Разработка усовершенствованного метода синтеза 5-фосфотиоэфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Богачев, Виктор Семенович

• Богачев, Виктор Семенович
• кандидат химических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат химических наук Богачев, Виктор Семенович

Введение

Глава I.Методы химического синтеза аналогов НК,модифицированных по межнуклеотидным фосфатным группамС обзор литературы).

1.1. Введение

1.2. Тиофосфатные аналоги НК.

1.2.1. Синтез 5'-фосфотиоэфирных(5'1^) аналогов Ж.

1.2.2. Синтез фосфотионатных аналогов НК.

1.3. Фосфамидные аналоги НК.,

1.3.1. Синтез 5'-фосфамидных(5'Рм) аналогов НК

1.3.2. Синтез зЦ&осфамидных(3'Рм) аналогов НК

1.3.3. Синтез амвдофосфатных аналогов НК.

1.4. Фосфонатные аналоги НК.

1.4.1.Синтез 3- и б^-фосфонатныхСЗ^и 5jP0) аналогов НК

1.4.2. Синтез бЁ-фосфонатныхСЙР^) аналогов НК.

1.4.3. Синтез 5^-метилфосфонатных(51Р0+) аналогов НК

1.4.4. Синтез фосфонометильных(Рс) аналогов НК.

1.5. Синтез фосфотриэфирных(Р^) аналогов НК.

1.6. Синтез фосфитныхСР^) аналогов НК.

Глава 2. Результаты и обсуждение результатов.

2.1. Исследование кинетики реакции алкилирования

2.1 Л. Определение порядка реакции алкилирования.

2.1.2. Зависимость констант скорости реакции алкилирования от различных факторов

2.1.2.1. Зависимость ^ реакции алкилирования от природы противокатионов реагентов.

2.1.2.2. Зависимость Kj реакции алкилирования от концентрации воды в реакционной смеси.

2.1.2.3.Зависимость Kj реакции алкилированияот добавок солей.

2.1.2.4. Зависимость Kj реакции алкилирования от рН . .43 2.1.2.5.Зависимость Kj реакции алкилирования от температуры.

2.1.3. Рекомендации для синтеза 5'Р^-аналогов НК

2.2. Синтез электронейтральных мономеров INpgR+.

2.2.1. Выбор структуры и метода синтеза мономеров.

2.2.2. Синтез алкилирущего реагента (R+Br)I".

2.2.3. Синтез алкилтиофосфатов NpsR+*

2.2.4. Реакция иодирования NpsR+.

2.2.5. Синтез 1Тр^+реакциеЙ переалкилирования ITpsCNEt

2.3. Исследование кинетики реакции INpsR+o Тр£ в ДШ?А

2.4. Синтез б'Р^-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов

2.4.1. Синтез ^-аналогаТ-С*!^ (ХХШ).

2.4.2.Синтез б'Р^-аналога гексадекадезоксирибонуклеотида(ХШ.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Исходные материалы.

3.2. Основные методы работы.

3.3. Методики синтеза.

3.3.1.Синтез 2-6poM-[N-(п-диэтилметиламино)фенил]прошонамида иодида (R+Br )1~

3.3.2. Синтез мономеров INpgR

3.3.3. Синтез ITpsR+H3 ITpgCN Et реакцией переалкилирования

3.3.4. Синтез 5'Р5-аналогов (ХХШ) и (XXIV)

3.4. Методики кинетических измерений.

3.5. Реакция циклизации мономеров INpsR+

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка усовершенствованного метода синтеза 5-фосфотиоэфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов»

Быстрое развитие исследований в области молекулярной биологии и генной инженерии стимулирует не только разработку новых методов синтеза олигонуклеотидов[1,2], но и их разнообразных аналогов [3-5]. Интерес к таким соединениям обусловлен наличием у них специфических физико-химических и биологичест-ких свойств, отсутствующих у природных НК. Основными областями применения таких соединений являются физико-химические исследования, направленные на изучение структуры и функций НК [31, а также исследования, связанные с изучением молекулярных механизмов действия и субстратной специфичности ферментов метаболизма НК [4,5]. Некоторые аналоги НК проявляют противовирусную активность [6,7].

Одними из наиболее перспективных соединений этого типа являются 5^-фосфотиоэфирные аналоги НК, содержащие неприродные Р-$-0(5*)-межнуклеотидные связи Ш-Ю]. Замена 0(5)-атомов на атомы серы приводит к некоторому удлинению межнуклеотид-ной связи в таких производных НК, изменению ее геометрии [II], [12] и появлению новых свойств. Так, они проявляют большую устойчивость к ферментативному гидролизу по сравнению с природными прототипами [10,13], но легко расщепляются окислителями [14]. Вторичная структура таких аналогов похожа на структуру Ж, они образуют комплементарные комплексы с полинуклеоти-дами[9,141. Рассматриваемые аналоги являются субстратами ряда ферментов метаболизма НК, таких,как ДНК-полимераза IE.coli [15], полинуклеотидлигаза и полинуклеотидкиназа фага Т4 СЕ6], а также различных нуклеаз [10,13]. Дальнейший прогресс в этой исследований области связан с расширешешфизико-химических и субстратных свойств таких производных НК с целью выявления перспектив их практического применения. Для обеспечения таких исследований разнообразными по длине и составу 5'Р$-аналогами НК необходим эффективный и быстрый метод их синтеза. Известные методы не обеспечивали решение этой задачи.Они немногочисленны [9,10,17], однотипны и основаны на использовании высокой нуклеофильности тиофосфата[18] и его производных. Ключевой стадией в этих способах является реакция алкилирования Ps -компонента( на первой стадии Nps ) 5-активированными нуклеотидными мономерами, например, 5^-0-тозил-[9]или 5Цдезокси-5-иоднуклеозид-3^0-(5 --Р-цианэтил) тиофосфатами [19,20] в ДИФА или смесях его с водой. Ранее нами было показано, что наибольшая скорость реакции алкилирования достигается при применении Li^-солей Nps и иод-мономеров lNp$CNEt[20-22]. Но скорость реакции и в этом случае была невысокой, уменьшаясь значительно к тому же на конечных стадиях синтеза при увеличении длины и отрицательного заряда Ps -компонента. Нацример, длительность реакции алкилирования на первой стадии синтеза 5PS-аналога нонатимидилата составляла 1ч , а на восьмой - 20ч. Увеличение длины Р5-компонента сопровождается резкш ухудрекием растворимости его Li^-солей в да$А, вследствие чего реакция большую часть времени протекает в гетерофазном режиме, что также приводит к значительному уменьшению ее скорости121]. Перечисленные недостатки ограничивают сферу применения метода [21] , наиболее эффективного . из известных, синтезом сравнительно коротких 5'РБ-аналогов НК.

Таким образом, разработка усовершенствованного метода синтеза З^-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, отличающегося от известных способов большей скоростью и эффективностью, являлась весьма актуальной задачей. Ее решение затруднялось практически полным отсутствием данных о механизме реакции алкилирования, лежащей в его основе.

Основными вопросами, решению которых посвящена данная работа, являются следующие. Во-первых, проведено систематическое исследование кинетики реакции алкилирования на примере взаимодействия Tps с иодпроизводными lTpsCN Et и IT в ]Щк с целью выяснения ее механизма и поиска путей увеличения ее скорости. Во-вторых, определена зависимость реакционной способности иодпроизводных в данной реакции от их строения, в частности, от их заряда, a -компонента - от типа соли. На основе найденных закономерностей выбрана структура иодмономеров и тип соли Ps-компонента, обеспечивающие повышение скорости реакции алкилирования, и разработан метод синтеза таких моно-ров. В-третьих, проведено исследование кинетики реакции полученных мономеров с Tps в ДМФА.

В результате решения указанных задач разработан усовершенствованный метод синтеза 5 Ps-аналогов олигодезоксирибо-нуклеотидов, ключевой стадией которого является реакция алкилирования Вьц/\/+-солей Np^ новыми мономерами - 2',5-дщдезок-си-5-иоднуклеозид-3-0-^ -P-[lV -(п-диэтилметиламино) фенил]кар-бамоилэтил]тиофосфатами, представляющими собой электронейтральные внутренние соли, в безводном ДМФА. Средние затраты времени на проведение одной стадии синтеза снижены в 10 раз, в том числе на проведение реакции алкилирования - в 100 раз,по сравнению с известным методом [21]. Достигнута независимость скорости реакции алкилирования от длины и заряда Ps -компонента. Эффективность метода продемонстрирована на примере синтеза ^-аналогов гексатимидилата и гексадекадезоксирибонуклеотида. Структура последнего соответствует одному из фрагментов гена гормона человека ангиотензина I. Доступность 5 Pg-аналогов такой длины позволила существенно расширить, исследование их биохимических свойств, в частности, провести изучение их матричных свойств в системе ДНК-полимеразы I E.coli [15].

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Богачев, Виктор Семенович

- 87 -ВЫВОДЫ.

1. Разработан усовершенствованный метод синтеза 5ч)юсфотж>-эфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих нецри-родные Р -S-С(b)-межнуклеотидные связи, ключевой стадией которого является реакция алкилирования Buz,A/+-солей Nps новыми электронейтральными мономерами IWpsR+ в ДОА. Применение таких мономеров и солей Nps приводит к увеличению скорости реакции алкилирования в среднем,на одну стадию синтеза, более чем в 100 раз по сравнению с известным методом и достижению ее независимости от длины и заряда Ps -компонента. Данным методом синтезированы 5-фосфотиоэфирные аналоги гексатимидилата и гексадекадезоксирибо-нуклеотвда с выходом,соответственно, 51,6 и 12%.

2. Изучен механизм образования нецриродной Р -S-С(Й -межнук-леотидной связи реакцией алкилирования на примере взаимодейст- . вия различных солей "Ips с галоидпроизводными RX (RX =ITpsCNEt дт,

BrEt ) в ДОА и 96% водном ДОА при 22°. Показано, что: а)порядок этой реакции по 1ps зависит от типа его соли и концентрации: цри увеличении последней в диапазоне 0,001-0,1 М он уменьшается от I до 0 в случае Li и №а+-солей Tps и не изменяется в случае тетраалкиламмониевых солей Tps , равняясь I; порядок реакции.по галоидцроизводным ИХ не зависит от их концентрации и равен I; б) эффективная константа скорости второго порядка реакции алкилирования зависит от типа соли Tps и заряда RX , а константа скорости первого порядка этой реакции - от концентрации воды в реакционной среде, природы и концентрации добавляемой соли, от рН. Наибольшая скорость данной реакции достигается в случае электронейтральных галоидпроизводных RX , Bu^N^cojie Тр$,при рН 7,5-8 в отсутствии воды и солей; в) наиболее вероятной причиной обнаруженных зависимостей является. образование ионных аосоциатов реагентов с катионами.

3. На основании полученных кинетических данных предложено использовать в качестве мономеров для синтеза 5^-фосфотиоэфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов новые соединения - иодпро-изводные нуклеотидов INp$R+ , представляющие, собой электронейтральные внутренние соли, и разработан метод их синтеза.

4. Исследована кинетика реакции алкилирования ВьцМ^-солиТрд новыми мономерами INpsR+b №Ш>к при 22°. Установлено, что: а)кинетика данной реакции подчиняется закону второго порядка; б) константа скорости второго порядка изученной реакции в 40 раз превышает соответствующую константу скорости реакции отрицательно-заряженных мономеров INpsCNEt вследствие нейтрализации, отрицательного заряда, осуществленной в иодпроизводных INpsR* .

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Богачев, Виктор Семенович, 1984 год

1.Шабарова З.А. Методы синтеза фрагментов ДНК.- В кн.: Итоги та-уки и техники, ВИНИТИ АН СССР, сер.молекул, биология, 1980,т. 12, ч.2, 0.6-61

2. Wu R., Bahl С.P., Narang S.A. Synthetic oligodeoxynuclecfa.des for analyses of ША structure and function,- In: Progress in Hucleic Acids Res, and Mol.Biology, 1978, v.21, Academic Press Hew York etc., p. 102-141

3. Шомштейн З.А., Гиллер С.А. Модельные аналоги нуклеиновых кислот.- В кн.: Успехи химии гетероцшслов.Рига, 1976, с.307-322

4. Eckstein Р, Investigation of enzyme mechanisms with nucleosidephosphorothioates.- Angew.Chem.int.edn.,1975,v.14, N 3, p.160166.5*Eckstein P. Phosphorothioate analogues of nucleotides.- Accounts Chem. Res,,1979, v.12, N 1, p.204-210

5. Clercq E. de, Eckstein P., Merigan T.C. Interferon induction through chemical modification of a synthetic polyribonucleotide. Science, 1969, v.165, N 3898, p.1137-1143

6. Eckstein P., Gindl H. Polynucleotides, containing a thiophos-phate backbone,- Eur,J.Biochem., 1970, v.13,N 2, p.558-564

7. Michelson A.M. Polynucleotides.IY.The synthesis of oligonucleotides analogs, substituted in sugar's residue.- J.Chem.Soc., 1962, N 3, p.979-982

8. Nagyvary J.,Chladek S., Roe J# The synthesis of 5'-thioanalogs of polydeoxyribonucleotides.- Biochem.Biophys.Res.Commun. ,1970s v.39, N 5, p.878-882

9. Cook A.P. Nucleoside S-alkyl phosphorothioates.IV.Synthesis of nucleoside phosphorothioate monoesters.- J.Amer.Chem.Soc.,1970, v.92, Ы 1, p.190-195

10. Потапов В.A.,Рыбаков B.H. ,Богачев B.C. ,Ривкин М.Й. Думарев В.

11. П. Репарирующая репликация 5-5-тиофосфатного аналога гексаде-кадезокоирибонуклеотида,катализируемая ДНК-полимеразой I E.coli.-Биоорган. химия,1983, т. 9, Ж7, с. 954-957

12. Рыбаков В.Н., Ривкин М.И. ,Богачев B.C., Кумарев В.П. Сшивка аналогов олигодезоксинуклеотидов с P-S-ССЙ-связями полинук-леотвдлигазой фага Т4.- Биоорган.химия, 1981,т.7, $9, с.1423-1425

13. A.C.9I065KCCCP). Способ получения олигодезокситиотимцдила-тов/ В.П.Кумарев, В.С.Богачев, Л.В.Баранова, В.Ф.Кобзев.-Опубл. в Б.И. ,1982, № 9

14. Пальм В.А. Основы количественной теории органических реакций. -2-е изд.перераб. и доп.- Л:Химия,Ленинградское отд. ,1977,с.335, 94-95

15. A.C.9I0650(CCCP). Производные дезокситионуклеотидов как мономеры для синтеза полидезокситионуклеотвдов и способ их получения/ В.П.Кумарев, В.С.Богачев, В.Ф.Кобзев, Л.В.

16. Баранова,- Опубл. в Б.И., 1982, В 9

17. Кумарев В.П., Богачев B.C., Кобзев В.Ф., Баранова А.вУшофосфатные аналоги нуклеиновых кислот.II. Синтез и свойства б-Б-тиофосфатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов.- Биоорган, химия, 1982, т.8, 16 II, с.1525-1534

18. А.С.899571(СССР). Олигодезокситионуклеотиды, проявляющие матричные свойства в РНК-полимеразной системе E.coli/ В. П.Кума-рев, B.C.Богачев, В.Ф.Кобзев, Л.В.Баранова, М.И.Ривкин.-Опубл, в Б.И., 1982, Л 3

19. Nemer M.J., Ogilvie К.К. Ribonucleotide analogues having novel intemucleotide linkages.- Tetrahedron lett.,1980, v.21, H 43, p.4149-4152

20. Letsinger R.L., Lunsford W.B. Synthesis of thymidine oligonucleotides by phosphite triester intermediates.- J.Amer. Chem.Soc., 1976, v.98, Ж 11, p.3655-3661

21. Корана Г. Новые направления в химии биологически важных эфи-ров фосфорной кислоты.-М. :Мир, 1964, с.ПО-143

22. Letsinger R.L., Muiigall W.S. Phosphoroamidate analogs of oligonucleotides.» J.Org.Chem., 1970, v.35, N 11, p.3800-3803

23. Agarwal K.L., Yamazaki A.,Cashion P.I., Khorana H.G. Chemical synthesis of polynucleotides.- Angew.Chem.int.edn.Engl.,1972, v.11, N 6, p.451-459

24. Eckstein P. Diuridine-3' ,5 '-thiophosphate.- Tetrahedron Lett., 1967, N 36, p.3495-3499

25. Хадсон P. Структура и механизм реакций фосфорорганических соединений,- М.: Мир, 1967, с.146-149

26. Malkieviez А., Smrt J. Synthesis of thymidinephosphorothio-yl(0^ )thymidine via phosphorothioate-0,0,S-triesters.~ Tetrahedron Lett.,1973, N 7, p.491-492

27. Malkievicz A., Smrt J. Oligonucleotidic compounds.XLII. Synthesis of thymidi^hosphorothioylCO^'-O^')thymidinephosphoro-thioylCO^'-O5')thymidine.- Coll.Czech.Chem.Commun.,1973, v.38, H 10, p.2953-2961

28. Malkievicz A., Smrt J.Oligonucleotidic compounds.XLIII.Synthesis of some diribonucleoside phosphates analogues containing the phosphorothioic-0,0-diester bond.- Coll.Czech.Chem.Commun<1973, v.38, N 10, p.2962-2975

29. Burgers P.M.J., Eckstein P. Diastereomers of S'-adenosyl^'-O-uridyl-phosphorothioate: chemical synthesis and enzymatical properties.- Biochemistry, 1979, v.18, N 4, p.592-596

30. Burgers P.M.J., Eckstein P. Synthesis of dinucleosidemono-phosphorothioates via addition of sulphur to phosphite tri-esters.-Tetraheron Lett.,1978, N 40, p.3835-3838

31. Marlier I.P., Bencovic S.I. A highly efficient chemical synthesis of Rp and Sp adenylO'-S'Jadenyl-OjO-phosphorothioate.-Tetrahedron Lett., 1980, v.21, N 12, p.1121-1124

32. Lesnikowski Z.J.,Smrt J., Stec W.J., Zielinski W.B. A new rout to 0,0-dinucleoside esters of phosphorothionic acids.-Bull.Acad.pol.Sci.ser.sci.chim.,1978, v.26, N 9, p.661-663.

33. Uznanski В., Wiewiarowski W., Stec W.J. The chemical synthesis of Rp and Sp diastereomers of thymidyl-(3'-5')thymidyl-0,0-phosphorothioate.- Tetrahedron Lett., 1982, v.23, Iff 41, p.4289-4292

34. Green G.L., Letsinger R.L. Formation of internucleotide 3'-5' phosphoroamidate links by direct coupling of a phosphoryl and amino groups.- Nucl.Acids Res., 1975, v.2, N 7, p.1123-1127

35. Letsinger R.L,, Heavner G.A. Synthesis of phosphoromonoami-date diesters nucleotides via the phosphite-azide coupling method.- Tetrahedron Lett.,1975, U 2, p.147-150

36. Ажаев A.B.,Кочеткова С.В., Озоло A.M., Цилевич Т.А. Синтез

37. З-амино-З-дезоксинуклеозидов и их производных.-В кн.: Новости химии нуклеозидов и нуклеотидов.Рига, I978,c.9-II

38. Соколова Н.И., Киселева Е.Г., Горкун А.Ф., Шабарова З.А. Новый метод синтеза олигодезоксирибонуклеотидов с фосфамид-ной межнуклеотидной связью.- Биоорган.химия, 1984, т. 10,1. I, с.75-78

39. Воробьев О.Е., Соколова Н.И., Мельникова В.И., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Динуклеозидфосфо-(Рм-»н)-аминокислоты.- Докл. АН СССР, 1966, т.166, J& I, с.95-98

40. Соколова Н.И., Гурова Г.И., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Нуклеопептиды. Синтез тимидилил- (3^5) -аденозино (Р N)-амидов. Вестник МГ7, сер.химия, 1969, № 5, с. 104-105

41. Соколова Н.И., Пономаренко И. В., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Обратимая модификация межнуклеотидных фосфатных груш в олигодезоксирибонуклеотидах.- Докл. АН СССР, 1980, т.253, В 6, с.1395-1398

42. Соколова Н.И., 1*урова Г.И., Гатинская А.Г., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Свойства межнуклеотидного-(Рм-*н )-узла в модельных соединениях.- Мол.биология, 1969, t.3,b.6,c.837-845

43. Потапов В.К., Вейко В.П., Шабарова З.А. Блокирование межнуклеотидной фосфатной группы при твердофазном синтезе олиго-дезоксирибонуклеотидов.- Биоорган.химия, 1979, т.5,113,с.468-470

44. Nemer M.J#, Ogilvie К.К. Phosphoramidate analogues of diri-bonucleoside monophosphates.- Tetrahedron Lett., 1980, v.21, N 43, p.4153-4154

45. Letsinger R.L., Schott M.E. Selectivity in binding a phenan-thridium-dinucleotide derivative to homopolynucleotides.- J. Amer.Chem.Soc.,1981, v.103, N 24, p.7394-7396

46. Jones G.H.,Albrecht H.P., Damodaran N.P., MoffattJ.G. Synthesis of isosteric phosphonate analogs of some biologically important phosphodiesters.- J.Amer.Chem.Soc., 1970, v.92,1. К 18, p.5510-5511

47. Holy A., Guinberger D., Smrt J., Sorm P. Synthesis of a GpUpU analogues containing 5,-deoxyuridine-5,*-phosphonicacid and its effect upon the binding of ^дУа1уд ^ 14c alanyl-tRNA to ribosomes.- Biochim.Biophys.Acta, 1967» v. 138, N 1, p.207-209

48. Rammler D.H., Bagdasarian A., Morris F. Inhibition of mic-rococcal nucleas with 5'-deoxythymidine-5'-phosphonic acid containing oligomers.-Biochemistry,1972,v.11,N 1,p.9-12

49. Rammler D.H., Yengoyan L., Paul A.V., Bax P.S. Nucleoside phosphonic acids,II,The synthesis of 5'-deoxythymidine 5'-phosphonic acid and its pyrophosphate derivatives.- Biochemistry, 1967, v.6, N 6, p.1828-1837

50. Holy A.Synthesis and biological activity of some analogues of nucleic acid components.- Ins Phosphorus chemistry directed towards biology. New York, 1980, p.53-54

51. Agarwal K.L., Riftina P. Synthesis and enzymatic properties of deoxyribooligonucleotides containing methyl and phenyl phosphonate linkages.- Nucl.Acids Res., 1979, v.6, N 9, p. 3009-3024

52. Miller P.S., Yano J., Yano E.,Carrol C., Yagraman K., Ts'o P.O.P. Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucleoside methyl phosphonates.-Biochemistry, 1979, v.18, N 23, p.5134-5143

53. Catlin J.C., Cramer P. Deoxyoligonucleotide synthesis via the triester method.- J#Org.Chem.,1973,v.38,N2,p.245-252

54. Stawinski J., Hozumi Т., Narang S.A.,Bahl C.P., Wu R. Aryl-sulfonyltetrazoles, new coupling reagent and further improv-ments in the triester method for the synthesis of deoxyribooligonucleotides.- Nucl.Acids Res.,1977,v.4,N1,p.353-371

55. Kraszewski A,, Stawinski J., Wiewiorowski M. The case of SUlphonation in the chemical synthesis of oligonycleotides.-Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N 10, p.2301-2305

56. Knorre D.G., Zarytova V.F. Reactive phosphorylating intermediates in nucleic acid chemistry.- In: Phosphorus chemistry directed towards biology. New York, 1980, p.13-31

57. Miller P.S., Dicon N., Pulford M., Mc.Parland K.B. Oligo-thymidilate analogues having stereoregular alternating me-thylphosphonate/ phosphodiester backborn.- J.Biol.Chem., 1980, v.255, N 20, p.9659-9665

58. Miller P.S., Agris C.H., Murakami A., Reddy P.M.,Spits S.A., Ts'o P.O.P. Preparation of oligodeoxyribonucleoside methyl-phosphonates on a polysterene support.- Nucl.Acids Res., 1983, v.11, N 18, p.6225-6242

59. Michelson A.M., Todd A.R. Nucleotides.Part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3':5'-internuc-leotidic linkage.- J.Chem.Soc., 1955* ^ 8, p.2632-2638

60. Letsinger R.L., Mahadevan V. Oligonucleotide synthesis on a polymer support.- J.Amer.Chem.Soc.,1965,v.87,N15,p.3526-3527

61. Eckstein P., Rizk J. Synthese von oligonucleotiden uber phosphorsauretriester.- Angew.Chem.,1967,bd.79,N 1513.684-687

62. Rees C.B., Saffhill R. Oligonucleotide synthesis via phos-photriester intermediates: the phenyl-protecting group.-J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1968, N 13, p.767-768

63. Miller P.S., Pang K.N.,Kondo N.S., Ts'o P.O.P. Synthesis and properties of adenineand thymine nucleosides alkyl phos-photriesters, the neutral analogs of dinucleoside monophosphates.- J.Amer.Chejjt.Soc.,1971 »v.93, H 22, p.6657-6665

64. Miller P.S.,Barrett J.S.,Ts'o P.O.P. Synthesis of oligode-oxyribonucleotide ethyl phosphotriesters and their specific complex formation with transfer Ribonucleic acid.- Biochemistry, 1974,v.13, IT 13, p.4887-4896

65. Smrt J. Protection of the internucleotidic bond after its synthesis. An approach to the synthesis of oligonucleotidic chain».-Tetrahedron Lett. ,1972, IT 33, p.3437-3438

66. Boer de, G., Miller P.S., Ts'o P.O.P. Hydrogen-bonded complexes of adenine and thymine nucleoside alkyl phosphotri-esters in deuteriochloroform.- Biochemistry, 1973, v.12, N 4, p.720-726

67. Петренко В.A., Поздняков П.И., Сиволобова Г.Ф., Шубина Т.Н. Неионные аналога олигонуклеотидов. Синтез триэфирных олиго-нуклеотидов. реакцией переэтерификации.- Биоорган.химия, 1980, т.6, Xt 3, с.431-435.

68. Петренко В.А., Поздняков П.й. Синтез триэфирных аналогов ди^езоксинуклеози^осфатов, содержащих остаток гидроксил-амина.- Биоорган.химия, 1983, т. 9, № 6, с.832-837

69. Абрамова Т.В., Лебедев А.В. Исследования диастереомеров неионных аналогов олигонуклеотидов. Синтез и разделение диастереомеров этиловых эфиров ди- и тетратимидилатов.- Биоорган, химия, 1983, т.9, №6, с.824-831

70. Doub G.W., Tamelen,van,E.E, Synthesis of oligoribonucleo-tides based on facile cleavage of methyl phosphotriester intermediates. -J. Amer. Chem, Soc. ,1977, v, 99,N40, p. 3525-3528

71. Kraus С.A. The ion-pair concept.: its evolution and some application.» J.Phys.Chem., 1956,v.60, N 2, p.129-141

72. Паркер А. Д. Скорости реакции бимолекулярного. замещения в протонных и диполярных апротонных растворителях.- Успехи химии, 1971» т.40, в.12, с.2203-2249

73. HO.Winstein S.,Savedoff L.G.,Smith S., Stevens J.D.R., Gall J.S, Ion pair, nucleophilicity and salt effect in bimolecular nucleophilic substitution.- Tetrahedron Lett. ,.*I960,N9,p.24-3!

74. Evans C.C., Sugden S. Exchange reactions and electrolytic dissociation in non-aqueus solvents.- J.Chem.Soc., 1949, H 2, p.270-273

75. Berg A., Ugelstad J. The effect of the solvent on the reaction of Na+ and K+PhO~ in nucleophilic substitution reactions.Part II.Relative reactivity of Na+ and K+PhO~ in different aprotic solvents.-Acta Chem.Scand.,1965»v.19, N 3, p* 742-750

76. ИБ.Широбоков Й.Ю., Островский В.А., Колдобский Г.И. Тетразолы. 1У.Кинетика реакции алкилирования калиевой, соли 5-фенилтет-разола диметилсульфатом в ацетонитриле,- Ж.Орган.химии, 1979, т.15, вып.4, с.839-844

77. Эмануэль Н.М., Кнорре.Д.Г. Курс химической.кинетики.- 3^-е изд. ,перераб.и доп.-М. :Высшая школа,1974,с. 114,116-117,120

78. П7.Ингольд К. Теоретические основы органической химии.- М.: Мир, 1973, с.372-373, 391-392тто

79. J-xo*Verheyden J.P.H.,Moffatt J.G. Halosugar nucleosides.Iodination of the primary hydroxyl groups of nucleosides with methyl-triphenoxyphosphonium iodide.- J.Org.Chem.,1970,v.35, N 7, p.2319-2326

80. А.С.988824(СССР). Способ получения иодпроизводных дезокси-тионутслеотидов/ В.П.Кумарев, В.С.Богачев, В.Ф.Кобзев, Л.В.Баранова, Н. С. Кобзева.- Опубл. в Б.И., 1982, № 2

81. Терней А.Современная органическая химия.-М:Мир,1981,т2,с548

82. Микельсон А.Химия нуклеозидов и нуклеотидов.М.:Мир, 1966, с510

83. Jardetzky О., Roberts С.К. NMR in molecular biology.- New York etc.: Academic Press, 1981,p.187

84. Kumarev V.P., Rivkin M.I., Bogochev V.S.,Baranova L.V., Merculov VM.« Rybakov V.N. Molecular cloning of synthetic angio-tensine I gene in E.coli. Rout to phisiologically active hormone. FEBS Lett., 1980,v.114,N 2, p.273-277

85. A.C.925964(СССР).Способ получения полидезоксинуклеотидов/ В.П.Кумарев,B.C.Богачев,Л.В.Баранова,М.И.Ривкин.-Опубл.в Б.И., 1982, № 17

86. Schwarz/mann radiochemical/biochemical catalog, 1977,p.91

87. Tu C.P.D.,JayE.,Bahl C.P.,Wu R. A reliable mapping metbod for sequence determination of oligodeoxyribonucleotides by mobility shift analysis.-Analyt.Biochem., 1976,v.74,N1,p.74-93

88. Jay E.,Bambara R., Padmanabhan R. ,Wu R.DNA sequence analysis: a general,simple and rapid method for sequencing large oli-godeoxyribonucleotide fragments by mapping.- Nucl.Acids Res., 1974, v.1, N 2,p.331-353

89. Вейганд К. ,Хильгетаг Г. Методы эксперимента в органической химии.- М. :Химия, 1968, с.235

90. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований.-М.-Л. :Химия, 1964, с.63

91. ТЗО.Беккер Г.,Бергер В.и др.Органикум.- М. :Мир, 1979,т.2,с.353