Дуплекс - специфическая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Щеглов, Александр Сергеевич

• Щеглов, Александр Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Щеглов, Александр Сергеевич

1. Введение стр.3.

2. Обзор литературы: «Неспецифические РНК, ДНК - эндонуклеазы» стр. 4.

2.1 Нуклеазы, их место в классификации ферментов стр. 4.

2.2 Распространенность неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 6.

2.3 Физико-химические свойства неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 8.

2.4 Каталитические особенности неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 11.

2.5 Субстратная специфичность неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 14.

2.6 Первичная структура неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 19.

2.7 Пространственная структура неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 27.

2.8 Биологическая роль неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 30.

2.9 Применение неспецифических РНК, ДНК эндонуклеаз стр. 31.

3. Материалы и методы стр. 32.

4. Результаты и обсуждение стр. 43.

5. Выводы стр. 67.

6. Благодарности стр. 68.

7. Список использованных сокращений стр. 69.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дуплекс - специфическая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба»

Значение нуклеаз для современной биологии сложно переоценить. С одной стороны, нуклеазы представляют собой очень интересный и важный объект исследования. Любой живой организм содержит несколько разных нуклеаз, играющих существенную роль в его жизни. В настоящее время известно множество типов нуклеаз от высокоспецифичных эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последовательности ДНК, до ДНК, РНК-неспецифичных экзо- эндо- нуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но и нуклеотид-три-фосфаты. Ферменты этой группы являются ключевыми участниками таких биологически важных процессов как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а так же пищеварение. Ученые, изучающие любой из перечисленных процессов, уделяют немало внимания различным нуклеазам. Но, помимо этого, изучение самих нуклеаз, их молекулярной организации, механизмов взаимодействия с субстратом, основ специфичности очень интересная научная работа, С другой стороны, именно использование нуклеаз произвело настоящую революцию в методах молекулярной биологии. Молекулярное клонирование, позволивщее на много порядков увеличить нащи знания о живой природе, основано на применении высоко специфичных нуклеаз эндо пуклеаз рестрикции. Так же на основе использования различных нуклеаз были созданы щироко распространенные изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и другие. Но, при этом, новые нуклеазы с новыми свойствами могут служить основой для создания новых методов молекулярной биологии. Поэтому поиск и изучение новых нуклеаз представляет собой научно интересное и практически значимое исследование. Данная работа посвящена изучению нуклеазы из гепатопанкреаса камчатского краба (дуплекс специфичной нуклеазы, или ДСН). Нами был клонирован ген, кодирующий этот фермент, разработан препаративный метод вьщеления пативного белка в чистом виде, и охарактеризованы его свойства. Наиболее интересными из оных являются термостабильность и высокая оптимальная температура катализа, а так же субстратная специфичность ДСН гидролизует только двух цепочечную ДНК или цепь ДНК в ДНК-РНК гибридах. Эти свойства делают возможным разработку уникальных молекулярнобиологических методов на основе ДСН. Кроме того, первичная структура ДСН гомологична первичной структуре ДНК, РНК неспецифичпых эндонуклеаз. Ферменты этой группы гидролизуют как РНК, так и ДНК, как дву, так и одно цепочечную. Нами впервые было показапо, что среди ферментов этого подсемейства возможны исключения высокоснецифичные нуклеазы.Обзор литературы: «Неспецифические РНК, ДНК эидонуклеазы». 2.1 Нуклеазы и их место в классификации ферментов. Во всех живых организмах генетическая информация хранится и реализуется посредством нуклеиновых кислот. Все живые организмы содержат набор ферментов, осуществляющих синтез, модификацию, репарацию и деградацию нуклеиновых кислот. Зачастую один фермент может осуществлять несколько ферментативных реакций как, например, и синтез, и деградацию ДНК. Среди этого разнообразия выделяют нуклеазы ферменты, гидролизующие фосфодиэфирные связи между сахарными остатками нуклеотидов нуклеиновых кислот. Нуклеазы щироко представлены в различных живых организмах и принимают участие в таких процессах как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а так же пищеварение. На основе использования различных н)тслеаз (прежде всего эндонуклеаз рестрикции) были созданы щироко распространенные методы молекулярного клонирования, изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и другие. Современная классификация учитываем следующие параметры нуклеаз (1,2,3; 4): 1. Тип субстрата ДНК или РНК; 2. Положение атакуемой нуклеотидной связи крайнее в цепи ДНК (РНК) (экзонуклеазы) или наоборот (эндонуклеазы); 3. Тип продукта реакции мононуклеотиды или олигонуклеотиды; 4. Тип гидролизуемой связи между 5/ или 3/ атомом сахарного остатка и фосфатом. С учетом всех этих параметров схема классификации нуклеаз вьп-лядит следующим образом (5; 4): Нуклеазы ДНК, РНК специфичные нуклеазы Рибонуклеазы (РНКазы) Экзорибонуклеазы Эндорибонуклеазы ДНК, РНК неспецифичные нуклеазы Дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) Экзодезоксирибонуклеазы Эндодезоксирибонуклеазы Эндонуклеазы рестрикции Эндонуклеазы хоуминга Экзонуклеазы Эндонуклеазы Эндо-экзонуклеазы Дезоксирибонуклеазы, специфичные к поврежденной ДНК Рис. 1. Схема классификации нуклеаз (4, 5).Danio poly A -specific RNase Bovin pancreatic RNase Danio caspase-activated DNase Drep4 Drosophila Tosca Drosophila Caenorhabditis exonucleasel Bovin DNasel Danio "staphyloooccal" nucleas Caenorhabditis "staphylococcal Caenoriiabditis RNaselli Caenorhabditis oligoribonuclea Danio small fragment nuclease Drosophiia oligoribonuclease Bovin endoG Caenorhabditis EndoG Drosophila Endoribonuclease Dc Caenorhabditis Endoribonucleas Caenoriiabditis excinuclease AB Bovin AP endonucleasei Danio APEX nuclease Caenorhabditis NUC-1 Bovin DNaseli alpha Caenorhabditis Cell death-rela Caenorhabditis endonuclease 1 1 Caenorhabditis exonuclease mut Drosophila RNaseZ Caenorhabditis RNaseZ Drosophila RNaseHI Caenorhabditis RNse HI Рисунок 2. Филогенетическое дерево известных нуклеаз быка, дрозофиллы, нематоды и зебрафиши (аминокислотные последовательности взяты из электронной базы данных Национального Института Здоровья, США; анализ структуры и построение дерева произведены при помощи программы ClustlX).Происхождение различных типов нуклеаз не ясно. Как нравило, нуклеазы одного тина из филогенетически далеких видов похожи друг на друга гораздо больше, чем нуклеазы разных типов одного организма (см. рис 2). Поэтому вероятно, что различные нуклеазы либо возникли независимо, либо эволюционируют независимо в течение очень длительного периода. С другой стороны, на основании сходства строения активных центров некоторые исследователи вьщеляют суперсемейство 1313а-Ме, куда относятся ДНК, РНК неспецифичные нуклеазы, нохожие на нуклеазу Serratia, эндонуклеазные (ДНКазные) домены колицинов, и высокоспецифичные нуклеазы хоуминга, содержащие H-N-H и His-Cys мотивы в активных центрах (6,7). Хотя, например, H-N-H домен колицина Е9, His-Cys участок эндонуклеазы хоуминга 1-Рро1 и активный центр нуклеазы Serratia являются структурными гомологами (6, 8), вопрос об эволюционных связях между этими ферментами остается открытым. Большая часть ДНК, РНК неспецифичных нуклеаз может бьггь

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Щеглов, Александр Сергеевич

5. Выводы:

1. Клонирован ген и определена аминокислотная последовательность новой нуклеазы из гепатопанкреаса камчатского краба.

2. Разработан препаративный метод выделения этого фермента из коммерчески доступного препарата.

3. Охарактеризованны физико-химические и каталитические свойства исследуемого белка.

4. Показана его уникальная субстратная специфичность - гидролиз исключительно двуцепочечного ДНК содержащего субстрата.

6. Благодарности.

В заключение я хотел бы поблагодарить:

Г.Н. Руденскую и Л.Л. Завалову за ценные консультации при разработке метода выделения ДСН;

В. Кожемяко за предоставленный «ацетоновый порошок» гепатопанкреаса камчатского краба;

Д. Ребрикова за помощь в клонировании кДНК копии гена ДСН.

7. Список использованных сокращений.

А.К.- аминокислота

ДЕАЕ- диэтил-амино-этил

ДМФА - диметилформамид

ДСН - дуплекс - специфичная нуклеаза

ДТТ- дитиотрейтол o.e.- оптических единиц

ПААГ- полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль трис+- Трис(гидроксиметил)метиламин, цвиттерионный буфер

ТХУ - три хлор уксусная кислота

ЭДТА- этилендиаминтетраацетат

Ас- ацетил

Атр - ампицилин

СМ- карбокси-метил

Cm - хлорамфеникол

Em - эритромицин

IPTG - изопропил ß - D - тио -галактопиранозид kcat -константа каталитическая

Км -константа Михаэлиса

Km - канамицин pl- изоэлектрическая точка рКа -константа ионизации

SDS - додецил сульфат натрия

Хаа- любой аминокислотный остаток

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-р - D - галактопиранозид

Заключение.

В результате данной работы мы детально охарактеризовали новый фермент - ДСН. Так же мы клонировали ее ген и разработали препаративный метод получения этого белка в чистом виде.

ДСН принадлежит к подробно изученному семейству РНК, ДНК неспецифических эндонуклеаз и по первичной структуре очень похожа на нуклеазу креветки. Однако ее свойства, а именно субстратная специфичность, радикально отличают ДСН от ранее описанных нуклеаз этой группы. Способность гидролизовать только двуцепочечную ДНК, независимо от нуклеотидной последовательности, и оставлять интактной одноцепочечную ДНК и любую РНК, является уникальной. Более того, наличие у ДСН аминокислот, типичных для активного центра неспецифичных нуклеаз, делает молекулярный механизм действия нашего фермента вдвойне интересным и требующим дальнейшего изучения. С другой стороны, ДСН сочетает высокую специфичность с высокой стабильностью. Это сделало возможным ее эффективное использование в молекулярной биологии. В нашей лаборатории были разработаны оригинальный метод детекции точечных нуклеотидных замен в геноме (107), и метод нормализации библиотек полноразмерных кДНК (108), основанные на применении ДСН. Разработанный метод нормализации библиотек полноразмерных кДНК не имеет кокурентноспособных аналогов и широко используется как моими коллегами, так и учеными из других российских и зарубежных лабораторий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Щеглов, Александр Сергеевич, 2005 год

1. Laskowski, М. (1959) Enzymes hydrolyzing DNA. Ann. N.Y. Acad. Sci. 81,776-783.

2. Bernard, E.A. (1969) Ribonucleases. Annu. Rev. Biochem. 38, 677- 682.

3. Laskowski, Sr. M. (1982) Nucleases: historical perspectives. In: Nucleases (Linn, S. and Roberts, R.J., Eds.), pp. 1-21. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

4. Rangarajan ES, Shankar V. (2001) Sugar non-specific endonucleases. FEMS Microbiol Rev. 2001 Dec;25(5):583-613.

5. Linn, S. (1982) Tabulation of some well-characterized enzymes with deoxyribonuclease activity. In: Nucleases (Linn, S. and Roberts, R.J., Eds.), pp. 341-357. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork.

6. Kuhlmann, U.C., Moore, C.R., James, R., Kleanthous, C. and Hemmings, A.M. (1999) Structural parsimony in endonuclease active sites: should the number of homing endonuclease families be redefined? FEBS Lett. 463,1-2.

7. Chevalier, В., Stoddart, B. (2001) Homing endonucleases: structural and functional insight into catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res. vol. 29, No 18,3757 3774.

8. Fraser, M.J. and Low, R.L. (1993) Fungal and mitochondrial nucleases. In: Nucleases, 2nd edn. (Linn, S.M., Lloyd, R.S. and Roberts, R.J., Eds.), pp. 171-207. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

9. Cunningham, L., Catlin, B.W. and Privat de Gar'lhe, M. (1956) A deoxyribonuclease of Micrococcus pyogenes. J. Am. Chem. Soc. 78,4642-4645.

10. Filimonova, M.N., Dementyev, A.A., Leshchinskaya, I.B., Bakulina, G.Yu. and Shlyapnikov, S.V. (1991) Isolation and characterization of extracellular nuclease of Serratia marcescens. Biokhimiya 50, 508-520.

11. Eaves, G.N. and Je.ries, C.D. (1963) Isolation and properties of an exocellular nuclease of Serratia marcescens. J. Bacteriol. 85,273- 278.

12. Kanamori, N., Sakabe, K. and Okazaki, R. (1973) Extracellular nucleases of Bacillus subtilis. Purification and properties. Biochim. Biophys. Acta 335,155-172.

13. Chow, T.Y.-K. and Resnick, M.A. (1987) Purification and characterization of an endo-exonuclease from Saccharomyces cerevisiae that is influenced by the RAD52 gene. J. Biol. Chem. 262,17659-17667.

14. Muro-Pastor, A.M., Flores, E., Herrero, A. and Wolk, C.P. (1992) Identification, genetic analysis and characterization of a sugar-nonspecific nuclease from the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Mol. Microbiol. 6,3021-3030.

15. Chen, L.-Y., Ho, H.-C., Tsai, Y.-C. and Liao, T.-H. (1993) Deoxyribonuclease of Syncephalastrum racemosum enzymatic properties and molecular structure. Arch. Biochem. Biophys. 303,51-56.

16. Ho, H.-C., Shiau, P.-F., Liu, F.-C., Chung, J.-G. and Chen, L.-Y. (1998) Purification, characterization and complete amino acid sequence of nuclease C from Cunninghamella echinulata var. echinulata. Eur. J. Biochem. 256,112-118.

17. Nicieza, R.G., Huergo, J., Connolly, B.A. and Sanchez, J. (1999) Purification, characterization and role of nucleases and serine proteases in Streptomyces differentiation. J. Biol. Chem. 274, 20366-20375.

18. Rangarajan, E. and Shankar, V. (1999) Extracellular nuclease from Rhizopus stolonifer: purification and characteristics of single strand preferential deoxyribonuclease activity. Biochim. Biophys. Acta 1473,293-304.

19. Dake, E., Hofmann, T.J., Mclntire, S., Hudson, A. and Zassenhaus, H.P. (1988) Purification and properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 263,7691-7702.

20. Chow, T.Y.-K. and Fraser, M.J. (1983) Purification and properties of single strand DNA-binding endo-exonuclease of Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 258,12010-12018.

21. Koa, H., Fraser, M.J. and Kafer, E. (1990) Endo-exonuclease of Aspergillus nidulans. Biochem. Cell Biol. 68,387-392.

22. Martin, C.E. and Wagner, R.P. (1975) Two forms of a mitochondrial endonuclease in Neurospora crassa. Can. J. Biochem. 53, 823-825.

23. Matousek, J. and Tupy, J. (1984) Purification and properties of extracellular nuclease from tobacco pollen. Biol. Plant 26,62-73.

24. Vischi, M. and Marchetti, S. (1997) Strong extracellular nuclease activity displayed by barley (Hordeum vulgare L.) uninucleate microspores. Theor. Appl. Genet. 95,185-190.

25. Siwecka, M.A., Rytel, M. and Szarkowski, J.W. (1989) Purification and characterization of nuclease I associated with rye germ ribosomes. Acta Biochim. Pol. 36,45-62.

26. Siwecka, M.A. (1997) Purification and some properties of a novel dsRNA degrading nuclease bound to rye germ ribosomes. Acta Biochim. Pol. 44,61-68.

27. Kuligowska, E., Klarkowska, D. and Szarkowski, J.W. (1988) Purification and properties of endonuclease from wheat chloroplasts, specific for single-stranded DNA. Phytochemistry 27,12751279.

28. Holstein, S.E.H., Kobert, B., Hillmer, S., Brown, P.H., Ho, T.-H.D. and Robinson, D.G. (1991) Subcellular localization of nuclease in barley aleurone. Physiol. Plant 83,255-265.

29. Cordis, G.A., Goldblatt, P.-J. and Deutscher, M. (1975) Purification and characterization of a major endonuclease from rat liver nuclei. Biochemistry 14,2596-2603.

30. Chou, M.-Y. and Liao, T.-H. (1990) Shrimp hepatopancreatic deoxyribonuclease purification and characterization as well as comparison with bovine pancreatic deoxyribonuclease. Biochim. Biophys. Acta 1036,95-100.

31. Harosh, I., Mezzina, M., Harris, P.V. and Boyd, J.B. (1992) Purification and characterization of a mitochondrial endonuclease from Drosophila melanogaster embryos. Eur. J. Biochem. 210, 455-460.

32. Cote, J. and Ruiz-Carillo, A. (1993) Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G. Science 261,765-769.

33. Stevens, A. and Hilmoe, R.J. (1960) Studies on a nuclease from Azotobacter agilis. Isolation and mode of action. J. Biol. Chem. 235, 3016-3022.

34. Yonemura, K., Matsumoto, K. and Maeda, H. (1983) Isolation and characterization of nucleases from a clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958. J. Biochem. (Tokyo) 93, 12871295.

35. Linn, S. and Lehman, I.R. (1966) An endonuclease from mitochondria of Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 241,2694-2699.

36. Ikeda, S., Maeda, N., Ohshima, T. and Takata, N. (1996) Identification and characterization of a mitochondrial endonuclease from yeast, Schizosaccharomyces pombe. Biochem. Mol. Biol. Int. 40, 1017-1024.

37. Iwasaki, M., Igarashi, H. and Yutsudo, T. (1997) Mitogenic factor secreted by Streptococcus pyogenes is a heat-stable nuclease requiring Hisl22 for activity. Microbiology 143,2449-2455.

38. Mittra, B., Sadhukhan, P.K. and Majumder, H.K. (1998) A novel endonuclease from kinetoplastid hemoflagellated protozoan parasite Leishmania. J. Biochem. (Tokyo) 124,1198-1205.

39. Nomura, A., Suno, M. and Mizuno, Y. (1971) Studies on 3P-nucleotidase-nuclease from potato tubers. Purification and some properties of the enzyme. J. Biochem. (Tokyo) 70, 993-1001.

40. Imagawa, H., Toryu, H., Ozawa, T. and Takino, Y. (1982) Purification and characterization of nucleases from tea leaves. Agric. Biol. Chem. 46,1261-1269.

41. Ruiz-Carrillo, A. and Renaud, J. (1987) Endonuclease G: a (dG)nU(dC)n-specific DNase from higher eukaryotes. EMBO J. 6,401-407.

42. Shuai, K„ Das Gupta, C.K., Hawley, R.S., Chase, J.W., Stone, K.L. and Williams, K.R. (1992) Purification and characterization of an endo-exonuclease from adult flies of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 20,1379-1385.

43. Cotec, J., Renaud, J. and Ruiz-Carillo, A. (1989) Recognition of (dG)n.(dC)n sequences by endonuclease G. Characterization of the calf thymus nuclease. J. Biol. Chem. 264, 3301-3310.

44. Miller, M. and Krause, K. (1996) Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis. Protein Sci. 5,24-33.

45. Franke, I., Meiss, G., Blecher, D., Gimadutdinow, O., Urbanke, C. and Pingoud, A. (1998) Genetic engineering, production and characterisation of monomelic variants of the dimeric Serratia marcescens endonuclease. FEBS Lett. 425, 517-522.

46. Ball, T.K., Suh, Y. and Benedik, M.J. (1992) Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity. Nucleic Acids Res. 20,4971-4974.

47. Franke, I., Meiss, G. and Pingoud, A. (1999) On the advantage of being a dimer, a case study using the dimeric Serratia nuclease and the monomelic nuclease from Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Biol. Chem. 274, 825-832.

48. Kwong, S. and Fraser, M.J. (1978) Neurospora crassa endoexonuclease and its inactive (precursor?) form. Can. J. Biochem. 56,370-377.

49. Fraser, M.J., Chow, T.Y.-K., Cohen, H. and Koa, H. (1986) An immunochemical study of Neurospora crassa nucleases. Biochem. Cell Biol. 64, 106-116.

50. Brown, P.H. and Ho, T.-H.D. (1987) Biochemical properties and hormonal regulation of barley nuclease. Eur. J. Biochem. 168,357-364.

51. Benedik, M.J. and Strych, U. (1998) Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiol. Lett. 165,1-13.

52. Pedersen, J., Andersen, J., Roepstor., P., Filimonova, M. and Biedermann, K. (1993) Characterization of natural and recombinant nuclease isoforms by electrospray mass spectrometry. Biotechnol. Appl. Biochem. 18,389-399.

53. Wei, C.-F., Alianell, G.A., Bencen, G.H. and Gray Jr., H.B. (1983) Isolation and comparison of two molecular species of the BAL 31 nuclease from Alteromonas espejiana with distinct kinetic properties. J. Biol. Chem. 258, 13506-13512.

54. Rangarajan, E.S. and Shankar, V. (2001) Nuclease Rsn from Rhizopus stolonifer: characteristics of associated adenine specific - ribonuclease activity. J. Biochem. Mol. Biol. Biophys. 5,99-108.

55. Cuatrecasas, P., Fuchs, S. and Anfinsen, C.B. (1967) Catalytic properties and specificity of the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 242,1541-1547.

56. Tucker, P.W., Hazen Jr., E.E. and Cotton, F.A. (1978) Staphylococcal nuclease reviewed: A prototypic study in contemporary enzymology. I. Isolation, physical and enzymatic properties. Mol. Cell. Biochem. 22,67-77.

57. Fraser, M.J. (1980) Purification and properties of Neurospora crassa endo-exonuclease, an enzyme which can be converted to a singlestrand specific endonuclease. Methods Enzymol. 65, 255-263.

58. Filimonova, M.N., Balaban, N.P., Sharipova, F.R. and Leshchinskaya, I.B. (1980) Production of Serratia marcescens nuclease in a homogeneous state and study of the physicochemical properties of the enzyme. Biokhimiya 45,2097-2103.

59. Shishido, K. (1985) Effect of spermine on cleavage of plasmid DNA by nuclease SI and BAL 31. Biochim. Biophys. Acta 826,147-150.

60. Frank, J.J., Hawk, J.A. and Levy, C.C. (1975) Polyamine activation of staphylococcal nuclease. Biochim. Biophys. Acta 390, 117-124.

61. Levy, C.C., Hieter, P.A. and LeGendre, S.M. (1974) Evidence for the direct binding of polyamines to a ribonuclease that hydrolyzes ribonucleic acid at uridylic acid residues. J. Biol. Chem. 249,6762-6769.

62. Filimonova, M.N., Baratova, L.A., Vospel'nikova, M.D., Zheltova, A.O. and Leshchinskaya, I.B. (1981) Characterization of endonuclease from Serratia marcescens. Biokhimiya 46,1660-1666.

63. Suno, M., Nomura, A. and Mizuno, Y. (1973) Studies on 3P-nucleotidase-nuclease from potato tubers. Further studies on substrate specificity and mode of action. J. Biochem. (Tokyo) 73, 12911297.

64. Hatahet, Z. and Fraser, M.J. (1989) Specific inhibitors of Neurospora endo-exonuclease. Biochem. Cell Biol. 67, 632-641.

65. Meiss, G., Franke, I., Gimadutdinow, O., Urbanke, C. and Pingoud, A. (1998) Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA. Eur. J. Biochem. 251,924-934.

66. Nestle, M. and Roberts, W.K. (1969) An extracellular nuclease from Serratia marcescens. Purification and some properties of the enzyme. J. Biol. Chem. 244, 5213-5218.

67. Nestle, M. and Roberts, W.K. (1969) An extracellular nuclease from Serratia marcescens. Specificity of the enzyme. J. Biol. Chem. 244, 5219-5225.

68. Friedho., P., Meiss, G., Kolmes, B., Pieper, U., Gimadutdinow, O., Urbanke, C. and Pingoud, A. (1996) Kinetic analysis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia nuclease. Eur. J. Biochem. 241,572-580.

69. Stevens, A. and Hilmoe, RJ. (1960) Studies on a nuclease from Azotobacter agilis. Hydrolysis of ribonucleic and deoxyribonucleic acid. J. Biol. Chem. 235,3023-3027.

70. Pritchard, A.E., Kowalski, D. and Laskowski Sr., M. (1977) An endonuclease activity of venom phosphodiesterase specific for single-stranded and superhelical DNA. J. Biol. Chem. 252, 8652-8659.

71. Kanamori, N., Cozzarelli, N.R. and Okazaki, R. (1974) Extracellular nucleases of Bacillus subtilis. The nucleases as 5P-end-group reagents. Biochim. Biophys. Acta 335,173-184.

72. Meiss, G., Friedho., P., Hahn, M., Gimadutdinow, O. and Pingoud, A. (1995) Sequence preferences in cleavage of dsDNA and ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease. Biochemistry 34,11979-11988.

73. Taniuchi, H., Anfinsen, C.B. and Sodja, A. (1967) The amino acid sequence of an extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 242,4752-4758.

74. Wang, W.-Y., Liaw, S.-H. and Liao, T.-H. (2000) Cloning and characterization of a novel nuclease from shrimp hepatopancreas, and prediction of its active site. Biochem. J. 346,799-804.

75. Ho, H.-C. and Liao, T.-H. (1999) Protein structure and gene cloning of Syncephalastrum racemosum nuclease. Biochem. J. 339,261-267.

76. Miller, M.D., Tanner, J., Alpaugh, M., Benedik, M.J. and Krause, K.L. (1994) 2.1 A structure of Serratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA. Nat. Struct. Biol. 1,461-468.

77. Lunin, V.Y., Levdikov, V.M., Shlyapnikov, S.V., Blagova, E.V., Lunin, V.V., Wilson, K.S. and Mikhailov, A.M. (1997) Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7 A resolution and mechanism of its action. FEBS Lett. 412,217-222.

78. Friedho., P., Kolmes, B., Gimadutdinow, O., Wende, W., Krause, K.L. and Pingoud, A. (1996) Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 24,2632-2639.

79. Miller, M.D., Cai, J. and Krause, K.L. (1999) The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster. J. Mol. Biol. 288,975-987.

80. Fräser, M.J. (1979) Alkaline deoxyribonucleases released from Neurospora crassa mycelia: two activities not released by mutants with multiple sensitivities to mutagens. Nucleic Acids Res. 6, 231-246.

81. J Mol Biol. 2004 Apr 23;338(2):217-28.

82. Compton, M.M. and Cidlowski, J.A. (1987) Identification of a glucocorticoid- induced nuclease in thymocytes. A potential 'lysis gene' product. J. Biol. Chem. 262, 8288-8292.

83. Gaido, M.L. and Cidlowski, J.A. (1991) Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes. NUC18 is not histone H2B. J. Biol. Chem. 266,18580-18585.

84. Matousek, J., Trnena, L., Oberhauser, R., Lichtenstein, C.P. and Nellen, W. (1994) dsRNA degrading nucleases are differentially expressed in tobacco anthers. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375, 261- 269.

85. Shapiro, J., Machattie, L., Eron, L., Ihler, G., Ippen, K. and Beckwith, J. (1969) Isolation of pure lac operon DNA. Nature (London) 224,768-774.

86. Marks, A. and Spencer, J.H. (1970) Isolation of Escherichia coli transfer RNA hybrids. J. Mol. Biol. 51,115-130.

87. Joseph, D.R. and Stafford, D.W. (1976) Purification of sea urchin ribosomal RNA genes with a single-strand specific nuclease. Biochim. Biophys. Acta 418, 167-174.

88. Bartok, K., Fraser, M.J. and Fareed, G.C. (1974) Detection of sequence heterology by use of Neurospora crassa nucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 60, 507-514.

89. Kacian, D.L. and Spiegelman, S. (1974) Use of micrococcal nuclease to monitor hybridization reactions with DNA. Anal. Biochem. 58, 534-540.

90. Fox, K.R. and Waring, M.J. (1987) The use of micrococcal nuclease as a probe for drug-binding sites on DNA. Biochim. Biophys. Acta 909,145-155.

91. Krupp, G. and Gross, H.J. (1979) Rapid RNA sequencing: nucleases from Staphylococcus aureus and Neurospora crassa discriminate between uridine and cytidine. Nucleic Acids Res. 6, 3481-3490.

92. Przykorska, A., Kuligowska, E., Gerhart, E., Wagner, H., Szarkowksi, J.W. and Nordstrom, K. (1989) Two plant nucleases as tools for structural analysis of RNA. Biochemistry 28, 15851588.

93. Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.

94. Menzorova N.I., Markova A.V., Rasskazov V.A. (1994) Highly stable Ca+2, Mg+2 -dependent Dnase from crab hepatopancreas. Biochemistry (Moscow), Vol. 59, No 3,1994.