Молекулярно-генетический анализ возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота в северо-западном регионе РФ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Прасолова Ольга Владимировна

• Прасолова Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Прасолова Ольга Владимировна

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Исторические данные, распространение вируса ВД КРС

2.2 Течение и симптомы болезни

2.3 Пути передачи инфекции

2.4 Патогенез

2.5 Патогенность вируса

2.6 Классификация

2.6.2 Морфология и характеристика вириона

2.6.3 Организация генома и репликация

2.6.4 Протеины

2.6.5 Устойчивость

2.6.6 Антигенная вариабельность

2.7 Диагностика ВД КРС

2.8 Патологоанатомические изменения

2.9 Профилактика и лечение ВД

2.10 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы и оборудование

3.1.1 Патологический и биоматериал

3.1.2 Культура клеток

3.1.3 Коммерческие наборы для исследования

3.1.4 Средства измерений

3.1.5 Реактивы для молекулярно-генетических исследований

3.1.6 Посуда и материалы

3.1.7 Програмное обеспечение

3.1.8 Препараты для лечения животных

3.2 Методы исследования

3.2.1 Проведение серологического мониторинга

3.2.2 Эпизоотологическое обследование

3.2.3 Культивирование вируса на культуре клеток

3.2.4 Проведение ПЦР анализа

3.2.5 Положительные контроли

3.2.6 Секвенирование амплифицированных фрагментов генома

3.2.7 Определение нуклеотидной последовательности методом 53 капиллярного электрофореза

3.3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.3.1 Идентификация патологических агентов в респираторном 62 симптомокомплексе у крупного рогатого скота в хозяйствах

3.3.2 Выделение вируса на культуре клеток

3.3.3 Выбор специфических праймеров для амплификации и 74 детекции вируса ВД КРС

3.3.4 Подбор оптимальных условий амплификации

3.3.5 Введение контрольных образцов

3.3.6 Анализ специфичности работы олигонуклеотидов

3.3.7 Анализ чувствительности методики

3.3.8 Эффективность ПЦР

3.3.9 Исследование биологического материала

3.3.10 Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса ВД КРС

3.3.11 Филогенетический анализ вируса ВД КРС

3.3.12 Интерпретация результатов испытания с использованием 96 ресурса NCBI/BLAST

3.3.13 Схема оздоровления хозяйства

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота в северо-западном регионе РФ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Вирусная диарея крупного рогатого скота широко распространена в мире и является одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии промышленного животноводства, причиняющей серьёзный ущерб воспроизводству животных в таких странах, как Канада, Голландия, Дания, Франция, Германия, Австрия, Венгрия и США [Booth E.R., 2013]. В этих странах заболевание носит эндемичный характер, а серопозитивность взрослого скота достигает 50-90% [Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., 2007].

На территории нашей страны ВД КРС наиболее часто регистрируется в регионах с высоким уровнем ведения племенного молочного животноводства (Петрова О. Г., 2014; Шилова Е.Н., 2014; Глотов А.Г., 2017), к числу которых можно отнести Северо-Западный, молочное скотоводство которой характеризуется наивысшим в РФ уровнем продуктивности

Так, по данным А.Е. Верховской (2008) - 90,9% обследованных животных в 15 регионах РФ являются серопозитивными. При исследовании ввезенного скота, в том числе племенного, в шести регионах Сибири, от 75 до 95% поголовья оказались серопозитивными, однако данные по генотипированию BVDV и изучению свойств этого вируса в русской литературе отсутствуют [A. G. Glotov, T. I. Glotova, 2016]. Наряду с улучшением племенных качеств стад в регионах РФ, возникли и конкретные проблемы так, как вирусы повреждая защитные механизмы дыхательной и пищеварительной систем, облегчают проникновение различных бактерий (Escherichia coli, Proteus, Mycoplasma, Chlamydiaceae и др.), которые в значительной степени определяют тяжесть течения болезни [Плешакова В.И., 2012] и играют важную роль в возникновении иммунодефицитов у животных [Галиуллин А.К., 2014].

Основной причиной появления данной инфекции в РФ является ввоз племенного поголовья КРС из эндемичных стран так, как до 2015 года исследование на вирусную диарею крупного рогатого скота не входило

в перечень диагностических исследований в перечень диагностических исследований при перемещении животных между государствами. Решение о необходимости такого исследовании было принято в рамках Решения Комиссии Таможенного союза от 18.06.2010 г. №317 (ред. от 14.07.2015 г.) «О применении ветеринарно-санитарных мер в Евразийском экономическом союзе», но только в отношении племенных не вакцинированных животных и семенного материала. На момент вступления в силу данного решения в РФ наиболее распространенные диагностикумы, используемые в рутинной работе лабораторий могли выявлять вирус ВД, но не определять его генотипы, что необходимо для изучения молекулярной эпизоотологии болезни в рамках рамках Кодекса здоровья наземных животных МЭБ [2016]. Особое значение имеет идентификация атипичных форм вируса ВД, в том числе при производстве вакцин и культивировании культур клеток [Stahl K., 2010; Palomares R.A., 2013].

Однако существующие методы идентификации вируса ВД имеют некоторые недостатки. Использование полимеразно-цепной реакции, для идентификации вируса, даже в мультиплексном варианте, не может быть эффективной из-за сложной генетической структуры генома. Поэтому актуальным является необходимость изучения генетической вариабельности вируса ВД по нескольким генам, циркулирующего на территории каждого региона и проведение филогенетического анализа в каждом конкретном случае.

Степень разработанности

Интенсивная работа по профилактике и оздоровлению животноводческих хозяйств от ВД-БС проводится в странах ЕС. При этом мнение о целесообразности использования вакцин неоднозначно. Учитывая положительный, так называемый скандинавский опыт оздоровительных мероприятий, Дания, Финляндия и другие страны в основу планов борьбы положили исключительно метод выявления и удаления из стада животных, зараженных ВД-БС. Это решение возникло в результате опыта, показавшего,

что противоэпизоотические мероприятия, акцентированные только на применении вакцин, недостаточно эффективны.

Проводимые в «неблагополучных» по ВД КРС хозяйствах различных регионов РФ мероприятия до недавнего времени сводились к вакцинации маточного поголовья и молодняка различными поли- или моновалентными вакцинами [Гулюкин М.И., 2007; Юров К.П.,2015], с помощью которых достигался временный эффект, но в целом проблема оставалась нерешенной.

Исследования М.И. Шульпина (2004 г.) предусматривают проведение филогенетического анализа генома только по 5UTR области генома. В работе А.Г. Южакова (2009г.) предлагается проводить секвенирование вакцинных и вирулентных штаммов пестивирусов (вирус КЧС и ВД). К сожалению данные исследования не затрагивали Северо-Западный регион и не предусматривали идентификацию атипичных форм вируса, один из которых выявлен в 2010 году в Италии.

По исследованиям S. Vilcek et al. (2001) штаммы первого генотипа, включающего 11 субгенотипов, распространены во всем мире. Второй генотип вируса ВД-БС КРС представлен несколькими субгенотипами и выделяется от больных животных значительно реже (J.F. Ridpath et al., 2005). Кроме отличий на генетическом уровне у вируса выявлены некоторые антигенные различия, которые значительно выше в пределах одного генотипа, чем между генотипами (M. Nagai et al., 2001; L. Jones et al., 2001; R.W. Fulton et al., 2005). Особое значение для изучения молекулярной эпизоотологии болезни имеет идентификация атипичных форм вируса.

Подразделение пестивирусов на виды проводится по нескольким параметрам, и их родству с типовыми вирусами видов, идентифицированных, на данный момент (BVDV-1:NADL; BVDV-2: 890; BDV: BD31 и CSFV: Alfort/187). Родство по нуклеотидному сиквенсу является важнейшим критерием подразделения пестивирусов на виды. Например, сиквенсы 5'-NCR между типовыми вирусами четырех известных, на данный момент, видов различаются на 15%. В большинстве случаев

степень гомологии по 5'^СЯлозволяет дифференцировать виды. Однако иногда родство по одному нуклеотидному сиквенсу может быть непонятным (двусмысленным) и должно быть подкреплено сиквенсами по нескольким генам либо дополнительными сравнительными анализами. Сыворотка крови переболевших животных, содержащая антитела против данного вида пестивирусов (например, BVDV-1), обычно имеет титр нейтрализующей активности в несколько раз выше в отношении вирусов соответствующего вида (BVDV-1), чем против вирусов других видов. Наконец, различия по виду животного, от которого выделен вирус, могут (но не всегда) помочь в определении видовой принадлежности. Например, BVDV-1 и CSFV считаются разными видами, так как они отличаются друг от друга по (1) не менее чем 25%-му различию нуклеотидного состава (по полному геному), (2) не менее чем 10-ти кратным различиям по титрам нейтрализации, при проведении реакции перекрестной нейтрализации с использованием поликлональных антител (сывороток иммунных животных), и (3) по спектру восприимчивых видов животных-хозяев (в естественных условиях CSFV инфицирует только свиней, тогда как BVDV-1 инфицирует как жвачных, так и свиней).

Цель и задачи исследования Целью данной работы являлось проведение молекулярно-генетического анализа вируса вирусной диареи крупного рогатого скота по нескольким генам в Северо-Западном регионе РФ, осуществление филогенетического анализа выявленных генотипов, разработка схемы оздоровительных мероприятий.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести мониторинговые исследования этиологической структуры смешанных респираторных инфекций крупного рогатого скота в условиях Северо-Западного региона РФ;

2. Выделить вирус на чувствительной культуре клеток;

3. Изучить строение генома вируса ВД КРС и выбрать диагностически значимые гены для исследования. Подобрать универсальные праймеры на данные гены, для идентификации всех генотипов вируса, в том числе атипичных, оптимизировать условия ПЦР, создать положительные контроли. Определить специфичность и аналитическую чувствительность методики. Осуществить её метрологическую экспертизу;

4. Провести секвенирование генома и филогенетический анализ идентифицированных образцов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота;

5. Разработать схему оздоровления хозяйств в Северо-западном регионе РФ.

Научная новизна работы Определена этиологическая структура смешанных респираторных инфекций крупного рогатого скота в условиях Северо-Западного региона РФ.

Предложены оригинальные праймеры на диагностически значимые гены для амплификации и генотипирования всех возможных типов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Разработана методика эффективной лабораторной идентификации вируса, обладающая 100% специфичностью и высокой аналитической чувствительностью. Подана заявка на патент.

В результате секвенирования показано, что нуклеотидные последовательности вирусов, выделенных из хозяйств отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, используемых для профилактики вирусной диареи КРС на территории РФ.

При проведении филогенетического анализа установлено, что нуклеотидные последовательности вируса ВД КРС, выделенные из хозяйств Северо-Западного региона РФ, являются вакциноподобными и относятся к генотипу 1 подтипу «а».

Разработана схема оздоровительных мероприятий при вирусной диарее крупного рогатого скота.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Проведены мониторинговые исследования этиологической структуры смешанных респираторных инфекций крупного рогатого скота в условиях Северо-Западного региона РФ.

Выделены изоляты вируса вирусной диареи у крупного рогатого скота на изучаемой территории и изучены особенности его генетической вариабельности.

Результаты проведенных исследований апробированы и оформлены в виде практических и учебно-методических рекомендаций: «Применение молекулярно-генетических методов исследований в ветеринарии» - СПб, 2017 г. (одобрены и рекомендованы к изданию методическим советом Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины); «Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике вирусной диареи купного рогатого скота» - СПб., 2017 г. (одобрены и рекомендованы к изданию секцией зоотехнии и ветеринарии отделения сельскохозяйственных наук РАН); «Методические рекомендации по проведению оздоровительных мероприятий при вирусной диарее крупного рогатого скота в хозяйствах Ленинградской области» - СПб, 2017 г. (одобрены и рекомендованы к изданию комитетом по агропромышленному и рыбохозяйственному комплексу Ленинградской области).

Разработана и используется в лабораторной практике «Методика генетической идентификации вируса вирусной диареи крупного рогатого скота на основе секвенирования фрагментов генома», подвергнута метрологической экспертизе (регистрационный номер экспертного заключения МЭ 1/0013 от 16 ноября 2016 г.) и утверждена директором ФГБУ

«ВГНКИ» от 30 декабря 2016 г. (регистрационный № 154/4 от 19 января 2017 г.).

Результаты молекулярно-генетического анализа возбудителя вирусной диареи крупного скота в хозяйствах Северо-Западного региона РФ послужили основой для усовершенствования мероприятий по борьбе с данной болезнью.

Методология и методы исследований. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов. В работе использовали серологические (РНГА), вирусологические (культивирование, вирусвыделение), физико-химические (составление растворов необходимой концентрацией вещества), молекулярно-генетические (ОТ-ПЦР, секвенирование, клонирование) и статистические методы исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Этиологическая структура респираторных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Северо-Западного региона РФ;

2. Молекулярно-генетический анализ полученных последовательностей вируса вирусной диареи крупного рогатого скота;

3. Генетическая идентификация вируса вирусной диареи крупного рогатого скота на основе секвенирования фрагментов генома;

4. Оздоровление хозяйств при вирусной диарее крупного рогатого скота Степень достоверности и апробация результатов работы. Статистическую обработку результатов проводили по методу

Стьюдента-Фишера, построение графиков и диаграмм выполнены с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2010. Выравнивание геномов проводили методом ClustalW в программах MEGA 5.0 и BioEdit. Достоверность экспериментальных исследований подтверждена соответствующими испытаниями и проведенной независимой метрологической экспертизой разработанной методики. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчетных научных

и учебно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Санкт- Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (Санкт-Петербург, 2014, 2015, 2016).0сновные результаты диссертационной работы доложены на научных конференциях: 7 Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием -2015, (Москва); II международном Ветеринарном Конгрессе International VETistanbul Group Congress-2015 (Санкт-Петербург); Международной научной конференции студентов, аспирантов и учащейся молодежи, посвященной 85-летию зоотехнического образования в Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана, 2015 год, (Казань); Межведомственной научно-практической конференции «Инфекционные болезни - актуальные проблемы, методы борьбы и профилактика», 2015, (Москва); Международной научно-практической конференции молодых ученых «МОЛОДЕЖЬ И ИНН0ВАЦИИ-2015» УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», (Горки) 2015г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы морфологии и биотехнологии», 2015, (Самара); Всероссийской научно-практической конференции «Новые методы экспресс-диагностики микроорганизмов в медицине, фармации, ветеринарии и экологии», 2015 (Санкт-Петербург); 7 International Conference «Global Science and Innovation», 2016 год, Чикаго, США; 4-ом Европейском конгрессе Европейской ассоциации ветеринарной лабораторной диагностики (EAVLD), 2016 (Прага, Чехия); 4 Международной научной конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 55-летию аспирантуры ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2016г. (Владимир). IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2017» (Москва).

Публикации. Материалы диссертации легли в основу 16 научных работ, в том числе 4 статей были опубликованы в изданиях, включенных

ВАК Минобразования и науки в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертации.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертационной работы изложены на 165 страницах компьютерного текста. Включая введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты, обсуждение), заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы, приложения.

Библиографический перечень содержит 191 источник, в том числе 106 отечественных и 85 иностранных. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками (фотографиями/диаграммами/ графиками), 15 таблицами.

Личный вклад аспиранта. Диссертационная работа является результатом исследования автора в период с 2013 по 2017 годы. Исследования были осуществлены под руководством доктора биологических наук, профессора А.А.Сухинина. Научный руководитель оказывал организационно-методическую помощь в работе. Автор самостоятельно выполнила научные исследования, в том числе экспериментальные, систематизировала и проанализировала полученные результаты. Соавторы научных публикаций не возражают против использования в диссертации материалов совместных исследований О.В. Прасоловой.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Исторические данные, распространение вируса ВД КРС

Вирусная диарея (ВД) крупного рогатого скота — контагиозная болезнь преимущественно молодых животных, характеризующаяся эрозивными и язвенными поражениями слизистых пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфатических узлов, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей. У коров возможны аборты.

Распространение болезни в мире и России в частности представлены на картах с интернет ресурса МЭБ. Так если в 2010 многие страны заявляли об отсутствии болезни либо об эпизоодических вспышках, то в 2013 году вирус был представлен на большей территории мира и РФ, к 2016 году увеличилось количество стран с официально подтвержденным статусом зараженных зон (Рис.1-3)

Рис. 1 Карта распространения вируса ВД КРС в мире по данным МЭБ

на 2010 год.

уднро1ЕО:О1~|

Рис.2 Карта распространения вируса ВД КРС в мире по данным МЭБ

на 2013 год

ШМНРСИЕО го 1 7 |

Рис. 3 Карта распространения вируса ВД КРС в мире по данным МЭБ

на 2016 год

Как самостоятельное заболевание вирусная диарея зарегистрирована в США (П. Олофсон, 1946). Возбудитель выделили и идентифицировали Гиллеспи и сотр. (1961).

2.2 Течение и симптомы болезни

Инкубационный период варьирует в пределах 2-14 дней. Различают латентное, подострое, острое и хроническое течение болезни. Латентное течение инфекции устанавливают на основании обнаружения в сыворотке специфических антител. У инфицированных животных не выявляли клинических признаков болезни. Подострое течение характеризуется незначительным подъемом температуры до39,7-40,0.С, частичным или полным отказом от корма, быстропроходящими поражениями слизистой оболочки ротовой полости в виде гиперемии. Отмечают эрозии и изъязвления, иногда истечения из носовой полости, слезотечение, кашель и кратковременную (12-24 ч)диарею. Болезнь продолжается 2-4 дня и обычно заканчивается выздоровлением. Острое течение отличается внезапностью, высокой температурой (40,5-42,5.С), умеренной или сильной депрессией, тахикардии, учащениями дыхания, потерей аппетита. На слизистой оболочке ротовой полости заметны гиперемия, эрозии, со временем превращающиеся в язвы, покрытые сероватыми наложениями.

На носовом зеркале, в ноздрях, во влагалище образуются язвы. Выраженные признаки диареи наблюдаются преимущественно у телят. Каловые массы характеризуются жидкой консистенцией, зловонностью, с пузырьками газа, примесью слизи и крови. Могут отмечаться аборты у беременных животных. Диарея иногда длится до 30 дней и обычно заканчивается гибелью животных. Хроническое течение обычно наблюдается в конце эпизоотической вспышки. Появление симптомов болезни растягивается иногда до 6 месяцев. Прогноз чаще неблагоприятный.

Необходимо отметить, что у животных старше двух лет болезнь протекает, как правило, субклинически и часто остаётся незамеченной.

Наиболее неблагоприятный исход связан с трансплацентарным инфицированием потомства[73].

Хроническая инфекция развивается когда корова заражена не цитопатогенным штаммом вируса, в начале стельности вирус мутируя может переходить в цитопатогенный вариант, заражая плод до созревания его иммунной системы. В этом случае телята рождаются с отрицательным титром антител, но могут являться вирусоносителями на протяжении всей жизни, что делает их главным источником вируса. В стадах с такими животными существуют повышенные издержки производства из-за плохого усвоения корма, повышенной заболеваемости и ростом смертности [76,107].

Персистентно инфицированные телята часто рождаются слабыми, отстают в росте и поражаются вторичными пневмониями. Количество ПИ телят может достичь 50%, у которых могут развиться различные клинические признаки болезни слизистых: лихорадка, профузная диарея, ринит, эрозивный или язвенный стоматит, истощение и гибель в течение нескольких недель [14, 15]. Постнатальное инфицирование вирусом диареи не приводит к развитию персистентной инфекции, у животных наблюдаются клинические признаки и иммунный ответ.

2.3 Пути передачи инфекции ВД легко передаётся от животного к животному, от стада к стаду прямым или непрямым путём, особенно при остром течении и наличии персистентно инфицированных телят, выделяющих вирулентный вирус.

Трансплацентарное инфицирование плодов в практических условиях происходит достаточно часто. Считается, что у неиммунных стельных коров трансплацентарное инфицирование плодов происходит независимо от стадии стельности с вероятностью 100% [14]. Вирус разных генотипов и соответствующие нейтрализующие антитела обнаружены в сыворотке эмбрионов инфицированных коров. Исход трансплацентарного заражения зависит от иммунологической зрелости плода (125 дней) и вирулентности вируса. Заражение в ранний период стельности приводит

к гибели и рассасыванию плода. Заражение на 80-м -125-м дне стельности ведёт к гибели плодов или рождению телят с низкой массой тела или с дефектами развития. Такие телята являются иммунотолерантными, пожизненными носителями и выделителями вируса, предрасположенными к развитию болезни слизистых [76, 142]. Плоды, заражённые после 125 дней стельности, обычно выживают, образуют вируснейтрализующие антитела и освобождаются от вируса [11].

2.4 Патогенез

Из места внедрения вирус быстро попадает в кровь и разносится по всему организму. Примерно через 2...4 сут возбудитель локализуется на слизистой оболочке ротовой полости, пищевода, желудочно-кишечного тракта, в жидкостях глаза, обусловливая соответствующие поражения.

Вирус характеризуется весьма коварным механизмом воздействия на иммунную систему организма. Это действие обусловлено выраженной способностью возбудителя к репликации в лимфоидной ткани, вследствие чего происходит угнетение специфических и неспецифических защитных реакций животного (иммунодепрессия).

Проникая в лейкоциты, вирус разрушает их, в результате развивается острое заболевание, заканчивающееся гибелью, что связано с неспособностью животных продуцировать защитные вируснейтрализующие антитела. Инфицированные лимфоциты могут стать иммунологически неполноценными, что позволяет вирусу сохраняться в других чувствительных клетках в течение жизни животного. Такие животные, не имея вируснейтрализующих антител и оставаясь клинически здоровыми, могут выделять патогенный для не иммунного скота возбудитель вирусной диареи.

Возбудитель диареи крупного рогатого скота проникает через плацентарный барьер, что приводит к широкому распространению скрытой инфекции среди новорожденных телят, может вызывать поражения

центральной нервной системы при инфицировании плодов на критической стадии развития.

Диарея приводит к обезвоживанию организма и, как следствие этого, нарушению водно-солевого обмена, резкому и быстрому истощению, расстройству кровообращения, усилению токсикоза.

Заражение в период до 90 дней стельности в большинстве случаев сопровождается абортами и установлением персистентной инфекции у матери. Если заражение происходит между 90-м и 150-м днем, возникают конгенитальные дефекты нервной системы. Инфицирование после 150-го дня стельности, по данным многих исследователей, не отражается на состоянии плода.

Вирус прикрепляется к клеткам за счет рецепторов гликопротеина Е (Е1 и Е2), проникает в клетку путем эндоцитоза и реплицируется в цитоплазме. Вирус только частично выключает нуклеиновый и белковый синтез клетки млекопитающего-хозяина. Инфекция сопровождается пролиферацией перинуклеарных мембран. Изучение роли структурных и неструктурных вирусных белков показало, что Е белок оболочки играет главную роль в индукции нейтрализующих антител и защитного иммунитета.

г

Мягыо

С «мча

Рис.4 Жизненный цикл флавивирусов

Вирус прикрепляется к клеткам за счет рецепторов гликопротеина Е (Е1 и Е2), проникает в клетку путем эндоцитоза и реплицируется в цитоплазме (рис.4).

2.5 Патогеность

Различают два биотипа вируса: цитопатогенный (ЦП) и нецитопатогенный (НЦП). Каждый биотип вируса существует в виде двух генотипов: 1 и 2 [27, 28], которые различаются между собой генетически и иммунологически [2,3,4,5]. В природе встречаются оба биотипа вируса, относящиеся к первому или второму генотипам.

Анализ различных изолятов вируса диареи выявил тенденцию биотипов и генотипов к мутациям и рекомбинациям, в результате которых происходят внезапные изменения биологических свойств. Биотипы классифицируют по их способности вызывать цитопатический эффект в культуре клеток, а не по вирулентности для животных. Серологически оба биотипа (ЦП и НЦП) идентичны. Хотя болезнь вызывают оба генотипа, но острое и тяжёлое течение вызывает только НЦП вирус типа 2. Выявлено наличие 11 и более субгенотипов вируса [3,5], роль которых в патологии ВД пока не выяснена [3].

2.6 Классификация

В семейство Флавивирусов (от лат. flavus - жёлтый) входит большая группа вирусов, поражающих позвоночных и насекомых, состоит из 3 родов -род Pestivirus (от лат. pestis - чума): вирусы классической чумы свиней, диареи крупного рогатого скота и пограничной болезни овец; - род Flavivirus: вирусы жёлтой лихорадки, клещевого энцефалита и др.; - род Hepacivirus: вирус гепатита С.

Несмотря на то, что вирусы семейства имеют подобные геномы и сходные физико-химические свойства, они значительно различаются между собой биологически.

Современная классификация вирусов основана на определении типа геномной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК, одно- или двухнитевая,

положительной или отрицательной полярности, линейная непрерывная или сегментированная, циркулярно- замкнутая и т.д.), морфологии вириона, типе симметрии нуклеокапсида, стратегии репликации генома, биологических характеристиках вируса и клинической картине заболевания РНК-содержащие вирусы содержат 5-15 генов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Прасолова Ольга Владимировна, 2018 год

/ / / /

10-5 10 "6 ^07 10" 8 10"9 Ю"10

Порог|

5 10 15 20 25 30 35

-Рис. 19 Результат амплификации разведения плазмидной ДНК на

примере БУБ Крго (клон №2)

Уровень О при амплификации разведения плазмидной ДНК на

примере БУБ Крго (клон №2).

№ Имя Тип СТ Конц.Стандарта Конц. Расч. (Ког КозФФ. В а Сред. С1 Ст

3 клон 2-1 10 -5 Образец 13,59 13,53

4 клон 2-2 10 -5 Образец 13,54 13,54

7 клон 2-1 10 -6 Образец 23,08 23,03

8 клон 2-2 10 -6 Образец Образец 22,91 22,91

11 клон 2-1 10 -7 26,56 26,56

12 клон 2-2 10 -7 Образец 26,30 26,30

15 клон 2-1 10 -3 Образец 30,09 30,03

16 клон 2-2 10 -3 Образец 30,00 30,00

13 клон 2-1 10 -3 Образец 33,44 33,44

20 клон 2-2 10 -3 Образец 33,47 33,47

23 клон 2-1 10-10 Образец 36,87 36,87

24 клон 2-2 10-10 Образец 37,27 37,27

27 клон 2-1 10-11 Образец

23 клон 2-2 10-11 Образец

31 клон 2-1 10-12 Образец

32 клон 2-2 10-12 Образец

33 К- Образец

Вывод: В результате проведенных исследований для всех трех фрагментов выбраны клоны плазмид для положительного контроля (для 5/ -клон №1, для Крго - клон №2, для Е2 - клон №2), разведение которых было оптимальным 10-6.

3.3.6 Анализ специфичности работы олигонуклеотидов

Способность ПЦР тест-системы выявлять только целевую ДНК

Критерий

ПЦР тест-система должна выявлять целевую ДНК. ПЦР тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов в 100% проводимых исследований.

Результаты исследований

Для определения специфичности, согласно рекомендациям МЭБ, использовали панель образцов биоматериала, включающую в себя заведомо положительные (живые вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота, содержащих один и два генотипа вируса) и отрицательные образцы

(инактивированные вакцины, живые вакцины против классической чумы свиней, ТЕ-буфер).

В результате экспериментов доказано наличие специфической амплификации в образцах, содержащих РНК вируса ВД и отсутствие неспецифической амплификации гетерологичных штаммов и ДНК генома крупного рогатого скота. Таким образом доказана 100% специфичность методики.

3.3.7 Анализ чувствительности и предел обнаружения (ЬОБ) методики.

Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод.

Критерий:

Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Предел обнаружения определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1 %. Результаты исследований:

Определение аналитической чувствительности методики проводили с использованием десятикратных разведений рекомбинантных плазмид с известной концентрацией.

Готовили серию десятикратных разведений ПКО E2, и 5UTR в ТЕ буфере. Для каждого разведения проводили амплификацию целевого фрагмента в двух повторах. Для обеспечения воспроизводимости определение аналитической чувствительности проводили независимо с использованием разного оборудования. Результаты исследований представили в виде таблицы (Таблица 10,11,12).

За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, дающую воспроизводимый положительный сигнал при ПЦР.

Оценка аналитической чувствительности праймеров, используемых для

амплификации фрагмента 5иТК

№ образца Наличие фрагмента 5\ повтор №1 повтор № 2 Наименование образца

1 + + + ПКО 5\, концентрация 9 х105 копий/мл

2 + + +

3 + + + ПКО 5\, концентрация 9х104 копий/мл

4 + + +

5 + + + ПКО 5\, концентрация 9х10 копий/мл

6 + + +

7 + + + ПКО 5\, концентрация 9х10 копий/мл

8 + + +

9 + + + ПКО 5\, концентрация 90 копий/мл

10 + + +

Таблица 11

Оценка аналитической чувствительности праймеров, используемых для

амплификации фрагмента ^го

№ Наличие фрагмента повтор №1 повтор № 2 Наименование

образца образца

1 + + + ПКО ^га

2 + + + концентрация 7 х105

3 + + + ПКО ^го,

4 + + + концентрация 7х104

5 + + + ПКО Мрго

6 + + + концентрация 7х10

7 + + + ПКО ^го,

8 + + + концентрация 7х102

9 + + + ПКО ^го,

10 + + + концентрация 70

Оценка аналитической чувствительности праймеров, используемых для

амплификации фрагмента E2

№ образца Наличие фрагмента Е2 повтор №1 повтор № 2 Наименование образца

1 + + + ПКО Е2 концентрация 3 х105 копий/мл

2 + + +

3 + + + ПКО Е2,концентрация 3х104 копий/мл

4 + + +

5 + + + ПКО Е2 концентрация 3х10 копий/мл

6 + + +

7 + + + ПКО Е2 концентрация 3х102 копий/мл

8 + + +

9 + + + ПКО Е2 концентрация 30 копий/мл

10 + + +

Вывод: В результате исследований доказано, что аналитическая чувствительность ПЦР высокая, (90, 70 и 30 копий целевой ДНК соответственно), однако LOD составляет не более 0,1%, что соответствует критериям.

3.3.8 . Эффективность ПЦР

Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Критерий:

Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90% (от 90 до 110%). Это требование соответствуют значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): 3,1 - 3,6. В идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: E = 100% , (slope = -3,32). Эффективность ПЦР оценивали по уравнению:

Е = [10(-1/slope)]-1.

Результаты исследований:

Для оценки эффективности ПЦР проводили аплификацию с рядом логарифмических разведений целевой плазмидной ДНК в двух повторах каждое (табл 13).

Таблица 13

Логарифмические разведения целевой плазмидной ДНК и уровень О.

Разведения а FAM средн

ДНК матрицы, а FAM

фрагмент 5/ ^ разведений трешхолд 0,05

исходная 0,0 21,12 21,11 21,12

в 4 раза 0,6 23,26 23,23 23,25

в 16 раз 1,2 25,27 25,18 25,23

в 64 раза 1,8 27,60 27,45 27,53

в 256 раз 2,4 29,85 29,57 29,71

В 1024 раза 3,0 32,11 31,99 32,05

Г1М

• Хлршя

Рис. 20 Результат амплификации логарифмических разведений целевой плазмидной ДНК, на примере фрагмента Е2.

По результатам амплификации строили график зависимости О от логарифма условной концентрации ДНК матрицы, принимая за единицу

неразведенную ДНК. Определяли наклон линейной области (slope) (Рис. 21-23).

Рис.21 График зависимости О: от логарифма концентрации ДНК матрицы (эффективность амплификации) по 5/ области - 96%

Рис.22 График зависимости С: от логарифма концентрации ДНК матрицы (эффективность амплификации) по Крго области - 101%

70

60

50

у = 3,4369х + 15,023 Н2 = 0,9982

40

О

20

30

10

0

0

2

3

4

-1дС (ОМА)

5

6

7

Рис.23 График зависимости О: от логарифма концентрации ДНК матрицы (эффективность амплификации) по Е2 области - 95%.

Вывод: Эффективность ПЦР для трех пар праймеров находится в необходимом диапазоне измерений.

3.3.9 Исследование биологического материала

Для исследования мы использовали вирус, выделенный на культуре клеток КСТ, вакцины для профилактики ВД, биологический материал от крупного рогатого скота, у которого наблюдались признаки респираторных инфекций или диарея, из хозяйств Северо-Западного региона

3.3.10 Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса ВД КРС

Для секвенирования амплифицировали участки длиной 288, 428 и 820 п.н. Нами получены нуклеотидные последовательности для штамма КЛБЬ, чаще всего используемого при производстве вакцин, а так же для образцов из хозяйств Северо-Западного региона РФ. Для каждого хозяйства, в котором были обнаружены положительные результаты секвенирования.

3.3.11 Филогенетический анализ вируса ВД КРС

В большинстве случаев все нуклеотидные последовательности, полученные для образцов из одного хозяйства в одно время, совпадали между собой. Гомология нуклеотидных и аминокислотных последовательностей по каждому из трех фрагментов генома составила 98,9-100%. Поиск гомологичных последовательностей с осуществлялии с пользованием ресурса NCBI/BLAST (Рис. 24-27).

х ÄAJT® •»« ii]

им tatfi ЬМЬ ЬиОМЦм и*

»KM IUI! им HAT Mi 4(«vgfi«lvt)f tarn bctytf идеи an. IM Sn-W.rtataumiin

□ DELTA-BLAST.«вот* poiwwcraitn мг» а

BLAST AanbüdRttStqGinor« Otw i oc« )ПП| с и>9. V Mtf ГМ MI! MM ««mtViwta t rt Ц

•tkm ' Отанм «Vom 'fei km« • Ы • 9mm • тпи wn • rvKpw чи)ет •Ми i*t ! 'к WÜM • ig«« • АМмАп

SJWBUST МйММЛЬвв

OeomWjogvf/ ^ MM . .. . , T 1 |MM M чрм мири мри NUTmmi MfKlMtHlMMM wra BM| I Mr мм*

Ьгтртютщчтч*! tMk

Mi Setf mm ши лп; 1 ППЙМ vxew jur,

tMT Sertf hM<M MMdi хм 1 рмм

ом» FruK чйиМ шс«и i tr«M vc4e(4i wry

Рис. 24 Вид главной страницы BLAST ресурса NCBI.

Рис.25 Окно запроса BLAST поиска в нуклеотидных базах данных NCBI.

Sequences prodjcing significant alignments:

Select: M Маш Selected:!]

Alignments 0

Description Max score Total score Query cover * value ident Accession

в Bovine ml diarrhea virus 1 dene. 5' untranslated region, strain: Deer 531 531 100% 5e-147 100ft №040132.1

в Bovine viral diarrhea virus-1 aene for ootvorotern comnlete cds. strain:KS85-1nco 516 516 99% 1o Ю 99% AB07S950.1

в Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL793 5' UTR and nolvDroteih oene. dertiaf its 510 510 93% 7e-14i 99% 0119871311

■ Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL1719 S UTR and Dolvnrotem aene, Dartial cds 507 5П7 9«% 9e-140 99% EU987134.1

в Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL795 5' UTR 503 5(13 97% tern 99% GÖ9S7133.1

■ Bovine viral diarrhea virus 1 strain 15' UTR 499 499 97% 1e-137 99% DQ07521D.1

1 Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL17315' ITTR and oolvdrotein aene oartal cds 4% 496 99% 2e-136 98% GJ987137.1

О Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL1723 5' UTR and oolvdrotein aene, Dartal cds 496 496 97% 2e-136 99% OU987136.t

п Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL173J5" UTfl and Dolvprotein aene partial cds 494 494 96% 7e-136 99% BU98713S.1

р Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL625 5' UTR and DOIVDrotein oene. oartial cds 492 49? 98% ?e-13S 98% GUM71J1.1

О Bovine viral diarrhea virus 1 strain A414 5' UTR and ootvDrotetn dene, partial cds 486 486 98% 1e-133 98% GJ987127.1

в Bovine viral diarrhea virus 1 strain LL1722 5' UTR and oolvdrutein aene, Dartial cds 481 481 98% 5e-132 97% OU987135.1

в Bovine viral diarrhea virus 1 strain A469 5' UTR 468 468 96% 4e-128 97% OU987129.1

в Bovine viral diarrhea virus 1 dene, 5' unfransleted tedion. oaitial sequence. strain: 190-cd 465 465 85% 3e-12d 100% АБ019679.1

Ü nestivinjstvoe 1 sliain S-ALT5IK 5' untranslated renion 463 463 85% to 1Л 100% U974741

□ Pestivirus tvDe 15' non-codinn ranion, nenomic RNA. strain 2IWS5 461 461 86% 4e-123 99% AJ2S35941

в Bovine viral diarrhea virus t oenomic RNA. 5' UTR oartial sentience isolate: Mongolia 7 448 448 99% 5e-122 96% LC 099931.1

■ Bovine viral diarrhea virus 1 Genomic RNA, 5' UTR oartal sedtrence, isr^ate: Mdndolia 3 448 448 99% 6e-122 96% LC099927.1

СП ___i»jas^- c,,.,___ ... mif НЛ..Л.

Рис.26 Форма отчета BLAST поиска

GenBank ▼

Bovine viral diarrhea virus 1 gene, 5' untranslated region, strain: Deer

GenBank: AB040132.1 FASTA Graphics

Go to: R LOCUS

DEFINITION

ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

REFERENCE AUTHORS TITLE

JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL

FEATURES source

AB040132 287 bp RNA linear VRL 17-JAN-2007

Bovine viral diarrhea virus 1 gene, 5' untranslated region., strain:

Deer.

AB040132

AB040132.1

Bovine viral diarrhea virus 1 Bovine viral diarrhea virus 1

Viruses; ssRNA viruses; ssRNA positive-strand viruses, no DMA stage; Flaviviridae; Pestivirus. 1

Harasawa,R.

Taxonomic status of giraffe and deer isolates of pestivirus,

estimated by palindromic nucleotide substitutions at the 5'

untranslated region

Published Only in Database (2006)

2 (bases 1 to 2B7)

Harasawa,R,

Direct Submission

Submitted (15-MAR-200O) Ryo Harasawa, The University of Tokyo, Faculty of Medicine; Hongo 7-3-1, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0933, Japan (E-mail:ryoigir.u-tokyo.ac.jp, Tel:[phone], Fax:[phone])

Location/Qualifiers 1..287

/organism="Bovine viral diarrhea virus 1" /mol_type="genomic RNA" /strain="Deer" /dbxref="taxon:11099" /note="synonym: pestivirus type 1" 1..287

Change region shown

Customize view

Analyze this sequence

Run BLAST Pick Primers

Highlight Sequence Features Find in this Sequence

Related information

Full text in PMC

Taxonomy

LinkOutto external resources

Virus Pathogen Resource

[Virus Pathogen Resource]

Recent activity

Turn Off Clear

5 Bovine viral diarrhea virus 1 gener 5'

untranslated region, strain: Deer Njcieotide

Рис.27 Пример страницы с информацией о полученной нуклеотидной последовательности, размещенной в базе NCBI

Предметом наших исследований было генетическое сравнение вирусов вирусной диареи, изолированных от крупного рогатого скота, по различным регионам генома. Первоначальный филогенетический анализ проводили по 5иТЯ области, так как результаты молекулярной эволюции, полученные для консервативных областей генома, обладают большей достоверностью. Регион 5'иТЯ общий для всех pestiviruses и предназначен для их обнаружения. Однако эти фрагменты могут быть слишком маленькими и их часто недостаточно и для детального филогенетического анализа. Для исследования генетических связей внутри рода возможно дополнительно использовать ген ^го и Е2. При анализе использовали полученные нами нуклеотидные последовательности вируса ВД КРС, представленные в базе данных GenBank.

Вакцинный штамм идентифицирован как КЛБЬ, уровень гомологии составил 100%, на всей протяженности генома, как и заявлено производителем, что подтверждает правильность выбранных

последовательностей праймеров (рис.28)

Рис.28 Страница с информацией о полученной нуклеотидной последовательности, размещенной в базе NCBI

Однако расшифровать аЫ файл после секвенирования вакцины, содержащей два аттенуированных штамма вируса вирусной диареи (КЛБЬ и 53637) не удалось. Осуществить ручную обработку не представилось возможным из-за наложения пиков друг на друга, соответственно, с помощью предлагаемой методики, возможно только обнаружение штаммов в реакции ОТ-ПЦР, но идентифицировать их с помощью секвенирования по Сенгеру, не представляется возможным. (Рис.29-30).

Рис. 29 Фрагмент обычной хроматограммы

Рис. 30 Фрагмент хроматограммы при идентификации штаммов в вакцине, содержащей два штамма вируса ВД Так же необходимо отметить, что при исследовании инактивированных вакцин, результат ОТ-ПЦР всегда был отрицательным.

В связи с вышеизложенным, для контроля качества вакцин, содержащих инактивированные штаммы вируса ВД или несколько штаммов в одной вакцине, необходимо использовать другие методы контроля.

В результате секвенирования образцов из хозяйства показано, что нуклеотидные последовательности вируса ВД КРС из образца отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики болезни

на территории нашей страны. Нами идентифицирован нецитопатогенный штамм Deer и цитопатогенный штамм strain KS86-1 ср, которые относятся к первому генотипу, подтипу а.

GenBank »

Send to:

Bovine viral diarrhea virus-1 gene for polyprotein, complete cds, strain:KS86-1cp

GenBank: AB078952.1 FASTA Graphics

Goto:©

LOCUS

DEFINITION

ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

REFERENCE AUTHORS TITLE

JOURNAL PUBMED REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL

FEATURES

source

AB078952 13203 bp RNA linear VRL 25-FEB-2003

Bovine viral diarrhea virus-1 gene for polyprotein, complete cds,

strain:KS86-lcp.

AB078952

AB078952.1

Bovine viral diarrhea virus 1 Bovine viral diarrhea virus 1

Viruses; ssRMA viruses; ssRNA positive-strand viruses, no DMA stage; Flaviviridae; Pestivirus. 1

NagaijM., 5akoda,Y., Mori,M., Hayashi,M., Kida,H. and Akashi,H. Insertion of cellular sequence and RNA recombination in the structural protein coding region of cytopathogenic bovine viral diarrhoea virus

J. Gen. Virol. 84 (PT 2), 447-452 (2003) 12569578

2 (bases 1 to 13203)

NagaijM., Akashi,H. and Sakoda,Y.

Direct Submission

Submitted (28-JAN-2002) Makoto Nagai, Ishikawa Nanbu Livestock Hygiene Service Centers Saida 324-2, Kanazawa, Ishikawa 920-3131, Japan (E-mail:[e-mail], Tel:[phone], Fax:[phone])

Location/Qualifiers 1..13233

/organism="Bovine viral diarrhea virus 1" /mol_type="genomic RNA" /strain="KS86-lcp" /db_xref="taxon;11399" <1. .386

* ★ *

GenBank

2017 Service to America Award Finalist

Change region shown

Customize view

Analyze this sequence Run BLAST Pick Primers

Highlight Sequence Features Find in this Sequence

Related information

Full text in PMC

H t I g I „ j "ü H I 3 I

3/аШ" 8

Рис.31 Пример страницы с информацией о полученной нуклеотидной последовательности, размещенной в базе NCBI

По данным международной базы NCBI, штамм Deer нецитопатогенный, впервые выделен из тканей плода КРС и сыворотки в 2001 году в Аргентине (Jones LR, Zandomeni R, Weber EL). В исследованиях отмечали сероконверсию и отсутствие клинических признаков болезни. Штамм был выделен у ряда диких оленевых, которые могут быть резервуаром болезни, включая, европейская косулю (Capreolus CAPREOLUS), красного оленя (Cervus ELAPHUS), белохвостого оленя (Odocoileus virginianus), они могут перекрестно заражать крупный рогатый скот, овец, коз и свиней. Именно поэтому данный штамм вируса невозможно выявить с помощью классических методов диагностики (выделение на культуре клеток).

Штамм KS86-1 впервые выделен в Японии (Makoto Naga, Yoshihiro Sakoda, Masashi Mori) в 2003 году. Исследователями определены различия в генетической структуре цитопатогенного штамма (^86-1ср) и нецитопатогенного (KS86-1 ncp) (Рис.30)

Рис.32 Генетическая структура штаммов ^86-1ср и ^86-1пср

Кроме описанных образцов, нами исследован вирус, выделенный на культуре клеток КСТ. Поставлена задача определить является ли обнаруженный методом ПЦР, вирус вакцинным штаммом или полевым изолятом. Так как, при сравнении в базе данных NCBI уровень гомологии с полноразмерными геномами вируса 1 типа находился в диапазоне 93-99% на значительном протяжении последовательности более 79%, нами решено осуществить построение дендрограммы.

Для построения филогенетического дерева использовали метод присоединения ближайших соседей и эволюционную двухпараметрическую модель Кимуры с аппроксимацией гамма-распределения частот эволюции среди сайтов последовательности. (Рис.33-34)

-АВ042713*Й»К88$-1

-АУ690485-Яга1П-1тзп

и97474-$1гат-5-А1Т5-К АВ078950-51гэт-К$86-1 АВ019679-$Кай-190ср

_I-М

-1197449-М557А-90

г -и97410-Яг8ш-М079В-91

и97409-5Иа1П-М0658-93

-00075210-ЯГ81П-1

^59930«о1«МН.972

-Я59931ниИ«-СН1939

_ОШ133*й»и795

-Я59932-СИ928

(Зи987132-ШаЫ1793 (30987136-111723

-^759927н$о1а(е-СН1Р23

-^759923н$о1*»-СН1Р22

-GU987137.slraftU.1731

иР759ЭЗЗ-(5о1аи-СН1Р31 ОМШ«а»и.173Э

-Си987129-Яга1П-А169

-би987131-и.625

-(50987134411719

АР244954-1$о1а1е-17Р ~~ АР4179984иМ«<Ы I АР3565<М-&иа«1-СН511 -ОЛ87135-йиЫ11722

I-1

0005

Рис 33 Филогенетические отношения вирусов ВД КРС, выделенных на территории Северо-Западного региона по 5 UTR области

■ КПЗэч вн нШйфТЬоиУЖЛ и

-КВДТН^ги-Ш

_.ЧШИЭИ-тШИБ-Я

--КТЙМЙ^ЙЫтййи

__АБ№Н24ги-К£9И

-лй41 ■ 1

---

- I-КШ1 5^77-тЭ

I--шизн.мьивш^из

-КГйДОЫА»40-1

■- -Еи2Ы2№5а№ВЗ№№

--Ки!55М4-41ги-и311-314

_. КШФбШаЬЗД

АЙ11196Э.1||Я1-?Иер — АУ5Ш7-!(гр1-1?Р рШКОм'-йЭ! гА91гВДЗ№|>

-Р+А

ош ш ом ои т ам

Рис 34 Филогенетические отношения вирусов ВД КРС, территории Северо-Западного региона и представленных GenBank по №го области

выделенных на в базе данных

Анализ последовательности нуклеотидов фрагмента 5 UTR и Npro области показал, что изучаемый изолят отличается от вакцинного. От ближайшего соседа АВ019679strain 90 на три нуклеотида, от Ш7449М557А-90 на четыре нуклеотида. При секвенировании по гену E2 получен отрицательный результат, что может говорить о мутации вируса.

Данные изоляты относятся к циркулирующим в хозяйствах вакцинноподобным штаммам 1 генотипа подтипа а.

.3.3.12 Интерпретация результатов испытаний использованием ресурса NCBI/BLAST

Для поиска гомологичных последовательностей в базах данных NCBI использовали алгоритм BLAST на поисковом интернет-ресурсе www.ncbi.nlm.nih.gov .Отчет о поиске представляется в виде списка последовательностей, с которыми полученная в результате испытания нуклеотидная последовательность имеет наибольшую гомологию.

Если полученная нуклеотидная последовательность имеет генетическую неоднородность в отдельных положениях,принимают, что штамм генетически неоднороден.

Если полученная нуклеотидная последовательность имеет генетическую неоднородность, но возможность установления родства с определенным штаммом или изолятом вируса сохраняется, принимали, что штамм испытуемого образца имеет генетическую неоднородность с указанием наиболее гомологичных последовательностей.

Результаты испытания представляли в виде филогенетического анализа, наглядно представляющего уровень нуклеотидных различий полученной нуклеотидной последовательности и последовательностей из баз данных.

При исследовании вакцин, если полученная нуклеотидная последовательность имеет 100%-ную гомологию с аналогичным участком генома штамма вируса, заявленного в сопроводительной документации вакцины, принимают, что не выявлено генетических отличий штамма

испытуемой вакцины от заявленного. В случае если последовательность фрагмента генома штамма вируса испытуемой вакцины отсутствует в базах данных, обращаются к производителю вакцины для получения дополнительной информации о генетической структуре штамма. Если полученная нуклеотидная последовательность имеет незначительные отличия от последовательности заявленного штамма (более 99% гомологии), принимают, что штамм испытуемой вакцины имеет высокую степень гомологии с заявленным, с указанием выявленных отличий. В случае значительных отличий полученной нуклеотидной последовательности от заявленного штамма (менее 99% гомологии) принимают, что штамм испытуемого образца не соответствует заявленному штамму с указанием выявленных нуклеотидных отличий.

3.3.13 Схема оздоровления хозяйства от вирусной диареи крупного

рогатого скота

Для анализа состояния стада было прoведено эпизоoтологическое обследoвание хозяйства с применением, клинических, патологоанатомических, бактериолoгических, вирусолoгических,

молекулярно-генетических и имму^логических методов. Особое внимание уделено изучению общего санитарного состояния хозяйства, рассмотрен рацион кормления, экошмические и произвoдственные показатели хoзяйств, подготовка корoв к oтелам, выращивание телят.

Установлено, что выход телят в среднем вставляет 75-80%. Отмечен высокий уровень забoлеваемости молoдняка респираторными и желудочш-кишечными бoлезнями. Причиной этому служат нарушения услoвий содержания, несбалансированность рациона, недоброкачественность кормoв. При анализе санитаршго состояния установлено что наиболее часто встречаются такие нарушения как несоответствие температурного режима, высокая серость движения воздуха, нарушение сроков выпойки молозива, не соблюдение санитарных разрывов при за^лнении помещения телятами,

боксы для родов сдержаться с нарушением зоoгигиенических норм. нарушение услoвий содержания и кормления стельных коров, отсутствие адекватшй витаминизации поголовья, недоброкачественность кормoв, несбалансированность рациона,

Очень часто при лечении телят применяются антаб^т^и, которые кроме полoжительных эффектов oказывают и негативное действие. В первую очередь нарушается микробиоценоз, приводящий к длительному бактериозу и возникновению устойчивых штаммoв возбудителей бoлезней, снижается иммунитет.

При воздействии на животных абиогенных факторов нами проводился отбор проб крови для исследования на наличие антител к вирусным болезням КРС дважды с интервалом 14 дней (инфекционный ринотрахеит, парагрипп -3, вирусная диарея). С помощью методов серологической диагностики (исследование парных сывороток крови - РНГА) был обнаружен титр антител к ИРТ и ВД КРС, для выявления геномов данных вирусов проводили исследование методом ПЦР. Были получены положительные результаты относительно обнаружения геномов вирусов ИРТ и ПГ-3. Параллельно проводили исследование патологического материала на бактериальные инфекции (колибактериоз, протейная инфекция, сальмонеллёз). Положительный результат получен при диагностике пастереллёза.

У новорожденных телят с признаками диспепсии проводили забор крови для клинического исследования и анализ состава микрофлоры. (Рис.34)

5 4 3 2

ot

Форменные элементы крови

□ Абсолютное число лейкоцитов, ^109/л

■ Абсолютное число лимфоцитов, ^109/л

□ Абсолютное содержание нейтрофилов, ^109/л

Рис. 34 Лейкограмма больных телят

При расшифровке лейкограммы нами выявлен лейкоцитоз (увеличение количества лейкоцитов в два раза, по сравнению с нормой), резковыраженная лимфопения и снижение уровня нейтрофилов в 1,5 раза. Данные результаты говорят не только о нарушениях в системе иммунитета, но и об ослаблении иммунного ответа, возникающего обычно при инфекционном процессе.

При исследовании микрофлоры фекалий новорожденных телят нами обнаружена энтеропатогенная E. Coli, снижение уровня Bifidobacteria и Lactobacilli более чем в два раза.

Лечение и профилактика вирусной диареи у новорожденных телят имеет свои характерные особенности. В этот период колостральный иммунитет находится на стадии снижения (как клеточный, так и гуморальный), а собственный еще не развился. У таких животных клинические признаки болезни могут не проявляться, а выделение возбудителей происходит.

1

Для всех групп животных было улучшено содержание и кормление -введены в рацион легкоусвояемые корма, добавлены витамины, минеральные вещества.

Для лечения телят применяли следующую схему:

- в возрасте до 1 месяца выпаивали препарат «Лактофторхин», составными компонентами которого являются: ацидофильная симбиотическая культура микроорганизмов (ТУ 9197 - 001 - 0047941 - 97), энрофлоксацин и масло твин - 80. Кратность дачи препарата 1 раз в день. Курс - 5 дней;

- в случае заболевания в возрасте 1 - 3-х месяцев применяли норсульфазол (20,0г), уротропин (60,0г), стрептомицин внутримышечно 1 раз в день три дня подряд. Дополнительно в рацион включили «ацидофильное молоко» (молоко+муравьиная кислота, сутки настаивали при комнатной температуре, выпаивали в охлажденном виде по 0,5 л).

Дезинфекцию помещений и мероприятия по контролю её качества проводили в соответствии с «Правилами дезинфекции и дезинвазии объектов государственного надзора», утвержденные Министерством сельского хозяйства Российской Федерации 15.07.2002 №13-5-2/0525.

Влажную дезинфекцию осуществляли с помощью препарата «Экоцид -С» , через 3 часа - дезинфекция в течение трех дней подряд «Пихтоиновыми» дымовыми шашками.

После проведения лечебных и дезинфекционных мероприятий, использовали вакцину «Bovi-shieldGold», содержащую аттенуированные штаммы вируса: инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR-Bovine herpesvirus type1), вирусной диареи (BVD types 1 и 2), парагриппа-3 (PI3), респираторно-синтициальной инфекции (BRSV) и инактивированные штаммы лептоспир: L.canicola, L.grippotyphosa, L.hardjo, L.icterohaemorrhagiae, L.pomona., дважды с интервалом 3 недели, затем через 6 месяцев.

Применение данной схемы при выращивании телят способствовало улучшению производственных показателей (сохранность, прирост массы), уменьшению количества условно - патогенных и патогенных микроорганизмов, снижению падежа телят от инфекционных болезней молодняка.

Уровень иммуноглобулинов в молозиве у коров контролировали сразу после отела, а у телят (кровь) на 2-4 день жизни с помощью цинк-сульфатного теста.

(Таблица 14, Рисунок 35)

Таблица 14

Результат исследования сыворотки крови от телят и молозива от новотельных коров на содержание иммуноглобулинов

за 2015 год

Соответ Слабовыраже Значительная Резковыражен

Наименован Всего проб ствует нная иммуноглобу ная

ие норме иммуноглобу линемия иммуноглобу

хозяйства (более 2г%) линемия (1,5-2г%) линемия

(1,5-2г%) (1,5-2г%)

проб % проб % проб % проб %

Хозяйство №1 кровь 20 7 35 9 45 3 15 1 5

молозиво 25 12 48 6 24 3 12 4 16

Хозяйство №2 кровь 25 10 40 7 28 6 24 2 8

молозиво 20 10 50 3 15 4 20 3 15

ИТОГО: кровь 45 17 38 16 36 9 20 3 6

молозиво 45 22 49 9 20 7 15,5 7 15,5

ВСЕГО: 90 39 43 25 28 16 18 10 11

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

□Норма

■ Слабовыраженная иммуноглобулинемия

□ Значительная имуноглобулинемия

□ Резковыр

аженная иммуноглобулинемия

Рис.35 Уровень иммуноглобулинемии у телят до и после лечения

Таким образом, уровень значительной и резковыраженной иммуноглобулинемии у животных снизился в 1,8 раза по сравнению с началом проводимых мероприятий. Почти в два раза увеличилось количество животных с нормальным уровнем иммуноглобулинов.

При анализе полученных данных, стало очевидным преимущество предлагаемой схемы лечения. Сохранность новорожденных телят достигла уровня 92%, по сравнению с животными без лечения 62,5% и с лечением по общей схеме хозяйства 75%.

Таблица 15

Влияние предлагаемой нами схемы на производственные показатели

№п\ п Изучаемые показатели Группа №1 Группа №2 Группа №3

1 Возраст животных Новорожденные (25-50 кг) Новорожденные (25-50 кг) Новорожден ные

(25-50 кг)

2 Количество животных группе, голов 8 8 8

3 Получаемое лечение предложенная нами схема по схеме, используемой в хозяйстве -

4 Пало животных, голов 1 2 3

5 Пало, % 8 25 37,5

6 Сохранность, % 92 75 62,5

7 Масса животного, кг 25 - 60 25-50 25-50

8 Среднесуточный привес, кг 0,790±0,60 0,680 ±0,86 0,560±0,73

Анализ данных показал, что комплексный подход к решению проблемы оздоровления хозяйства при вирусной диарее крупного рогатого скота повысил эффективность иммунизации против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3. Кроме того, благодаря использованию предлагаемой схемы был снижен уровень забoлеваемости молoдняка респираторными и желудочш-кишечными бoлезнями. Таким образом, разработанный комплекс мероприятий по оздоровлению крупного рогатого скота от вирусной диареи может быть рекомендован к практическому применению.

Особенности профилактических мероприятий при вирусной диарее в хозяйствах молочного направления Ленинградской области

Проблема BVD остается неразрешенной по настоящее время во многих странах мира, в том числе в РФ. Исключением не является и Ленинградская область, молочное скотоводство которой характеризуется наивысшим в РФ уровнем продуктивности: среднегодовой удой за 2016г от 7- до 8-и тыс. кг молока на одну фуражную корову, в отдельных племзаводах и племрепродукторах среднегодовой удой превышает 9...10 тыс. кг молока на одну фуражную корову. По причине BVD значительное количество высокоценных животных выбывает из стада и не может быть реализовано на

племенные цели (племенные телочки, ремонтные бычки). Ввиду того, что на протяжении десятилетий Ленинградская область является основным племрассадником молочного крупного рогатого скота (КРС), проблема БУБ для региона становится все более актуальной.

Официальная статистка по вирусной диарее КРС до настоящего времени в Ленинградской области не велась. Ограничений по данному заболеванию на хозяйства не накладывалось. Вместе с тем на протяжении более 10-15 лет в большинстве хозяйств области имели место серологические подтверждения присутствия вируса БУБ в стадах молочного направления (высокие титры специфических антител) при комплексных серологических исследованиях в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ленинградская межобластная ветеринарная лаборатория" на ИРТ, парагрипп-3, ВД-БС, РСИ, а также клинические проявления данного заболевания, в большинстве случаев у молодняка КРС, в ряде хозяйств).

Результатом серологических подтверждений (высокие титры антител), отдельных случаев клинических проявлений в хозяйствах БУБ стало широкое применение иммунопрофилактики с использованием различных вакцин, как живых, так и инактивированных, в том числе комплексных (Комбовак, Бовишилд-Голд, Гипробовис-4 и других). При этом зачастую как выбор вакцины, так и смена применяемых вакцин в хозяйствах не всегда были обоснованными.

Не всегда учитывался и тот фактор, что хотя специфическая иммунопрофилактика и снижает риск возникновения заболевания, но полной защиты она не обеспечивает. Кроме того, взрослый крупный рогатый скот при инфицировании трансплацентарно может передавать возбудителя БУБ плоду, не имеющему иммунной защиты.

Программа оздоровительных мероприятий предлагаемых для хозяйств Ленинградской области (проект)

I этап

Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по вирусной диарее крупного рогатого скота (BVD) и эпизоотологический мониторинг по районам и хозяйствам Ленинградской области с учётом результатов лабораторной диагностики.