Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Сорокина, Мария Юрьевна

• Сорокина, Мария Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сорокина, Мария Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическое значение работы.

Апробация диссертации.

Объем и структура диссертации.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов.

2. Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах.

3. Принцип полимеразной цепной реакции.

4. Подбор праймеров.

4.1. Дизайн праймеров.

4.2. Температура отжига.

4.3. Длина праймеров.

4.4. Вырождение праймеры.

5. Факторы воздействующие на ПЦР.

5.1. Температура и время денатурации.

5.2. Температура и время элонгации.

5.3. Реакционный буфер.

5.4. Количество циклов амплификации.

5.5. «Горячий старт» ПЦР.

5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории.

5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО).

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных.

2. Образцы-сравнения ДНК.

2.1. Коммерческие препараты ДНК.

2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК из цельной крови животных.

3. Образцы кукурузной, куриной, рыбной и мясокостной муки.

3.1. Отбор образцов.

3.2. Приготовление смесей.

3.3. Перечень видов смесей кормовой муки.

4. Образцы сухого и консервированного корма для животных.

5. Образец сыворотки лошадей.

6. Методика выделения ДНК из цельной крови по Maniatis (94).

6.1. Выборочный лизис эритроцитов.

6.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К.

6.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом.

7. Оценка концентрации ДНК спектрофотометрическим методом (94).

8. Методика выделения ДНК сорбцией на селикагеле по Boom (24).

9. Методика проведения реакции амплификации.

9.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации.

9.2. «Горячий старт».

10. Методика проведения электрофореза в агарозном геле.

11. Методика определения говядины в образцах методом ИФА.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины.

2. Изучение специфичности выбранных праймеров.

3. Подбор условий ПЦР.

3.1. Оптимизация температуры отжига специфических олигонуклеотидов (праймеров).

3.2. Подбор концентрации праймеров.

3.3. Применение «горячего старта».

4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации.

5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки.

6. Внутренний контрольный образец (BKO).

7. Отрицательные и положительные контрольные образцы.

8. Состав разработанной тест-системы.

9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.

10. Сравнение чувствительности методов ПЦР и ИФА.

11. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «БИГ».

12. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения.

13. Эпизоотическая статистика при тестировании кормов на ДНК жвачных животных методом ПЦР в России.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

РИСУНКИ.

ТАБЛИЦЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции»

Актуальность проблемы

Ветеринарная служба, защищая потребителя от фальсификации мясной продукции, постоянно проводит видовую дифференциацию мяса в продуктах питания и кормах, подвергавшихся термической обработке. Значение этих мероприятий в последние годы особенно возросло в связи с открытием новых видов прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ГЭ) (10).

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) впервые выявлена в Великобритании в ноябре 1986 года (148). По данным международного эпизоотического бюро за 1989-2002 годы в мире зарегистрировано 3611 случаев ГЭ КРС, и более 177 ООО случаев в Великобритании. В 2000-2001 годах отмечен рост случаев ГЭ КРС во Франции (134), Ирландии, а в 2001-2002 годах в Бельгии, Германии, Нидерландах, Испании, Италии, Португалии отмечено от нескольких десятков до сотен случаев в год. В 2003 году в мире зарегистрировано 777 случаев ГЭ КРС и 425 случаев в Великобритании.

Основной источник заражения ГЭ - мясокостная мука, полученная из жвачных животных. В Великобритании в начале 80-х годов были изменены режимы переработки сырья животного происхождения при производстве мясокостной муки, которые не обеспечивали инактивацию возбудителя болезни (3).

С 1996 г. во всех странах Европейского Союза (ЕС) ввели запрет на скармливание жвачным животным мясокостной муки, приготовленной из млекопитающих. Однако из-за незаконного сбыта мясокостной муки в страны, не являющиеся членами ЕС, и фальсификации рыбной муки добавками протеинов млекопитающих по экономическим причинам риск заражения достаточно велик. В связи с открытием в последние годы ГЭ кошек в группу риска попали и корма для домашних животных (25).

Таким образом, определение видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов актуально. Однако такие методы как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция кольцеприципитации (КП) применяемые для видовой идентификации сырого мяса не эффективны, т.к. термическая обработка приводит к денатурации белков и потере ими видовой специфичности (62).

В отличие от белков ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции. Поэтому применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР) является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов подвергавшихся термической обработке.

Цель и задачи исследования

Цель исследования — разработать тест-систему для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ПЦР для идентификации и дифференциации ДНК говядины и баранины в кормах.

2. Оценить эффективность различных способов выделения ДНК из кормов (рыбная и мясная мука), комбикормов для крупного, мелкого рогатого скота и птицы, сухих и консервированных кормов для домашних животных (собак, кошек).

3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы с ИФА-набором фирмы Cortees Diagnostics Limited (Великобритания).

4. Определить эффективность ПЦР-тест-системы для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР при тестировании кормов, поступающих по импорту в Россию.

Научная новизна работы

Впервые сконструированы олигонуклеотидные праймеры для дифференциальной амплификации специфических последовательностей ДНК жвачных животных (крупного и мелкого рогатого скота) в варианте мультиплексной ПЦР, на основе которых разработана тест-система, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси мясокостной муки жвачных в исследуемом материале или 10 пг ДНК жвачных в пробе ПЦР.

Установлено, что универсальным методом пробоподготовки корма является протеиназная обработка с последующей сорбцией ДНК на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина. Данный метод пробоподготовки исследуемого материала обеспечивает высокую чувствительность тест-системы.

Создан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и полностью исключает ошибки исследователя при постановке реакции.

Разработаны положительные контрольные образцы ДНК bovis и ДНК ovis, являющиеся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов (680 и 350 п.н. соответственно).

Практическое значение работы

Разработана и впервые внедрена в ветеринарную практику тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции.

Установлено, что ПЦР-анализ для выявления тканей жвачных животных в кормах, значительно превосходит по чувствительности и специфичности традиционные методы (ИФА и реакция КП) и позволяет дифференцировать ДНК крупного и мелкого рогатого скота в варианте мультиплексной ПЦР.

Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «БИГ» с декабря 2000 года по январь 2004 года позволило снизить фальсификацию рыбной муки и кормов тканями жвачных животных с 30,3% до 6,1%, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:

1. Наставление по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (№ 13-5-02/0161);

2. Технические условия тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-029-00494189-01).

Апробация диссертации

По теме диссертации опубликовано 4 научных статьи.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ 1999-2003 гг.

Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (Москва, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г.); на международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.); на 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.); на научно-проблемных методических коммисиях ФГУ ВГНКИ (1999-2003 гг.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена 104 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 162 источника, в том числе 148 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 9 таблицами. Прилагаются разработанные нормативные и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

Щ *

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сорокина, Мария Юрьевна, 2004 год

1. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. — 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987 - 336 е., ил.

2. Гусева Е.В., Сатина Т.А., Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (обзор литературы). Владимир, 1997.

3. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных. / Руководство для врачей. М.: Медицина, 1999. —192 е.: ил.

4. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н., Шипулин Г.А. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных. // Ветеринария. 2000. - № 3. - С. 25-28.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская миробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. — СПб.: СпецЛит, 2002. 591 е.: ил.

6. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 е., ил.

7. Монкс О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С. Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии. // Ветеринария. 1998. -№ 1. - С. 16-22.

8. Орлянкин Б.Г. Структура и биология прионов (обзор). // С.-х. биол. 1998. -№2.-С. 46-58.

9. Устин А.В., Макаров В.В.// С.-х. биол., 1994, 2:20-25.

10. Хохрин С.Н. Корма и кормление животных: Учебное пособие. СПб.: Издательство "Лань", 2002. 512 с.

11. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues in searching molecular sequence databases. // Nature Genet. 1994. - V. 6. - P. 119-129.

12. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 403-410.

13. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

14. Barttlett S.E., Davidson W.S. FINS (forensically informative nucleotide sequencing): A procedure for identifying the animal origin fo biological speciements. // Biotechniques. 1992. - V. 12. - P. 408-411.

15. Bassam B.J., Caetano-Anolles G. Automated "hot start" PCR using mineral oil and paraffin wax. // Biotechniques. 1993. - V. 14(1). - P. 30-34.

16. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank: update. // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32(Database issue). - P. D23-D26.

17. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank. // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 23-27.

18. Berger R.G., Mageau R.P., Schwab В., Johnston R.W. Detection of poultry and pork in cooked and canned meat foods by enzime-linked immunosorbent assays. J.Assoc, of anal. chem. 1988 - V.71. - P. 406-409.

19. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., Van Der Noordaa J. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. - V. 28(3). - P. 495-503.

20. Bradley R. Animal prion diseases. In: Prion deseases (by ed. Collinge J., Palmer M.S.). Oxford University Press. - 1997.

21. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Ferrie R., Newton C., Little C. The elimination of primer dimer-accumulation in PCR. // Nucleic Acids Res. —1997. V. 25. - P. 3235-3241.

22. Bruce M.E., Will R.G., Ironside J.W et al. Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. // Nature. 1997. - V. 389 (6650). - P. 498-501.

23. Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48(1)-P. 137-144.

24. Buntjer J.B., Lenstra J.A., Haagsma N. Rapid species identification in meat using satellite DNA probes. // Z. Lebesm. Unters. Forseh. 1995. - V. 201. - P. 577582.

25. Butler D. Brain mix-up leaves BSE research in turmoil. // Nature. 1998. - V. 413.-P. 760.

26. Butler D. Doubts over ability to monitor risks of BSE spread to sheep. // Nature.1998.-V. 395.-P. 6-7.

27. Chen H., Zhu G. Computer program for calculating the melting temptrature of degenerate oligonucleotides used in PCR or hybridization. // Biotechniques. -1997.-V. 22(6).-P. 1158-1160.

28. Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31(13). - P. 3497-3500.

29. Chikuni K., Tabata T., Kosugiyama M., Monma M., Saito M. // Meat Sciense. -1994.-V. 37.-P. 337-345.

30. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extractoin. // Anal. Biochem. 1987. -V. 162.-P. 156-159.

31. Cimino C.D., Metchette K.C., Tessman J.W., Hearst J.E. Isaacs S.T. Post-PCRsterilisation: a method for the polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. -1991.-V. 19(1).-P. 99-107.

32. Collinge J., Sidle K.C.L., Meads J.E.A. Molecular analysis of prion stain variation and the aetiology of new variant CJD. // Nature. 1996. - V. 383 (6602) - P. 685690.

33. Compton T. Degenerate primers for DNA amplification. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). New York: Academic Press. -1990.-P. 39-45.

34. Court of auditors. Special report No 14/2001 on BSE. // Official Journal of European communities. 20.11.2001 - C 324/1.

35. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P. (ed.). Molecular Biology Techniques Manual. Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town.-2001.

36. Dang C., Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. // J.Mol.Biol. 1996. - V. 264(2).-P. 268-278.

37. DAquila R.T., Bechtel L.J., Videler J.A., Eron J.J., Gorczyca P, Kaplan J.C. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. // Nucleic Acids Res. 1991. - V. 11;19(13). - P. 3749.

38. Deslys J.P., Comoy E., Hawkins S., Simon S., Schimmel H., Wells G., Grassi J., Moyagh J. Screening slaughtered cattle for BSE. // Nature. 2001. - V. 409. - P. 476-477.

39. Dielfenbach C.W., Lowe T.M.F., Dveksler G.S. General concepts for PCR primer desin. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

40. Dupont M., Goldsborough A., Levayer T., Savare J., Rey J.M., Rossi J.F.,1.Demaille J., Lavabre-Bertrand T. Multiplex fluorescent RT-PCR to quantity leukemic fusion transcripts. // Biotechniques. 2002. -V. 33(1). -P. 158-164.

41. Ebbehoj K.F., Thomsen P.D. Species differentiations of heated meat product by DNA hybridization. // Meat Sei. 1991. - V. 30. - P. 221-234.

42. Eggert A., Brodeur G.M., Ikegaki N. Relative quantitative RT-PCR protocol for TrkB expression in neuroblastoma using GAPD as an internal control. // Biotechniques. 2000. - V. 28(4). - P. 681-691.

43. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction. // Science. 1991. -V. 252(5013). - P. 1643-1651.

44. Frankel G., Giron J.A., Valmassoi J., Schoolnik G.K. Multi-gene amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool. // Mol. Microbiol. 1989. - V. 3(12). - P. 1729-34.

45. Fugate H.G., Penn S.R. Immunodiffusion technique for the identification of animal species. // J. Assoc. Off Anal. Chem. 1971. - V. 54(5). - P. 1152-1156.

46. Fuqua S.A.W., Fitzgerald S.D. and McGuire W.L. A simple polymerase chain reaction method for detection and cloning of low-abundance transcripts. // BioTechniques. 1990. - V. 9(2) - P. 206-211.

47. Gelfand D.H., White T.J. Thermostable DNA polymeases. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.) New York: Academic Press. -1990.-P. 129-141.

48. Gordon D.F., Quick D.P., Erwin C.P., Donelson J.E., Maurer R.A. Nucleotide sequence of the bovine growth hormone chromosomal ; gene. // Mol. Cell Endocrinol. 1983. -V. 33(1). P. - 81-95. Review.

49. Gorelenkov V., Antipov A., Leinine S., Daraselia N., Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. // Biotechniques. 2001. - V. 31(6). - P. 1326-1330.

50. Grennan B., O'Sullivan N.A., Fallon R., Carroll C., Smith T., Glennon M., Maher M. PCR-ELISAs for the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry samples. // Biotechniques. 2001. - V. 30(3). - P. 602-610.

51. Hayden A.R. // J. Food Sei. 1981. - V. 46. - P. 1810-1813.

52. Henegariu O., Neerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. // Biotechniques. 1997. - V. 23.-P. 504-511.

53. Hoffman K., Fischer K., Muller E., Kemper V. Experiments to demonstrate the effectiveness of heat treatments applied to canned meats and meat-ans-bone meals. // Fleischwirtschaft. 1996. - V. 76. - P. 920-923.

54. Horton R.M., Hoppe B.L. Conti-Tronconi B.M. AmpliGrease: "hot start" PCR using petroleum jelly. // Biotechniques. 1994. - V. 16(1). - P. 42-43.

55. Innis M.A., Gelfand D.H. Optimisation of PCR Protocols. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.) New York: Academic Press. -1990.-P. 3-12.

56. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. (ed.). PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, California. - 1990. - 523 P

57. Innis M.A., Myambo K.B., Gelfand D.H., Brow M.A.D. DNA sequencing with Thermus aquaticus SNA polymerase and direct sequensing of polymerase chain reaction amplified DNA. // Proc.Natl. Acad. Sei. USA. - 1989. - V. 85. - P. 9436-9440.

58. Jensen J.S., Uldum S.A., Sondergard-Andersen J., Vuust J., Lind K. Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples. // J Clin Microbiol. 1991. - V. 29(1). - P. 46-50.

59. Jobse C., Buntjer J.B., Haagsma N., Breukelman H.J., Beintema J.J., Lenstra J.A. Evolution and recombination of repetitive DNA from the ruminants. // J.Mol.Evol. -1995.-V. 41.-P. 277-283.

60. Kaboev O.K., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., Bahrmand A.R. PCR hot start using primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure). // Nucleic Acids Research. 2000. - V. 28 (21). - P. 94-95.

61. Kaboev O.K., Shevelev I.V., Luchkina L.A., Tret'iakov A.N., Shcherbacova O.G.Bioorg. Khim. 1999. - V. 25. - P. 398-400.

62. Kainz P., Schmiedlechner A., Strack H.B. Specifity-enhanced hot-start PCR: addition of double-strand DNA fragments adapted to the annealing temperature. // Biotechniques. 2000. - V. 28(2). - P. 278-282.

63. Kang'ethe D.K., Lindquist K.J., Gathuma J.M. In: Biochemical identification of meat species, (ed. Patterson R.L.S.). NY: Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York. - 1985. - P. 129-144.

64. Karlin S., Altschul S.F. Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. — V. 90. -P. 5873-5877.

65. Kellogg D.E., Snisky J.J., Kwok S. Quantitation of HIV1 proviral DNA ralative to cellular SNA by the polymerase chain reaction. // Anal.Biochem. 1990. - V. 189. -P. 202-208.

66. Kidd K.K., Ruano G. Optimizing PCR. In: PCR 2. A pracrical approach, (ed. McPherson M.J., Harnes B.D., Taylor G.R.). Oxford University Press. - 1995.

67. Kim S., Kim T. Selection of optimal internal controls for gene expression profiling of liver disease. // Biotechniques. 2003. - V. 35(3). - P. 456-460.

68. Kimberlin R.H., Wilesmith J.W. Bovine spongioform encephalopathy: epidemiology, low dose expose and risk. // Ann. N.Y. Acad. Sei. — 1994. V. 724. -P. 210-220.

69. Knoth K., Roberts S., Poteet C., Tamkun M. Gugkt degenerate, inisine-containing primers specifically amplkfy rare cDNA using the polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 10932.

70. Krawetz S.A., Pon R.T., Dixon G.H. Increased efficiency of the Taq polymerase catalysed polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Research. 1989. — 17(2) -P. 819.

71. Kuipler M., Sanches R., Gaken J.A., Bignon Y.-J. Cloning and characterization of retroviral plasmid, pCCl, for combination suicide gene therapy. // Biotechniques. 2000. - V. 28(3). - P. 572-576.

72. Kwok S. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). Academic Press, San Diego, California. - 1990. - P. 142-5

73. Kwok S., Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. // Nature (London).1989.-V. 339.-P. 237-238.

74. Lasmezas C.I., Deslys J.P., Demainay R. et al. BSE transmission to macaques. // Nature 1996. -V. 381. - P. 743-744.

75. Latora D., Hopkins D., Campbell K., Hurley J.M. Multiplex allele-specific PCR with optimized locked nucleic acid primers. // Biotechniques. 2003. - V. 34(6). -P. 1150-1158.

76. Lee M.S., Chang K.S., Cabanillas F., Freireich E.J., Trujillo J.M., Stass S.A. Detection of minimal residual cells carrying the t(14;18) by DNA sequence amplification. // Science. 1987. - V. 237(4811). - P. 175-8.

77. Loh E.Y., Elliot J.F., Cwirla S., Lanier L.L., Davis M.M. Polymerase chain reaction with single-sided specificity: analysis of T cell receptor delta chain. // Science. 1989. - V. 243(4888). - P. 217-20.

78. Lopez R., Robinson S., Kibria A., Harte N., Patel G., Harper R., Quevillon E., Silventoinen V., Kallio K., Jokinen P. The European Bioinformatics Institute web site: a new view. // Bioinformatics. 2003.- V. 19(4). - P. 546-547.

79. MacCallum L.J. Detection of PCR amplified products In: PCR essential data (ed. Newton C.R.). Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.

80. Maddison D.R., Swofford D.L., Maddison W.P. NEXUS: an axtendible file format for systematic information. // Syst. Boil. 1997. - V. 46. - P. 590-621.

81. Malo M.S., Abedrapo M., Chen A., Mozumder M., Pushpakaran P., Alkhoury F., Zhang W., Fleming E., Hodin R.A. Improved eukaryotic promoter-detection vector carrying two liciferase reporter genes. // Biotechniques. 2003. - V. 35(6). - P. 1150-1154.

82. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (ed.). Molecular cloning, a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor - 1982.

83. Manos M.M., Ting Y., Wright D.K., Lewis A.J., Broker T.R., Wolinsky S.M.Molecular Diagnostics of Human Cancer. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. - 1989. - 7. - P. 209-14.

84. Manz J. // Fleischwirtsch 1985. - V. 65. - P. 497-499.

85. Matthews J.L.K., Chung M., Matyas J.R. Persistent DNA contamination in competitive RT-PCR using cRNA internal standards: identity, quantity and control. // Biotechniques. 2002. - V. 32(6). - P. 1412-1417.

86. McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R. (ed.) PCR 2. A Practical Approach. -Oxford University Press. — 1995.

87. Meyer R., Candrian U., Luthy J. Detection of pork in heated products by the polymerase chain reaction. // Journal of AOAC International. 1994. — V. 77. - P. 617-622.

88. Meyer R., Hofelein C., Luthy J., Candrian U. PCR-RFLP analysis: a simple method for species identification in food. // Journal of AOAC International. — 1995.-V. 78.-P. 1542-1551.

89. Milgrom F., Tuggac Z.M., Witebsky E. Studies on species specificity. // J. Immunol. 1964. - V. 93. - P. 902-909.

90. Miyazaki S., Sugawara H., Gojobori T., Tateno Y. DNA Data Bank of Japan (DDBJ) for genome scale research in life science. // Nucleic Acids Res. — 2003. -V.31.-P. 13-16.

91. Moretti T., Koons B., Budowle B. Enhancement of PCR amplification yield and specificity using AmpliTaq Gold DNA polymerase. // Biotechniques. 1998. - V. 25(4).-P. 716-722.

92. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymology (ed. R. Wu). — 1987. V. 155. -P. 335-50. Academic Press, London.

93. Nakamura Y., Carlson M., Kraspcho K., White R. Isolation and mapping of a polymorphic DNA sequence (pMCT118) on chromosome lp D1S80. // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16(19) - P. 9364.

94. Newton C.R. (ed.). PCR essential data. Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.

95. Orian J.M., O'Mahoney J.V., Brandon M.R. Cloning and sequencing of the ovine growth hormone gene. //Nucleic Acids Res. 1988. - V.16(18). - P. 9046.

96. Orrego C. Organizing a laboratory for PCR work. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press. 1990.

97. Oste C. Amplifications. 1989 - V. 1. - P. 10.

98. Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA //Methods in Enzymology. 1990. - V. 183. - P. 63-98.

99. Pearson W. R., Lipman D. J. Improved Tools for Biological Sequence Comparison. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1988. V. 85. - P. 2444- 2448.

100. Pearson W.R. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package. // Methods Mol Biol. 2000. - V. 132. - P. 185-219.

101. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 3724-3730.

102. Powel S.J. Protocol optimization and reaction specificity. In: PCR essential data (ed. Newton C.R.). Oxford: John Wiley & Sons Ltd. - 1995.

103. Prusiner S.B. Prions. In: Fields Virology, third edition. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia. - 1996. - P. 2901-2950.

104. Prusiner S.B. The prion diseases. // Brain Pathol. 1998. - V. 8. - P. 499513.

105. Rice P., Longden I., Bleasby A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. // Trends Genet 2000. 2000. - V. 16(6). - P. 276-277.

106. Ridley R.M., Baker H.F. Variation on theme of Creutzfeldt-Jakob disease: implications of new cases with a young age at onset. // J. Gen. Virol. 1996. - V. 77(12).-P.2898-2904.

107. Rosenstraus M., Wang Z., Ghang S.-Y., DeBonville D., Spadoro J.P. An Internal Control for Routine Diagnostic PCR: Design, Properties, and Effect on Clinical Perfomance.// Journal of Clinical Microbiology.- 1998.-V. 36(1). -P. 191-197.

108. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K. and Rasmussen O.F. 1992. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solution. // International Journal of Food Microbiology. 1992. - V. 7. -P. 37-45.

109. Ruano G., Brash D.E., Kidd K.K. PCR: the first few cycles. // Amplifications. -1991.-V. 7.-P. 1-4.

110. Ruano G., Pagliaro E.M., Schwartz T.R., Lamy K., Messina D., Gaensslen R.E., Lee H.C. // Biotechniques. 1992. - V. 13. - P. 266.

111. Rudi K., Treimo J., Moen B., Rud I., Vegarud G. Internal controls for normalizing DNA arrays. // Biotechniques. 2002. - V. 33(3). - P. 496-502.

112. Rybicki E. PCR Primer Design and Reaction optimisation. In: Molecular BiologyTechniques Manual, (ed. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P.) — Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. 2001.

113. Rybicki E., Hughes F.L. Detection and typing of maize streak virus and other distanly ralated geminiviruses of grasses by polymerase chain reaction amplyfication of a conserved viral sequence. // Jornal of General Virology. 1990. -V. 71.-P.2519-2526.

114. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA.//Nucleic Acids Res. 1989.-V. 17(21).-P. 8543-8551.

115. Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization fo the annealing temperature for DNA ampification in vitro. // Nucleic Acids Research. 1990. - V. 18(21). -P. 6409-6412.

116. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymarase. // Sience. 1988. - V. 239. - P. 487-491.

117. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restiction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Sience. 1985. - V. 230. - P. 13501354.

118. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86(16). - P. 6230-4.

119. Sardelli A.D. 1993. Amplifications. 9: 1

120. Sarkar G., Kapeiner S., Sommer S.S. Formamide can drastically increase the specificity of PCR. // Nucleic Acids Research. 1990. - V. 18(24). - P. 7465.

121. Schiermier Q. Testing times for BSE. //Nature. 2001. - V. 409. - P. 658-659.

122. Shams L., Kanitani Y., Shimojo S. Likely size of the French BSE epidemic. // Nature. 2000. - V. 408. - P. 787-788.

123. Shibata D., Namiki T., Higuchi R. Identification of a mislabeled fixed specimen by DNA analysis. II Am. J. Surg. Pathol. 1990. - V. 14(11). - P. 1076-8.

124. Sims R.J. Ill, Liss A.S., Gottlieb P.D. Normalization of luciterase reporter assays under condition that alter internal controls. // Biotechniques. 2003. - V. 34(5). -P. 938-940.

125. Sinclair A.J., Slattery W.J. Identification of meat according to species by isoelectric focusing. // Aust. Vet. J. 1982. - V. 58(2). - P. 79-80.

126. Smith K.T., Long C.M. Bowman B, Manos M.M. Using cosolventa to engence PCR amplification. // Amplifications 1990. - V. 9/90(5). - P 16-17.

127. Stoesser G., Baker W., van den Broek A., Garcia-Pastor M., Kanz C., Kulikova T., Leinonen R., Lin Q., Lombard V., Lopez R. et al. (2003) The EMBL nucleotide sequence database. // Nucleic Acids Res. — 2003. V. 31. - P. 17-22.

128. Thweatt R., Goldstein S., Reis R.J.S. A universal primer mixture for sequense determination at the 3'ends of cDNAs. // Analytical Biochemisty. — 1990. V. 190. -P. 314-316.

129. Unseld M., Beyermann B., Brandt P., Hiesel R. Identification fo the species origin fo highly processed meat product by mitochondrial DNA sequences. // PCR Methods and Applications. 1995. - V. 4. - P. 241-243.

130. Vize P.D., Wells J.R.E. Isolation and characterization of the porcine growth hormone gene. // Gene. 1987. V. 55(2-3). - P. 339-44.

131. Wang A.W., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 9717-9721.

132. Weant R.S., Edmunds P., Swaninathan B. 1990. Effect of ionic and nonionic detergents on the Taq-polymerase. // Biotechniques. 1990. - V. 9. - P. 308-309.

133. Weissensteiner T., Lanchbury J.S. Strategy for controlling preferential amplification and avoiding false negatives in PCR typing. // Biotechniques. — 1996. V. 21(6). - P. 1102-1108.

134. Wells G.A., Scott A.C., Johnson C.T., Gunning R.F., Hancock R.D., Jeffrey M., Dawson M., Bradley R. A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. // Veterinary Record. 1987. - V. 121. - P. 419-420.

135. Westbrook J., Feng Z., Chen L., Yang H., Berman H. M. The Protein Data Bank and structural genomics. //Nucleic Acids Research. -2003. Vol. 31(1). -P. 489491.

136. White T.J., Madej R., Persing D.H. The polymerase chain reaction: clinical applications. // Adv. Clin. Chem. 1992. - V. 29. - P. 161-196.

137. Wilesmith J.W., Hoinville I.J., Ryan J.B.M. et al. Bovine spongiform encephalopathy: aspects of the clinical picture and analyses of possible changes 1986-1990. // Vet. Record. -1992. V. 130. - P. 197-201.

138. Will R.G., Ironside J.W., Zeidler M.A. et al. A new variant of Creutzfeldt-Jakob desease in the UK. // Lancet. 1996. V. 347. - P. 921-925.

139. Willhauck M., Vogel S., Keilholz U. Internal control for quality assurance of diagnostic RT-PCR. // Biotechniques. 1998. - V. 25(4). - P. 656-659.

140. Williamson A.L., Rybicki E. Detection of genital human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification with degenerate nested primers. // J. Med., Virol. 1991.-V. 33(3).-P. 165-171.

141. Worswick R. BSE record set straight. // Nature. 2001. - V. 414. - P. 249.

142. Wright D.K., Manos M.M. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.). Academic Press, San Diego, California. - 1990. - P. 356-367.

143. Yamada M., Hudson S., Tournay O., Bittenbender S., Shane S.S., Lang B., Tsujimoto Y., Caton A.J., Rovera G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86.-P. 5123.

144. Yap E.P.H., McGee J.O.D. Short PCR products yeilds improved by lower denaturation temperatures. //Nucleic Acids Research. 1991. - 19(7). - P. 1713.

145. Набора для определения примеси тканей крупного рогатого скота в. рыбной муке иммуноферментным методом (ВНИИЗЖ, г.Владимир);

146. Набора для определения примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке в реакции кольцепреципитации (ВНИВИ, г.Казань);

147. Набор для определения примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке иммуноферментным методом (ВНИИЗЖ, г.Владимир) показал низкую чувствительность (76%) и специфичность (57,2%) и в существующем виде для практического применения малопригоден.

148. Набор для определения примеси тканей крупного рогатого скота в рыбной муке в реакции кольцепреципитации (ВНИВИ, г.Казань) показал низкую чувствительность (29,4%) и специфичность (21%) и в существующем виде для практического применения непригоден.