , Mg -dependent endonuclease antibody detects specifically a class of chromatin-bound endonuclease.-// Biochem. Biophys. Res. Com. 1997. V. 236. P. 423-426.

40. Glukhov B. N., Jerusalimasky A.P., Canter V. M., Salganic R. I. Ribonuclease treatment of tickborne encephalitis. // Arch. Neurol. 1976. V. 33. N. 9. P. 598-603.

41. Shak S., Capon D. J., HellmissR., Marsters S. A., Baker C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. N. 23. P. 9188-9192.

42. Linardou H., Deonarain M. P., Spooner R. .A., Epenetos A. A. Deoxyribonuclease I (DNase I). A novel approach for targeted cancer therapy. // Cell. Biophys. 1994. V.24. N. 25. P. 243-248.

43. Sierakowska H., Shugar D. Mammalian nucleolytic enzymes.// Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1977. V. 20. P. 59-130.

44. Funakoshi A., Tsubota Y., Wakasugi H, Ibayashi H, Takagi Y. Purification and properties of human pancreatic deoxyribonuclease I. // J. Biochem. 1977. V. 82. N. 6. P. 1771-1777.

45. Love J. D., Hewitt R. R. The relationship between human serum and human pancreatic DNase I. //J. Biol. Chem. 1979. V.254. N. 24. P. 12588-12594.

46. Kishi K., Yasuda T.Jkehara y., Sawazaki K., Sato W., Iida R. Human serum deoxyribonuclease I (DNase I ) polymorphism; pattern similarities among isozymes from serum, urine, kidney, liver, and pancreas. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 47. N. 1. P. 121-126.

47. Pergolizzi R., Appierto V., Bosetti A., DeBellis G. L., Rovida E., Biunno I. Cloning of a gene encoding a DNase I-like endonuclease in the human Xq28 region. // Gene. 1996. V. 168. N. 2. P.267-270.

48. Ito K., Minamiura N., Yamamoto T. Human urine DNase I: immunological identity with human pancreatic DNase I, and enzymic and proteochemical properties of the enzyme. // J. Biochem. 1984. V. 95. N. 5. P. 1399-1406.

49. Yasuda T., Awazu S., Sato W., Iida R„ Tanaka Y., Kishi K. Human genetically polymorphic deoxyribonuclease: purification, characterisation, and multiplicity of urine deoxyribonuclease I. //J. Biochem. 1990. V. 108. N. 3. P. 393-398.

50. Nadano £>., Yasuda T., Kishi K. Purification and caracterization of genetically polymorphic deoxyribonuclease 1 from human kidney. // J. Biochem. 1991. V. 110. N. 3. P. 321-323.

51. Yasuda T., Sawazaki K, Nadano D., Takeshita H., Nakanaga M., Kishi K. Human seminal deoxyribonuclease I (DNase I ): purification, enzymological and immunological

. characterisation and origin. // Clin. Chim. Acta. 1993. V. 218. N. 1. P. 5-16.

52\ Yasuda T., Nadano D., Iida R., Takeshita H., Lane S. A., Callen D. F., Kishi K. Chromosomal assignment of the human deoxyribonuclease I gene, DNASE 1 (DNL1), to band 16pl3.3 using the polymerase chain reaction. // Cytogenet. Cell. Genet. 1995. V. 70. N. 3-4. P. 221-223.

53. Kishi K, Yasuda T„ Awazu S., Mizuta K. Genetic polymorfism of human urine deoxyribonuclease I. // Hum. Genet. 1989. V. 81 N. 3. P. 295-297.

54. Ulmer J. S., HerzkaA., Toy K. J., Baker D. L., Dodfge A. H., Sinicropi D., Shak S., Lazarus R. A. Engineering actin-resistant human DNase I for treatment of cystic fibrosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. N. 16. P. 8225-8229.

55. Jones S. J., Worrall A. F, Connolly B. A. Site-directed mutagenesis of the catalytic residues of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. // J. Mol. Biol. 1996. V. 264. N. 5. P. 1154-1163.

56. Doherty A. J., Worall A. F., Connolly B. A. The roles of arginine 41 and tyrosine 76 in the coupling of DNA recognition to phosphodiester bond cleavage by DNase I: a study using site-directed mutagenesis. //J. Mol. Biol. 1995. V. 251. N. 3. P. 366-377.

57. Liao T. H, Ho H. S., Abe A. Chemical modification of bovine pancreatic deoxyribonuclease with phenilglyoxal - the involvement of Arg-9 and Arg-41 in substrate binding. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1079. N. 3. P. 335-342.

58. Doherty A. J., Worall A. F., Connolly B. A. The roles of arginine 41 and tyrosine 76 in the coupling of DNA recognition to phosphodiester bond cleavage by DNase I: a study using site-directed mutagenesis. // J. Mol. Biol. 1995. V. 251. N. 3. P. 366-377.

59. Moore S. Pancreatic DNase. // In: The Enzymes ( Boyer P. D., ed ) New York , Academic Press. 1981. V. 14. P. 281-296.

60. Suck D., Lahm A., Oefner C. Structure refined to 2A of nicked DNA octanucleotide complex with DNase I. //Nature. 1988. V. 332. N. 6163. P. 464-468.

61. Suck D., Oejher C. Structure of DNase I at 2.0 A resolution suggest a mechanism for binding to and cutting DNA. //Nature. 1986. V.321. N. 6070. P.620-625.

62. Worrall A. F., Connolly B. A. The chemical synthesis of gene coding for bovine pancreatic DNase I and its cloning and expression in Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 35. P. 21889-21895.

63. Suck D. DNA recognition by DNase I. // J. Mol. Recognit. 1994. V. 7. N. 2. P. 65-70.

64. Zeng Z, Par melee D., Ну aw H., Coleman T. A., Su K, Zhang J., Gentz R., Ruben S., Rosen C., Li К Cloning and characterisation of a novel human DNase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 231. N. 2. P.499-504.

65. Rodriguez A. M, Rodin D., Nomura H., Morton С. С., Weremowicz S., Schneider M. C. Identification, localisation, and expression of two novel human genes similar to deoxyribonuclease I. // Genomics. 1997. V. 42. N.'3. P.507-513.

66. Parrish J. F., Ciccodicola A., Wehhert M„ Cox G. F., Chen E., Nelson D. L. A muscle-specific DNase I - like gene in human Xq28. // Hum. Mol. Genet. 1995 V. 4. N. 9. P. 1557-1564.

67. Pergolizzi R., Appierto V., Bosetti A., DeBellis G. L., Rovida E., Biunno I. Cloning of a gene encoding a DNase I-like endonuclease in the human Xq28 region. // Gene. 1996. V. 168. N. 2. P.267-270.

68. Murai K, Yamanaka M„ Akagi K„ Anai M. Purification and characterisation of deoxyribonuclease II from human urine. // J. Biochem. 1980. V. 87. N. 4. P.1097-1103.

69. Yasuda Т., Nadano D., Awazu s., Kishi K. Human urine deoxyribonuclease П (DNase II ) isoenzymes: a novel immunoaffinity purification, biochemical multiplicity, genetic heterogeneity and broad distribution among tissues and body fluids. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1119. N. 2. P. 185-13193.

70. Gottlieb R. A., Giesing H.A., Engler R.L., Babior KM. The acid deoxyribonuclease of neutrophils: a possible participant in apoptosis-associated genome destruction. // Blood. 1995. V. 86. N. 6. P. 2414-2418.

71. Yasuda Т., Takeshita H, Iida R., Nakajima Т., Hosomi O., Nakashima Y, Kishi K. Molecular cloning of the cDNA encoding human deoxyribonuclease II. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N. 5: P. 1610-2616.

72. Beintema J. J.,Wietzes P., Weickman J. L., Glitz D. G. Amino acid sequence of human pancreatic ribonuclease. // Anal. Biochem. 1984. V. 136. N. 1. P. 48-64.

73. Beintema J. J., Hofsteenge J., Iwama M., Morita Т., Ohgi К, Irie M., Sugiyama R. H„ Schieven G. L., Dekker C. A., Glitz D. G. Amino acid sequence of the nonsecretory ribonuclease of human urine. // Biochemistry. 1988. V. 27. N. 12. P. 4530-4538.

74. Колбановская E. Ю., Морозов H. Ю., Гаврюшов С. А., Ильин В.А., Байнтема Дж., Влодавер А., Карпейский М. Я. Структурно-функциональный анализ рибонуклеазы А и родственных белков. //Мол. биология. 1993. Т. 27. вып. 2. С. 1315-1334.

Г

75. Hamann K. J., Barker R. L., Loegering D. A., Pease L.R., Gleich G. J. Sequence of human eosinophil-derived neurotoxin cDNA: identity of deduced amino acid sequence with human non-secretory ribonucleases. // Gene. 1989. V.83. P. 161-167. .....——

76. Schuller C:, Nijssen H. M„ Kok R., Beintema J. J. Evolution of nucleic acids coding for ribonucleases: the mRNA sequence of mouse pancreatic ribonuclease. // Mol. Biol. Evol. 1990. V. 7. N. 1. P. 29-44.

77. Sorrentino S., Glitz D. G. Ribonuclease activity and substrate preference of human eosinophil cationic protein (ECP). // FEBS Lett. 1991. V.288. N.l/2. P. 23-26.

78. Sorrentino S., Libonaty M. Human pancreatic-type and nonpancreatic-type ribonucleases: a direct side-by -side comparison of their catalytic properties. // Biochemistry. 1994. V.312. P. 340-348.

79. Mastrianni D. M., Eddy R. L., Rosenberg H. F, Corrette S. E., Shows T. B., Acckerman S. J. Localisation of the human eosinophil Charcot-Leyden ciystal protein (lysophospholipase ) to chromosome 19 and human ribonuclease 2 ( eosinophil-derived neurotoxin) and ribonuclease 3 (eosinophil cationic protein) genes (RNS2 and RNS 3) to chromosome 14. // Genomics. 1992. V. 13. N. 1. P. 240-242.

80. Rosenberg H. F.,Dyer K. D. Molecular cloning and characterisation of novel human ribonuclease (RNase k6): increasing diversity in the enlarging ribonuclease gene family. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. N. 18. P. 3507-3513.

81. Hamann K. J., Ten R. M, Loegering D. A., Jenkins R. B., Heise M. T., Schad C. R., Gleich G. J., Barker R. L. Structure and chromosome localisation of the human eosinophil-derived neurotoxin and eosinophil cationic protein genes: evidence for intronless coding sequences in the ribonucleasegene superfamily. // Genomics. 1990. V. 7. P. 535-546.

82. Weickman J. L., Elson M, Glitz D. J. Purification and characterisation of human pancreatic ribonuclease. // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 5. P. 1272-1278.

83. Iwama M., Kunihiro M., Ohgi K., Irie M. Purification and properties of human urine ribonucleases.// J. Biochem. 1981. V. 89. N. 4. P. 1005-1016.

84. Cranston J. W., Perini F., Crisp E. R., Hixson C. V. Purification and properties of ribonucleases from human urine. // Biochim. Biophys. Acta 1980. V. 616. P. 239-258.

85. De Prisco R., Sorrentino S., Leone E.,. A ribonuclease from human seminal plasma active on double-stranded RNA. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 788. N. 3. P. 356-363.

86. Sorrentino 51, Lavitrano M., De Prisco R., Libonati M. Human seminal ribonuclease. A tool to check the role of basic charges and glycosylation of ribonuclease in the action of the enzyme on double-stranded RNA. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 827 N. 2. P. 135-139.

87. Sorrentino S., De Prisco R., Libonati M. Human seminal ribonuclease. Immunological quantitation of cross-reactive enzymes in serum, urine and seminal plasma. // Biochim Biophys Acta. 1989. V. 998. N. l.P. 97-101. ~ !

88. Mizuta K, Awazu S., Yasuda T., Kishi K. Purification arid characterisation of three ribonucleases from human kidney: comparison with urine ribonucleases.// Arch. Biochem. Biophys. 1990. V.281. N.l. P.144-151.

89. Yasuda T., NadanoD., Takeshita H., Kishi K. Two distinct secretory ribonucleases from human cerebrum: purification , characterisation and relationships to other ribonucleases. // Biochem J. 1993. V. 296. P. 617-625.

90. Dalaly B. K, Eitenmiller R. R„ Friend B. A., Shahani K M. Human milk ribonuclease. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 615. N. 2. P. 381-391.

91. Yasuda T., Mizuta K, Sato W„ Kishi K. Purification and characterisation of two ribonucleases from human erythrocytes: immunological and enzymological comparison with ribonucleases from human urine. //Arch. Biochem. Biophys. 1990. V. 279. N. 1. P.130-137.

92. Akagi K, Yamanaka M., Murai K.,Omae T. Purification and properties of acid ribonuclease from human serum and leucocytes. // Cancer. Res. 1978. V. 38. P. 2163-2167.

93. Blank A., Dekker C. A. Ribonuclease of human serum, urine, cerebrospinal fluid, and leukocytes. Activity staining following electrophoresis in sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gels. // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 8. P. 2261-2267.

94. Seno M., Futami J., Tsushima Y., Acutagawa K, Kozaka M., Tada K, Yamada H. Molecular cloning and expression of human ribonuclease 1 cDNA. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1261. N. 3. P. 424-426.

95. BeintemaJ. J., Blank A., Schieven G. L., Dekker C. A., Sorrentino S., Libonati M. Differences in glycosilation pattern of human secretory ribonucleases. // Biochem. J. 1988. V. 255. N. 2. P. 501-505.

96. Sorrentino S., Tucker G. K, Glitz D. G. Purification and characterisation of ribonuclease from human liver. //J. Biol. Chem. 1988. V. 263. N. 31. P. 16125-16131.

97. Yasuda T., Mizuta K, Sato W., Kishi K. Purification and characterisation of ribonuclease from human spleen. Immunological and enzymological comparison with nonsecretory ribonuclease from human urine.// Eur. J. Biochem. 1990. V. 191. P. 523-529.

98. Gleich G, J., Loegering D. A., Bell M. P., Checkel J. L, Ackerman S. J., McKean D. J. Biochemical and functional similarities between human eosinophil-derived neurotoxin and eosinophil cationic protein: homology with ribonuclease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3146-3150.

99. Shapiro R., Vallee B. L. Interaction of human ribonuclease with placental ribonuclease inhibitor. // Biochemistry. 1991. V. 30. N. 8.~P. 2246-2255. ' >

100. Lawrence C. W„ Little P. A., Little B. W., Glushka J., van Halbeek H, AlhadeffJ. A. Human non-secretory ribonucleases. II. Structural characterisation of the N-glycans of the kidney, liver and spleen enzymes by NMR spectroscopy and electrospray mass spectrometry. // Glycobiology. 1993. V. 3. N. 3. P. 249-259.

101. Rosenberg H. F., Tenen D. G., Ackerman S. J. Molecular cloning of the human eosinophil-derived neurotoxin: a member of the ribonuclease gene family. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 4460-4464.

102. Sorrentino S„ Glitz D. G., Hamann K. J., Loegering D. A., Checkel J. L., Gleich G. J. Eosinophil-derived neurotoxin and human liver ribonuclease. Identity of structure and linkage of neurotoxicity to nuclease activity. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. N. 21. P. 14859-14865.

103. Barcer R. L„ Loegering D. A, Ten R. M., Hamann K. J., Pease R. L., Gleich G.J. Eosinophil cationic protein cDNA. Comparison with other toxic proteins and ribonucleases. // J. Immunol. 1989. V. 143. N. 3. P. 952-955.

104. Rosenberg H. F. Recombinant human eosinophil cationic protein. Ribonuclease activities not essential for cytotoxicity. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 7876-7881.

105. Young J. D.-E, Peterson C. G. B., Venge P., Cohn Z. A. Mechanism of membrane damage mediated by human eosinophil cationic protein. //Nature. 1986. V. 321. N. 6070. P. 613-616.

106. Shapiro R., Fett J. W., Strydom D. J., Vallee D. L. Isolation and characterisation of human colon carcinoma-secreted enzyme with pancreatic ribonuclease-like activity. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 7255-7264.

107. Rosenberg H. F., Dyer K. D. Human ribonuclease 4 (RNase 4): coding sequence, chromosomal localisation and identificationof two distinct transcripts in human somatic tissues. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. n. 21. P. 4290-4295.

108. Zhou H. M., Strydom D. J. The amino acid sequence of human ribonuclease 4, a highly conserved ribonuclease that cleaves specifically on the 3' side of uridine.// Eur. J. Biochem. 1993. V. 217. N. l.P. 401-410.

r

109. Hofsteenge J., Matthies R., Stone S. R. Primary structure of a ribonuclease from porcine liver, a new member of the ribonuclease superfamily. // Biochemistry. 1989. V. 28. N. 25. P. 98069813.

110. FettJ. W., Strydom D. J., Lobb R. R., Alderman E. M„ Bethune J. M., Riordan J. F, Vallee B. L. Isolation and characterisation of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 5480^5486.

111. Shapiro R., Strydom D. J., Olson K. A., Vallee B. L. Isolation jf angiogenin from normal human plasma. // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5141-5146.

112. Мертвецов H. П., Стефанович Л. E, Ангиогенин и механизм ангиогенеза. Новосибирск. Наука. 1997.

113. Saxena S. К., RybakS. М., Davey R. Т., Youle R. J., Ackerman Е. J. Angiogenin is cytotoxic, tRNA-specific ribonuclease in the RNase A superfamily. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. N. 30. P. 21982-21986.

114. Moroianu J., Riordan J. F. Nuclear translocation of angiogenin in proliferating endothelial cells is essential to its angiogenic activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. V. 91. N. 5. P. 1677-1681.

115. Rosenberg H. F., Dyer K. D. Molecular cloning and characterisation of a novel human ribonuclease (RNase k6): increasing diversity in the enlarging ribonuclease gene family. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. N. 18. P. 3507-3513.

116. Richards F. M„ Wickoff H. N. Bovine pancreatic ribonuclease. // The Ezymes. 1971. V. 4. P. 647-806.

117. Cuchillo С. M., Pares X., Guasch A., Barman Т., Trovers F., Nogues M. V. The role of 2',3'-cyclic phosphodiesters in the bovine pancreatic ribonuclease A catalysed cleavage of RNA: intermediates or products? // FEBS Letters. 1993. V. 333. N. 3. P. 207-210.

118. Llorens R., Arus C., Pares X., Cuchillo С. M. Chemical and computer graphics studies on the topography of ribonuclease A active site cleft. A model of the enzyme-pentanucleotide substrate complex. // Protein Eng. 1989. V. 2. N. 6. P. 417-429.

119. Blackburn P., Moore S. Pancreatic ribonuclease. // The Enzymes. 1982. V. 15. P. 317-433.

120. delCardayre S. В., Raines R. T. A residue to residue hydrogen bond mediates the nucleotide specificity of ribonuclease A. // J. Mol. Biol. 1995. V. 252. N. 3. P. 328-336.

121. Currant T. P., Shapiro R., Riordan J. F. Alteration of the enzymic specificity of human angiogenin by site-directed mutagenesis. // Biochemistry. 1993. V.33. P.2307-2313.

122. Rain G. £>., Gilliland T. Alteration of the enzymic specificity of the ribonuclease superfamily.// Biochem, J. 1995. V.310. P.1317-1319.

123. Mosimann S. C., Newton D. L., Youle R. J., James M. N. G. X-ray cristallographic structure of recombinant eosinophil-derived neurotoxin at 1. 83 A resolution. // J. Mol. Biol. 1996. V. 260. P. 540-552.

m

■tf '

124. Yakovlev G. I., Sorrentind S., Moiseyev G. P., Libonati M. Double-stranded RNA: the variables controlling its degradation by RNases. //Nucleic Acids Symp. Ser. 1995. V.33. P. 106-108.

125. Pares X., Nogues M. V, de Llorens R., Cuchillo C. M. Structure and function of ribonuclease A binding subsites. // Essays. Biochem. 1991. V. 26. P. 89-103.

126. Jermann T. M., Opitz J. G., Stackhous J., Benner S. A. Reconstructing the evolutionary history //Nature. 1995. V. 374.N. 6517. P.57-59.

127. Boix E., Nogues M. V., Shein C. H, Benner C. A., Cuchillo C. M. Reverse transfosforilation by ribonuclease A needs in an intact p2- binding site. Point mutations at Lys-7 and Arg-10 alter the catalytic properties of the enzyme. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 2529-2534.

128. Acharya K. R., Shapiro R., Allen S. C., Riordan J. F„ Vallee B. L. Crystal structure of human angiogenin reveals the structural basis for its functional divergence from ribonuclease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91 P. 2915-2919.

129. Russo N., Shapiro R., Acharya K. R., Riordan J. F., Vallee B. L. Role of glutamine-117 in the ribonucleolytic activity of human angiogenin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 1920-2924.

130. Harper J. W., Auld D. S., Riordan J. F, Vallee B. L. Enzymatically active angiogenin, ribonuclease A hybrids formed by peptide interchange. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 219226.

131. Devi A. S., Das M. R., Pandit M. W. Lactoferrin conteins structural motifs of ribonuclease. // Biochim. Biophys. Acta 1994. V.1205. P. 275-281.

132. Kobe B„ Deisenhofer J. A structural basis of the interactions between leucine-rich repeats and protein ligands. //Nature. 1995. V. 374. P. 183-186.

133. Aisen P., Listowsky I. Iron transport and storage protein. // Ann. Rev. Biochem. 1980. V. 49. P. 357-393.

134. Moguilevsky N., Retequi L., Mason P. Comparison of human lactoferrins from milk and human neutrophilic leukocytes. Relative molecular mass, isoelectric point, iron-binding properties and uptake by liver. // Biochem. J. 1985. V.229. P. 353-359.

135. Bellamy W., Takase M.,Yamauchi K., Wakabayashi H., Kawase K., Tomita M. Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1121. P. 130-136.

136. Zou S., Magura С. E., Hurley W. L. Heparin-binding properties of lactoferrin and lysozime. // Сотр. Biochem. Physiol. [ B]. 1992. V. 103. P. 889-895.

137. Zhao X.-Y., Hut cherts T. W. Proposed mechanisms for the involvment of lactoferrin in the hydrolysis of nucleic acids. // Adv. Exp. Med. Biol. 1994. V. 357. P. 271-278. <

138. Watanabe Т., Nagura H., Watanabe K., Brown W. B. The binding of human milk lactoferrin to immunoglobulin A. // FEBS Letters. 1984. V. 168. P. 203-207.

139. Berkel P. H, Geerts M. E„ VeenH. A., Kooiman P. M., Pieper F. R„ deBoer H. A., Nuijens J. H. Glicosilated and unglicosilated human lactoferrin both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial lipopolysaccharide, but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis. // Biochem. J. 1995. V. 312. P. 107-114.

140. Boxer L. A., Haak R. A., Yang H. H, Wolach J. В., Whitcomb J. A., Butterick C. J., Baehner R. L. Membrane-bound lactoferrin alters the surface properties of polymorphonuclear leukocytes. // J. Clin. Invest. 1982. V. 127. P.1211-1216.

141. Hammarstrom M. L., Mincheva-Nilson L., Hammarstrom S. Functional lactoferrin receptors on activated human lymphocytes. // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. V. 371. P. 47-53.

142. He J., Furmansky P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. //Nature. 1995. V.363. P. 721-724.

143. Ramaswamy H, Swamy Ch. V. В., Das M.R. Purification and characterisation of a high molecular weight ribonuclease from human milk. // J. Biol. Chem. 1993 V. 268. N. 6. P. 4181-4187.

144. Devi A. S., Das M. R., Pandit M. W. Lactoferrin contains structural motifs of ribonuclease. //' Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1205. P. 275-281.

145. Сидоров В. H., Щербаков Д. Ю., Рихтер В. А., Рабинов И. В. Способ получения меченных тритием органических соединений. А. С. N. 631943. 1990.

146. Зарытова В. Ф., Иванова Е. М., Романенко В. П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом. // Биоорг. химия. 1985. Т. 11. N.6. С. 815-820.

147. Бауск Е. В., Горн В. В., Лебедев В. В. Унифицированный способ триэфирного твердофазного синтеза 5'-фосфорилированных олигодезоксинуклеотидов на основе в-цианэтиловых п-хлорфениловых эфиров ^ацилнуклеозид-5'^-фосфатов. // // Биоорг. химия. 1985. Т. 11. N.6. С. 820-825.

148. Веньяминова А. Г., Горн В. В., Зенкова М. А., Комарова Н. И., Репкова М.И. Автоматический Н-фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов с использованием 2'-тетрагидропиранильной группы. // Биоорг. Хим. 1990. Т. 16.-С.941-950. " ------

149. Мудраковская А. В., Ямковой В. И. Препаративное получение гомоолигорибонуклеотидов, терминированных 5'-фосфатом. // Ферменты микроорганизмов и деградация биополимеров. М.: ВНИИСЭТИ. 1990. С. 199-206.

150. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Nucleic Acides. V. 1. N. Y.: CRC Press, 1975. P. 589.

151. Иммунологические методы. Под ред. Фриммеля. М.: Медицина. 1987. С. 406-407.

152.Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. С. 464-465.

153. Layne Е. Spectrophotometry and turbidimetric method for measuring proteins. // Method Enzymol. 1957. V. III. P. 447-454.

154. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V.227. P.680-685.

155. Merril C.R., Goldman, D., Van Keuren, M. L. // Electrophiresis. 1982. V. 33. P. 17-26.

156. Suelter С. H. A practical guide to enzymology. // Biochemistry: A series of monographs. 1985. P. 164-166.

157. Lee J. S., Dombroski D. S., Mosmann T. R. Specificity of autoimmune monoclonal Fab fragments binding to single-stranded deoxyribonucleic acid. // Biochemistry. 1982. V. 21. N. 20. P. 4940-4945.

158. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С. 132.

159.Комор Г. Е. Разработка способов получения гомополи- и олиго- дезоксинуклеотидов с использованием иммобилизованных ферментов.: Диссертация на соискание ученой степени к. б. н. Новосибирск. 1990.

160. Келети Т. П Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 1990. С. 131-135.

161. Rosental A. L., Lacks S. A. Nuclease detection in SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis. // Anal. Biochem. 1977. V. 80. N. 1. P. 76-90.

162. Sasso E. H., Silverman G. J., Mannik M. Human IgM molecules that bind staphylococcal protein A contain VHIIIH chains. // J. Immunol. 1989. V. 142. N. 8. P. 2778-2783.

163. Hillson J. L., Karr N. S., Oppliger 1. R., Mannik M, Sasso E. H. The structural basis of germline-encoded VH3 immunoglobulin binding to staphylococcal protein A. // J. Exp. Med. 1993. V. 178. N. 1. P. 331-336.

164. Hakoda M., Hayashimoto S., Yamanaka H, Terai C., Kamaiani N., Kashiwazaki S. Molecular basis for the interaction between human IgM and staphylococcal protein A. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1994. V. 72. N. 3. P. 394-401. i

165. Hakoda M., Kamatani N., Hayashimoto-Kurumada S., Silverman G. J., Yamanaka Я, Terai C., Kashiwazaki S. Differential binding avidities of human IgM for staphylococcal protein A derive from specific germ-line VH3 gene usage. // J. Immunol. 1996. V. 157. N. 7. P. 29762981.

166. Косик О. Г. Физико-химические особенности IgA, IgM и IgG сыворотки крови здоровых людей. // Иммунология 1991. N.l. С.21-23.

167. Власов А.В., Андриевская О.А., Канъшкова Т.Г., Барановский А.Г., Наумов В.А., Бреусов А.А., Жъеже Р., Бунева В.Н, Невинский Г.А. РНК-гидролизующие антитела из крови больных системной красной волчанкой. //Биохимия. 1997. Т. 62. С. 556-562.

168. Breslow R., Huang D.-L., Anslyn E. On the mechanism of action of ribonucleases: dinucleotid cleavage catalysed by imidazole and Zn2+. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. V. 86. P. 17461750.

169. Irie M., Mikami F., Monma K, Ohgi K, Watanabe H, Yamaguchi R., Nagase H. Kinetic studies on the cleavage of oligouridilic acids and poly U by bovine pancreatic ribonuclease A. // J. Biochem. 1984. V. 96. P. 89-96.

170. Абрамова 3. В., Дудкин С. М., Карабашян Л. В. Кинетическое изучение деполимеризации полиадениловой кислоты, катализируемой рибоуклеазой А. // Молекуляр. биол. 1974. Т. 8. Вып. 4. С. 501-506.

171. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир. 1987. С. 324.

172. Bait С. W., Houck J. С. The kinetics of ribonucleic acid depolimerization by ribonuclease. // Biochim. Biophys. Acta. 1963. V. 89. N. 1. P. 90-94.

173. Manheimer-Lory A., Irigoyen M, Gaynor В., Monhian R., Splaver A., Diamond B. Analysis of V kappa I and V lambda II light chain genes in the expressed B-cell repertoire. // Ann. N Y Acad. Sci. 1995. V. 764. P. 301-311.

17 4. Manheimer-Lory A., Monhian R., Splaver A.. Gaynor В., Diamond B. Analysis of V kappa 1 germline genes from an SLE patient and expressed autoantibodies. // Autoimmunity. 1995. V. 20. N. 4. P. 259-265.

1 75. Bensimon С., Chastagner P., Zouali M. Human lupus anti-DNA autoantibodies undergo essentially primary V kappa gene rearrangements. // EMBO 1994. V. 13. N. 13. P. 2951-2962.

176. Rosental A. L., Lacks S. A. Nuclease detection in SDS-poIyacrylamicte gelelectrophoresis. 11 Anal. Biochem. 1977. V. 80. N. 1. P. 76-90.

177. Рыкова E. Ю. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. Изучение условий образования и свойств олигонуклеотид-белковых комплексов .: Диссертация на соискание ученой степени к. б. н. Новосибирск. 1994.

178. Иммуногенетика человека. М.: Мир, 1994. Т. 1.

179. Diamond В., Scharff М. D. Somatic mutation of the Т15 heavy chain gives rise to an antibody with autoantibody specificity. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984. V. 81. N. 18. P. 5841-5844.

180. van Es J. H., Gmelig-Meyling F. H., van de Akker W. R., Aanstoot H., Derksen R. #., Logtenberg T. Somatic mutations in the variable regions of human IgG anti- double-stranded DNA autoantibody suggest a role for antigen in the induction of systemic lupus erythematosus. // J. Exp. Med. 1991. V. 173. N. 2. P. 461-470.

181. Naparstec Y, Andre-Schwartz J., Manser Т., Wysocki L. J., Breitman L., Stollar B. D., Gefter M., Schwartz R. S.A single germline VH gene segment of normal A/J mice encodes autoantibodies characteristic of systemic lupus erythematosus. // J. Exp. Med. 1986. V. 164. N. 2. P. 614-626.

182.van Es J. H„ Aanstoot #., Gmelig-Meyling F. H, Derksen R. #., Logtenberg T. A human systemic lupus erythematosus-related anti-cardiolipin/single-stranded DNA autoantibody is encoded somatically mutated variant of the developmentally restricted VH gene. // J. Immunol. 1992. V. 149. N. 6. P. 2234-2240.

183. Taki S., Hirose S., Kinoshita K., Nishimura H., Shimamura Т., Hamuro J., Shirai T. Somatically mutated IgG anti-DNA antibody clonally related to germ-line encoded IgM anti-DNA antibody. // Eur. J. Immunol. 1992. V. 22. N. 4. P. 987-992.

184. Hirose S., Wakiya M., Kawano-Nishi Yi. J., Sanokawa R., Taki S., Shimamura Т., Tsurui H., Nishimura H. Somatic diversification and affinity maturation of IgM and IgG anti-DNA antibodies in marine lupus. // Eur. J. Immunol. 1993. V. 23. N. 11. P. 2813-2820.

/85. Demaison C, Ravirajan C. T., Isenberg D. A., Zouali M. Analysis of variable region genes encoding anti-Sm and anti-cardiolipin antibodies from a systemic lupus erythematosus patient.

// Immunology. 1995. V. 86. N. 3; P. 487-494. -------------------

186. Harada T., Suzuki N.. Mizuhima Y., Sakane T. Usage of novel class of germ-line Ig variable region gene for cationic anti-DNA autoantibodies in human lupus nephritis and its role for the development of the disease. // J. Immunol. 1994. V. 15B. N. 10. P. 4807-4815.