Получение и характеристика клонотеки к ДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.30, кандидат биологических наук Козлов, Константин Андреевич

• Козлов, Константин Андреевич
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козлов, Константин Андреевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Структура и макромолекулярный состав линзы

глаза позвоночных

1.1. Клеточное строение хрусталика и общая характеристика его белков

I.I.I. Структурные белки хрусталика

1.2. Тканеспецифичные белки хрусталика и кодирующие

их полинуклеотидные последовательности

1.2.1. Альфа-кристаллины

1.2.2. Структура альфа-кристаллиновых мРНК

1.2.3. Клонирование кодирующих последовательностей альфа-кристаллинов

1.2.4. Гамма-кристаллины

1.2.5. Структура гамма-кристаллиновых мРНК

и их клонирование

1.2.6. Дельта-кристаллины

1.2.7. Динамика синтеза мРНК дельта-кристаллинов

в ходе дифференцировки хрусталика

1.2.8. Клонирование дельта-кристаллиновых мРНК

1.2.9. Другие таксон-специфичные кристаллнны

Молекулярное клонирование комплементарной ДНК

11.1. Физико-химические свойства нативных бета-кристаллинов

11.2. Свойства и структура бета-кристаллиновых субъвдинщ

11.3. Клонирование и анализ кодирующих последовательностей бета-кристаллинов

11.3.1. Основные характеристики бета-кристаллиновых мРНК

11.3.2. Клонирование и анализ бета-кристаллиновых последовательностей

11.4. Молекулярное клонирование комплементарной ДНК

11.4.1. Векторы клонирования

11.4.2. Стратегии клонирования кДНК

11.4.3. Методы клонирования кДНК

11.5. Заключение

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Материалы

II. Методы

11.1. Получение хрусталиков лягушки

11.2. Выделение суммарной РНК из хрусталиков лягушки

11.3. Выделение поли(А)РНК хроматографией

на олиго(дТ)-целлюлозе

11.4. Синтез комплементарной цепи ДНК

11.5. Синтез второй цепи кДНК

11.6. Обработка двуспиральной кДНК нуклеазой В1

11.7. Синтез дГ- и дЦ-коннекторов

11.8. Отжиг дскДНК и вектора pBR 322

Н.Э. Трансформация бактериальных клеток

11.10. Лизис бактериальных колоний

на нитроцеллюлозных фильтрах

11.11. Гибридизация колоний

11.12. Радиоавтография фильтров

11.13. Выделение плазмидной ДНК с помощью ДОН-лизиса

11.14. Выделение плазмидной ДНЕ быстрым фенольным методом

11.15. Выделение плазмидной ДНК щелочным методом

11.16. Препаративное выделение плазмидной ДНК неионно-детергентным лизисом

11.17. Центрифугирование плазмидной ДНК в равновесном градиенте хлористого цезия с бромистым этидием

11.18. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК

11.19. Электрофоретический анализ ДНК в агарозных

гелях и радиоавтография

11.20. Электрофоретический анализ рестрицированной

ДНК в полиакриламидных гелях

11.21. Электрофоретический анализ одаоцепочечной кДНК

в денатурирующем полиакриламидном геле

11.22. Иммобилизация плазмидной ДНК

на нитроцеллюлозных мембранах

11.23. Гибридизация поли(А)РНК с иммобилизованной плазмидной ДНК

11.24. Трансляция элюированной поли(А)РНК

в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика

11.25. Диск-электрофорез продуктов трансляции

в ПАА-гелях с ДОН

11.26. Флуорографиче ский анализ продуктов трансляции после разделения в ПМ-гелях с ДСН

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I. Ферментативный синтез двуспиральной кДНК

на матрице поли(А)РНК хрусталика лягушки

II. Ферментативный синтез дГ- и дЦ-коннекторов

III. Клонирование дскДНК в векторе pBR 322

характеристика рекомбинантных клонов

V. Характеристика клонотеки редкощепящими эндо-

нуклеазами и методом гибридизации/трансляции . 105 VI. Идентификация рекомбинантов, кодирующих

полипептиды бета-кристаллинов хрусталика

кодирующих бета-кристаллины лягушки

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика клонотеки к ДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов»

ВВЕДЕНИЕ

Все вида взаимодействий, лежащих в основе детерминации и дифференцировки, в принципе определяются взаимодействиями на молекулярном уровне. Детерминированное состояние клетки невозможно выявить ни одним из существующих в настоящее время экспериментальных подходов. Дифференцировку рассматривают как внешнее выражение детерминации, характеризующееся специализацией в клеточной морфологии, физиологической функции и биосинтетической активности.

Основа генетического контроля цитодифференцировки обусловлена тканеспецифичностью действия генов. Для определения места действия генов в экспериментальной эмбриологии применяют такие традиционные методы исследования, как парабиоз, трансплантацию тканей, клеток или клеточных органелл, культивирование тканей или клеток in vitro, получение химерных животных. Достаточно эффективные, сами по себе эти методы дают лишь косвенные результаты. В этом плане совершенно новые возможности предоставляет технология рекомбинантных ДНК, возникшая на основе обнаруженных в 70-х годах ферментов нуклеинового обмена, а также экстрахромосомных факторов устойчивости к лекарственным препаратам и бакте-риоциногенных факторов (Mandel, Higa, 1970; Cohen et al., 1972, 1973).

Учитывая специфику генноинженерных методов, дифференцировку целесообразно рассматривать с точки зрения производства клеткой определенных специализированных молекул. Подобный подход вмещает в себя и такое понятие, как тканеспецифичность. Рассматривая ци-тодифференцировку, обычно подразумевают, что в ее основе лежит синтез специфических белков. Специфичные белки определяют харак-

тернов строение и специализированные функции конкретных клеточных систем. Клетки, дифференцированные в разных направлениях, должны отличаться друг от друга хотя бы одним специфическим белком; специфичность характеризуется первичной структурой белковой молекулы, а также ее относительным количественным содержанием. Количественное содержание бежа служит косвенной мерой экспрессии соответствующих генов. Следовательно, выделение индивидуальных генов позволяет исследовать процессы, связанные с более ранними этапами реализации генетической информации.

Таким образом, ценность технологии клонирования заключается и в том, что этот подход открывает возможность исследования не только тканеспецифичности, т.е. дифференциальной активности генов в пространстве, но и углубляет изучение их стадиеспецифично-сти, отражающей дифференциальную активность генов во времени. На ранних стадиях эмбриогенеза - моруле, бластуле, когда клетки то-типотентны - дерепрессируются гены, отвечающие за процессы роста и общего метаболизма; начиная со стадии гаструлы происходит активация тканеспецифичных генов, контролирующих синтез тканеспе-цифичных молекул белка и дифференцировку определенных типов клеток (Конюхов, 1980; Korochkin, 1981; Davidson, 1986).

Настоящее исследование посвящено созданию экспериментальной основы для изучения дифференциальной активности тканеспецифичных генов в развитии. В качестве объекта исследования выбран хрусталик глаза лягушки Rana temporaria. Причина выбора обусловлена несколькими обстоятельствами: хрусталик позвоночных отчетливо морфологически выражен, легко доступен в значительных количествах, функционально высокоспециализирован, однороден по молекулярному составу; белковые компоненты хрусталика - кристаллины -

до настоящего времени довольно интенсивно изучались. Как следствие, линза глаза давно уже стала традиционным объектом экспериментальной эмбриологии.

Цель нашего исследования состояла в получении банка клонов, содержащих нуклеотидные последовательности мРНК, кодирующей структурные водорастворимые белки хрусталика глаза лягушки-кри-сталлины, и идентификации полученных клонов. При этом основной акцент был сделан на идентификацию клонов, кодирующих ¡3-кристал-лины - наиболее гетерогенный по составу класс полипептидов хрусталика. Решение поставленной задачи обусловило не только получение молекулярных зондов, обеспечивающих возможность исследования структуры геномных кристаллиновых генов, изучения экспрессии кристаллиновых генов на разных этапах нормального развития линзы глаза и в процессе регенерации хрусталика, но также предоставило потенциальный путь практического применения - исследования молекулярной основы таких патологических процессов, как катарактоге-нез.

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

поли(А) - полирибоадениловая кислота

поли(А)РНК - поли(А)-содержащая РНК

поли (А) ""РНК - поли (А )-не со держащая РНК

(+)-цепь ДНК - ДНК, комплементарная РНК

(-)-цепь ДНК - ДНК, идентичная по структуре РНК

дскДНК - двуспиральная комплементарная ДНК

кДНК - комплементарная ДНК

оцкДНК - одноцепочечная кДНК

оскДНК - односпиральная кДНК

кзДНК - ковалентнозамкнутая ДНК

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза

РНКаза - рибонуклеаза

дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

НТФ - рибонуклеозидтрифосфат

ТдТ - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза тпн - тысячи пар нуклеотидов по - пары оснований

УПН - узнаваемая последовательность нуклеотидов

кД - килодальтон

к.к. - конечная концентрация

БМЭ - р-меркаптоэтанол

БФС - бромфеноловый синий

ДГТ - дитиотрейтол

БСА - бычий сывороточный альбумин

АкА - акриламид

МбА - метилен-бисакриламид

ДОН - додецилсульфат натрия

ПАА - полиакриламидный

ПМГ - полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония

ИЗФ - изоэлектрическое фокусирование

ИМЭФ - иммуноэлектрофорез

РРО - 2,5-дифенилоксазол

ССЦ - стандартный солевой цитрат

(0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат Na) УТБ - стандартная питательная среда (0,5% NaCl, 1% триптона,

0,5% дрожжевого экстракта, рН 7,2) ФАМ - формамид

ЗДТА - натриевая соль этилендааминтетрауксусной кислоты ЭтБр - этидиумбромид

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Структура и макромолекулярный состав линзы глаза позвоночных 1.1. Клеточное строение хрусталика и общая характеристика его белков

Хрусталик глаза представляет собой высокоспециализированный орган, основная функция которого состоит в получении адекватной рефракции падающих лучей света для обеспечения необходимой остроты зрения. Трофика хрусталика обеспечивается с помощью диффузии из окружающей жидкости, называемой водянистой влагой глаза.

Линза является эпителиальным образованием и состоит из эк-тодермальных клеток разной степени дифференцировки. Хрусталик подразделяют на несколько составных частей: переднюю и заднюю капсулу (секретируются клетками поверхностных слоев линзы), эпителий, расположенный только на передней поверхности линзы, кору и ядро хрусталика (см. рис. I; капсулы не показаны).

Основная часть хрусталика состоит из однотипных клеток, называемых волокнами, и этим хрусталик отличается от любого другого органа. Волокна образуются из монослоя эпителиальных клеток передней поверхности линзы - единственной популяции клеток, имеющей митотическую активность (I на рис. I).

Вблизи экватора линзы находится герминативная зона, где происходит деление эпителиальных клеток - процесс, который совершается с постепенно замедляющейся скоростью на протяжении всей жизни организма. На экваторе расположена зона клеточной элонгации; здесь инициируется дифференцировка образуемых в гер-

Рис. I. Схема строения хрусталика амфибий.

1 - эпителий хрусталика, сохраняющий митотическую активность;

2 - экватор хрусталика - зона клеточной элонгации, начальной дифференцировки волокон хрусталика;

3 - кора хрусталика, состоящая из волокон, сохранивших клеточные ядра и органеллы;

4 - ядро хрусталика, содержащее терминально дифференцированные волокна без ядер и органелл.

минативной области эпителиальных клеток в лентоподобные волокна хрусталика (2 на рис. I). Вскоре после начала элонгации клетки волокон постепенно утрачивают свои ядра и большинство органелл, уменьшая таким образом рассеивание света внутри линзы (Лигапй, Уашайа, 1967; КшаЬага, 1975). Вместе с тем, в периферическом слое волокон линзы, составляющем кору хрусталика (3 на рис. I) белоксинтезирующий аппарат еще полностью сохраняется.

Помимо однотипности основной массы клеток, хрусталик уникален также и тем, что, несмотря на непрерывный рост линзы, старые ее клетки не отторгаются. Они становятся более компактными, сда-вливаясь в центре линзы молодыми клетками с периферии, которые, в свою очередь, покрываются вновь образующимися хрусталиковыми волокнами, постепенно компактизуясь по направлению к ядру хрусталика (4 на рис. I). Это перемещение клеток к центру отражается в морфологических различиях клеточных слоев, образованных в различные периоды развития организма. Рост клеток, протекающий на протяжении всей жизни в пределах капсулы линзы, ведет к постепенному затвердеванию ядра по мере старения, в то время как кора хрусталика остается мягкой.

Линза глаза позвоночных имеет сферическую форму, и для обеспечения своей основной функции не должна иметь одинаковый индекс рефракции, т.к. в этом случае лучи будут фокусироваться на различном расстоянии от линзы. Суммарное содержание воды и белка в хрусталике составляет 98%, причем ядро линзы позвоночных содержит 60% белка, а кора - только 20% (РМИрзоп, 1969). Индекс рефракции прямо зависит от концентрации белка, поэтому градиент концентрации последнего обусловливает наличие градиента рефракции в хрусталике от максимального значения в ядре хруста-

лика с резким убыванием по направлению к коре (Fernald, Wright, 1983).

I.I.I. Структурные белки хрусталика

Исследование структурных макромолекул линзы глаза имеет уже вековую историю. Структурные белки хрусталика крупного рогатого скота были впервые выделены Мёрнером в 1894 г. (Могпег, 1894), который подразделил их на водорастворимые кристаллины и водоне-растворимую фракцию, названную им альбуминоидом.

По сравнению с другими тканями, хрусталик глаза позвоночных имеет наиболее высокое содержание белка, который составляет около 20 - 60% сырого веса и почти весь сухой вес этого органа (Zigler, Goosey, 1981; Wistow, Fiatigorsky, 1988). В первом приближении структурные белки линзы подразделяют на водорастворимые и водонерастворимые. Кристаллины, относящиеся к водорастворимым белкам, составляют 80-90% общего белка хрусталика (Piatigorsky et al., 1980).

Кристаллины являются легко идентифицируемыми маркерами экспрессии генов при дифференцировке и в процессе регенерации линзы. В основе классификации кристаллитов позвоночных до настоящего времени используются обозначения, предложенные более ста лет назад (Могпег, 1894). Исходя из иммунологических и физико-химических характеристик, можно выделить встречающиеся у всех видов позвоночных а- и кристаллины p/7-сверхсемвйства. Гамма- кристаллины, утратившие присвоенное им Мёрнером смысловое значение, отсутствуют у птиц и рептилий. За исключением обнаруженного ранее дельта-кристаллина, с середины 80-х г.г. идентифицирован целый ряд других кристаллинов: е, р, ^ и т, что позволило выделить эти белки в отдельный класс таксон-специфичных кристаллитов.

Дельта-кристаллин обнаруживается только у рептилий и птиц (Manski, Haibert, 1965; Piatigorsky et al., 1972; Fiatlgorsky, 1980). Таксон-специфичные кристаллины как на генетическом, так и аминокислотном уровне в значительной степени гомологичны -вплоть до 100% - ферментам цикла окисления жирных кислот и другим ферментам (Fiatlgorsky, Wistow, 1989).

В литературе описаны также кристаллины с высокой подвижностью при электрофорезе: IM- или пре-а-кристаллины (van Dam, ten Gate, 1966; Campbell et al., 1968; Brahma, 1977). Fl-кристаллины и а-кристаллины теленка полностью отличаются друг от друга по аминокислотному составу и иммунохимически (Bloernendal, 1981). В свою очередь, пре-а-кристаллины, обнаруживаемые в хрусталиковых волокнах амфибий (Campbell et al., 1968; Brahma, Doorenmaalen, 1969; McDevitt, Collier, 1975), антигенно неродственны FM-кри-сталлину теленка (Brahma, Doorenmaalen, 1976).

Характерным свойством большинства кристаллитов является их способность образовывать полимерные мультисубъединичные комплексы значительного молекулярного веса (Fiatlgorsky, 1981). Для а-кристаллинов характерны агрегаты массой около 800 ООО, для р-кристаллинов - 50 000-160 ООО и даже до 500 ООО, ö-кристаллина -приблизительно 200 ООО, е-кристаллина - 120 ООО (Harding, Dilley, 1976; Конюхов, 1980; Bloemendal, 1982; Stapel et al., 1985). Как показано с помощью электрофореза, эти комплексы образованы четырьмя типами субъединиц в случае а-кристаллинов, шестью-семью - в случае рефракции, и пятью - для ^-фракции полимерных p-кристаллинов (Bloemendal, 1981).

Средняя молекулярная масса существующих в мономерной форме 7-кристаллинов составляет около 20 кД (Harding, Dilley, 1976).

Помимо кристаллинов, в хрусталик© имеется множество других водорастворимых белков, ответственных за биосинтез нуклеиновых кислот и белков, протеолиз и гликолиз (Hockwin, Ohrloff, 1981). Некоторые из них очищены и идентифицированы: лейцинаминопептида-за - белок с молекулярной массой 326 кД (Hanson et al., 1965; Ouypers et al., 1982), ингибитор рибонуклеазы (Ortwerth, Byrnes, 1971, 1972; Bloemendal et al., 1977a), G-актин массой около 43 кД (Kibbelaar et al., 1979), нейтральная протеаза (Blow et al., 1975), фермент, ответственный за N-концевое ацетилирование кристаллинов (Granger et al., 1976; Hockwin, Ohrloff, 1981) и фосфо-рилирование некристаллиновых полипептидов (Sen, Pfeiffer, 1982).

Водонерастворимые белки хрусталика обнаруживаются главным образом во фракции "альбуминоида", по Мёрнеру (Mörner, 1894). Изучение этих белков, выявляемых в клеточной мембране и цитоске-лете, начато лишь в 70-х годах (Bloemendal et al., 1972, 19776; Hertaberg et al., 1982). В первом приближении данные белки подразделяют на растворимые и нерастворимые в мочевине - usl и ить соответственно, по классификации Влумендала (Bloemendal, 1982).

Более подробно основные классы водорастворимых тканесгоци-фичных белков хрусталика - кристаллинов - рассмотрены ниже. Учитывая, что одна из целей нашего исследования состоит в выделении нуклеотидных последовательностей, кодирующих бета-кристаллины, белки этого класса рассмотрены в отдельной главе.

1.2. Тканеoneцифичные бедки хрусталика и кодирующие их полинуклеотидные последовательности

I.2.1. Альфа-кристаллины

Альфа-кристаллины являются наиболее хорошо изученными водорастворимыми белками хрусталика (Spector, 1965; Waley, 1969а; Harding, Dilley, 1976; Bloemendal, 1977; Siezen et al., 1979; Bloemendal, Groenewoud, 1982). Анализ, проведенный с помощью ультрацентрифугирования, показал, что а-кристаллины представляют собой популяцию агрегатов со средним молекулярным весом около 800 ООО (Spector, 1969). По мере старения а-кристаллины образуют агрегаты очень большого молекулярного веса, которые называют НМ-а-кристаллинами (Bloemendal, 1977). Огоктор с соавт. и Крампс и соавт. (Spector et al., 1971; Kramps et al., 1975) обнаружили, что при гель-фильтрации на биогеле фракция а-кристал-линов разделяется на две группы агрегатов, молекулярный вес

а

одной из которых составляет более чем 50 х 10.

Несмотря на значительное варьирование молекулярной массы нативных а-кристаллинов, этот класс белков представлен ограниченным набором полипептидных цепей. Общее количество индивидуальных субъединиц а-кристаллинов в настоящее время установлено окончательно (Bloemendal, 1981). О помощью электрофоретического разделения а-кристаллиновых полипептидов в щелочных ПАА-гелях, содержащих 5,5-8 М мочевину, было показано, что все агрегаты а-кристаллинов образованы лишь четырьмя типами субъединиц, обозначаемых оА-г, аАп, схВт и аВо (А - для кислых цепей, В - для основ-

X J. /О

ных) (Waley, 19696; Bloemendal, 1969; Bloemendal et al., 1972). хотя существуют и исключения из этой номенклатуры (см. ниже).

Количественно аА^-цепь является наиболее преобладающей субъединицей, причем aAj-субъединица полностью отсутствует в эмбриональном хрусталике теленка (Schoenmakera, Bloemendal, 1968; Palmer, Papaconstantinou, 1969). В то время как аА-полипептиды являются исключительно линзоспецифичными, синтезируясь в дифференцирующихся волокнах, aB-цепь синтезируется в клетках эпителия и коры хрусталика и обнаруживается в сетчатке, сердце, мышцах, коже, мозге и легких (Bliat, Nagineni, 1989).

а-Кристаллины грызунов, помимо субъединиц А и В, содержат еще одну цепь, отсутствующую у других видов позвоночных. ПАА/ДСН -электрофорез продуктов ионообменной хроматографии сх-кристалли-нов крысы выявляет минорный полипептид массой 24 кД, при анализе в гелях со щелочной мочевиной мигрирующий между цепями aBj и оА^ (Cohen et al., 1978). Авторы обозначили данный полипептид aAIns ввиду полной идентичности его оА^-субъединице, за исключением вставки из 22 остатков между 63 и 64-й аминокислотами цепи акп.

Л/

При электронномикроскопическом анализе НМ-а-кристаллины с величиной седиментации 40-240 S выглядят как набор отдельных а-кристаллиновых частиц случайного размера (Kramps et al., 1975). Обработка НМ-а-кристаллинов 6-8 М мочевиной приводит к диссоциации их на субъединицы (Spector, Kats, 1965), что служит основой различных методов препаративного выделения индивидуальных цепей а-кристаллинов. Группа Блумендала для разделения цепей а-кристаллинов применила метод хроматофокусирования (Stuyterman, Wijdenes, 1978). Авторам удалось выделить все кислые и основные субъединицы а-кристаллинов теленка с 75% выходом однократным хроматофокусированием на колонке с 6 М мочевиной (Bloemendal, Groenewoud, 1982; Body, Bloemendal, 1988).

По данным электрофоретического анализа в ПАА-гелях с ДОН, т.е. в условиях разделения полипептидов по размеру (Laemmli, 1970), молекулярный вес а-кристаллиновых субъедишщ составляет около 20 ООО (Bloemendal, 1982). В этих условиях цепи аАт и акп,

X ¿0

так же как и цепи aBj и аВ^, не разделяются. Полностью разделить все четыре субъединицы а-кристэллинов удается лишь фракционированием по заряду, что достигается с помощью электрофореза в ПАА-гелях с 5,5-8 М мочевиной и щелочных рН (Bloemendal, 1969; Waley, 19696). Интенсивность окрашивания индивидуальных полос в таких гелях отражает соотношение цепей А и В нативных а-кристал-линов, непостоянное в ходе развития: субъединица аВ превалирует в центральном эпителии линзы (Vermorken et al., 1978; Vermorken, Bloemendal, 1978), тогда как в волокнах хрусталика существует обратное соотношение, для аА- и оВ-субъединиц составляющее 3:1 (Delcour, Fapaconstantinou, 1974).

В результате полного анализа первичной структуры а-кристаллиновых субъединиц было установлено, что цепь oAg состоит из 173 аминокислот и имеет рассчитанную массу 19 832 (van der Ouderaa et al., 1973). Размер оВ^-субъединицы равен 175 аминокислотам, молекулярный вес составляет 20 070, причем аА- и аВ-цепи имеют 55%-60% гомологию (van der Ouderaa et al., 1974; Bloemendal, 1981). Из четырех субъединиц, составляющих нативные а-крис Таллинн, только две - oAg и оВп - находятся под непосредственным генетическим контролем. Около 30% вновь синтезированных оАо и oBg-цепей в результате посттрансляционного дезамидирования превращаются в цепи oAj и oBj, отсутствующие в эмбриональной линзе и не синтезирующиеся в системе трансляции in vitro (Bloemendal et al., 1972; van Venrooi^ et al., 1974; Delcour, Bouchet, 1978).

Учитывая небольшую разницу молекулярных масс cd- и аВ-субъ-единиц, поведение их при разделении в гелях с ДОН весьма необычно, т.к. подвижность аВ-цепей в этих условиях заметно ниже таковой у аА-цепей; по этой причине к оценке молекулярного веса а-кристаллиновых субъединиц на основе такого анализа следует подходить с известной осторожностью (van der Ouderaa et al., 1974).

Структурный анализ дополнительной аА1пв-субъединицы, специфичной для а-кристаллинов крысы, мыши, хомяка, морской свинки, песчанки и некоторых других грызунов, показал, что в 22-аминоки-слотной вставке, отличающей эту цепь от оА^-субъединицы, отсутствуют кислые аминокислоты и имеется пять основных (Bloemendal, 1981). Очевидно, это и служит причиной необычного поведения цепи aAIns при исследовании с помощью электрофореза в гелях со щелочной мочевиной и изофокусирования (Cohen et al., 1978).

Содержание аА1пвсубъединицы в нативных а-кристаллинах примерно в 20 раз ниже по сравнению с нормальными аА-цепями, причем до сих пор не обнаружено ни одного белка, имеющего структурное соответствие, наблюдаемое для А2 и А1пЕ5-субъединиц а-кристаллинов млекопитающих (Bloemendal, 1981).

Особый интерес представляют механизмы, лежащие в основе образования мультимерных кристаллиновых комплексов регулярного строения в условиях ограниченного разнообразия их составляющих субъединиц. Наибольшее число таких работ выполнено именно на модели альфа-кристаллинов. Для решения этого вопроса проводились исследования как по ренатурации кристаллиновых цепей после диссоциации нативных а-кристаллинов 6-8 М мочевиной (Wisse et al., 1966; Li, Spector, 1974; Bloemendal et al., 1975a, 6; Malinow-ski, Manski 1980; Manski, Malinowski, 1980), так и изучали обра-

зование агрегатов при синтезе а-кристаллинов в бесклеточной системе и ооцитах шпорцевой лягушки (Asselbergs et al., 1978а).

Реассоциация а-кристаллиновых субъединиц происходит после удаления мочевины диализом против буфера, не содержащего мочевину. При этом коэффициент седиментации ренатурированных а-кристаллинов оказывается всегда несколько ниже своего первоначального значения, составляющего около 18 S (van Kamp et al., 1974).

Мански и Малиновски (Manski, Mallnowskl, 1980) оценивали ренатурацню очищенных ак- и аВ-цепей нммунохимическими методами. В реассоциатах аА-субъединиц сохраняется 25% детерминант, в аВ-агрегатах - 58%. Авторы предложили модель, согласно которой гомологичная агрегация ведет к ассоциации А- и B-цепей в соотношении 2:1; такая "основная" молекула а-кристаллина может агрегировать далее с образованием высокомолекулярных частиц с различными иммунохимическими характеристиками.

В процесс реассоциации больший вклад вносит взаимодействие между a-, ß- и 7-кристаллинами, а не агрегация гомологичных полипептидов, при этом сначала взаимодействуют только а- и ß-кристаллины. По мере старения первоначальный aß-кристаллиновый комплекс ассоциирует и 7-кристаллины (Mallnowskl, Manskl 1980). Технология рекомбинантных ДНК позволила исследовать агрегацию наиболее гетерогенных белков хрусталика - бета-кристаллинов. Ре-комбинантные ßB2- и ßAЗ-пoлипeпти1zда сохраняют свои антигенные детерминанты; рВ2-цепь массой 24 кД и ßAS-субъединица (номенклатуру бета-кристаллинов см. в табл. I, стр. 45) образуют гетеро-димеры в условиях, близких к существующим в линзе (концентрация цепей около ЮМ) в течение 6 часов (He^tmanclk et al., 1997).

1.2.2. Структура а-кристаллиновых мРНК

Матричная РНК Ао-цепи а-кристаллинов была одной из первых индивидуальных эукариотических мРНК, очищенных до гомогенного состояния. G помощью зонального центрифугирования диссоциированных полирибосом хрусталика теленка Берне и соавт. (Berns et al., 1971) выделили две фракции мРНК с седимент ационными коэффициентами 10 S и 14 S. При трансляции 14 S мРНК в различных бесклеточных системах (Berns et al., 1972а, 1973} и ооцитах шпорцевой лягушки (Berns et al., 19726) синтезировался единственный полипептид, соответствующий А2-субъединице а-кристаллинов. Фракция мРНК с коэффициентом седиментации 10 Б в бесклеточной системе индуцировала синтез аВо-цепи, однако в трансляте присутствовали также и другие полипептиды (Mathews et al., 1972).

Учитывая, что по размеру субъединицы аАо и аВ9 отличаются друг от друга только на две аминокислоты (aAg-цепь состоит из 173 аминокислот, aBg - из 175) (van der Ouderaa et al., 1973, 1974), разница в размерах 14 S мРНК и 10 S мРНК, равных примерно 1500 и 735 нуклеотидам соответственно (Ohen, Spector, 1977а), малообъяснима. 0 другой стороны, если в случае 10 S мРНК соотношение ее длины и размера аВо- цепи в целом согласовывалось со значением для хорошо изученной 3 S mFHK глобина, имеющей избыточную длину в 65-125 нуклеотидов (Williamson, et al., 1971), то несоответствие в размерах 14 S мРНК и aAg-цепи длительное время оставалось непонятным. Длина 14 S мРНК теленка, даже с учетом 3'-полиаденилатных блоков, содержащих, по разным оценкам, около 50 (Layers et al., 1974) или 200 нуклеотидов (Favre, Bertaasoni, 1974), предполагает возможность кодирования по меньшей мере двух

полипептидов с молекулярной массой 20 Кд. Аналогичная ситуация характерна и для 14 S мРНК хрусталика крысы (Cohen et al., 1976), а также 15 S мРНК линзы цыпленка (Williamson et al.,

1972), хотя в последнем случае гомогенность препарата мРНК авторами не доказана.

Пытаясь объяснить функциональную роль избыточной длины 14 S мРНК, Берне и соавт. (Berns et al., 19726) выдвинули несколько предположений. Главное отличие структурной организации про- и эукариотических мРНК заключается в отсутствии полицистронных матриц у эукариот. Тем не менее Чен и Опектор опубликовали ряд работ (Chen, Spector, 1977а, б), в которых на основании двумерного картирования продуктов нуклеазного гидролиза 14 S мРНК, трансляции в бесклеточной системе и молекулярной гибридизации 14 S мРНК и кДНК, синтезированной на матрице 10 S мРНК, постулируется бицистронность 14 S мРНК.

Эти выводы, однако, противоречили результатам трансляции 14 S мРНК в бесклеточных системах и ооцитах (Berns et al., 1972а;

1973) и экспериментов по ингибированию трансляции этой мРНК кэп-аналогами (Asselbergs et al., 19786). Окончательно разрешить вопрос о структурной организации 14 S мРНК а- кристаллинов удалось только с использованием методов клонирования рекомбинантных ДНК (Moormann et al., 1981; King et al., 1982; King, Piatigorsky, 1983). Было показано, что значительный размер 14 S мРНК обусловлен необычно длинной нетранслируемой областью на 3'-конце.

Особый интерес представляет собой механизм регуляции синтеза альфа-кристаллинов в клетках хрусталика. Трансформация эпителиальных клеток линзы в волокна в ходе дифференцировки сопровождается значительными изменениями синтеза а-кристаллинов. Ско-

рость синтеза этих белков в эпителиальных клетках зрелой линзы почти в семь раз выше, чем в волокнах коры хрусталика (ВеХсоиг, Рарасо1^ап1;1пои, 1972). При этом, видимо, изменяется и скорость синтеза индивидуальных субъединиц, что отражается в изменении стехиометрического соотношения Ад- и В^-цепей в олигомерах а-кристаллинов от величины 2:1 в клетках эпителия до 3:1 в волокнах линзы (БеХсоиг, Рарасопз 1;ап 1; Хпои, 1974). Ввиду того, что аАо и аВо-субъединицы кодируются раздельно 14 Б и 10 Б мРНК, такое изменение соотношения вновь синтезируемых субъединиц в процессе дифференцировки в пользу аА^-цепи, вероятно, является следствием изменений в содержании кодирующих эти полипептиды мРНК.

Одной из вероятных причин аккумуляции 14 3 мРНК до более высокого уровня может быть ее стабилизация. Данное предположение косвенно подтверждается экспериментами по культивированию линз быка с актиномицином Д, в результате которых авторы пришли к выводу о большей стабильности мРНК, кодирующей Ао-цепь, по сравнению с мР'НК В^-цепи (ВеХсоиг et а!., 1976). Механизм различной стабильности 14 3 и 10 5 мРНК остается до конца непроясненным.

Другой причиной относительной аккумуляции одной из мРНК может являться их разный трансляционный потенциал в ходе трансформации клеток хрусталика. В целом молекулярные механизмы контроля скорости утилизации указанных мРНК а-кристаллинов так же остаются невыясненными.

1.2.3. Клонирование кодирующих последовательностей альфа-кристаллинов

Детальное изучение структуры 14 Б а-кристаллиновых мРНК стало возможным только с применением методов молекулярного кло-

нирования. В первом из такого рода исследований были охарактеризованы клоны, содержащие последовательности 14 S мРНК кристалли-нов хрусталика крысы (Moormarm et al., 1981).

В своей работе авторы использовали ранее полученный банк ре-комбинантных плазмид с последовательностями, гомологичными нескольким различным кристаллиновым мРНК (Dodemont et al., 1981). После селекции плазмид по размеру вставки были отобраны два репрезентативных клона, индуцировавших синтез аАо-субъединиц при анализе методом гибридизации/трансляции. Оба клона содержали кДНК-копии одной и той же мРНК. Длина 14 S мРНК а-кристаллинов, вычисленная на основании данных секвенирования этих клонов, составила 892 нуклеотида. Полученная последовательность несет практически всю информацию для оА^-субъединицы, но не содержит участка, кодирующего вставку из 22 аминокислот цепи aAIns грызунов (см. выше), также кодирующейся мРНК размером 14 S (Cohen et al., 1976; 1978).

Детальный анализ первичной структуры 14 S мРНК однозначно доказал отсутствие бицистронной организации этого мессенджера (Moormarm et al.,1981). Только одна из возможных рамок считывания обеспечивает информацию для полипептидной цепи достаточного размера. Протяженность 3'-концевого участка 14 S мРНК составляет более 50% ее длины, однако эта фланкирующая последовательность является нетранслируемой из-за значительного количества стоп-ко-донов. Используя выделенные клоны, Мурману и соавт. удалось идентифицировать две фракции мРНК размером около 1250 и 1300 нуклеотидов, из которых первая индуцировала синтез aAg-поли-пептида, а вторая - субъединицу аА (Moormarm et al., 1981).

Несколько позже в лаборатории Пятигорского была проклониро-

вана кДНК, гомологичная 14 S мРНК альфа-кристаллинов мыши (King et al., 1982). Скрининг методом позитивной гибридизации/трансляции (Parnes et al., 1981) позволил идентифицировать клон оо вставкой размером 1023 нуклеотида, содержащей почти полный набор кодонов субъединицы oAg. Сопоставление транслируемых областей оА-кристаллиновых кДНК мыши и крысы обнаруживает 18 синонимичных замен в нуклеотидной последовательности.

Сравнительный анализ дот-матриксным методом (Maizel, Lenk, 1981 ) кДНК-клона oAg-крисТаллина мыши с известными аминокислотными последовательностями оА- (van der Ouderaa et al., 1973), аВ- (тап der Ouderaa et al., 1974), ßBp- (Driessen et al., 1981) и 7-кристаллинов (Croft, 1972) быка позволил Кингу и соавт. (King et al., 1982) выявить значительную степень ее гомологии с аА- и частичную гомологию с оВ-субъединицей; с р- и 7-кристалли-нами никакой гомологии не наблюдалось.

Описанный выше клон кДНК, кодирующий oAg-кристаллин (King et al., 1982), был использован для исследования оА-содержащих последовательностей мышиной геномной ДНК (King, Piatigorsky, 1983). В результате скрининга нескольких банков клонированной хромосомной ДНК был получен рекомбинантный фаг со вставкой около 14 тпн, анализ 5'-концевой первичной структуры которой показал наличие двух кодирующих участков (экзонов), разделенных не-кодирующей областью (интроном) длиной 1376 пар оснований. Интрон

разделяет кодоны 63 и 64 - именно те, между которыми расположены

Тпч

дополнительные 22 аминокислоты субъединицы аА крысы (Cohen et al., 1978). Анализ первичной структуры интрона обнаружил внутри него последовательность, кодирующую 22-аминокислотную вставку аА1ш-субъединицы. Поскольку геном мыши содержит только один аА-

кристаллиновый ген, Кинг и Пятигорский пришли к выводу, что ин-дидивидуальные аАп- и аА -мРНК продуцируются данным геном посредством альтернативного сплайсинга (King, Piatigorsky, 1983).

Столь пристальный интерес к изучению последовательностей, Тпя

кодирующих аА -субъединицу, основан на том, что образование этой цепи, имеющей вставку из 22 аминокислот, трудно объяснить с позиций широко распространенной гипотезы, предполагающей дупликацию генов-предшественников в ходе эволюции. В то же время 57% гомология субъединиц аАо и аВо в рамках данной гипотезы вполне объяснима (van der Ouderaa et al., 1974).

Альтернативный сплайсинг, лежащий в основе синтеза субъединицы aAIns, вообще говоря, может определять различные процессы на молекулярном уровне. В случае вирусов эукариот разнообразное использование специфичных сайтов сплайсинга обеспечивает максимальную степень утилизации ограниченного генома (Ziff, 1980; Darnell, 1982). Сплайсинг РНК клеточных генов может отвечать за регуляторные функции, давая дополнительные возможности варьирования генетических продуктов в соответствии с функциональными потребностями различных типов клеток и тканей. Примерами такого рода явлений могут служить дифференцированный сплайсинг тяжелых цепей иммуноглобулинов (Rogers et al., 1980), кальцитонинового гена (Amara et al., 1982), клеточных протоонкогенов (McGrath. et al., 1983). Возможность увеличения эволюционного разнообразия генных продуктов без изменения или элиминации самих генов в ходе эволюции с помощью альтернативного сплайсинга обсуждалось ранее Джилбертом (Gilbert, 1978).

1.2.4. Гамма-кристаллиш

Предложенная Мёрнером классификация водорастворимых белков хрусталика (см. выше) в отношении гамма-кристаллинов утратила свой первоначальный смысл. В настоящее время гамма-кристаллины рассматривают как составную часть бета/гамма-сверхсемейства (Wistow, Fiatigorsky, 1988). Значительная доля исследований биохимических свойств 7-кристаллинов вследствие доступности исходного материала касается гамма-кристаллинов хрусталика глаза крупного рогатого скота.

Собственно гамма-кристаллины, в отличив от других кристал-линов (за исключением таксон-специфичных) являются мономерными белками молекулярной массой 18000-27000 (Bloemendal, 1981; Bindeis et al., 1983). К гамма-кристаллинам обычно относят фракцию, элюирующуюся вслед за фракцией бета-кристаллинов при разделении методом гель-фильтрации низкого давления. Наряду с 7-кристаллинами в элюате присутствует отделяющийся при ионообменной хроматографии белок массой 28000, названный (3Б-кристаллином (тап Dam, 1966).

Гамма-кристаллины составляют около 20% всех водорастворимых белков линзы теленка и при изоэлектрическом фокусировании делятся на 5 фракций с изоэлектрическими точками выше 7.0 (Zignan et al., 1983). Некоторые авторы все щелочные кристаллит относят к 7-кристаллинам (Bouts, 1973).

Первое систематическое исследование гамма-кристаллинов было предпринято Бьёрком. Автор показал гетерогенность выделенной методом гель-фильтрации фракции суммарных 7-кристаллинов теленка (Вjork, 1961) и с помощью ионообменной хроматографии получил

четыре гомогенных фракции, обозначенных им 7^, Тцха» Тщ^ и 1964). По другой номенклатуре фракции соответственно возрастающей кислотности полипептидов подразделяют на 7^, ^, 73, 7^ и 75 (К1ЬЬе1ааг, В1оетепйа1, 1975). Использование разработанного Бьёрком метода кристаллизации фракций 7-кристаллинов (Гарбер, Решетникова, 1976) инициировало целую серию исследований фракции 7^ рентгеноструктурным методом (СМ^айге е1; а!., 1977; В1ш1йе11 et а!., 1978, 1981; Моогшапп et а!., 1982).

В 1972 г. Крофт определил полную аминокислотную последовательность 711-фракции (Сго:£1:, 1972). Цепь 7^ имеет 165 аминокислотных остатков и вес 19870. Анализ первичной структуры четырех других 7-кристаллиновых субъединиц показал, что между ними существует более чем 85% гомология (БИщаЬу, Сго:Г1;, 1978).

Общее количество индивидуальных гамма-кристаллиновых полипептидов теленка, находящихся под непосредственным генетическим контролем, оценивается от 3 - 4 (В1оешепйа1, 1982) до 5 и более цепей (БНщвЬу, Сго:Г1;, 1978).

Значительное место в изучении гамма-кристаллинов занимают исследования 7-кристаллинов хрусталика крысы. Зигман и соавт. (г1@пап е1; а!., 1970) идентифицировали 7 гамма-кристаллиновых компонентов с изоточками в интервале рН 7.3-8.9. Анализ продуктов трансляции тотальной мРНК с помощью двумерного электрофореза обнаружил не менее 5-7 гаша-кристаллиновых полипептидов с подвижностью, соответствующей молекулярному весу от 17000 до 22000 (ВосХетоггЬ ех а!., 1981; Натаекегв et а!., 1982). Первичными генными продуктами являются 6 индивидуальных субъединиц (Иатаекегв е1; а!., 1982), что подтверждается полным соответствием их брутто-аминокислотного состава (о1егеп е1; а!., 1988) с та-

ковым, раочитанным на основе первичной структуры шести 7-крис-таллиновых генов (Moormann et al., 1983; den Dunnen et al., 1986). В хрусталике крыс вплоть до 3-месячного возраста 7-крис-таллины являются доминирующей фракцией (Ramaekers et al., 1982).

Гамма-кристаллины мыши менее изучены по сравнению с этими белками быка и крысы. При изозлектрическом фокусировании суммарных кристаллинов обнаруживается 8 7-кристаллиновых полипептидов, а методом капиллярного изотахофореза - даже 16 (Bours, Delmotte, 1979). Изофокусирование продуктов трансляции выделенной из мышиного хрусталика мРНК показывает наличие более семи 7-кристаллиновых субъединиц, причем частичное секвенирование некоторых цепей выявляет заметное различие в гомологии между отдельными группами этих полипептидов (Sliinoliara et al., 1982).

Исследование гамма-кристаллинов человека на разных стадиях развития обнаруживает их значительное сходство с 7-кристаллннами быка. Электрофоретическая подвижность, пептидные карты и аминокислотный состав близки таковым 7ц- Фракции и суммарных гамма-кристаллинов линзы быка; N-концевой аминокислотой 7-крнсталлинов человека, быка и крысы является глицин (Dilley, Harding, 1975).

Хрусталик амфибий занимает особое место в исследованиях процессов эмбриональной индукции, дифференцировки и регенерации. В силу данной специфики водорастворимые белки линзы рассматривались как маркеры данных процессов, и непосредственно биохимические свойства кристаллинов амфибий изучены недостаточно.

Гамма-кристаллины являются наиболее хорошо охарактеризованными водорастворимыми белками линзы амфибий; в развивающемся зачатке хрусталика они появляются первыми или одновременно с бета-кристаллинами (McDevitt et al., 1969; McDevitt, 1972; McDevitt,

Braiima, 1973, 1977; Михайлов, Такенов, 1983).

В линзе Xenopus laevis методом тонкослойного изофокусирова-ния обнаруживается 7 7-кристаллиновых компонентов (Braiima, Bouts, 1972), при дальнейшем иммунопроявлении идентифицирующиеся в диапазоне рН 7.2-8.7 (Михайлов и соавт., 1984). Электрофорети-ческий анализ гамма-кристаллинов американской травяной лягушки Rana pipiens демонстрирует присутствие 4 7-кристаллиновых фракций (MeDevitt, 1967). Сопоставление 7-кристаллинов Rana pipiens и Xenopus laevis методом изофокусирования выявило отсутствие 2-3 катодных фракций у травяной лягушки (MeDevitt, Brahma, 1973).

Иммунохимический анализ показал значительное родство гамма-кристаллинов Rana pipiens и тритона (Notïiiger et al., 1971), а также R. pipiens и 7-кристаллинов трех видов бесхвостых и хвостатых амфибий: Rana temporaria, Ambystoma mexieanum, Fleurodeles waltlii (Brahma, MeDevitt, 1974).

Сравнительное исследование гамма-кристаллинов нормальной и регенерирующей линзы тритона Notophtiialmus viridescens выявило один компонент подвижностью, соответствующей 17000 при анализе в ПАА/ДСН-геле, однако содержание данной фракции в регенерирующей линзе составляло 52% против 37% в нормальной (MeDevitt, 1982).

Гамма-кристаллины травяной лягушки Rana temporaria распределяются в зоне рН 6.8-8.3 и иммунохимически сходны с белками этого класса R. ridibunda, X. laevis, тритона, карпа, крысы и быка (Михайлов и соавт., 1984), но также обладают и видоспецифи-чными антигенными детерминантами (Михайлов, 1978; Горголюк и соавт., 1978).

7-Кристаллины зрелой линзы быка (Papaconstantinou, 1965), крысы (McAvoy, 1978), амфибий (MeDevitt et al., 1969; Braiima,

McDevitt, 1974), а также регенерирующей линзы тритона (McDevitt, Brahma, 1982) локализуются исключительно в клетках волокон хрусталика. Это свойство 7-кристаллинов лежит в основе их использования в качестве маркеров дифференцировки проспективных волокон линзы. В то же время имеются сообщения об обнаружении 7-кристал-линов в культуре эпителиальных клеток хрусталика мыши (Russell et al., 1978), травяной лягушки R. pipiens (McDevitt, Yamada, 1969), в эпителии на начальных стадиях дифференцировки линзы травяной лягушки Rana temporaria (Михайлов, 1982; Михайлов, Такенов 1983).

В литературе долгов время не было единого мнения о наличии гамма-кристаллинов у птиц и рептилий. Так, обнаруженный 7-кри-сталлин в хрусталике голубя (Brahma et al., 1972) оказался идентичен ßg-полипептиду (McDevitt, Oroft, 1977). Однозначно решить как вопрос присутствия 7-кристаллинов в линзе рептилий и птиц, так и синтезе данных белков в эпителии хрусталика позволяет использование клонированных молекулярных зондов.

1.2.5. Структура гамма-кристаллиновых мРНК и их клонирование

До появления технологии клонирования нуклеотидных последовательностей были возможны лишь косвенные подходы к механизмам экспресии 7-кристаллинов. Попытки исследовать ингибирование транскрипции актиномицином Д выявили 80%-е снижение синтеза 7-кристаллинов в эпителиальных и удлиняющихся клетках хрусталика и, наоборот, 68%-е стимулирование синтеза в волокнах линзы (Papaconstaritinou et а1., 1966). Если присутствие 7-кристаллинов

в препарате эпителия авторы смогли объяснить его контаминацией, то механизм стимулирования синтеза в клетках волокон обсуждался лишь на уровне гипотез.

В экспериментах по ингибированию трансляции кэп-аналогами было показано наличие метилированных 5'-блокирующих последовательностей у мРЕК гамма-кристаллинов и их меньшую чувствительность к ингибированию по сравнению с мРНК а- и ¡3-кристаллинов (АавеХЬех^з е1 а1., 1978).

При фракционировании в изокинетическом сахарозном градиенте мРНК 7-кристаллинов крысы седиментируют в области около 10 3 (БойетогЛ е1; а1., 1981). Близость физико-химических параметров индивидуальных гамма-кристаллиновых мРНК являлась основной причиной их недостаточной изученности рутинными физико-химическими методами. Адекватным методом фракционирования 7-кристаллиновах мессенджеров может рассматриваться их клонирование.

Голландским исследователям удалось клонировать последовательности мРНК хрусталика крысы, в результате чего было получено 3 7-кристаллиновых кДНК-клона со вставкой длиной 600 - 700 пн, что соответствует размеру, равному 10 единицам Оведберга (ВосЬзттюгЛ е1; а1., 1981). Методом рестрикционного картирования были отобраны два неидентичных клона, один из которых по размеру соответствовал нативному 7-кристаллиновому полипептиду длиной 173 аминокислоты, второй клон не имел части нуклеотидов 3"-нетранслируемой области (Моогшапп е1; а1., 1982).

Анализ первичной структуры этих клонов показал 85%-ю общую гомологию нуклеотидных последовательностей рекомбинантных вставок и 73%-ю гомологию соответствующих им полипептидов. Гомология этих полжгоптидов и 711-кристаллина быка составляла около 70%.

Внутри последовательностей выявляются два домена, образующие р-складчатую структуру, в соответствии со структурной моделью Бланделла (Blundell et al., 1981) свернутую в четыре мотива типа "греческий ключ". Авторы высказали предположение о происхождении зрелого 7-кристаллинового гена в результате неоднократной дупликации одного из доменов в ходе эволюции. Рестрикционный анализ геномной ДНК крысы показал наличие не менее пяти гамма-кристаллиновых генов (Moormann et al., 1982).

Американская группа исследователей с помощью клонирования фракционировала мРНК хрусталика мыши и в полученном банке обнаружила 4 гамма-кристаллиновых клона (Shinoíiara et al., 1982). Частичное рестрикционное картирование клонов показало их взаим-мную неидентичность. Используя эти клоны в качестве зонда, было установлено, что размер 7-кристаллиновой мРНК мыши составляет примерно 840 нуклеотидов. Гибридизация/трансляция рекомбинантных вставок с тотальной поли(А) РНК хрусталика в нежестких условиях выявила частичную гомологию одного из клонов с р-кристаллинами.

Авторы пришли к выводу о наличии в хрусталике четырех индивидуальных мРНК и вероятном существовании семейства 7-кристалли-новых генов (Sliinohara et al., 1982).

1.2.6. Дельта-кристаллины и другие таксон-специфичные белки хрусталика Дельта-кристаллины, в отличив от а- и р-кристаллинов, встречаются только у птиц и рептилий (Clayton, 1974; Williams, Piatigorsky, 1979а). Первоначально 5-кристаллины относили к классу p-кристаллинов (Maisel, Langpian, 1961) или обозначали как кристаллины с подвижностью p-кристаллина (p-mobility crystallin) (Clayton et al., 1968). Рэбеи (Rabaey, 1962) выделил эти белки в

особый класс и вследствие их появления первыми при дифференциро-вке линзы птиц назвал FISC (first important soluble crystallin). Общепринятое сейчас наименование "дельта-кристаллин" было предложено Звааном и йкедой (Zwaan, Ikeda, 1965).

Сравнительный анализ б-кристаллинов птиц и рептилий продемонстрировал их наличие у всех изученных видов, за исключением ехидны (Williams, Fiatigorsky, 1979а; de Jong et al., 1981). Нативные 8-кристаллины рептилий и птиц являются тетрамерными белками массой около 200000 (Maisel, Langman, 1961; Williams, Fiatigorsky, 1979a, б) и диссоциируют на субъединицы лишь в весьма жестких условиях (Fiatigorsky, Zelenka, 1974).

Молекулярная масса б-кристаллиновых субъединиц исследованных видов составляет около 50 кД, причем, по данным иммунохими-ческого анализа, 50 кД-фракция у всех видов имеет общие антигенные детерминанты (Williams, Fiatigorsky, 1979а). При отсутствии какой-либо гомологии с другими классами кристаллинов, о-крисТаллинн имеют общие антигенные детерминанты с кератином (Kodama, Eguchi, 1983). Изоэлектрические точки б-кристаллинов рептилий и птиц находятся в пределах рН 5-7, хотя рептилиям свойственны более щелочные изоточки этого диапазона (de Jong et al., 1981).

Наиболее хорошо изучены б- кристаллины кур, молекула которых состоит из 4 субъединиц двух видов массой 48 и 50 кД при соотношении в нативном агрегате соответственно 3:1 (Reszelbaeh et al., 1977 ). Изменение концентрации Nat К+, 01" и ацетата при трансляции б-кристаллиновой мРНК в бесклеточной системе может изменять соотношение субъединиц вплоть до обратного (Shinoïiara, Fiatigorsky, 1980).

Полипептид массой 48 кД образуется из 50 кД- субъединицы в

результат© отщепления двух кислых триптических пептидов (Shinohara et al., 1980). При изоэлектрическом фокусировании 5-кристаллины разделяются не менее чем на 5 компонентов (Brahma, van der Starre, 1976) и сгруппированы в узком диапазоне рН приблизительно от 5.05 до 5.34 (Bours, 1974).

В хрусталике кур содержание 5-кристаллинов максимально в волокнах эмбриональной линзы, где оно составляет 60-80% всего растворимого белка (Genis-Galvez et al., 1968; Piatigorsky et al., 1972). В процессе дифференцировки пропорция 5-кристаллинов значительно снижается (Brahma, van der Starre, 1975) и в зрелой линзе составляет около 50% (Bagchi et al., 1981).

Физико-химические свойства дельта-кристаллинов хрусталика дикой утки практически аналогичны таковым у кур, за исключением массы их составляющих субъединиц, равной 47 и 48 кД. При изофо-кусировании 5-кристаллины образуют 5 мажорных иммунохимически родственных фракций, состоящих из данных субъединиц в различных стехиометрических соотношениях (Williams, Piatigorsky, 19796).

1.2.7. Динамика синтеза мРНК дельта-кристаллинов в ходе дифференцировки хрусталика

мРНК дельта-кристаллинов является первой из кристаллиновых мессенджеров, использованных для изучения молекулярных основ инициации и регуляции синтеза кристаллинов. Этому способствовала успешная очистка 5-кристаллиновой мРНК до гомогенного состояния (2е1епка, МаИ^эгзку, 1974) и ее способность эффективно утилизироваться в системе обратной транскрипции (Milstone et а1., 1974). мРНК 5-кристаллинов кур имеет коэффициент седиментации

около 17 5, молекулярный вес 680000 и размер примерно 2200 нук-леотидов, что достаточно для кодирования только одной субъединицы массой около 50000 (геХепка, Р1а"ЗДогвку, 19766).

Методом гибридизации дельта-кристаллиновая мРНК обнаруживается уже на ранних стадиях формирования хрусталиковой плакоды, начиная аккумулироваться спустя 8-9 часов после индукции хрусталика глазным пузырем (ЗМпойага, РХа-ОДогвку, 1976). Среднее число молекул на клетку в волокнах увеличивается от 5хЮ4 на шестой до более чем 2x10 на 15-й день эмбрионального развития (1Ш81;опе е1; а!., 1976), постепенно уменьшаясь в постэмбриональный период вплоть до полного исчезновения (Тгё1юп е1; а!., 1982). В эпителиальных клетках динамика синтеза б-кристаллиновой мРНК в целом сходна, за исключением более низкого уровня аккумуляции молекул по сравнению с клетками волокон. В эпителии зрелой линзы мРНК и синтез б-кристаллиновых полипептидов полностью отсутствуют (ВееЪе, Р1а1^огзку, 1981).

Динамика синтеза мРНК б-кристаллинов линзы кур коррелирует с характером синтеза б-кристаллиновых субъединиц в процессе дифференцировки (см выше).

1.2.8. Клонирование дельта-кристаллиновых мРНК

мРНК б-кристаллинов линзы глаза кур является первым крис-таллиновым мессенджером, который удалось успешно проклонировать (ИмИ;, Р1а"Ы£огаку, 1979). Наибольший из клонов содержал вставку размером примерно 1241 пн, что составляет около 69% длины мРНК. Используя данный клон в качестве зонда, группа Пятигорского впервые выделила и геномные фрагменты, кодирующие куриные де-

льта-кристаллины (Bhat et al., 1980; Jones et al., 1980). С помощью гетеродуплексного анализа и рестрикционного картирования клонированных фрагментов были идентифицированы два неаллельных ö-кристаллиновых гена, содержащих по меньшей мере 14 и 15 интро-нов. Рассчитанная по нуклеотидной последовательности кДНК-клона первичная структура 5-кристаллиновых полипептидов выявила идентичность этих полипептидов аутентичным дельта-кристаллинам (Nickerson, Piatlgorsky, 1984).

Вслед за группой Пятигорского ö-кристаллиновая кДНК была клонирована еще в двух лабораториях (Bower et al., 1982а; Yasuda et al., 1982a, б). Три из полученных в лаборатории Клейтон клона (Bower et al., 1982а) гибридизовались не только с мРНК ö-крис-таллинов, но и с тремя другими фракциями мРНК; гибридизационная селекция выявила гетерогенный спектр дельта-специфичных полипептидов (Errington et al., 1982). Эти результаты не согласуются с данными группы Пятигорского о существовании единственного класса ö-кристаллиновых мессенджеров. Авторы выдвинули предположение об образовании множественных дельта-кристаллиновых мРНК в результате альтернативного сплайсинга (Bower et al., 1982а).

С помощью кДНК-зонда Ясуде с соавт. удалось выделить полноразмерный геномный клон ö-кристаллинов, а также часть другого, неаллельного гена, что совпадает с данными группы Пятигорского о наличии в геноме кур двух неаллельных ö-кристаллиновых генов. Авторы, однако, пришли к выводу о транскрипции в линзе только одного гена (Yasuda et al., 1982а), что противоречит данным американских авторов, согласно которым в хрусталике транскрибируются оба гена (Jones et al., 1980).

Принципиально решить вопрос о количестве транскрибирующихся

генов может только сравнительный анализ клонированных последовательностей мРНК и генома. Технология рекомбннантных ДНК исключительно эффективна и при изучении активности 5-кристаллиновых генов в клетках, что иллюстрируют работы по исследованию динамики синтеза мРНК в зрелой линзе (Treton et al., 1982), при трансдиф-ференцировке сетчатки кур (Bower et al., 19826), а также ткане-специфичность экспрессии клонированных б-кристаллиновых генов кур в эпителии линзы мыши после их инъекции в ядра клеток различных мышиных органов (Kondoli et al., 1983).

1.2.9. Другие таксон-специфичные кристаллины

и середины 80-х годов был обнаружен ряд водорастворимых белков хрусталика, обозначенных позже как "таксон-специфичные" кристаллины - е, Q, X и т. е-КрисТаллин найден в хрусталике утки (Stapel et al., 1985; öhiou et al., 1986), тау-кристаллин -миноги и черепахи (Stapel, de Jong, 1983; de Pomerai et al., 1984; Williams et al., 1985). Зета-кристаллин составляет около 10% водорастворимого белка линзы морской свинки (Huang et al., 1987) и у других видов млекопитающих отсутствует. А,-Кристаллин выявлен только в линзе зайца и кролика, где его содержание достигает 7-8% при массе субъединиц 35 кД (Mulders et al., 1988). Эпсилон-кристаллин состоит из трех субъединиц и имеет массу около 120 ООО (Stapel et al., 1985); молекулярная масса существующего в мономерной форме тау-кристаллина миноги составляет 48 кД (Stapel, de Jong, 1983), черепахи - 46 кД (Williams et al., 1985).

Качественный прогресс в идентификации таксон-специфичных

кристаллинов обеспечило применение технологии клонирования ре-комбинантных ДНК. Анализ первичной структуры показал, что тау-кристаллин черепахи имеет значительную гомологию с а-енолазой человека и дрожжей, в том числе полностью совпадает по размеру (Wistow et al., 1988). Различие состоит только в том, что ■т-крис Таллин моносубъединичен, тогда как а-енолаза проявляет ферментативную активность исключительно в виде димера.

Еще более интересные результаты получены в отношении эпси-лон-кристаллина (Hendrlks et al., 1988). Авторами показано, что s-кристаллин и лактатдегидрогеназа В^ утки полностью идентичны, являясь вдобавок продуктами одного гена. Сходные данные получены и для гена, одновременно кодирующего дельта-кристаллин и арги-нинсукцинатлиазу утки (Piatigorsky et al., 1988).

Аналогичным образом обстоит дело и с двумя другими таксон-специфичными белками хрусталика, названными лямбда- и зета- кристалликами. ?ъ-Кристаллин имеет 30% гомологии с 3-оксиацил- КоА-дегидрогеназой митохондрий свиньи, а так же 26%-ную гомологию с бифункциональным ферментом еноил-КоА: гидратазой-3-оксиацил-КоА-дегидрогеназой пероксисом крысы (Mulders et al., 1988). Оба фермента участвуют в цикле окисления жирных кислот. Зета-кристаллин, составляющий около 10% водорастворимого белка хрусталика морской свинки (Huang et al., 1987) имеет 25% гомологию с мышиной алкогольдегидрогеназой A (Rodokanaki et al., 1989).

Совокупность данных о структуре таксон-специфичных кристаллинов позволила Пятигорскому и Вистову выдвинуть гипотезу о рекрутировании ферментов в качестве структурных белков хрусталика в ходе эволюции (Platigorsky, Wistow, 1991).

Инги .

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Козлов, Константин Андреевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые в стране осуществлено клонирование комплементарной ДНК, в результате чего получен первый в мире банк клонов кДНК, кодирующей белки хрусталика глаза.

2. Показано, что содержащиеся в банке рекомбинантные последовательности репрезентативны как по длине исходного материала, так и по полипептидному составу различных классов кристаллинов хрусталика глаза травяной лягушки Rana temporaria.

3. Идентифицированы три клона комплементарной ДНК, соответствующих полипептидам бета-кристаллинов - наименьшего по содержанию и наболее гетерогенного из кристаллинов хрусталика глаза лягушки. Порядковые номера клонов pRT(L)44, pRT(L)72 и pRT(L)473; молекулярная масса полипептидов составляет 24, 26 и 26 кД соответственно.

4. Осуществлено подробное рестрикционное картирование соответствующих бета-кристаллинам клонов. Картирование выявило различие всех трех рекомбинантов. Клоны pRt(L)72 и pRt(L)473, кодирующие полипептиды равной молекулярной массы, могут в совокупности представлять практически полный структурный ген полипептида массой 26 кД.

5. Выявленные сайты рестрикции часто- и редкощепящих эндо-нуклеаз позволяют первоначально идентифицировать кодирующие последовательности полипептидов данного семейства белков хрусталика, в том числе и других видов позвоночных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование технологии клонирования кардинально отразилось на исследовании кристаллинов. Проведенные с использованием этих методов работы существенно поколебали доминировавшую столетие точку зрения на структурную уникальность называемых кристаллитами белков и, как следствие, их локализацию исключительно в хрусталике. В первую очередь это касается таксон-специфичных кристаллинов, не принадлежащих к классу а- и р/7-сверхсемейству, открытых в 70 - 80- годах.

Дельта-кристаллин кур, как обнаружено группой Пятигорского, имеет (конкретно ген 62) почти 70% гомологию с аргининсукцинат-лиазой человека Р1а1;1@эг8ку, 1987; РХа-^огэку е1; а!.,

1988). Эти данные независимо подтверждены другими авторами, обнаружившими к тому же 51-54% гомологии дельта-кристаллина цыпленка и аргинин-сукцинатлиазы дрожжей (УеЗп ег а!., 1988).

Несколько иная ситуация складывается с а- и ¡З/7-крйстэллинами. Какой-либо гомологии этих белков с ферментами, подобно о-, е-, С~» л- и т-кристаллинам, не обнаружено (Wistow, Fiatigorsky, 1988). Тем не менее в ряде работ было показано существенное сходство G-концевой последовательности альфа-кристаллинов с некоторыми белками эукариот, а именно консервативными областями малых - 14-27 кД - белков теплового шока дрозофилы, нематоды 0. elegans, ксенопуса, дрожжей (Ingolla, Craig, 1982; Russnak et al., 1983; Wistow, 1985; de Jong et al., 1988; Bossier et al., 1989) и основного антигена яиц р40 трематоды Schistosoma mansonl (Nene et al., 1986). До недавнего времени родственные а-кристаллинам белки рассматривались как исключительно эукариотические по происхождению. Однако, выявленный Нер-ландом с соавторами 18 кД- антиген М. leprae оказался частично гомологичным малым белкам теплового шока (Norland et al., 1988) и, соответственно, аА-крисТаллину быка (Lindquist, Craig, 1988).

Оверхсемейство бета/гамма-кристаллинов пополнилось кальций-связывающим белком S - главным компонентом оболочки спор бактерии Myxococcus xantftus - вследствие сходства четырех структурных мотивов типа "греческий ключ" (Wistow et al., 1985). Сюда же относят и белок онкогена щус человека, две области которого имеют гомологию с участками "греческий ключ" рВр-цепи хрусталика быка, превышающую 20% (Crable, 1985).

Применение технологии клонирования позволило установить первичную структуру ряда бета-кристаллиновых цепей нескольких видов позвоночных. С помощью секвенирования клонированной кДНК была определена аминокислотная последовательность рАЗ/А1-крис-таллина коровы ((325/23 по авторской номенклатуре (Gorin,

Horwitz, 1984), цыпленка ((319/26 по номенклатуре исследователей) и мыши - неустановленная ранее N-концевая часть белка (Peterson, Piatigosky, 1986); pBI-кристаллина быка (Quax-Jeuken et al., 1984), крысы (den Duimen et al., 1985) и цыпленка (He^tmancik et al., 1986); рВ2-кристаллина быка (Hogg et al., 1987); j3B3-крисТаллина крысы (den Durmen et al., 1985). На основе анализа клонированных последовательностей генома удалось рассчитать первичную структуру рАЗ/А1 -кристаллина человека (Hogget al., 1986) и pBI-кристаллина крысы (den Dunnen et al., 1986).

Накапливание данных о структуре белков хрусталика позволяет расширить информационную базу об их происхождении и экспрессии в других, помимо линзы, органах и тканях. Как следствие, возникает вопрос о специфичности называемых кристалликами белков.

С эволюционной точки зрения вырисовывается водораздел между а- и p/7-кристаллинами, и ферментами, именуемыми "таксон-специфичными кристаллинами". О другой стороны, и имеющиеся сведения об индукции синтеза оВ-кристаллиновой мРНК в мозге скрэпи-инфи-цированного хомячка как возможном ответе на стрессовую ситуацию в тканях (Duguid et al., 1988), и родство вплоть до тождества "таксон-специфичных кристаллитов" гликолитическим ферментам, индуцируемым тепловым шоком, и гомология а-кристаллинов белкам теплового шока - вкупе позволили высказать гипотезу о прямой причинной связи наличия перечисленных белков в хрусталике и постоянным метаболическим "стрессом", которому подвержена линза вследствие своей анатомической уникальности (de Jong et al., 1989).

Несмотря на то, что хрусталик амфибий является традиционным объектом исследования процессов дифференцировки, а кристаллины изучаются классическими физико-химическими и иммунохимическими методами около трех десятилетий, внедрение методов клонирования заметно ускорило прогресс в данной области. Этому способствовал и уже накопленный огромный экспериментальный материал о специфичных белках хрусталика. До начала наших исследований работ по характеристике кристаллиновых генов амфибий не проводилось. Клонирование комплементарной ДНК хрусталика лягушки Rana temporaria позволяет решить несколько принципиальных задач: ввести в область исследования кристаллиновых генов новый объект - амфибии; получить возможность изучения на новом уровне процессов регенерации и дифференцировки хрусталика; создать основу для анализа структуры кристаллиновых генов а, следовательно, определить как конечное их количество, так и возможную взаимосвязь с генами, контролирующими иные функции клетки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козлов, Константин Андреевич, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Гарбер М.Б.»Решетникова Л.С. Выращивание монокристаллов 7-кристаллинов из хрусталика теленка. // Докл. АН СССР.-1976.-т.226.,Ш 6.-стр. I452-1454.

2. Гаузе Г.Г.»Михайлов А.Т.,Горюнова Л.Е. Выделение кристалли-новых мРНК из хрусталика лягушки Rana temporaria и их характеристика с помощью трансляции в бесклеточной системе. // Докл. АН СССР.-1980.-т.250.»Л 4.-стр. 995-998.

3. Горголюк Н.А.»Михайлов А.Т.»Барабанов В.М. Иммунохимические маркеры дифференцировки хрусталика Rana temporaria в эмбриональном развитии. 2. Иммунохимический анализ появления и локализации отдельных классов белков хрусталика. // Онтогенез.-1978.-Т.9.5.-стр. 449-457.

4. Конюхов Б.В. Генетика развития позвоночных. М.: Наука, 1980.-294 стр.

5. Лопашов Г.В.,Строева О.Г. Развитие глаза в свете экспериментальных исследований. М.: Наука, 1963.-310 стр.

6. Маниатис Т.,Фрич Э.,Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984а.-гл. I.-стр. é-I9.

7. Маниатис Т.,Фрич Э.,Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 19846.-гл. 7.-стр. 218-220.

8. Михайлов А.Т. Иммунохимические маркеры дифференцировки хрусталика Rana temporaria в эмбриональном развитии. I. Состав и свойства водорастворимых антигенов хрусталика. // Онтогенез.-1978.-т.9.5.- стр. 439-448.

9. Михайлов А.Т. Специфические белки хрусталика амфибий. // Докл. АН СССР.-1982.-т.265.I.-стр. 199-201.

10. Михайлов А.Т.Дакенов Ж.А. Изменение клеточной локализации

7-кристаллинов в процессе дифференцировки хрусталика амфибий. // Онтогенез.-1983.-т. 14.,J6 4.-стр. 374-381.

11. Михайлов А.Т.,Горголюк Н.А.Дакенов Ж.А. Специфические белки хрусталика амфибий: иммунохимическая идентификация в нормальном развитии и в экспериментальных условиях. // Иммунологические аспекты биологии развития. М.: Наука, 1984.-стр. 201-216.

12. Речинский В.О.»Савочкина Л.П. ,Бибилашвили Р.Ш. Конструирование плазмидного вектора для клонирования промоторов. // Молек. биология.-1981.-т.I5.,вып. 4.-стр. 950-955.

13. Скобелева Н.А.»Козлов К.А.»Прасолов B.C. и др. Ферментативный синтез и молекулярное клонирование структурного гена а-глобина голубя. // Молек. биология.-1981.-т.15.,вып. 6.-стр. 1224-1233.

14. Фролова Л.Ю.»Скобелева Н.А.»Прасолов B.C.»Киселев Л.Л. Ферментативный синтез полноразмерного структурного гена глобина, содержащего "липкие" концы. // Докл. АН GCCP.-I977.-t.235. 5.-стр. I2II-I2I4.

15. Ашага S.G.,Jonas V.,Rosenfeld M.G. et al. Altematiye RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. // Nature.-1982.-y.298. ,No 5871.-p. 240-244.

16. Asselbergs P.A.M.,Koopmans M.,yan YenrooiJ W.J.,Bloemendal H. Post-translational assembly of lens a-crystallln In the reticulocyte lysate and In Xenopus laevls oocytes. // Eur. Journ. Biochem.-1978a.-Y.91.,No 1.-p. 65-72.

17. Asselbergs P. A.M.,Peters W.H.M. ,van Venrooi;} W.J., Bloemendal H. Inhibition of translation of lens mRNAs in a messenger-dependent reticulocyte lysate by cap analogues. // Biochim. Biophys. Acta.-19786.-y.520.,No 3.-p. 577-587.

18. Asselbergs P.A.M.,Koopmans M.,van YenrooiJ W.J.,Bloemendal H. Improved resolution of calf lens p-crystallins. // Exp. Eye Res.-1979a.-v.28.,No 2.-p. 223-228.

19. Asselbergs P.A.M.»Koopmans M.,van Yenrooi;} W.J.»Bloemendal H. j3-0rystallin synthesis in Xenopus oocytes. // Exp. Eye Res.-1979d.-Y.28.,No 4.-p. 475-482.

20. Bagchi M.,Alcala J.R.,Maisel H. Delta crystallin synthesis by the adult chicken lens. // Exp. lye Res.-1981 .-v.32. ,No 3.-

p. 251-254. »

21. Balbas P.,Soberon X.,Merino E. et al. Plasmid vector pBR 322 and its special-purpose derivatives - a review. // Gene.-1986.-v.50.,No 1-3.-p. 3-40.

22. Beebe B.C.,Platigorsky J. Trans lational regulation of 5-crystallin synthesis during lens delopment in the chicken embryo. // Dev. Biol.-1981.-v.84.,No 1.-p. 96-101.

23. Berbers G.A.M.,Boerman 0.0.,Bloemendal H.,de Jong W.W. Primary gene products of bovine p-crystallin and reassociation behavior of Its aggregates. // Eur. Journ. Biochem.-1982.-v.128.,No 2-3.-p. 495-502.

24. Berbers G.A.M.,Hoekman W.A.»Bloemendal H. et al. Proline-and alanine-rich N-terminal extension of the basic bovine p-crystallin B1 chains. // FEBS Lett.-1983.-v.161.,No 2.-p. 225-229.

25. Berbers G.A.M.,Hoekman W.A.»Bloemendal H. et al. Homology between the primary structures of the ma 13 or bovine p-crystallin chains. // Eur. Journ. Biochem.-1984.-v.139. ,No 3.-p. 467-479.

26. Berns A.J.M.,de Abreu R.,van Kraaikamp M. et al. Syntesis of lens proteins In vitro. V. Isolation of messenger-like RNA

from lens by high, resolution zonal centrifLigation. FEES Lett.-19T1 .-y.I 8. ,No l.-p. 159-163.

27. Berns A.J.M. ,Strous G.J.A.M. ,Bloemendal H. Heterologous in vitro synthesis of lens a-crystallin polypeptide. // Nature New Biol.-1972a.-Y.236.,No 1.-p. 7-9.

28. Berns A.J.M.,van Kraaikamp M.,Bloemendal H.,Lane G.D. Calf crystallin synthesis in frog cells: the translation of lens-cell 14 S RNA in oocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1972d. -y.69.,No 6.-p. 1606-1609.

29. Berns A. J.M. ,Schreurs V.V.A.M., van Kraaikamp M.W.G., Bloemendal H. Synthesis of lens protein in vitro. Translation of calf-lens messengers in heterologous systems. // Eur. Journ. Blochem.-1973.-v.33.,No 3.-p. 551-557.

30. Bhat S.P.,Jones R.E.,Sullivan M.A.,Piatigorsky J. Chicken lens crystallin DNA sequences show at least two 5-crystallin genes. // Nature.-1980.-v.284.,No 5753.-p. 234-237.

31. Bhat S.P. ,Nagineni N. aB subunit of lens-specific a-cristallin Is present In other ocular and non-ocular tissues. //Biochem. Biophys. Res. Commun.-1989.-v.158.,No 1.-p. 319-325.

32. Bhat S.P. ,Piatigursky J. Molecular cloning and partial characterization of 5-crystallin cDNA sequences in a bacterial plasmid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1979.-v.76.,No 7.-p. 3299-3303.

33. Bindels J.G.,Bessems G.J.J.,de Man B.M.,Hoenders H.J. Comparative and age-dependent aspects of crystallin size and distribution in human, rabbit, bovine, rat, chicken, duck, frog and dogfish lenses. // Cornp. Biochem. Physiol.-1983.-v.76B. ,No 1.-p. 47-55.

34. Bindels J.G.,Koopers A.,Hoenders H.J. Structural aspects of

boYine ¡3-crystallins: physical characterisation including dissociation-association behavior. // Exp. Eye Res.-1981.-v.33.,No 3.-p. 333-343.

35. Birnboim H.C.,Doly J. A rapid alkalain extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res.-1979.-V.7.,No 6.-p. 1513-1523.

36. Bishop J.O. Molecular hybridisation of RNA with a large excess of DNA. // Biochem. Journ.-1972.-y.126.,No 1.-p. 171-185.

37. BJork I. Studies on 7-erystallIn from calf lens. I. Isolation by gel filtration. // Exp. Eye Res.-1961 .-v.1. ,N0 3.-p. 145-154.

38. B^ork I. Studies on 7-erystallin from calf lens. II. Purification and some properties of the main protein components. // Exp. Eye Res.-1964.-Y.3.,N0 4.-p. 254-261.

39. Bjork I. Studies on 7-crystallIn from calf lens. III. Comparison of the the main protein components by peptide mapping. // Exp. Eye Res.-1970.-Y.9.,No 2.-p. 152-157.

40. Bloemendal H. Report on the symposium on the biochemistry of the lens. // Exp. Eye Res.-1969.-y.8.,N0 3.-p. 227-240.

41. Bloemendal H. The Yertabrate eye lens. // Science.-1977.-Y.197.,No 4299.-p. 127-138.

42. Bloemendal H. The lens proteins. // Molecular and cellular biology of the eye lens. / Ed. H. Bloemendal. N.Y.: John Wiley & Sons, 1981.-p. 1-47.

43. Bloemendal H. Lens proteins. // Critical Reviews In Biochem.-1982.-y.12.,No 2.-p. 1-38.

44. Bloemendal H. Lens researh: from protein to gene. // Exp. Eye Res.-1985.-y.41.,No 4.-p. 429-448.

45. Bloemendal H.,Berns A.J.M.,van der Ouderaa F.,de Jong

W.W.W. Evidence for a "non-genetic" origin of the A1 chains of a-crystallln. // Exp. Eye Res.-1972.-y.14.,No 1.-p. 80-84.

46. Bloemendal H.,Bems T.,Zweers A. et al. The state of aggregation of a-crystallin detected after large-scale preparation by zonal centrifligation. // Eur. Journ. Biochem.-1972.-v.24.,No 3.-p. 401-406.

47. Bloemendal H. »Groenewoud G. One-step separation of the sub-units of a-crystallin by chromatofocusing in 6 M urea. // Analyt. Biochem.-1981 .-v. 117. ,No 2.-p. 327-329.

48. Bloemendal H.,Vermorken A.J.I. ,Kibbelaar M. et al. Nomenclature for the polypeptides of the lens membranes. // Exp. Eye Res.- 1977(5.-y.24.,No 3.-p. 413-415.

49. Bloemendal H.,Zweers A.,Koopmans M.,van den Broek W. Improved separation of the alkaline RNAse-inhibitor from eye lens and electrophoretic demonstration of its subunits. // Biochim. Biophys. Res. Gommun.-1977a.-v.77.,No 2.-p. 416-425.

50. Bloemendal H.,Zweers A.,Vermorken F. et al. The plasma membranes of eye lens fibers: biochemical and structural characterization. // Cell Differ.-1972.-v.1.,No 2.-p. 91-106.

51. Blow A.M.J.,van Heyningen R. .Barrett A.J. Metal-dependent proteinase of the lens. Assay purification and properties of the bovine enzyme. // Biochem. Journ. -1975.-v. 145.,No 3. -p. 591-599.

52. Blundell T.,Lindley P.,Miller L. et al. The molecular structure and stability of the eye lens: X-ray analysis of 7-crystallin II. // Nature.-1981.-v.289.,No 5800.-p. 771-777.

53. Blundell T.L..Lindley P.P.,Moss D.S. et al. The low-resolution structure analysis of the lens protein 7-crystallin. // Acta Grystallographica.-1978.-v.B34.,Pt. 12.-p. 3653-3657.

54. Body P..Bloemendal H. Simultaneous separation of all lens crystallin subunits by chromatofocusing. // PEBS Lett.-1988.-v.232.,No 1.-p. 39-45.

55. Bolivar F.,Betlach M.O. ,Heynecker H.L. et al. Origin of replication of pBR 345 plasmid BNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977B.-V. 74.,No 12.-p. 5265-5269.

56. Bolivar F. ,Rodrigues R.L.,Betlach M.C.,Boyer H.W. Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicil-lin-resistant derivatives of the plasmid pMB 9. // Gene.-1977a.-v.2.,No 2.-p. 75-93.

57. Bolivar F.,Rodrigues R.L.,Greene P.J. et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. // Gene.-1977(3.-v.2. ,No 2.-p. 95-113.

58. Bollum F.J. »Groeniger E.,Yoneda M. Polydeoxyadenylic acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1964.-v.51.,No 5.-p. 853-859.

59. Bours J. Free isoelectric focussing of bovine lens 7-crystallin. // Exp. Eye Res.-1973.-v.16.,No 6.-p. 501-515.

60. Bossier P.,Pitch I.T.,Tuite M.P. Structure and expression of a yeast gene encoding the small heat-shock protein Hsp 26. // Gene.-1989.-v.78.,No 2.-p. 323-330.

61. Bours J. Isoelectric focussing and immunochemistry of lens crystallins. // Docum. 0phtalmologica.-1974.-v.37. ,No 1 .-p. 146.

62. Bours J.,Delmotte P. Age-dependent variations In the composition of the crystallins and albuminoid of the mouse lens studied by Isoelectric focusing and Isotachophoresis. // Sci. Tools.-1979.-v.26.,No 4.-p. 58-64.

63. Bower D.J. ,Errirjgton L.H. ,Wainwright N.R.,Sime 0. et al. Cytoplasmic RNA sequences complementary to cloned chick

O-crystallin cDNA show size heterogeneity. // Biochem. Journ. -1982a.-v.201.,No 1-2.-p. 339-344.

64. Bower D.J. »Pollock B.J.,Clayton R.M. High levels of S-crystallin precursor RNA in early development of chick lens cells. // Stability and switching in cellular differentiation. / Eds. R.I. Clayton, D.E.S. Truman. N.Y.: Plenum Press, 1982C5.-p. 445-450.

65. Brahma S.K. Ontogeny and localization of pre-a crystal!In antigen in Rana temporaria lens development. // Exp. Eye Res.-197T.-V.25., No 3.-p. 311-315.

66. Brahma S.K. Isofocusing and Immunoelectrophoretic studies of soluble eye lens proteins from regenerated and normally developed Xenopus laevis. // Exp. Eye Res.-1980.-v.30.,No 3.-p. 269-275.

67. Brahma S.K.,Bours J. Thin layer Isoelectric focusing of the soluble lens extracts from larval stages and adult Xenopus laevis. // Exp. Eye Res.-1972.-v.13.,No 4.-p. 309-314.

68. Brahma S.K.»McDevitt D.S. Ontogeny and localization of gam-ma-crystallins in Rana temporaria, Ambystoma mexicanum and Pleurodeles waltlii normal lens development. // Exp. Eye Res.-1974.-v.19.,No 4.-p. 379-387.

69. Brahma S.K.,Rabaey M.,van Doorenmaalen W.J. Ontogeny and localization of 7-crystallin antigen In the developing pigeon (Columbia livia) lens. // Exp. Eye Res.-1972.-v.14. ,N0 2.-p. 130-134.

70. Brahma S.K.,Starre H.v.d. Studies on biosynthesis of soluble lens crystallln antigens in the cnick by isoelectric focusing In thin- layer polyacrylamide gel. // Exptl. Cell Res.-1976.-v.97.,No 1.-p. 175-183.

71. Brahma S.K.,van Doorenmaalen W.J. Study of the soluble lens proteins from different amphibian species. // Exp. Eye Res.-1969.- Y.8.,No 2.-p. 168-171.

72. Brahma S.K.,Yan Doorenmaalen W.J. Preparation of specific antiserum against Rana esculenta pre-a lens crystallin. // Experientla.-1976.-y.32.,No 7.-p. 930-931.

73. Broach J.R.,Hicks J.B. Replication and recombination functions associated with the yeast plasmid, 2ji circle. // Cell.-1980.-Y.21., No 2.-p. 501-508.

74. Broome S.,Gilbert W. Immunological screening method to detect specific translational products. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1978.-Y.75.,No 6.-p. 2746-2749.

75. Burd J.P.,Wells R.D. Synthesis and characterization of the duplex block polymer a(C15A15)*a(T15G15). // Journ. Biol. 0hem.-1974.- y.249.,No 22.-p. 7094-7101.

76. Cabello F.,TImmis K.,Cohen S.N. Replication control In a composite plasmid constructed by in Yitro linkage of two distinct replIcons. // Nature.-1976.-y.259.,No 5541.-p. 285-290.

77. Campbell J.C.,Clayton R.M.,Truman D.E.S. Antigens of the lens of Xenopus laeYis. // Exp. Eye Res. -1968. -y .7.,No 1. -p. 4-10.

78. Chen J.H.,Spector A. The bicistronic nature of lens a-crystallin 14 S mRNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977a.-Y.74.,No 12.-p. 5448-5452.

79. Ghen J.H.,Spector A. Isolation and characterization of initiation fragments from lens 10 S and 14 S a-crystallin messenger ribonucleic acids. // Biochemistry.-1977ô.-y. 16.,No 3.-p. 499-505.

80. Chiou S.-H. Biochemical characterization of crystallins

from frog lenses. // Int. Journ. Peptide Protein Res.-1987.-y.30.,No 1.-p. 108-116.

81. Chiou S.-H.,Chang W.-C.,Kuo J. et al. Biochemical comparison of 7-crystallIns from duck and frog eye lenses. // FEBS Lett.-1986.-v.196.,No 2.-p. 219-222.

82. Chirgadze Yu.N.,NIkonoY S.V.,Garber M.B.,ReshetnikoYa L.S. Crystallographic study of 7-crystallins from calf lens. // Journ. Mol. Biol.-1977.-y.110.,No 3.-p. 619-624.

83. Clarke L.,Carbon J. Biochemical construction and selection of hybrid plasmids containing specific segments of the Escherichia coli genome. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1975.-v.72.,No 11.-p. 4361-4365.

84. Clarke L.,Carbon J. A colony bank containing synthetic Col E1 hybrid plasmids represent at lye of the entire E. coll genome. // Cell.-1976.-y.9.,No 1.-p. 91-99.

85. Clayton R.M. Comparative aspects of lens proteins. // The Eye. / Eds. H. Davson, L.T. Graham. N.Y.: Academic Press, 1974.-v.5.-p. 399-494.

86. Clayton R.M.,Campbell J.0.,Truman D.E.S. A re-examination of the organ specificity of lens antigens. // Exp. Eye Res.-1968.-y. 7.,No 1.-p. 11-29.

87. Clewell D.B. Nature of Col E1 plasmid replication in Escherichia coll In the presence of chloramphenicol. // Journ. of Bacterlol.-1972.-y.110.,N0 2.-p. 667-676.

88. Clewell D.B.,Helinsky D.R. Properties of a supercoiled deoxyribonucleic acid-protein relaxation complex and strand specificity of the relaxation event. // Biochemistry.-1979.-v.9.,N0 22.-p. 4428-4440.

89. Cochet M.,Perrin P.,Gannon P. et al. Cloning of an almost

full-length chicken conalbumin double-stranded cDNA. // Nucl. Acids Res.-1979.-v.6.,No 7.-p. 2435-2452.

90. Cohen L.H.,Smits D.P.E.M.,Bloemendal H. Isolation and characterization of rat-lens messenger RNAs. // Comparison of lens proteins, synthesized In lens culture and in homologous and heterologous cell-free systems. // Eur. Journ. Biochem.-1976.-y.67.,No 2.-p. 563-572.

91. Cohen L.H.,Westerhuis L.W.,de Jong W.W..Bloemendal H. Rat a-crystallin A chain with an Insertion of 22 residues. // Eur. Joum. Biochem.-1978.-v.89.,No 1.-p. 259-266.

92. Cohen S.N.,Chang A.C.Y. Recirculation and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment In Esherihia coli transformants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1973.-y.70.,No 5.-p. 1293-1297.

93. Cohen S.N.,Chang A.C.Y.,Boyer H.W.»Helling R.B. Construction of biologically functional bacterial plasmids In Yitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1973.-y.70.,No 11.-p. 3240-3244.

94. Cohen S.N.,Chang A.C.Y.,Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance In bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-Pactor DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1972.-y.69.,No 8.-p. 2110-2114.

95. Covarrubias L.,Cervantes L.,Covarrubias A. et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. V. Mobilization and coding properties of pBR 322 and several deletion derivatives including pBR 327 and pBR 328. // Gene.-1981.-v.13.,No 1.-p. 25-35.

96. Crable J.C. Partial sequence homology of human myc oncogene protein to beta and gamma crystallins. // PEBS Lett.-1985.-v.181., No 1.-p. 157-159.

9T. Groft L.R. The amino acid sequence of 7-crystallin (Fraction II) from calf lens. // Biochem. Journ.-1972.-Y.128.,No 4.-p. 961-970.

98. Cuypers H.Th.,Yan Loon-Klaassen L.A.H.,Vree Egberts W.T.M. et al. The primary structure of leucine aminopeptidase from bovine eye lens. // Joum. Biol. Ghem.-1982.-v.257. ,N0 12.-p. 7077-7085.

99. Darnell J.E.,3r. Variety In the level of gene control In eukaryotic cells. // Nature.-1982.-v.297.,N0 5865.-p. 365-371.

100. David I.B.,Wahli W. Application of recombinant DNA technology to questions of developmental biology: a review. // Developm. Biol.- 1979.-v.69.,No 1.-p. 305-328.

101. Davidson E.H. Gene activity in early development.-Orlando-San Diego, etc.: Academic Press, 1986.-670 p.

102. Day T.H.,Clayton R.M. Intraspecific variation In the lens proteins. // Biochem. Genet.-1973.-v.8.,No 2.-p. 187-203.

103. De Jong W.W.,Cohen L.H. ,Leunissen J.A.M. ,Zweers A. Internally elongated rodent a-crystallin A chain: resulting from Incomplete RNA splicing. // Biochim. Biophys. Res. Commun.-1980.-v.96.,No 2.-p. 648-655.

104. De Jong W.W. ,Hendriks W. »Mulders J.W.M.,Bloemendal H. Evolution of eye lens crystallins: the stress connection. // Trends Biochem. Sci.-1989.-v.14.,N0 9.-p. 365-368.

105. De Jong W.W. ,Leunissen J.A.M. ,Leenen P.J.M. et al. Dogfi3h a-crystallin sequences. Comparison with small heat shock proteins and Shlstosoma egg antigen. // Journ. Biol. Chem.-1988.-V.263.,No 11.-p. 5141-5149.

106. De Jong W.W.,Stapel S.0.,Zweers A. A comparison of avian and reptilian 5-crystallin. // Gomp. Biochem. Physiol.-1981.-

Y.69B.,No 3.-p. 593-598.

107. De Jong W.W.,van der Ouderaa P.J.,Versteeg M. et al. Primary structures of the a-crystallln A chains of seven mammalian species. // Eur. Joum. Biochem.-1975.-v.53.,No 1.-p. 237-242.

108. De Pomeral D.I.,Ellis D.K.,Carr A. A lamprey lens protein related to avian and reptilian 5-crystallin. // Ourr. Eye Res.-1984.- Y.3.,No 5.-p. 729-735.

109. Dean D. A plasmid cloning vector for the direct selection of strains carrying recombinant plasmids. // Gene. -1981. -y.15. fNo 1 .-p. 99-102.

110. Delcour J.,Bouchet H. Evidence for a post-translational origin of subunlt oBI in the bovine lens a-crystallln. // Exp. Eye Res.- 1978.-v.26.,No 2.-191-195.

111. Delcour J.,0daert S.,Bouchet H. Stability of the protein synthesis machinery in the bovine lens. // Colloq. INSERM.-1976.-V.60.,No 1.-p. 39-47.

112. Delcour J.,Papaconstantinou J. Biochemistry of bovine lens proteins. IV. Synthesis and aggregation of a-crystallln sub-units In differentiating lens cells. // Journ. Biol. Chem.-1972.-V. 247.,No 10.-p. 3289-3295.

113. Delcour J. ,Papaconstantinou J. A change in the stoichio-metry of assembly of bovine lens a-crystallln subunits In relation to cellular differentiation. // Biochim. Biopys. Res. Commun.-1974.-v. 57.,No 1.-p. 134-141.

114. Den Dunnen J.T. .Moormann R. J.M. ,Lubsen N.H.,Schoenmakers J.G.G. Concerted and divergent evolution within the rat 7-crystallin gene family. // Journ. Mol. Biol.-1986a.-v. 189.,No 1.-p. 37-46.

115. Den Dunnen J.T. .Moormann R.J.M.,Lubsen N.H.»Schoenmakers J.G.G. Intron insertions and deletions in the b/7-crya tallin gene family: The rat ¡3331 gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-19860.-v.83.,No 9.-p. 2855-2859.

116. Den Dunnen J.T. fMoormann R. J.M. »Schoenmakers J.G.G. Rat lens p-crystallins are internally duplicated and homologous to 7-crystallIns. // Biochim. Biophys. Acta.-1985.-y.824.,N0 4.-p. 295-303.

117. Denliardt D.T. A membrane filter technique for the detection of complementary DNA. // Biochim. Biophys. Res. Oommun.-1966.-y.23., No 2.-p. 641-646.

118. Dilley K.J.,Harding J.J. Changes in proteins of the human lens In development arid aging. // Biochim. Biophys. Acta.-1975.-y.386.,N0 4.-p. 391-408.

119. Dodemont H. J. ,Andreoli P.M. »Moormann R.J.M. et al. Molecular cloning uf mRNA sequences encoding rat lens crystallins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-y.78.,No 9.-p. 5320-5324.

120. Driessen H.P.O. ,Herbrink P.»Bloemendal H.,de Jong W.W. Primary structure of the bovine beta-crystallin Bp chain. // Eur. Journ. Biochem.-1981.-v.121.,N0 1.-p. 83-91.

121. Buguld J.R.,Rohwer R.G.,Seed B. Isolation of cBNAs of scraple-modulated RNAs by subtractive hybridisation of a cDNA library. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1988.-v.85.,N0 15.-p. 5738-5742.

122. Dworkin M.B.,Dawid I.B. Use of a cloned library for the study of abundant poly(A)+RNA during Xenopus laevis development. // Developm. Biol.-1980.-v.76.,N0 2.-p. 449-464.

123. Erlich H.E.,Cohen S.N.,McDevitt H.O. A sensitive radioimmunoassay for detecting products translated from cloned DNA

fragments. // Oell.-19T8.-y.13.,N0 4.-p. 681-689.

124. Errington L.H.,Slme 0.,0layton R.M. Hybridization selection and cell free translation of mRNA from a 5-crystallin gene. // Stability and switching In cellular differentiation. / Eds. R.M. Clayton, D.E.S. Truman. N.I.: Plenum Press, 1982.-p. 451-453.

125. Favre A.,Bertazzoni U. The poly(A) content and secondary structure of the 14 S calf lens messenger RNA. // Biochim. Biophys. Res. Coirimun.-19T4.-y.56. ,No 1 .-p. 273-280.

126. Femald R.D.,Wright S.E. Maintenance of optical quality during crystalline lens growth. // Nature.-1983.-y.301. ,No 5901.-p. 618-620.

12T. Plddes J.G. .Goodman H.M. Isolation, cloning and sequence

analysis of the cDNA for the a-subunit of human chorionic

gonadotropin. // Nature.-19T9.-v.281.,No 5T30.-p. 351 -356. » > ? i

128. Predericq P. ,Betz-Bareau M. Transfert genetique de la

» ? »

propriete colicinogene chez E. coll. // Compt. Rend. Soe. Biol. -1953.-y.14T.-p. 1110-1112.

129. Genis-GalYez J.M.,Maisel H.,Castro J. Changes in chick lens proteins with ageing. // Exp. Eye Res.-1968.-y.T.,No 6.-p. 593-602.

130. Gilbert U.,Hoffman B.J. A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. // Gene.-1983.-y.25.,No 2-3.-p. 263- 269.

131. Gilbert W. Why genes in pieces ? // Nature.-1978.-v.271.,No 5645.- p. 501 .

132. Gillespie D. ,Spiegelman S. A quantative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. // Joum. Mol. Biol.-1965.- y.I2.,No 3.-p. 829-842.

133. Goeddel D.V.,Shepard H.M.fYelverton E. et al. Synthesis of human fibroblast interferon by Escherichia coll. // Nucl. Acids Res.- 1980.-y.8.,No 18.-p. 4057-4074.

134. Gordon J.I.,Burns A.T.H.,Christmann J.L.,Deeley R.G. Cloning of double-stranded cDNA that codes for a portion of chicken preproalbumin. A general method for Isolating a specific DNA sequence from partially purified mRNA. // Journ. Biol. Chem.-1978.-y.253.,No 23.-p. 8629-8639.

135. Gorin M.B.,Horwlts J. Cloning and characterisation of a cow beta crystallin cBNA. // Curr. Eye Res.-1984.-v.3.,No 7.-p. 939-948.

136. Granger M.,Tesser G.I.,de Jong W.W.,Bloemendal H. Model studies of enzymatic NH2-terminal acetylation of proteins with des-Nalfal-acetyl-alfa-melanotropin as a substrate. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1976.-v.73.,No 9.-p. 3010-3014.

137. Grunsteln M.,Hogness D.S. Colony hybridization: A method for the Isolation of cloned BNAs that contain a specific gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1975.-v.72.,No 10.-p. 3961-3965.

138. Hanson H.,Glasser D.,Kirschke H. Leucinaminopeptidase aus Rlnderaugenllnsen. Kristallisation, Eigensehaften und optimale Wirkungswelse. // Hoppe-Seil. Zeit Piiysiol. Chem.-1965.-y.340.,No 1.-p. 107-125.

139. Harding J.J. ,Dilley J. Structural proteins of the mammalian lens: A review with emphasis on changes in development, aging and cataract. // Exp. Eye Res.-1976.-v.22.,No 1.-p. 1-73.

140. Heidecker G.,Messing J. Sequence analysis of zeln cDNAs obtained by an efficient mRNA cloning method. // Nucl. Acids Res.-1983.- v.11. ,No 14.-p. 4891-4906.

141. Hejtmancik J.P.,PIatigorsky J. Diversity of p-crystallin

mRNAs of the chicken lens. Hybridization analysis with cDNA clones. // Journ. Biol. 0hem.-1983.-Y.258.,No 5.-p. 3382-3387.

142. He Jtmanc ik J.P.,Thompson M.A.,Wis tow G.,Piat igorsky J. cDNA and deduced protein sequence for the pB1-crystallin polypeptide of the chicken lens. Conservation of the PAPA sequence. // Journ. Biol. Chem.-1986.-v.261.,No 2.-p. 982-987.

143. Hejtmancik J.P.,Wingfield P.T..Chambers C. et al. Association properties of beta B2- and beta A3-crystallin: ability to form dimers. // Prot. Erigin.-1997.-y. 10. ,No 11.- p. 1347- 1352.

144. Hendriks W.,Mulders J.W.M.,Bibby M.A. et al. Duck lens e-crystallin and lactate dehydrogenase B4 are Identical: a single-copy gene product with two distinct functions. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1988.-v.85.,No 19.-p. 7114-7118.

145. Herbrink P.»Bloemendal H. Studies on (3-crystallin. I. Isolation and partial characterization of the principal polypeptide chain. // Biochim. Biophys. Acta.-1974.-y.336.,No 3.-p. 370-382.

146. Herbrink P.,van Westreenen H. .Bloemendal H. Puther studies on the polypeptide chains of (3-crystallin. // Exp. Eye Res.-1975.-v.20.,No 6.-p. 541-548.

147. Hershfield V.,Boyer H.W..Yanofsky C. et al. Plasmid Col El as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1974.-v.71.,No 9.-p. 3455-3459.

148. Hertzberg E.I. .Anderson D.J. .Priedlander M.,Gilula N.B. Comparative analysis of the mayjor polypeptides from liver gap Junctions and lens fiber Junctions. // Journ. Cell Biol.-1982.-v.92.,No 1.-p. 53-59.

149. Higuchi R. .Paddock G.Y.,Wall R.,Salser W. A general method for cloning eucariotic structural gene sequences. // Proc.

Natl. Acad. Scl. U3A.-19T6.-Y.T3.,No 9.-p. 3146-3150.

150. Hockwln 0.,0hrloff C. Enzymes In normal, aging and catar-actous lenses. // Molecular and cellular biology of the eye lens. / Ed. H. Bloemendal. N.Y.: John Wiley & Sons, 1981 .-p. 367-414.

151. Hogg D.,Gorin M.B.,Heinzmann 0. et al. Nucleotide sequence for the cDNA of the bovine beta-B2 crystallin and assignment of the orthologous human locus to chromosome-22. // Ourr. Eye Res.-1987.-v.6.,No 11.-p. 1335-1342.

152. Hogg D.,fsul L.-O.,Gorin M.,Breitman M.L. Characterization of the human j3-crystallln gene HubA3/A1 reveals ancestral relationships among the (37-crystallin superfamily. // Journ. Biol. Ohem.-1986.-v.261.,No 26.-p. 12420-12427.

153. Huang Q.L.,Russel P.,Stone S.H.,Zigler J.S. Zeta-crystallin, a novel lens protein from the guinea pig. // Current Eye Res.-1987.-v.6.,No 5.-p. 725-732.

154. Humphreys G.O.,Willshaw G.A..Anderson E.S. A simple method for the preparation of large quantaties of pure plasmid DNA. // Biochim. Biophys. Acta.-1975.-v.383.,No 4.-p. 457-463.

155. Inana G.,Piatigorsky J.,Norman B. et al. Gene and protein structure of a ¡3-crystallin polypeptide in murine lens: relationship of exons and structural motifs. // Nature.-1983.-v.302.,No 5906.-p. 310-315.

156. Inana G.,Shinohara T.,Maisel J.V.,3r.,Piatigorsky J. Evolution and diversity of the crystallins. Nucleotide sequence of a (3-crystallin mRNA from the mouse lens. // Journ. Biol. Chem.-1982.-V.257.,No 15.-p. 9064-9071.

157. Ingolia T.D.,Craig E.A. Pour small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian

a-crystallln. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1982.-v.79.,No 7.-p. 2360-2354.

158. Jackson J.P..Clayton R.M.»Williamson R. et al. Sequence complexity and tissue distribution of chick lens crystallin mRNAs. // Developm. Biol.-1978.-v.65.,No 2.-p. 383-395.

159. Jones R.I.,Bhat S.P..Sullivan M.A.,Pitigorsky J. Comparison of two 5-crystallin genes In the chicken. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1980.-v.77.,No 10.-p. 5879-5883.

160. Jurand A.,Yamada T. Elimination of mitochondria during wolfian lens regeneration. // Exp. Cell Res.-1967.-v.46.,No 3.-p. 636-638.

161. Kato K.,HImeno S.,Takahashi Y. et al. Molecular cloning of human gastrin precursor cDNA. // Gene.-1983.-v.26.,No 1.-p. 5357.

162. Kibbelaar M. ,Bloemendal H. The topography of lens proteins based on chromatography and two-dimensional gel electrophoresis. // Exp. Eye Res.-1975.-v.21.,No 1.-p. 25-36.

163. Kibbelaar M.A..Selten-Versteegen A.M.E.,Dunia I. et al. Actin In mammalian lens. // Eur. Journ. BIochem.-1979.-v.95. ,No 3.-p. 543-549.

164. King C.R. ,Piatigorsky J. Alternative RNA splicing of the murine oA-crystallln gene: protein-coding information within an intron. // Cell.-1983.-v.32.,No 3.-p. 707-712.

165. King C.R.,Shinohara T. ,PIatigorsky J. aA-crystallin messenger RNA of the mouse lens: more non-coding than coding sequences. // Science.-1982.-v.215.,No 4535.-p. 985-987.

166. Klein R.D.,Seising E. .Wells R.D. A rapid microscale technique for isolation of recombinant plasmid DNA suitable for restriction enzyme analysis. // Plasmid.-1980.-v.3.,No l.-p.

88-91.

16T. Kodama R.,Eguchi G. Characterization of an antiserum against feather keratins of the chick: its crossreactiun with lens protein, 6-crystallin. // Develop., Growth and Differ.-1983.-v.25.,No 3.-p. 261-270.

168. Kondoh H.,Yasuda K.,0kada T.S. Tissue-specific expression of a cloned chick 6-crystallln gene in mouse cells. // Nature.-1983.-V.301.,No 5899.-p. 440-442.

169. Korochkin L. Gene Interactions In Development.-N.Y.Berlin- Heidelberg: Springer-Verlag, 1981.-312 p.

170. Kramps H.A.,Stols A.L.H.,Hoenders H.J.,de Groot K. On the quartemary structure of higii-mo 1 ecular-weight proteins from the bovine eye lens. // Eur. Journ. Biochem.-1975.-v.50.,No 3,-p. 503-509.

171. Kurtz D.T. ,Nicodeiiius C.P. Cloning of a2u globulin cDNA using a high efficiency technique for the cloning of trace messenger RNAs // Gene.-1981.-v.13.,No 2.-p. 145-152.

172. Kuwabara T. The maturation of the lens cell: a morfologic study. // Exp. Eye Res.-1975.-v.20.,No 4.-p. 427-436.

173. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature.-1970.-V.227.,No 5259.-p. 680-685.

174. Laskey L.A.,Lev Z.,XIn J.-H. et al. Messenger MA prevalence in sea urchin embryos measured with cloned cDNAs. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1980.-v.77.,No 9.-p. 5317-5321.

175. Lavers G.C.,Chen J.H.,Spector A. The presence of poly-riboadenylic acid sequences In calf lens messenger RNA. // Journ. Mol. Biol.-1974.-v.82.,No 1.-p. 15-25.

176. Li L.-K.,Spector A. Circular dichroism and optical rotato-

ry dispersion of the aggregates of purified polypeptides of al-pha-crystallin. // Exp. Eye Res.- 19T4.-v.19.fNo 1.-p. 49-5T. ITT. Lindquist S.,Craig E.A. The heat-shock proteins. // Annu. Rev. Genet.-1988.-v.22.-p. 631-6TT.

1T8. Lobban P.E.,Kaiser A.D. Enzymatic end-to-end joining of DNA molecules. // Journ. Mol. Biol.-19T3.-v.T8.,No 3.-p. 453-4T1 .

179. Maisel H. fLangman J. An Immuno-embryological study on the chick lens. // Joum. Embryol. Exp. Morphol.-1961.-v.9.,Pt. 1. -p. 191-201.

180. Maizel J.Y. ,Lenk R.P. Enhanced graphic matrix analysis of nucleic acid and protein sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-v.78.,No 12.-p. 7665-7669.

181. Malinowski K.,Manski W. Immunochemical studies on lens protein-protein complexes II. On the mechanism of alpha-beta-gamma crystallln complex formation. // Exp. Eye Res.-1980.-v.30.,N0 6.-p. 527-536.

182. Mandel M.,Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. /7 Journ. Mol. Biol.-1970.-v.53.,No 1.-p. 159-162.

183. Maniatis T.,Jeffrey A.,van deSande H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. // Biochemistry.-1975.-v.14.,N0 17.-p. 3787-3794.

184. Manski W. .Halbert S.P. Immunochemical investigation on the phylogeny of lens proteins. // Protides of the biological fluids. Proceedings of the twelfth colloq., Bruge, 1964. / Ed. H. Pecters. Amsterdam: Elsevier, 1965.-p. 117-134.

185. Manski W.,Malinowski K. Comparison of a-crystallin A and B chains in their dissociated and associated states. // Exp. Eye

Res.-1980.-v.31.,No 6.-p. 581-590.

186. Mathews M.B.,0sbom M.,Berns A.J.M.,Bloemendal H. Translation of two messenger RNAs from lens In a cell-free system from Krebs II ascites cells. // Nature New Biology.-1972.-y.236. ,No 1.-p. 5-7.

187. McAYoy J.W. Cell division, cell elongation and distribution of a, p- and 7-crystallins In the rat lens. // Journ. Embriol. Exp. Morphol.-1978.-y.44.-p. 149-165.

188. McDevitt D.S. Separation and characterization of the lens proteins of the amphibian, Rana pipiens. // Journ. Exp. Zool.-1967.-y. 164.,No 1.-p. 21-30.

189. McDevitt D.S. Sequential appearance of a, ¡3 and 7-crystallins in embryonic and metamorphlc Rana pipiens. // Experientla.-1972.-v.28.,No 10.-p. 1215-1217.

190. McDevitt D.S. The crystallins of normal and regenerated newt eye lenses. // Stability and switching In cellular differentiation. / Eds. R.M. Clayton, D.E.S. Truman. N.Y.: Plenum Press, 1982.-p. 177-186.

191. McDevitt D.S.,Brahma S.K. Ontogeny and localization of the a, p and 7 crystallins in newt eye lens development. // Developm. Biol.- 1981.-v.84.,No 2.-p. 449-454.

192. McDevitt D.S..Brahma S.K. Ontogeny and localization of the crystallins during embryonic lens development in Xenopus laevis. // Journ. Exp. Zool.-1973.-v.186.,Nc> 2.-p. 127-140.

193. McDevitt D.S.,Collier C.R. The lens proteins of eastern North American salamanders, and their application to urodelian systematics. // Exp. Eye Res.-1975.-v.21.,No 1.-p. 1-8.

194. McDevitt D.S.,Croft L.R. On the existence of 7-crystallin in the bird lens. // Exp. Eye Res.-1977.-v.25. ,N0 5.-p. 473-

195. McDevitt D.S.,Mesa I.,Yamada T. Inmunofluorescence localisation of the crystallina in amphibian lens development, with special reference to the 7-erystallins. // Developm. Biol.-1969.-v.I9.,No 6.-p. 581-607.

196. McDevitt D.S.,Yamada T. Acquisition of antigenic specificity by amphibian lens epithelial cells in culture. // Amer. Zool.-1969.-v.9.,No 4.-p. 1130-1131.

197. McGrath J.P.,0apon D.J.,Smith D.H. et ai. Structure and organisation of the human Ki-ras prot©-oncogene and a related processed pseudogene. // Nature.-1983.-v.304.,No 5926.-p.501 -506.

198. McKenney K.,Shimatake H.,Court D. et al. A system to study promoter and terminator signals recognized by E. coli RNA polymerase. // Gene amplification and analysis. Vol. II. Structural analysis of nucleic acids. / Eds. J.G. GhirikJIan, T.S. Papas. North Holland, N.Y.: Elsevier, 1981.-p. 383-415.

199. McReynolds L.A.,Monahan J.J.,Bendure D.W. et al. The ovalbumin gene. Insertion of ovalbumin gene sequences in chimeric bacterial plasmlds. // Joum. Biol. Chem.-1977.-v.252.,N0 6.-p. 1840-1843.

200. MeliI M.,Whitfield C.,Rao K.V. et al. DNA-RNA hybridization in vast DNA excess. // Nature New Biology.-1971 .-v.231. ,N0 1.-p. 8-12.

201. Mikhailov A.T.,Korneev A.Ya. The lens proteins In adult and embryos of the periodic albino mutant of Xenopus laevis. // Wilhelm Roux' Arch.-1980.-v. 189.,No 3.-p. 155-163.

Milstone L.M.,Zelenka P.,Piatigorsky J. 5-Crystallin inRNA in chick lens cells: mRNA accumulates during differential stimula-

tion of ö-erystallin synthesis in cultured cells. // Dev. Biol.-1976.-y.48.,No 1.-p. 197-204.

202. Historie L.M.,Zelenka P.»Piatigorsky J. Quantitation of 5-crystallin synthesis and 5-crystallin inRNA in chick lens cells differentiating in vitro. // Journ. Cell Biol.-1974.-v.63. ,No 2.,Pt. 2.-p. 228a.

203. Moormann R.J.I.,den Dünnen J.T.,Bloemendal H.,Schoenmakers J.G.G. Extensive intragenic sequence homology In two distinct rat lens 7-crystallin cDNAs suggests duplications of a primordial gene. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1982.-v.79.,No 22.-p. 6876-6880.

204. Moormann R.J.M. ,den Dünnen J.T. ,Mulleners L. et al. Strict co-linearity of genetic and protein folding domains in an Intragenically duplicated rat lens 7-crystallIn gene. // Joum. Mol. Biol.-1983.-v.171.,N0 4.-353-368.

205. Moormann R.J.M., van der Velden H.M.W., Do demon t H.J. et al. An unusually long non-coding region in rat lens a-crystallin messenger RNA. // Nuel. Acids Res.-1981.-v.9.,N0 19.-p. 48134822.

206. Mömer O.T. Untersuchungen der Pro t e In- subs t ana en In den lichtbrechenden Medien des Auges. // Hoppe-Seyl. Zeit Physiol. Ghem.-1894.-v.18.,No 1 .-p. 61-106.

207. Mulders J.W.M.,Hendriks W., Blankes tei;ln W.M. et al. Ä,-Grystallin, a major rabbit lens protein, is related to hydro-xyacyl-coenzyme A dehydrogenases.// Journ. Biol. Chem.-1988.-v.263.,No 30.-p. 15462-15466.

208. Nagata S.,Taira H. ,Hall A. et al. Synthesis In E. coll of a polypeptide with human leukocyte Interferon activity. // Nature.-1980.-v.284.,N0 5754.-p. 316-320.

209. Nene V. .Dunne B.W.,Johnson K.S. et al. Sequence and expression of a major egg antigen from Schistosoma mansoni. Homologies to heat shock proteins and alpha-crystallIns. // Molec. Biochem. Parasitol.-1986.-Y.21.,No 2.-p. 179-188.

210. Norland A.H. .Mustafa A.S. .Sweetser D. et al. A protein antigen of Mycobacterium leprae Is related to a family of small heat shock proteins. // Journ. Bacterid.-1988.-v.170.,No 12.-p. 5919-5921.

211. Nickerson J.M..Piatigorsky J. Sequence of a complete chicken 5-crystallin cDNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1984.-y.81 ..No 9.-p. 2611-2615.

212. Nothiger R..McDevitt D.S.,Yamada T. Comparison of gamma-crystallins from frog and newt. // Exp. Eye Res.-1971.-v.12.,No 1.-p. 94-98.

213. G'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. // Journ. Biol. 0hem.-1975.-y.250.,No 10.-p. 4007-4021.

214. Ohshima Y. .Suzuki Y. Cloning of silk fibroin gene and its flanking sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977.-v.74.,No 12.-p. 5363-5367.

215. Okayama H.,Berg P. A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts In mammalian cells. // Molec. and Cell. BIol.-l983.-v.3.,No 2.-p. 280-289.

216. Okayama H.,Berg P. High-efficiency cloning of full-length cDNA. // Molec. Cell Biol.-1982.-v.2.,Nu 2.-p. 161-170.

217. Ortwerth B.J..Byrnes R.J. Futher studies on the purification and properties of a ribonuclease inhibitor from lens cortex. // Exp. Eye Res.-1972.-v.14.,No 2.-p. 114-122.

218. Ortwerth B.J.,Byrnes R.J. Properties of a ribonuclease In-

hibltor from bovine lens. // Exp. Eye Res.-1971 .-v. 12.,No 2.-p. 120-127.

219. Ostrer H.,Beebe B.C.,Piatigorsky J. (3-Crystallin mRNAs: differential distribution in the developing chicken lens. // Developm. Biol.-1981 .-v.86.,No 2.-p. 403-408.

220. Ostrer H..Piatigorsky J. p-Grystallins of the adult chicken lens: Relatedness of the polypeptides and their aggregates. // Exp. Eye Res.-1980.-v.30.,No 6.-p. 679-689.

221. Palmer W.G.,Papaconstantinou J. Aging of a-crystallin during development of the lens. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1969.-V.64.,No 1.-p. 404-410.

222. Papaconstantinou J. Biochemistry of bovine lens proteins. II. The 7-crystallins of adult bovine, calf and embryonic lenses. // Biochim. Blophys. Acta.-1965.-v.107.,No 1.-p. 81-90.

223. Papaconstantinou J.,Stewart J.A.,Koehn P.V. A localised stimulation of lens protein synthesis by actinomycin D. // Biochim. Bluphys. Acta.-1966.-v.144.,No 2.-p. 428-430.

224. Parries J.R.,Velan B. ,Pelsenfeld A. et al. Mouse p2-microglobulin cDNA clones: a screening procedure for cDNA clones corresponding to rare mRNAs. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-V.78.,No 4.-p. 2253-2257.

225. Paterson B.M.»Roberts B.E.,Kuff E.L. Structural gene identification mapping by DNA*mRNA hybryd-arrested cell-free translation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977.-v.74.,No 10.-p. 4370-4374.

226. Peacock S.L.,McIver C.M..Monahan J.J. Transformation of E. coll using homopolymer-linked plasmid chimeras. // Biochim. Biophys. Acta.-1981.-v.655.,No 2.-p. 243-250.

227. Peterson G.A.,Piatigorsky J. Preferential conversation of

the globular domains of the ¡3A3/A1 -crystallln polypeptide of the chicken eye lens. // Gene.-1986.-y.45.,No 2.-p. 139-147.

228. Phillpson B. Distribution of proteins within the normal rat lens. // Invest. Ophthalmol.-1969.-v.8.,No 2.-p. 258-270.

229. Piatigorsky J. Intracellular ions, protein metabolism and cataract formation. // Ourr. Topics in Eye Res.-1980.-v.3.-p. 1-39.

230. Piatigorsky J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular featres. // Differentiation.-1981.-v. 19.,No 3.-p. 134-153.

231. Piatigorsky J.,O'Brien W.E.,Norman B.L. et al. Gene sharing by 5-crystallln and argininosuccinate lyase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1988.-v.85.,No 10.-p. 3479-3483.

232. Piatigorsky J.,Shinohara T.,Bhat S.P. Correlated changes in a-crystallin synthesis and ion concentrations in the embryonic chick lenses: summary, current experiments and speculations. // Annals N.Y. Acad. Sci.-1980.-v.339. ,No 1 .-p. 265-279.

233. Piatigorsky J.,Webster H. deF.,Craig S.P. Protein synthesis and ultrastructure during the formation of embryonic chick lens fibers in vivo and in vitro. // Dev. Biol.-1972.-v.27.,No 2.-p. 176-189.

234. Piatigorsky J.,Wistow G. Ensyme/crystallins: gene sharing as an evolutionary strategy. // Cell.-1989.-v.57. ,No 2.-p. 197-199.

235. Piatigorsky J., Wis tow G. The recruitment of crystalllns: new functions precede gene duplication. // Science.- 1991.-V.252.,No 5009.-p. 1078-1079.

236. Piatigorsky J.,Zelenka P. Molecular weight and subunit structure of delta-crystallin from embryonic chick lens fibers. // Exp. Eye Res.-1974.-y.18.,No 5.-435-446.

237. Polansky J.R. .Bennett T.P. Alterations in physical parameters and proteins of lens from Rana catesbeiana during development. // Developm. Biol.-1973.-v.33.,No 2.-p. 380-408.

238. Pouwels P.H.,Enger-Valk B.E.,Brammar W.J. Cloning vectors. A laboratory manual.-Amsterdam-New York-0xford:Elsevier,1985.

239. Prentki P.,Krisch H.M. A modified pBR 322 vector with improved properties for the cloning, recovery, and sequencing of blunt-ended DNA fragments. // Gene.-1982.-v. 17.,No 2.-p. 189196.

240. Quax-Jeuken Y., Jans sen C.,Quax W. et al. Bovine p-crystallin complementary DNA clones. Alternating proline/ alanine sequence of j3B1 subunit originates from a repetitive DNA sequence. // Journ. Mol. Biol.-1984.-v. 180.,No 3.-p. 457472.

241. Rabaey M. Electrophoretic and immunoelectrophoretic studies on the soluble proteins in the developing lens of birds. // Exp. Eye Res.-1962.-v.1.,No 5.-p. 310-316.

242. Rabbits T.H. Bacterial cloning of plasmids carrying copies of rabbit globin messenger RNA. // Nature.-1976.-v.260. ,No 5548.-p. 221-225.

243. Radloff R.,Bauer W.,Vinograd J. A dye-buoyant-density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in HeLa cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1967.-v.57.,No 5.-p. 1514-1521.

244. Ramaekers P.,Dodemont H.»Yorstenbosch P.,Bloemendal H. Classification of rat lens crystallins and identification of

proteins encoded by rat lens mRNA. // Eur. Journ. Biochem.-1982.-V.128.,No 2.-p. 503-508.

245. Ramaekers P.0.S.,van Kan P.L.E.»Bloemendal H. A comparative study of p-crystallins from ungulates, whale and dog. // Ophthalmic Res.-19T9.-v.11.,No 3-4.-p. 143-153.

246. Reszelbach R. »Shinohara T. »Platigorsky J. Resolution of two distinct embryonic chick 5-crystallin bands by polyacryl-amide gel electrophoresis in the presence of 30dium dodecyl sulfate and urea. // Exp. Eye Res.-197T.-v.25. ,No 6.-p. 583593.

247. Richards R.I.,Shine J.,Ullrich A. et al. Molecular cloning and sequence analysis of adult chicken ¡3-globin cDNA. // Nucl. Acids Res.-1979.-v.7.,No 5.-p. 1137-1146.

248. Rodokanaki A.,Holmes R.K.,Borra's T. Zeta-crystallin, a novel protein from the guinea pig lens is related to alcohol dehydrohenases. // Gene.-1989.-v.78.,No 2.-p. 215-224.

249. Rogers J.,Early P.,Garter G. et al. Two mRNAs with different 3' ends encode membrane-bound and secreted forms of immunoglobulin \x chain. // Cell.-1980.-v.20. ,No 2.-p. 303-312.

250. Rougeon P.,Kourilsky P.,Mach B. Insertion of a rabbit p-globin gene sequence into an E. coll plasmid. // Nucl. Acids Res.-1975.-v.2.,No 12.-p. 2365-2378.

251. Roychoudhury R.,Jay E.,Wu R. Terminal labeling and addition of homopolymer tracts to duplex DNA fragments by terminal deoxynucleotidyl transferase. // Nucl. Acids Res.-1976.-V.3. ,No 1.-p. 101-116.

252. Ruther U. Construction and properties of a new cloning vehicle, allowing direct screening for recombinant plasmids. // Molec. Gen. Genet.-1980.-v.178.,No 2.-p. 475-477.

253. Rüther U.,Koenen M.,0tto K.,Müller-Hill B. pUR 222, a vector for cloning and rapid chemical sequencing of DNA. // Nucl. Ac ids Res.-1981.-v.9.,No 16.-p. 4087-4098.

254. Russel P.,Carper D.A.,KInoshita J.H. Synthesis of gamma crystallin by a cloned cell line from Nakano mouse lens. // Invest. Ophtalmol. Visual Sci.-1978.-v.17.,No 6.-p. 568-570.

255. Russell D.R.,Bennett G.N. Construction and analysis of In vivo activity of E. coll promoter hybrids and promoter mutants that alter the -35 to -10 spacing. // Gene.-1982.-v.20.,No 2.-p. 231-243.

256. Russnak R.H.,Jones D.,Candido E.P.M. Cloning and analysis of cDNA sequences coding for two 16 kilodalton heat shock proteins (hsps) In Caenorhabditis elegans: homology with the small hsps of Drosophila. // Nucl. Acids Res.-1983.-v.11.,No 10.-p. 3187-3205.

257. Schoenmakers J.G.G.,Bloemendal H. Subunits of alpha-crys-tallln from adult and embryonic cattle lens. // Nature.-1968.-v.220.,No 5169.-p. 790-791.

258. Seeburg P.H.,Shine J. .Martial J.A. et al. Nucleotide sequence and amplification in bacteria of structural gene for rat growth hormone. // Nature.-1977.-v.270.,No 5637.-p. 486494.

259. Seidman J.G.,Edgell M.H.,Leder P. Immunoglobulin light-chain structural gene sequences cloned In a bacterial plasmid. // Nature.-1978.-v.271.,No 5645.-p. 582-585.

260. Sen P.C.»Pfeiffer D.R. Characterization of. partially purified (Na+ + K+)-ATPase from porcine lens. // Biochim. Biophys. Acta.- 1982.- v. 693.,No 1.-p. 34-44.

261. Sharp P.A.,Sugden B.,Sambrook J. Detection of two restric-

tion endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidlum bromide electrophoresis. // Biochemistry.-1973.-v.12.,No 16.-p. 3055-3063.

262. Shine J.,Seeburg P.H.»Martial J.A. et al. Construction and analysis of recombinant DNA for human chorionic somatomammotropin. // Nature.-1977.-v.270.»No 5637.-p. 494-499.

263. Shinohara T.»Piatigorsky J. Anion and cation effects on 5-crystallin synthesis in the cultured embryonic chic lens and in a reticulocyte lysate. // Exp. Eye Res.-1980.-y.30.,No 4.-p. 351-360.

264. Shinohara T.»Piatigorsky J. Quantitation of 5-crystallin messenger RNA during lens Indication in chick embryos. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1976.-v.73.,No 8.-p. 2808-2812.

265. Shinohara T.»Reszelbach R.»Piatigorsky J. Two tryptic peptide differences among the subunits of 5-crystallin of the embryonic chick lens. // Exp. Eye Res.-1980.-v.30.,No 4.-p. 361370.

266. Shinohara T.,Robinson E.A.,Appella E.»Piatigorsky J. Multiple 7-crystallins of the mouse lens: Fractionation of mRNAs by cDNA cloning. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1982.-v.79.,No 9.-p. 2783-2787.

267. Slezen R.J. Reflections on the internal primary, secondary and tertiary structure homology of the eye lens proteins a-, ¡3-and 7-crystallln. // FEBS Lett.-1981.-v.133.,No 1.-p. 1-8.

268. Slezen R.J.,Bindels J.G.,Hoender3 H.J. The interrelationships between monomeric, ollgomeric and polymeric a-crystallin in the calf lens nucleus. // Exp. Eye Res.-1979.-v.28.,No 5.-p. 551-567.

269. Slezen R.J.,Wu E. »Kaplan E.D. et al. Rat lens

7-crystallins. Characterization of six gene products and their spatial and temporal distribution resulting from differential synthesis. // Journ. Mol. Biol.-1988.-v.199.,No 3.-p. 475-490.

270. Sim G.K.,Kafatos P.O.,Jones C.W.,Koehler M.D. Use of a cDNA library for studies on evolution and developmental expression of the chorion multlgene families. // Gell.-1979.-v.18.,No 4.-p. 1303-1316.

271. SIppel A.E.,Land H..Lindenmaier W. et al. Cloning of chicken lysozyme structural gene sequences synthesized in vitro. // Nucl. Acids Res.-1978.-v.5.,No 9.-p. 3275-3294.

272. Slingsby C.,Croft L.R. Structural studies on calf lens 7-crystallin fraction IV: a comparison of the cystein-containing tryptic peptides with the corresponding amino acid sequence of 7-crystallIn fraction II. // Exp. Exp Res.-1978.-v.26.,No 3.-p. 291-304.

273. Spector A. Physiological chemistry of the eye. // Arch. Ophthalmol.-1969.-v.81.,No 1.-p. 127-143.

274. Spector A. The soluble proteins of the lens. // Invest. Ophthalmol.-1965.-v.4.,No 4.-p. 579-591.

275. Spector A.,Katz E. The deaggregation of bovine lens a-crystallin. // Journ. Biol. Chem.-1965.-v.240.,N0 5.-p. 19791985.

276. Spector A.,Li L.-K., August eyn R.C. .Schneider A.,Preund T. a-Crystallin: the Isolation and characterization of distinct macro-molecular fractions. // Biochem. Joum.-1971 .-v. 124. ,N0 2.-p. 337-343.

277. Stapel S.0.,de Jong W.W. Lamprey 48-kDa lens protein represents a novel class of crystallins. // PEBS Lett.-1983.-v.162.,No 2.-p. 305-309.

278. Stapel S.O.,Zweers A.,Dodemont H.J. et al. s-Crystallin, a novel avian and reptilian eye lens protein. // Eur. Journ. Biochem.-1985.-v. 147.,No 1.-p. 129-136.

279. Stein J.P.,Gatterall J.P.,Woo S.L.G. et al. Molecular cloning of Ovomucoid gene sequences from partially purified ovomucoid messenger RNA. // Biochemistry.-1978.-v.17.,No 26.-p. 5763-5772.

280. Stuyterman L.A.A. ,Wi;Jdenes J. Chromatofocusing: Isoelectric focusing on ion exchange columns. II. Experimental verification. // Journ. Chromatography.-1978.-v.150.,No 1.-p. 31-44.

281. Suggs S.V.»Wallace R.B.,Hlrose T. et al. Use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes: Isolation of cloned cDNA sequences for human j32-microglobulIn. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-v.78.,No 11.-p. 6613-6617.

282. Sutcllff J.G. Complete nucleotide sequence of the Esherichia coll plasmid pBR 322. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.-1979.-v.43.-p. 77-90.

283. Thayer R.E. An Improved method for detecting foreign DNA in plasmids of E. coll. // Analyt. Biochem.-1979.-v.98.,No 1.-p. 60-63.

284. Thomas J.0.,Romberg R.D. An octamer of histones In chromatin and free in solution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1975.-v.72.,No 7.-p. 2626-2630.

285. Thomson I.,Wilkinson C.E.,Burns A.T.H. et al. Characterization of chick lens soluble proteins and the control of their synthesis. // Exp. Eye Res.-1978.-v.26.,No 4.-p. 351-362.

286. Treton J.A. .Shinohara T..Piatigorsky J. Degradation of 5-crystallin mRNA In the lens fiber cells of the chicken. // Dev. Biol.-1982.-v.92.,No 1.-p. 60-65.

287. Truman D.E.S.,Clayton R.M. The subunit structure of chick p-сгуstallins. // Exp. Eye Res.-1974.-v.18.,No 5.-p. 485-494.

288. Twigg A.J.,Sherratt D. Trans-complementable copy-number mutants of plasmld Col E1. // Nature.-1980.-y. 283.,No 5743.-p. 216-218.

289. Ullrich A.,Shine J.,Ghirgwin J. et al. Rat insulin genes: construction of plasmids containing the coding sequences. // Science.-1977.-y.196.,No 4296.-p. 1313-1319.

290. Van Dam A.P. Purification and composition studies of (3s~ crystallin. // Exp. Eye Res.-1966.-y.5.,No 4.-p. 255-266.

291. Van Dam A.P.,ten Cate G. Isolation and some properties of bovine a-crystallin. // Biochim. Biophys. Acta.-1966.-y. 121.,No 1.-p. 183-186.

292. Van der Ouderaa P.J., de Jong W.W. ,Bloemendal H. The amino acid sequence of the aA2 chain of bovine alpha crystallin. // Eur. Journ. Biochem.-1973.-y.39.,No 2.-p. 207-222.

293. Van der Ouderaa P.J., de Jong W.W..Hilderlnk A.»Bloemendal H. The amino-acid sequence of the aB2 chain of bovine a-crystallin. // Eur. Journ. Biochem.-1974.-v.49.,No 1.-p. 157168.

294. Van Kamp G.J. ,Hoenders H.J. The distribution of the soluble proteins In the calf lens. // Exp. Eye Res.-1973.-v.17.,No 4.-417-426.

295. Van Kamp G.J.,van Kleef P.S.M.,Hoenders H.J. Reaggregation studies on the polypeptide chains of calf lens а-crystallln. // Biochim. Biophys. Acta.-1974.-v.342.,No 1.-89-96.

296. Van Rens G.L.M.,Raats J.M.H.,Driessen H.P.C. et al. Structure of the bovine eye lens gammas crystallin gene formely beta S. // Gene.-1989.-v.78.,No 2.-p. 225-234.

297. Van Venrooi^ W.J. f de Jong W.W.,Janssen A.,Bloemendal H. In vitro formation of oA1 from aA2 chains of a-crystallin. // Exp. Eye Res.-1974.-v.19.,No 2.-p. 157-162.

298. Vermorken A.J.M.»Bloemendal П. a-Crystallin polypeptides as markers of lens cell differentiation. // Nature.-1978.-v.271.,No 5647.-p. 779-781.

299. Yermorken A.J.M.,Hilderink J.M.E.G.,van de Yen W.J.M., Bloemendal H. Lens differentiation. Orystallin synthesis in Isolated epithelia from calf lenses. // Journ. Cell Blol.-1978.-v.76.,No 1.-p. 175-183.

3G0. Yermorken P. J. M.,Herbrink P.,Bloemendal H. Synthesis of lens protein in vitro: formation of p-crystallin. // Eur. Journ. Biochem.-1977.-v.78.,No 2.-p. 617-622.

301. Yieira J.,Messing J. The pUC plasmids, an M13 mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. // Gene.-1982.-v.19.,No 3.-p. 259-268.

302. YIIla-Komaroff L.,Efstratiadis A.,Broome S. et al. A bacterial clone synthesizing proInsulin. // Proc. Natl. Acad. Scl. USA.-1978.-v.75.,No 8.-p. 3727-3731.

303. Vogt Y.M. Purification and futher properties of sirjgle-strand-speclflc nuclease from Aspergillus oryzae. // Eur. Journ. Biochem.-1973.-v.33.,No 1.-p. 192-200.

304. Waley S.G. The lens, function and macromolecular composition. // The Eye. / Ed. H. Davson . N.Y.-London: Academic Press, 1969a.-v.I.-p. 299-379.

305. Waley S.G. Nomenclature for the polypeptide chains of a-crystallin. // Exp. Eye Res.-19696.-v.8.,No 5.-p. 477-478.

306. West R.W.»Rodrigues R.L. Construction and characterization of E. coll promoter-probe plasmid vectors. III. pBR 322

derivatives with deletions in the tetracycline resistance promoter region. // Gene.-1982.-v.20.,No 2.-p. 291-304.

307. Williams J.G. The preparation and screening of a cDNA clone bank. // Genetic Engineering 1. / Ed. R. Williamson. London: Academic Press, 1981.-p. 1-59.

308. Williams J.G.,Lloyd M.M. Changes in the abundance of poly-adenylalated RNA during slime mould development measured using cloned molecular hybridization probes. // Journ. Mol. Biol.-1979.-V.129.,No 1.-p. 19-35.

309. Williams L.A.,Ding L.,Horwitz J. ,Piatigorsky J. T-Crystallin from the turtle lens: purification and partial characterization. // Exp. Eye Res.-1985.-v.40.,No 5.-p. 741749.

310. Williams L.A.»Platigorsky J. Comparative and evolutionary aspects of S-crystallin In the vertebrate lens. // Eur. Journ. Biochem.-1979a.-v.100.,No 2.-p. 349-357.

311. Williams L.A.,FiatIgorsky J. Heterogeneity of C-crystallins of the embryonic mallard lens. Correlation between subunit compositions and isoelectric points. // Biochemistry.-1979(5.-v.18.,No 8.-p. 1438-1442.

312. Williamson R.,Clayton R.,Truman D.E.S. Isolation and identification of chick lens crystallin messenger RNA. // Biochim. Biophys. Res. Commun.-1972.-v.46.,No 5.-p. 1936-1943.

313. Williamson R.,Morrison M.,Lanyon G. et al. Properties of mouse globin messenger ribonucleic acid and its preparation In milligram quantities. // Biochemistry.-1971 .-v.10. ,No 16.-p. 3014-3020.

314. Wilson J.T.,Wilson L.B.,deRiel J.K. et al. Insertion of synthetic copies of human globin genes Into bacterial plasmids.

// Nucl. Acids Res.-1978.-v. 5., No 2.-p. 563-581.

315. Wisse J.H.,Zweers A.,Jonklnd J.F. et al. Futher studies on the sub-units of a-crystallin. // Biochem. Journal.-1966.-y.99.,No 1.-p. 179-188.

316. Wistow G. Domain structure and evolution in a-crystallins and small heat-shock proteins. Hypotesis. // FEBS Lett.-1985.-v.181. ,No 1 .-p. 1-6.

317. Wistuw G.J.,LIetman T.,Williams L.A. et al. T-Grystallin/ a-enolase: one gene encodes both an enzyme and a lens structural protein. // Joum. Cell Biol.-1988.-v.107.,No 6.-part 2.-p. 2729-2736.

318. Wistow G.»Summers L.,Blundell T. Myxococcus xanthus spore coat proteins S may have a similar structure to vertebrate lens P7-crystallins. // Nature.-1985.-v.315.,No 6022.-p. 771-773.

319. Wistow G.J.»Piatigorsky J. Lens crystallins: the evolution and expression of proteins for a highly specialized tissue.-1988.-V.57.-p. 479-504.

320. Wood K.0.,Lee J.C. Integration of synthetic globln genes into an E. cull plasmid. // Nucl. Acids Res.-1976.-v.3.,No 8,-p. 1961-1971.

321. Yasuda K.,Kondoh H.,0kada T.S. et al. Organization of 5-crystallin genes in the chiken. // Nucl. Acids Res.-1982a.-V.10.,No 9.-p. 2879-2891.

322. Yasuda K. »Naka^ima N.,Agata K. et al. Cloning and structure of 5-crystallin genes. // Stability and switching in cellular differentiation. / Eds. R.M. Clayton, D.E.S. Truman. N.Y.: Plenum Press, 19825.-p. 467-471.

323. Yeh L.-S.L.,ElzanowskI A.,Hunt L.T.,Barker W.C. Homology of delta crystallin and argininosuccinate lyase. // Comp.

Biochem. Physiol.-1988.-v.B89.,No 2.-p. 433-437.

324. Zain S.,Sambrook J.,Roberts R.J.et al. Nucleotide sequence analysis of the leader segments in a cloned copy of adenovirus 2 fiber mRNA. // 0ell.-1979.-Y.16.,No 4.-p. 851-861.

325. Zelenka P.»Piatigorsky J. Isolation and in vitro translation of Q-crystallin mRNA from embryonic chick lens fibers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1974.-v.71.,No 5.-p. 1896-1900.

326. Zelenka P. »Piatigorsky J. Molecular weight and sequence complexity of 5-crystallin mRNA. // Exp. Eye Res.-1976.-v.22.,No 2.-p. 115-124.

327. ZIff E.B. Transcription and RNA processing by the DNA tumor viruses. // Nature.-1980.-v.287.,No 5782.-p. 491-499.

328. ZIgler J.S.,Carper D.,Russel P.,Kinoshita J.H. Analysis of some immunochemical properties of human ¡3-crystallin by radioimmunoassay. //Exp. Eye Res.-19800.-v.31.,No 4.-p. 389-397.

329. ZIgler J.S.,Jr.»Goosey J. Aging of protein molecules: lens crystallins as a model system. // Trends In Biochem. Sci.-1981.-v.6.,ref. edition.-p. 133-136.

330. ZIgler J.S.»Jr.»Horwits J.»Kinoshita J.H. Human |3-crystallin. I. Comparative studies on the fy, (3o and (33~ crystallins. // Exp. Eye Res.-1980a.-v.31.,No 1.-p. 41-55.

331. ZIgler J.S.,Jr.»Sidbury J.B.,Jr. A comparative study of the p-crystallins of four sub-mammalian species. // Oomp. Biochem. Physiol.-1976G.-v.B55.,No 1.-p.19-24.

332. ZIgler J.S.,Jr.»Sidbury J.B.,Jr. A comparative study of (3-crystallin from six mammals. // Comp. Biochem. and Physiol.-1976a.-v.B53.,No 3.-p. 349-355.

333. Zlgnan S.,Schultz J.»Yulo T. A comparative study of lens gamma crystallins using Isoelectric focusing. // Comp. Biochem.

Physiol.-1983.-Y.75.,No 3.-p. 425-427.

334. ZIgman S.,Schultz J.,Yulo T. Isoelectric focusing of gamma crystalline. I. Characterization of rat lens components. // Biochim. Blophys. Acta.-1970.-y.221.,No 3.-p. 576-582.

335. Zwaan J.,Ikeda A. An immunochemical study on the beta-crystallins of the chicken lens: ontogenetic and phylogenetic aspects. // The Structure of the eye. II Symposium. / Ed. J.W. Rohm. Stuttgart: Schatlauer-Verlag, 1965.-p. 419-429.

336. Zwaan J.,Ikeda A. Macromolecular events during differentiation of the chicken lens. // Exp. Eye Res.-1968.-v.7.,No 3.-p. 301-311.