Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.04, кандидат наук Драгунова, Екатерина Евгеньевна

  • Драгунова, Екатерина Евгеньевна
  • кандидат науккандидат наук
  • 2013, Кемерово
  • Специальность ВАК РФ05.18.04
  • Количество страниц 170
Драгунова, Екатерина Евгеньевна. Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота: дис. кандидат наук: 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств. Кемерово. 2013. 170 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Драгунова, Екатерина Евгеньевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1. Строение прионных белков, их функции в организме

1.2. Прионные болезни. Классификация, механизмы возникновения и развития прионных энцефалопатий у человека и животных

1.3. Методы выявления возбудителей и диагностика прионных болезней. Контроль качества сырья животного происхождения

1.4. Заключение по обзору литературы и задачи исследований

ГЛАВА 2. ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Организация выполнения работы

2.2. Объекты исследований

2.3 Методы исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

56

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение образцов животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции пато-

генных форм прионного белка

3.2 Исследование и анализ нуклеотидных последовательностей гена ^ РИКР прионного белка

3.3. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации специфических последовательностей прионного 76 белка

3.4. Выбор параметров и оптимизация процессов амплификации фраг-

80

ментов гена Р1ШР патогенного прионного белка

3.5. Разработка положительного контрольного и внутреннего контроль- ^ ного образцов для оценки эффективности протекания ПЦР

3.6. Исследование специфичности разработанной тест-системы и олиго-

нуклеотидных праймеров

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Методика изготовления ПЦР-тест-системы и ее описание

4.2. Оценка условий хранения и установление достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы

4.3. Расчет затрат на проведение исследования с помощью ПЦР-тест-системы

4.4. Проведение технико-экономической оценки рыночного потенциала

полученных результатов

ВЫВОДЫ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ А Государственный контракт № 16.512.11.2077 на

выполнение научно-исследовательских работ

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Технические условия на ПЦР - тест систему для

идентификации патогенного прионного белка

ПРИЛОЖЕНИЕ В Методические указания по использованию

ПЦР - тест системы

ПРИЛОЖЕНИЕ Г Акт результатов испытаний № 1 чувствительности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка

крупного рогатого скота

ПРИЛОЖЕНИЕ Д Акт результатов испытаний №2 достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота

110 110

118

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств», 05.18.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота»

ВВЕДЕНИЕ

Прионы (от англ. «proteinaceous infectious particles» - белковая инфекционная частица) - особый класс чисто белковых инфекционных агентов, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных.

Прионный белок может существовать в двух формах - неинфекционного белка, который является жизненно необходимым белком, обнаруживаемым в организме всех млекопитающих, включая и человека, и инфекционного белка, который является мутацией нормального прионного белка и вызывает прионные болезни животных и человека.

Прионные болезни - это группа трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний животных и людей. Эти болезни имеют длительные инкубационные периоды, но быстро прогрессируют с момента клинического начала заболевания. Все прионные болезни смертельны и в настоящее время не существует эффективных способов их лечения.

Изучение прионов и вызываемых ими заболеваний является новой, быстро развивающейся областью биомедицинских исследований, которая в последние годы приобрела важное научно-практическое значение.

Практический интерес связан, прежде всего, с разразившейся эпизоотией губчатой энцефалопатии коров в Великобритании, а также с выявлением, в основном в Великобритании, молодых людей с болезнью Крейтцфельд-та-Якоба и доказательством возможности передачи этого заболевания людям в результате употребления в пищу мясопродуктов, полученных от зараженных животных.

Также одним из путей заражения человека губчатой энцефалопатией являются нейрохирургические вмешательства, трансплантация тканей, назначение гормонов, полученных от зараженных доноров с нераспознанной болезнью Крейтцфельдта-Якоба (ятрогенные случаи болезни Крейтцфельдта-Якоба), использование для полива овощей и фруктов сточных вод, в которые

попали прионные белки вместе с отходами мясоперерабатывающих предприятий.

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота была зарегистрирована не только в Великобритании, но и в ряде других европейских стран: Швейцарии, Ирландии, Португалии, Франции, Германии, Нидерландах, Италии, Дании и на Фолклендских островах. Данные случаи возникновения заболевания связаны либо с импортом этими странами зараженных животных, либо с импортом зараженной мясо-костной муки, полученной из продуктов убоя и голов овец и использовавшейся для выкармливания молодняка.

Случаи возникновения прионных заболеваний обуславливают необходимость учета растущей вероятности возникновения прионных болезней у человека и животных.

По статистическим данным, в России с населением примерно 150 миллионов человек при уровне заболеваемости болезнью Крейтцфельдта-Якоба 1 случай на 1 млн ежегодно должно поражаться около 150 человек. Однако учет таких пациентов ведется несистематично: случаи заболевания не выявляются и не регистрируются.

Профилактика прионных болезней основывается на недопущении в пищу инфицированных мясных продуктов или других продуктов убоя. В связи с этим в Постановлении Главного государственного санитарного врача РФ от 15.12.2000г. №15 «О мерах по предупреждению распространения болезни Крейтцфельдта-Якоба на территории Российской Федерации» впервые определены профилактические меры, направленные на недопущение завоза спон-гиоформной энцефалопатии из зарубежных стран.

Постоянно увеличивающийся теоретический интерес к проблеме обусловлен результатами молекулярно-биологических исследований структуры прионных белков, позволивших собрать и систематизировать значительный материал о структуре, функции и накоплении в зараженном организме человека и животных данных инфекционных агентов.

Именно результаты молекулярно-биологических исследований структуры прионных белков дали основание определить новые направления в дальнейших подходах к диагностике и терапии прионных болезней.

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка прототипов молекулярно-генетических тест-систем для выявления патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- определить среди исследуемых объектов образцы животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка;

-провести анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка крупного рогатого скота; -сконструировать олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота;

- выбрать параметры и провести оптимизацию процессов амплификации фрагментов гена патогенного прионного белка;

- разработать положительный контрольный образец и внутренний контрольный образец для оценки эффективности проведения ПЦР-анализа;

- изучить специфичность разработанной ПЦР-системы и олигонуклеотидных праймеров;

- оценить условия хранения ПЦР-тест-системы и провести испытания, направленные на установление сроков пригодности ПЦР-тест-системы.

Научная новизна работы. Показано, что разработанная ПЦР-тест-система для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота имеет ряд конкурентных преимуществ по сравнению с имеющимися на мировом рынке аналогами для определения патогенной формы прионного белка - обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить диагностику прионных заболеваний на ранних стадиях

возникновения, способствует снижению инфекционной опасности для оператора при использовании тест-системы для исследуемой пробы, находящейся в закрытой пробирке.

Практическая значимость работы заключается в разработке ПЦР-тест-системы, позволяющей осуществлять прижизненную идентификацию патогенного прионного белка у животных в ветеринарии, контроль качества сырья животного происхождения при производстве препаратов медицинского назначения, оценку содержания патогенной формы прионного белка животного происхождения в продуктах питания, производимых пищевой промышленностью.

По результатам исследований разработан проект технических условий и методические указания по использованию ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

2. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

3. Оптимальные параметры проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

4. Положительный контрольный образец, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов.

5. Внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и исключает ошибки исследователя при постановке реакции.

6. Компонентный состав разработанной ПЦР-тест-системы.

7. Оптимальные условия хранения и достоверные сроки пригодности разработанной ПЦР-тест-системы.

Методология и методы исследования. При выполнении работы использовали стандартные, общепринятые и оригинальные методы исследований, в том числе описательные, аналитические, индуктивные и дедуктивные методы обобщения отечественной и зарубежной литературы по оценке существующих технологий производства тест-систем для идентификации прион-ных заболеваний человека и животных.

Апробация работы. Материалы по разработке тест-систем для идентификации патогенного прионного белка в пробах животного происхождения крупного рогатого скота представлены и получили одобрение на Международном научном форуме «Пищевые инновации и биотехнологии» (г. Кемерово, 2013г.).

Материалы диссертации используются в учебном процессе, осуществляемого кафедрой «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» по направлению подготовки «Биотехнология».

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы». Государственный контракт от «16» февраля 2011 г. № 16.512.11.2077.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

В настоящем обзоре проведен анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по вопросам, посвященным изучению свойств прионных белков, их структуры, функций прион-ных белков в здоровом организме, механизмах возникновения патогенного прионного белка, методах идентификации прионного белка в мясе крупного рогатого скота. На основании данного анализа литературных источников выбраны объекты и методы, сформулированы цель и задачи собственных исследований.

1.1. Строение прионных белков, их функции в организме

Прионный белок (от англ. «proteinaceous infectious particles» - белковая инфекционная частица) представляет собой сиалогликопротеид с молекулярной массой 33000-35000 дальтон, состоит из 254 аминокислот. Он найден у всех млекопитающих и является составной частью наружных клеточных мембран. Схема образования прионов в нервных клетках представлена на рисунке 1.1 [18,39,40].

Рисунок 1.1- Образование прионов в нервных клетках

Открытие прионов тесно связано с историей открытия и становления учения о медленных инфекциях. В 1954 г. В. Sigurdsson [2, 5, 6] изложил результаты своих многолетних исследований по изучению массовых заболева-

ний среди овец (на примере скрепи (scrapie) - заболевания, которое в природе встречается среди овец и коз). Несмотря на явные клинические различия и неодинаковую локализацию повреждений органов и тканей, В. Sigurdsson сумел обнаружить среди изученных им заболеваний принципиальное сходство и сформулировать четыре главных признака, отличающих медленные инфекции:

- длительный инкубационный период (месяцы и годы);

- медленно прогрессирующий характер течения;

- необычность поражения органов и тканей;

- неизбежность смертельного исхода.

Согласно литературным данным более поздних научных исследований было доказано, что медленные инфекции могут поражать не только животных, но и людей [11, 13].

В начале 80-х годов американский биохимик S. Prusiner показал, что возбудителем наиболее распространенной в природе медленной инфекции -скрепи, является безнуклеиновый низкомолекулярный (27-30 кДа) белок [16]. S. Prusiner назвал его «инфекционный прионный белок», а в качестве инфекционной единицы предложил наименование «прион» [18, 133].

Прионный белок (РгР) может существовать в двух формах - неинфекционной и инфекционной [32, 54].

л

РгР (аббревиатура от англ. - Prion Protein of Cell) - неинфекционный прионный белок, который носит наименование «клеточный». Является жизненно необходимым белком, обнаруживаемым в организме всех млекопитающих, включая и человека. Одной из отличительных черт клеточного прионного белка является его высокая чувствительность к

л

переваривающему действию протеазы К, под действием которой РгР полностью разрушается [113, 129].

PrPSc (PrPd) - инфекционный прионный белок, который вызывает скрепи у овец и коз и другие прионные болезни животных и человека. Считается, что PrPSc является мутацией РгРс [11, 113, 129].

il

J

Большинство экспериментальных данных свидетельствует о том, что формирование патогенного белка PrPSc происходит из-за конформационного перехода нормального клеточного белка в изоформу с уменьшением а-спиралей молекулы с 42 до 21% [2, 6, 7, 71]. Содержание Р-складчатых структур в этой аномальной форме патогенного приона увеличивается с 3 до 54% [12]. В бесклеточной системе продемонстрировано появление устойчивости к протеолизу изоформы прионного белка [11, 120], однако in vitro никому еще не удалось получить инфекционную форму PrPSc из нормального клеточного или рекомбинантного белка. Предполагается, что конформацион-ный переход нормального белка в патогенную форму обеспечивают неизвестные до сих пор кофакторы, или помощники, аналогичные молекулярным шаперонам [9, 90]. Полагают, что вновь образованная патогенная форма молекулы посредством неизвестного механизма, используя молекулы-посредники клетки хозяина, преобразует все большее количество нативных клеточных молекул РгР в аномальную форму, что аналогично цепной реакции расщепления атомного ядра. Накопление практически нерастворимой формы белка в клетках нейронов вызывает их вакуолизацию с последующей однозначной гибелью клеток [130, 132].

Ген (PRNP), кодирующий синтез нормального прионного белка (РгР ) и инфекционную изоформу данного белка (PrPSc), расположен в коротком плече хромосомы 20 у человека и хромосомы 2 у мыши. PRNP-ген регулируется в процессе развития и поддерживает устойчивую экспрессию во время всей жизни организма [32, 33].

Нормальный прионный белок РгР играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма: участвует в передаче нервных импульсов, посредством которых передаются приказы из центральной нервной системы органам-исполнителям, а от них идет информация в центр управления - головной мозг. Кроме того, клеточный прионный белок играет определяющую роль в поддержании так называемых «циркадианных» ритмов (от лат. cirka -

около и dies - день), регулируя суточные циклы активности и покоя в клетках, органах и в организме в целом [34, 35].

Важной функцией прионных белков является их способность передавать информацию о своей пространственной форме от одного белка к другому без участия ДНК [17, 112]. Ученые назвали это явление «белковой наследственностью».

Таким образом, нормальные прионы не только не опасны, но жизненно важны: без них организм просто не может существовать и погибает. Именно это и происходит, когда нормальный прионный белок трансформируется в инфекционный.

В настоящее время известно, что молекула нормального (клеточного) прионного белка состоит из четырех альфа-спиральных доменов, стабилизированных междоменными электростатическими взаимодействиями и S-S1-связью, в то время как в молекуле его инфекционной изоформы PrPSc два домена (НЗ и Н4) сохраняют свою первоначальную спирализованную форму, а два других (HI и Н2) превращаются в четыре бета-тяжа, связанные друг с другом и с доменами НЗ и Н4 [43, 52]. Подобное превращение оказывается возможным под действием самой молекулы инфекционного прионного белка, а также в результате порой даже незначительных мутационных изменений в PrP-гене или под воздействием каких-нибудь реакционно активных (например, фосфорорганических) соединений [54].

Данные структурные особенности патогенных прионов обуславливают их устойчивость по отношению к различным внешним воздействиям [32], анализ которых представлен в таблице 1.1.

Таблица 1.1 - Устойчивость прионных белков к различным воздействиям

Фактор Дозы Эффект

Химическое воздействие

NH2OH 0,1-0,5 мМ устойчив

Псорален 10-500 мг/мл устойчив

Продолжение таблицы 1.1

Фенол 100% инактивация

Додецилсульфат натрия (ЭБЭ) 1-10% инактивация

2 мМ устойчив

СН4Ы20 3-6 м инактивация

№НС03 Щ в течение 1 часа при 20°С инактивация

Гипохлорид натрия 2,5% в течение 1 часа при 20°С инактивация

Обработка ферментами

ДНКаза 100 мг/мл устойчив

Протеиназа К 100 мг/мл инактивация

Трипсин 100 мг/мл инактивация

Физическое воздействие

Автоклавирование 136 °С в течение 18 минут инактивация

Нагревание 160 °С в течение 24 часов инактивация

УФ Сильные дозы устойчив

Исходя из данных таблицы 1.1, очевидно, что прионы обладают высокой устойчивостью к традиционным способам дезинфекции и стерилизации -длительному нагреванию (до 24 часов при температуре 160 °С), ультрафиолетовому свету, гидролизу ферментов, химической обработке спиртами.

Также прионные белки устойчивы к кипячению, высушиванию и замораживанию больше, чем известные вирусы, причем инфекционная форма прионного белка является еще более стабильной [125, 133].

Механизм накопления инфекционного прионного белка в зараженном организме на сегодняшний день точно не известен. Однако имеющиеся све-

дения и представление о том, что это посттрансляционный процесс, дают основание считать, что инфицирующий прионный белок вызывает в здоровом до этого организме трансформацию нормального (клеточного) прионного белка в его инфекционную форму за счет его конформационных (пространственных) изменений. Модель конформационной структуры нормального и измененного прионного белка представлена на рисунке 1.2.

Рисунок 1.2 - Модель конформационной структуры нормального и измененного прионного белка

В данном случае речь идет об изменении третичной или даже четвертичной структуры исходного белка РгРс [151].

Накопление прионов сопровождается их агрегацией, образованием вы-сокоупорядоченных фибрилл (амилоидов), что в конечном итоге приводит к гибели клетки [51, 55]. Это проявляется повреждением мозговой ткани, в которой образуется множество небольших полостей, из-за которых мозг приобретает губкообразную структуру. В связи с этим заболевания, вызванные прионами, носят название губчатых энцефалопатий.

Таким образом, процесс накопления инфекционного прионного белка происходит не в результате синтеза в зараженном организме молекул PrPSc de novo, а вследствие конформационных изменений уже синтезированных нормальных молекул РгР под влиянием молекул инфекционного прионного белка PrPSc [139].

Схематически процесс накопления инфекционного прионного белка представлен на рисунке 1.3. Он предусматривает, прежде всего, необходимость контакта двух молекул. В результате под влиянием одной молекулы

РгР^ происходит трансформация контактирующей с ней одной молекулы РгР в ее инфекционную форму. Таким образом, всего в организме образуются две молекулы РгР8с. Следующий этап включает в себя уже влияние двух молекул РгР8с, под воздействием которых сразу образуются еще две, рост молекул РгР5с происходит в геометрической прогрессии. Таким образом, как видно из схемы, приведенной на рисунке 1.3, процесс накопления инфекционного прионного белка носит лавинообразный характер [42, 43].

РгР8о+ РгР°

РгР3с+ РгРС

РгР*Ч ргрр

РгР^Ч РгР° РгР8с+ РгР° РгР®°+ РгР° РгР*Ч РгРС

Зе Зс Зс Зс Зс Зс 9с Зс

РгР... РгР... РгР... РгР... РгР... РгР... РгР... РгР...

Рисунок 1.3 - Схема процесса накопления молекул инфекционного

прионного белка

Представленные характеристики инфекционного прионного белка свидетельствуют о том, что прионы представляют собой совершенно новый класс инфекционных агентов, принципиально отличный от мира простейших, бактерий, грибов, вирусов и вироидов [83]. Данные отличия выглядят еще более значительными при рассмотрении процессов размножения инфекционных прионов и особенностей вызываемых ими заболеваний.

1.2. Прионные болезни. Классификация, механизмы возникновения и развития прионных энцефалопатий у человека и животных

Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE), или прионные инфекции, - фатальная нейродегенеративная патология со спонгиоформными изменениями в головном мозге, встречающаяся у человека и многих видов животных [37, 88].

Название данной группы инфекций обусловлено результатами проведенных патоморфологических исследований, которые показали, что на основе первично-дегенеративных процессов и вакуолизации нейронов (без признаков воспаления) в инфицированном организме развивается характерная картина формирования так называемого губкообразного состояния (status spongiosus) серого и/или белого вещества головного, а иногда и спинного мозга, что может сопровождаться образованием амилоидных бляшек и выраженным глиозом.

Заболевания характеризуются длительным инкубационным периодом: от нескольких месяцев до десятков лет. После проявления клинических неврологических симптомов (деменции, развития парезов и др.) летальный исход, как правило, наступает через несколько месяцев [96, 119, 138].

Несмотря на то, что TSE морфологически и патофизиологически во многом подобны другим прогрессирующим энцефалопатиям, таким как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, их уникальность состоит в возможности передачи инфекции при профилактических прививках и употреблении в пищу контаминированного материала [15, 127].

Прионные заболевания мало распространены среди людей (приблизительно один случай на миллион в год), но у животных они нередки, а в связи с их инфекционностью опасность заражения человека очень велика. Именно этот факт обусловил ажиотаж вокруг эпидемии коровьего бешенства в Англии в 80-90х годах ХХв [9, 10].

Трансмиссивность прионных энцефалопатий определяется тремя факторами: дозой инфекта, путем инфицирования, видовым барьером [61, 62].

Чаще всего заражение человека прионами происходит при употреблении мяса больного животного. В отличие от нормальных прионов, патогенные прионы не разрушаются в желудке. В настоящее время исследуются пути проникновения разрушительных прионов из желудка или кишечника в головной мозг.

Обнаружено, что наибольшая концентрация возбудителя прионных инфекций находится в продолговатом и среднем отделах головного мозга животных, в мясе она гораздо ниже. Также согласно новейшим гипотезам прионы накапливаются и размножаются в определенных защитных клетках в лимфатических узлах и селезенке [81].

Источником заражения также могут послужить сточные воды, в которые прионные белки могут попасть вместе с отходами мясоперерабатывающих предприятий или вместе с выделениями больных людей и животных. Патогенные прионные белки способны сохраняться в сточных водах даже после длительного процесса очистки. Это означает, что одним из источников неизлечимого заболевания могут быть зараженные прионами овощи и фрукты, для полива которых используются воды с полей орошения [57, 61].

Симптомами прионных заболеваний являются депрессии, сонливость, утрата профессиональных навыков, нарушение двигательной системы, атрофия мышц, затрудненное глотание, параличи, деградация личности [87, 111].

Основные виды прионных заболеваний представлены в таблице 1.2.

Таблица 1.2 Классификация прионных заболеваний человека и животных

Нозологическая форма Естественный хозяин

Болезнь Крейтцфельдта - Якоба Человек

Куру Человек

Синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера Человек

Продолжение таблицы 1.2

Смертельная семейная бессонница Человек

Скрепи Овцы и козы

Трансмиссивная энцефалопатия норок Норки

Хроническая изнуряющая болезнь Олени и лоси

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота Коровы и быки

Губкообразная энцефалопатия кошек Кошки

Губкообразная энцефалопатия экзотических копытных Антилопы и большой куду

В настоящее временя у людей описаны четыре прионные болезни: болезнь Крейтцфельдта-Якоба, куру, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера и смертельная семейная бессонница. Болезнь Крейтцфельдта-Якоба является основным заболеванием, в то время как куру и синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера рассматриваются как особые ее формы [106].

Распространенность прионных заболеваний человека весьма различна в зависимости от конкретного вида патологии и исследуемого региона. Наиболее изучена распространенность болезни Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), эпидемиология болезни представлена на рисунке 1.4 [44].

Из рисунка 1.4 видно, что случаи возникновения болезни Крейтцфельдта-Якоба встречаются в Японии, в большинстве стран Северной Америки и Европы со средней частотой 0,3-1 случай на 1 млн. населения в год. Соотношение между заболеваемостью мужчин и женщин составляет 1,5:1 [135, 148].

Рисунок 1.4 - Эпидемиология болезни Крейтцфельдта-Якоба (темный цвет -страны, в которых были зафиксированы случаи заболевания людей; светлый - зафиксированные случаи коровьего бешенства)

Однако выявлено несколько популяций, где БКЯ встречается чаще, в частности, у ливийских евреев, проживающих в Израиле, где заболеваемость встречается с частотой 31,3 на 1 млн. в год. Такая высокая частота в определенных популяциях связана с наследованием заболевания в связи с мутациями гена, определяющего синтез прионного белка. В большинстве проанализированных литературных источников не отмечается достоверного увеличения числа случаев БКЯ в процессе многолетних исследований, за исключением семейных. В тоже время, имеются работы, где данные тенденции отмечаются. Однако этот рост может быть связан с улучшением и стандартизацией диагностики данного заболевания, а также с большей настороженностью врачей в этой стране в отношении прионных болезней [98, 147].

Болезнь Крейтцфельдта-Якоба - быстро прогрессирующее дистрофическое заболевание коры большого мозга, базальных ганглиев и спинного мозга. Считается основным проявлением губчатой энцефалопатии [18].

Начальные симптомы заболевания включают когнитивные расстройства, нарушения сна, поведенческие отклонения, психические нарушения. С прогрессированием болезни к указанным признакам добавляются экстрапирамидные и пирамидные симптомы, атаксия, нарушение зрения [80].

Болезнь Крейцфельдта-Якоба составляет около 85 % всех прионных энцефалопатий человека, поражает людей, независимо от пола, возраста и национальности. Начало заболевания проявляется, как правило, в среднем или позднем возрасте, в типичных случаях на пятом десятке жизни, но может возникнуть в любом возрасте. Болезнь быстро прогрессирует, обычно приводит к летальному исходу в течение 12 месяцев от начала заболевания [152].

Похожие диссертационные работы по специальности «Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств», 05.18.04 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств», Драгунова, Екатерина Евгеньевна

129 ВЫВОДЫ

1. Среди исследованных образцов животного происхождения определены образцы с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка - фракция водорастворимых белков говядины и плазма крови.

2. С помощью компьютерных программ «0^оСа1с» и «Сгиз1;а1\У» был проведен анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена РШЧР прионного белка, включающий филогенетический и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена нормального и патогенного прионного белка крупного рогатого скота, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецефичных и видоспецефичных праймеров и построения филогенетического дерева, устанавливающего генетическую связь инфекционного прионного белка.

3. Сконструированы и синтезированы олигонуклеотидные прайме-ры для амплификации гена РШчГР патогенного прионного белка.

4. Проведен выбор и оптимизация параметров проведения амплификации. Температурно-временной профиль программы амплификации составляет: 95°С - 1 мин - 1 цикл; 95°С - 30 с - 30 циклов; 56°С - 1 мин -30 циклов; 72°С - 30 с - 30 циклов, 72°С - 10 мин - 1 цикл.

Подобраны компоненты для проведения ПЦР-реакции. Для проведения пробоподготовки выбраны следующие реактивы: солевой раствор Вебера, 10%-ный раствор гидроксида натрия, промывочный буфер, раствор для блокировки свободных мест связывания, рекомбинантный стрептавидин, биоти-ниллированные моноклональные антитела к патогенному прионному белку 15ВЗ. Для проведения специфической ПЦР-реакции выбраны: матричная

ДНК-мишень, два искусственно синтезированных праймера, четыре дезокси-

_____ ___

рибонуклеотида, термостабильная ДНК-полимераза, ионы , ПЦР-буфер, флуоресцентные зонды.

5. Экспериментально получен положительный контрольный образец, являющийся маркером длины ПЦР-продуктов для последующей элек-трофоретической детекции.

Результаты исследований показали, что разработанный положительный контрольный образец обеспечивает высокую чувствительность определения видовой специфичности тканей животного происхождения.

Экспериментальным путем разработан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и исключает ошибки исследователя при постановке реакции.

6. Подтверждена высокая специфичность разработанной тест-системы и олигонуклеотидных праймеров путем электрофоретического разделения образцов мясного фарша, содержащего патогенный прионный белок, а также путем сравнительного анализа результатов определения патогенного прионного белка, полученных с использованием предлагаемой ПЦР-тест-системы и ИФА-системы «Те8еЕ™».

7. Проведена оценка условий хранения и установлены достоверные сроки пригодности разработанной ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота.

Условия хранения: в сухом, защищенном от света месте при температуре 4±2°С.

Гарантийный срок хранения: 4 месяца, при соблюдении условий хранения. Испытания эффективности и чувствительности, проводимые на протяжении четырех месяцев, свидетельствуют о том, что в пределах изучаемого периода ПЦР-тест-система сохраняет высокие значения показателей ее эффективной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Драгунова, Екатерина Евгеньевна, 2013 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Антипова, Л.В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов. - М.: Колос, 2001. - 376 с.

2. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. / Л.Б Борисов. - М.: Медицинское информационное агентство, 2005. - 736 с.

3. Вартапетян, А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология.- М.: Наука, 1991.- С. 926-936.

4. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова.- Новосибирск: Издательство СО РАН, 1999.- 252 с.

5. Галкин, А.П. Прионы дрожжей, амилоидозы млекопитающих и проблема протеомных сетей. / А.П. Галкин, Л.Н. Миронова, Г.А.Журавлева, С.Г. Инге-Вечтомов // Генетика. - 2006. - Т. 42. № 11. - С. 1 - 13.

6. ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. Оценка биологическая медицинских изделий. Часть 2. Требования к охране здоровья животных. - Введ. 2010 - 0701. - М.: Стандартинформ, 2009. - 16 с.

7. ГОСТ Р ИСО 10993-4-2009. Оценка биологическая медицинских изделий. Часть 4. Выбор испытаний, относящихся к взаимодействию с кровью. - Введ. 2010 - 09 - 01. - М.: Стандартинформ, 2010. - 32 с.

8. ГОСТ Р 52833-2007(ис0 22174:2005) Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения.

9. Григорьев, В.Б. Методы диагностики прионных заболеваний / В.Б. Григорьев, А.Н Покидышев, С.Л Кальнов, С.М. Клименко // Вопросы вирусологии.- 2009. - № 5. - С. 4 - 9.

10. Григорьев, В. Б. Прионные болезни человека и животных/ В.Б. Григорьев // Вопросы вирусологии. - 2004. - Т. 6. - С. 4 - 12.

11. Завалишин, И.А. Прионы и прионные болезни / И.А Завалишин, И.Е. Шитикова, Т.Д. Жученко // Клиническая микробиология. - 2000. - Т. 2. -№2.-С. 12-19.

12. Захаров, И.А. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов / И.А. Захаров, С.А Кожин, Т.Н.Кожина, И.В.Фёдорова. - Л.: Наука., 1984. - 143 с.

13. Зуев, В.А. Медленные вирусные инфекции человека и животных. / В.А. Зуев. - М.: Медицина, 1988. - 256 с.

14. Зуев, В.А. Прионы - новый класс возбудителей инфекционных заболеваний / В.А. Зуев // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - № 10. -С. 33 - 38.

15. Зуев, В.А. Прионные болезни человека и животных: Руководство для врачей. / В.А. Зуев, И.А. Завалишин, В.М. Ройхель- М.: Медицина, 1999.- 192 с.

16. Инге-Вечтомов, С.Г. Рецессивные суперсупрессоры у дрожжей / С.Г Инге-Вечтомов, В.М Андрианова // Генетика. - 1970. - Т. 6.- С. 103-116.

17. Инге-Вечтомов, С.Г. Цитогены и прионы: цитоплазматическая наследственность без ДНК? / С.Г Инге-Вечтомов // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - №5. -С. 11 - 18.

18. Крейтцфельдта - Якоба болезнь // Большая медицинская энциклопедия, Т. 11. - 3-е изд. - М.: «Советская энциклопедия», 1979. - С. 519.

19. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-П групп пато-генности».

20. МУ 1.3.1888-04 «Эпидемиология. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными микробиологическими агентами 1П-1У групп патогенности».

21. Обухов, И.Л. Применение ПЦР в ветеринарии // Аграрная Россия.- 2002.- № 2.- С. 62 - 64.

22. Панина, Е.А. Идентификация ДНК пушных зверей в кормах методом ПЦР / Е.А. Панина, И.Л. Обухов // Ветеринария.- 2008.- № 4.- С. 56 -57.

23. Патент Российская Федерация №2281510 GO 1 N33/68. Антитела, специфически реагирующие с прионным протеином РгР или его фрагментом, и их применение / В.П. Барграсер, Е.Е. Булычева, А.С. Домогатская. Патентообладатель: ООО «БиоХарт». - Заявл. 23.03.2005. - Опубл. 10.08.2006.

24. Патент Российская Федерация №2281511 G01N33/68. Поликло-нальное антитело, специфически реагирующее с прионным протеином в ткани мозга млекопитающих, и диагностический реагент на его основе / В.П. Барграсер, Е.Е. Булычева, А.С. Домогатская. Патентообладатель: ООО «БиоХарт». Заявл. 23.03.2005. - Опубл. 10.08.2006.

25. Патент JP №ЕР1127894 Al. Method of diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy (TSE) / S.Weiss. Патентообладатель: S.Weiss. - Заявл. 29.05.1998. - Опубл. 29.08.2001.

26. Патент JP №EP1437144 A1A61K49/00. Rapid in-vivo test for Transmissible Spongiform Encephalopathy in the eye / L.Carsten, C. Lippmann. Патентообладатель: IVPT GMBH [DE]. - Заявл. 09.01.2003. -Опубл. 14.07.2004.

27. Патент US №FR2849204 Al. Detection of pathological prion proteins, useful for diagnosis of spongiform encephalopathy, includes precipitation of the protein with an aminoglycoside antibiotic/ Moussa Aly, Coleman Anthony William, Bencsik Reynier Anna. Патентообладатель: AGENCE FRANÇAISE DE SECURITE S [FR]; CENTRE NAT RECH SCIENT [FR]. - Заявл. 20.12.2002. - Опубл. 25.06.2004.

28. Патент US №2004018554 Al G01N33/68/ Methods and compositions for detection of bovine spongiform encephalopathy and variant CreutzfeldtJakob disease/ Larry R. Green. Патентообладатель: Larry R. Green -Заявл. 22.04.2002. - Опубл. 29.01.2004.

29. Патент US №2007224593 Al G01N33/53/ Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy / Goldstein, Lee E.; O'Rourke, Katherine I., Патентообладатель: Goldstein, Lee E - Заявл. 18.10.2006. - Опубл. 27.09.2007.

30. Патент US № GB2435789 A G01N21/75. Prion sensors for diagnosis of transmissible /spongiform encephalopathy or for détection of prions, and use thereof/ Патентообладатель: UNIV GUELPH [СА]. Заявл. 27.06.2002. -Опубл. 05.09.2007.

31. Покровский, В.И. Молекулярные основы прионных болезней. //

B.И. Покровский, О.И Киселев // Вестник РАМН. - 1998. - № 10. - С. 45 - 55.

32. Покровский, В.И. Прионы и прионные болезни / В.И. Покровский, О.И.Киселев, Б.Л. Черкасский. - М.: РАМН, 2004. - 384 с.

33. Полещук, Н.Н. Инфекционность белков 18-20 КД, выделенных из мозга людей, умерших от амиотрофического лейкоспогиоза / Н.Н. Полещук,

C.П. Капитулец, H. Н. Капитулец и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1993. - № 10. - С. 409 - 412.

34. Полещук, Н.Н. Использование электронной микроскопии для диагностики спонгиозных энцефалопатий / Н.Н. Полещук, С.П. Капитулец, Ю.Г. Илькевич, З.Б Квачева // Лабораторное дело. - 1991. - № 4. - С. 42-44.

35. Полещук, Н.Н. Формирование инфекционных скрепиоподобных структур при персистенции агента амиотрофического лейкоспонгиоза в культуре клеток мозга / Н.Н. Полещук, Ю.Г. Илькевич, С.П. Капитулец и др. // Вопросы вирусологии. - 1991. - Т. 37, № 1. - С. 37 - 40.

36. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. // М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. -223 с.

37. Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота. / С.С. Рыбаков Владимир, 2007. - 588 с.

38. Телков, М.В. Характеристика транскриптов генов supl и sup2 у дрожжей сакхаромицетов / М.В. Телков, А.П. Сургучев // Докл. Акад. Наук СССР. - 1986. - Т. 290. - №4. - 140 с.

39. Тер-Аванесян, М.Д. Прионы: инфекционные белки с генетическими свойствами / М.Д. Тер-Аванесян, В.В. Кушниров // Биохимия.- 1999.Т. 64.- Вып. 12.- С. 1638 - 1647.

40. Тер-Аванесян, М.Д. Молекулярные механизмы "белковой" наследственности: прионы дрожжей / М.Д. Тер-Аванесян, С.В. Паушкин, В.В. Кушниров // Молекулярная биология.- 1998.- Т. 32.- №1.- С. 32 - 42.

41. Терентьев, П. В. Практикум по биометрии / П. В. Терентьев, Н.С. Ростова. - Л: изд-во ЛГУ, 1977. - 152 с.

42. Шибата, Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов / Д.К. Шибата - М.: Мир, 1999. - С. 395-425.

43. Шкундина, И.С. Прионы / И.С. Шкундина, М.Д. Тер-Аванесян // Успехи биол. химии. 2006. -Т. 46.- С. 3 - 42.

44. Электронный ресурс http://c0mm0ns.wikimedia.0rg/wiki/File:Gl0bal_mad_c0w_cases_map.PNG

45. Электронный ресурс http://www.med2000.ru/nl/nl2.htm.

46. Электронный ресурс http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

47. Электронный ресурс http://www.vector-best.ru/nvb/n50/st50_4.htm.

48. Электронный ресурс http://umka-vet.com.ua/faq-zhivotnie/metod-ptsr.html

49. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. А.А. Конопаткина,- М.: Колос, 1984. - С. 163 - 172.

50. Ю.Рубель, А.А. Дрожжевой шаперон Hsp 104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне / А.А. Ю.Рубель, А.Ф. Сайфит-динова, А.Г. Лада, А.А Нижников, С.Г. Инге-Вечтомов, А.П. Галкин // Молекулярная биология. - 2008. - Т. 42. - №1. — С. 123 - 130.

51. Abid, К. The intriguing prion disorders / К. Abid, C.Soto // Cell. Mol. Life Sci. - 2006. -Vol. 63.- P. 2342 - 2351.

52. Aguzzi, A. Mammalian prion biology: one century of evolving concepts / A. Aguzzi, M. Polymenidou // Cell. 2004. - Vol. 116. - №2. - P. 313 - 327.

53. Aguzzi, A. Molecular mechanisms of prion pathogenesis / A. Aguzzi, C. Sigurdson, M. Heikenwalder // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2008. - Vol. 3. -P. 11-40

54. Aguzzi, A. Pathogenesis of prion diseases: current status and future outlook / A. Aguzzi, M. Heikenwalder // Nat. Rev. Microbiol. - 2006. - Vol.4. -N.10. - P.765 - 775.

55. Aguzzi, A. Pathogenesis of prion diseases: a progress report / A. Aguzzi, F.L. Heppner // Cell Death Differ. - 2000. - Vol. 7. - № 10. - P. 889-902.

56. Alper, T. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? / T. Alper, W.A Cramp, D.A. Haig, MC. Clarke // Nature. 1967. - Vol. 214. - P. 764 -766.

57. Alperovitch, A. Codon 129 prion protein genotype and sporadic Creutzfeldt-Jakob disease / A. Alperovitch, Zerr I., Pocchiari M., et al.. Lancet. 1999.-Vol. 353. P. 1673 - 1674.

58. Apetri, A.C. Early Intermediate in Human Prion Protein Folding As Evidenced by Ultrarapid Mixing Experiments / A.C. Apetri, K. Maki, H. Roder, W.K. Surewicz // J. Am. Chem. Soc.-2006.-Vol. 128.-P. 11673 - 11678.

59. Apetri, A.C. Kinetic intermediate in the folding of human prion protein / A.C. Apetri, W.K. Surewicz // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 44589 -44592.

60. Apodaca, J. Cellular tolerance of prion protein PrP in yeast involves proteolysis and the unfolded protein response / J. Apodaca, I. Kim, H. Rao // Bio-chem Biophys Res Commun. -2006. Vol. 347. - № 1. - P. 319 - 326.

61. Bagriantsev, S.N. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis / S.N. Bagriantsev, V.V. Kushnirov, S.W. Liebman // Methods Enzymol. — 2006. Vol. 412. - P. 33 - 48.

62. Bagriantsev, S. Specificity of prion assembly in vivo. PST. and [PIPt] form separate structures in yeast / S. Bagriantsev, S.W. Liebman // J Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - № 49. - P. 51042 - 51048.

63. Bainbridge, J. The normal cellular form of prion protein modulates T cell responses / J. Bainbridge, K.B. Walker // Immunol. Lett. 2005. - Vol. 96. -№ l.-P. 147- 150.

64. Barletta JM. Detection of ultra-low levels of pathologic prion protein in scrapie infected hamster brain homogenates using real-time immuno-PCR /D.C. Edelman , W.E. Highsmith WE , NT.Constantine// J Virol Methods.-2005. -№ 127(2).-P. 154- 164.

65. Bartz, J.C. Extraneural prion neuroinvasion without lymphoreticular system infection / J.C. Bartz, C. Dejoia, T. Tucker, A.E. Kincaid, R.A. Bessen // J. Virol. 2005.-Vol. 79. —P. 11858 - 11863.

66. Bartz, J.C. Prion interference is due to a reduction in strain-specific PrPSc levels / J.C. Bartz, M.L. Kramer, M.H. Sheehan, J.A. Hutter, J.I. Ayers, R.A. Bessen, A.E. Kincaid // J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P. 689 - 697.

67. Baskakov, I.V. The reconstitution of mammalian prion infectivity de novo / I.V. Baskakov // IIFEBS J. - 2007. - Vol. 274. - P. 576 - 587.

68. Bate, C. Squalestatin cures prion-infected neurons and protects against prion neurotoxicity / C. Bate, M. Salmona, L. Diomede, A. Williams // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279.-№15.-P. 14983 - 14990.

69. Bellinger Kawahara, C. Scrapie prion liposomes and rods exhibit target sizes of 55,000 Da / C. Bellinger Kawahara, E. Kempner, D. Groth et al. // Virology. - 1988. - Vol. 164. - P. 537 - 541.

70. Benestad, S.L. Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of a new type, Nor98 / S.L Benestad., P. Sarradin, B. Thu et al. // Vet. Rec. - 2003. - Vol. 153. - P.202 - 208.

71. Beringue V. Regional heterogeneity of cellular prion protein isoforms in the mouse brain. / V. Beringue, G. Mallinson, M. Kaisar, M. Tayebi, Z. Sattar, G. Jackson, D. Anstee, J. Collinge, S. Hawke // Brain. 2003. - № 126. - P. 2065 -2073.

72. Bessen, RA. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy / RA. Bessen, R.F. Marsh // J Virol. - 1994. - Vol. 68. - № 12.- P. 7859 - 7868.

73. Biacabe, A. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases / A. Biacabe, J. Laplanche, S. Ryder et al. // EMBO J. - 2004. - Vol. 5. - P. 10 -14.

74. Bockman, J. Immunological Analysis of Host and Agent Effects on Creutzfeldt Jakob Disease and Scrapie Prion Proteins / J. Bockman, D. Kingsbury // J. Virol. - 1988. - Vol.62. - № 9. - P. 3120 - 3127.

75. Bolton, D.C. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion / D.C. Bolton, M.P. McKinley, S.B. Prusiner // Science.- 1982. V. 218. -P. 1309- 1311.

76. Brown, P. Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease / P. Brown, L. Cervenakova, H. Diringer // J. Lab. Clin. Med. - 2001. - V. 137. - № 1. - P. 5-13.

77. Bradley, R. Prion Diseases./ R. Bradley, J. Collinge, M.S. Palmer eds // Oxford. - 1997. - P. 89 - 129.

78. Brown, P. Creutzfeldt-Jakob disease: blood infectivity and screening tests / P. Brown // Semin. Hematol. - 2001. - V. 38, N 4 (Suppl. 9). - P. 2 - 6.

79. Bruce, M. E. Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent / M. E. Bruce, R. G. Will, J. Ironside et al. // Nature. 1997.-Vol.389. - P.498 - 501.

80. Budka, H. Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (prion diseases) / H. Budka, A. Aguzzi, P. Brown et al.. Brain Pathol. - 1995. - Vol. 5. - P. 459 - 466.

81. Caplazi, P Biology of PrPsc accumulation in two natural scrapie infected sheep flocks / P. Caplazi, K. Rourke, C. Wolf et al. // J. Vet. Diagn. Invest. -2004. Vol. 16.- P.489 - 496.

82. Capobianco, R. Conversion of the BASE Prion Strain into the BSE Strain: The Origin of BSE? / R. Capobianco, C. Casalone, S. Suardi et al. // PLoS Pathog. - 2007. - Vol.3. -№ 3. - P. 0001 - 0008.

83. Carrell, R.W. Conformational disease / R.W. Carrell, D.A.Lomas // Lancet. - 1997. - Vol. 350.-№. 9071. - P. 134 - 138.

84. Casalone, C. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt Jakob disease / C. Casalone, G. Zanusso, P. Acutis et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -

2004. - Vol. 101. - P. 3065 - 3070.

85. Chang, B. Test for detection of disease associated prion aggregate in the blood of infected but asymptomatic animals / B. Chang, X. Cheng, S. Yin et al. // Clin. Vaccine Immunol. - 2007. - Vol. 14. - № 1.- P. 36 - 43.

86. Collinge J. Molecular analysis of prion strain variation and the etiology of new variant CJD / J. Collinge, K. Sidle, J. Meads, et al. // Nature. - 1996. -Vol.383. - P. 685 - 690.

87. Collinge, J Prion Diseases./J.Collinge, M.S. Palmer eds. // Oxford. -1997.-P. 18-55.

88. Court, L Transmissible subacute spongiform encephalopathies: prion diseases / L. Court, B. Dodet, ed. // Elsevier, Paris, 1996. - 158 pp.

89. Christof M. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification./ A. Michael, R. Wacke// TRENDS in Biotechnology.-

2005.- Vol.23. - N 4. - P. 208 - 216

90. Edenhofer, F. Prion protein PrPc interacts with molecular chaperones of the Hsp60 family / F. Edenhofer, R. Rieger, M. Famulok et al. // J. Virol. - 1996. - V. 70. - № 7. - P. 4724 - 4728.

91. Espinosa, J. Sheep passaged bovine spongiform encephalopathy agent exhibits altered pathobiological properties in bovine PrP transgenic mice / J. Espinosa, O. Andreoletti, J. Castilla // J. Virol. 2007. -Vol. 81. -№ 2. - P. 835 - 843.

92. Fornai, F. A hypothesis on prion disorders: are infectious, inherited, and sporadic causes so distinct? / F. Fornai, M. Ferrucci, M. Gesi et al. // Brain. Res. Bull. - 2006. - Vol.69. - №.2. - P.95 - 100.

93. Fraser, J. What is the basis of transmissible spongiform encephalopathy induced neurodegeneration and can it be repaired? / J. Fraser // Neuropathol. Appl. Neurobiol. - 2002. - Vol.28. - P.l- 11.

94. Gajdusek, D.C. Alpers M. Experimental transmission of a kuru-like syndrome to chimpanzees / D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs // Nature. - 1966. -Vol. 209. - P. 794 - 796.

95. Gajdusek, D.C. Subviral Pathogenesis of Plants and Animals: Viroids and Prions / D.C. Gajdusek // New York: Academic Press, Inc. - 1985. - P. 483544.

96. Gavier Widen D. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases / D. Gavier Widen, A G. Biacabe, J L. Laplanche, S. Ryder, T. Baron // EMBO. - 2004. - Vol.5. - P.l 10 - 115.

97. Gavier Widen, D. Pathology and pathogenesis of bovine spongiform encephalopathy and scrapie / D. Gavier Widen, M. Jeffrey, L. Gonzalez // Curr. Topics. Microbiol. Immunol. - 2004. - Vol.284. - P.65 - 97.

98. Glatzel, M, Human prion diseases: epidemiology and integrated risk assessment / M. Glatzel, P.M. Ott., T. Lindner et al. // Lancet Neurol. - 2003. -Vol. 2. - P. 757 - 763.

99. Gofflot, S. Immunoquantitative PCR for prion protein detection in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease / S. Gofflot, M. Deprez, B.Moualij, A. Osman // Clinical Chemistry - 2005. - №. 9 - P. 1605 - 1611.

100. Gonzalez, L. Comparative titration of experimental ovine BSE infec-tivity in sheep and mice / L. Gonzalez, F. Chianini, S. Martin // J. Gen. Virol. -2007. - Vol.88. - № 2. - P. 714 - 717.

101. Grassi, J. Rapid test for the preclinical postmortem diagnosis of BSE in central nervous system tissue / J. Grassi et al. // Vet. Rec. - 2001. - V. 10. - P. 577 - 582.

102. Gutell, R.R. Lesson from evolving rRNA:16s and 13s structures from a comparative perspective / R.R. Gutell, N.Larsen, C.R. Woese // Microbiol. Rev. - 1994. - V. 58.-P. 10-26.

103. Hadlow, W.J. Scrapie and kuru / W.J. Hadlow // Lancet. - 1959. -Vol. 2. P. 289 - 290.

104. Hadlow, W. J. Bovine spongiform encephalopathy. The BSE dilemma / W. J Hadlow // N.Y.: Springer. - 1996. - P. 122 - 137.

105. Harris D.A. Cellular biology of prion diseases. / D.A. Harris // Clin. Microbiol. Rev. 1999. - Vol. 12. - № 3. - P. 429 - 444.

106. Harris, D.A. Prion diseases/ D.A. Harris // Nutrition. - 2000. - Vol.6. -№16.-P. 554.

107. Hartman, L.J. Development of a novel internal positive control for Taqman based assays / L.J. Hartman, S.R. Coyne, D.A. Norwood // Molecular and cellular probes.- 2005.- №19.- P. 51 - 59.

108. Heppner, F. Recent developments in prion immunotherapy / F. Hepp-ner, A. Aguzzi // Curr. Opin. Immunol. - 2004. - Vol.16. - №.5. - P. 594 - 608.

109. Houston, F. Transmission of BSE by blood transfusion in sheep / F. Houston, J.D. Foster, A. Chong et al. // Lancet. - 2000. - V. 356.- P. 999 - 1000.

110. Hsiao, K. Spontaneous neurodegeneration in transgenic mice with mutant prion protein / K. Hsiao, M. Scott, G. Foster et al. // Science. -1990. -Vol.250, N4987.-P. 1587- 1590.

111. Hu, W. Prion proteins: Physiological functions and role in neurological disorders / W. Hu, B. Kieseier, E. Frohman et al. // J Neurol Sci. - 2007.

112. Hu, W. Prion proteins: a biological role beyond prion diseases.Acta / W. Hu, R. Rosenberg, O. Stuve // Neurol. Scand. - 2007. - Vol.116. № .2. - P. 7582.

113. Huang, Z. Prions Prions Prions./ Z. Huang, S.B. Prusiner, F.E. Cohen // Berlin. - 1998. P. 49 - 63.

114. Huang, H. Evaluation of Western blotting methods using samples with or without sodium phosphotungstic acid precipitation for diagnosis of scrapie and chronic wasting disease / H. Huang, J. Rendulich, D. Stevenson // The Canadian Journal of Veterinary Research. - 2005. - Vol. 69. - P. 193 - 199.

115. Ironside, J. Prion diseases / J. Ironside, J. Bell. // J. Collinge, M. Palmer eds. Oxford. - 1997. - P. 57 - 87.

116. ISO 22442-1:2007. Медицинские изделия, использующие ткани животных и их производные. Часть 1. Применение менеджмента риска. -Введ. 2007-12-15. - М.: Стандартинформ, 2007. - 36 с.

117. ISO 22442-2:2007 Медицинские изделия, использующие ткани животных и их производные. Часть 2. Контроль источников, забора и обработки. - Введ. 2007-12-15. - М.: Стандартинформ, 2007. - 24 с.

118. ISO 22442-3:2007 Медицинские изделия, использующие ткани животных и их производные. Часть 3. Валидация уничтожения и/или инактивации вирусов и агентов заразной спонгиозной энцефалопатии (TSE). - Введ. 2007-12-15. - М.: Стандартинформ, 2007. - 32 с.

119. Jeffrey, М. Cell associated variants of disease specific prion protein immunolabelling are found in different sources of sheep transmissible spongiform encephalopathy / M. Jeffrey, S. Martin, ez L. Gonzal // J. Gen. Virol. - 2003. -Vol.84.-P. 1033 - 1046.

120. Kocisko D.A. Cell-free formation of protease-resistant prion protein / D.A. Kocisko, J.H. Come, S.A. Priola et al.// Nature. - 1994. - V.370. - P. 471-474.

121. Korth, C. Monoclonal antibodies specific for the native, disease associated isoform of the prion protein / C. Korth, P. Streit, B. Oesch // Methods. En-zymol. - 1999. - Vol.309. - P.106 - 122.

122. Lezmi, S. Comparative molecular analysis of the abnormal prion protein in field scrapie cases and experimental bovine spongiform encephalopathy in sheep by use of Western blotting and immunohistochemical methods / S. Lezmi, S. Martin, S. Simon et al. // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 3654 - 3662.

123. Liang H. A highly sensitive immuno-PCR assay for detecting group Streptococcus./ E.Susan, Cordova, L. Kieft// Journal of Immunological Methods.-2003.-№ 279.- P. 101-110.

124. Ludwig, W. Phylogeny of bacteria beyond the 16s rRNA standard/ W. Ludwig, K.-H.Schleifer // ASM News. - 1999. - V.65. - P. 752 - 757.

125. McKinley, M.P. A proteaseresistant protein is a structural component of the scrapie prion / M.P. McKinley, D.C. Bolton., S.B. Prusiner // Cell. - 1983. -Vol. 35.-P. 57-62.

126. Oberdieck, U. Characterisation of antisera raised against species specific peptide sequences from scrapie associated fibril protein and their application for post mortem immunodiagnosis of spongiform encephalopathies / U. Oberdieck, Y. Xi, M. Pocchiari, H. Diringer // Arch. Virol. - 1994. - Vol.136. - №.12. - P. 99 -110.

127. Palmer, M. Prion Diseases / M.Palmer, J. Collinge, eds. // Oxford. -

1997.-P. 1-17.

128. Pan, T. An aggregation specific enzyme linked immunosorbent assay: detection of conformational differences between recombinant PrP protein dimers and PrP(Sc) aggregates / T. Pan, P. Wong, C. Li et al. // J. Virol. - 2005. - Vol.79. -P. 12355 - 12364.

129. Prusiner, S.B. Prions Prions Prions /S.B. Prusiner ed. //Berlin.- 1998. -P. 1 - 18.

130. Prusiner, S.B. Molecular biology of prion diseases / S.B. Prusiner // Science. - 1991. - V. 252. - P. 1515 - 1522.

131. Prusiner, S.B. Inherited prion diseases / S.B. Prusiner // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. - 1994. - V. 91. - P. 4611 - 4614. \

132. Prusiner, S.B. Molecular biology and pathogenesis of prion diseases / S.B. Prusiner// TIBS. - 1996. - P. 482 - 487.

133. Prusiner, S. B. Prions / S.B. Prusiner // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -

1998.-V. 95.-P. 13363 - 13383.

134. Raymond, G.J Molecular assessment of the potential transmissibilities of BSE and scrapie to humans / G.J. Raymond et al. // Nature. - 1997. - V. 388. -P. 285 - 288.

135. Report of a WHO Consultation. Global Surveillance Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies Geneva. - 1998. -P 9 - 11.

136. Report of a WHO Consultation on Medicinal and other Products in Relation to Human and Animal Transmissible Spongiform Encephalopathies. Geneva, Switzerland, 24-26 March, 1997.

137. Reuter T. Prion protein detection via direct immuno-quantitative realtime PCR./H. Brandon, Gilroyed, W. Trevor, M.Cordon //McAllister. - 2009. -Vol. 78.-№3.- P. 307-311

138. Roberts, G. W. Prion protein immunoreactivity in human transmissible dementias / G. W. Roberts, R. Lofthouse, R. Brown et al. // N. Engl. J. Med. -1986. -Vol.315. -N.19.-P.1231 - 1233.

139. Safar, J. Eight prion strains have PrPsc molecules with different conformations /J. Safar, H. Wille, V. Itri et al. // Nature. - 1998. - V. 4. - P. 1157-1165.

140. Scott, A. Bovine spongiform encephalopathy: detection and quantitation of fibrils, fibril protein (PrP) and vacuolation in brain / A. Scott, G. Wells, M. Stack // Vet. Microbiol. - 1990.- Vol.23. - N.l 4. - P.295 - 304.

141. Serban, D. Rapid detection of Creutzfeldt Jakob disease and scrapie prion proteins / D. Serban, A. Taraboulos, S. DeArmond, S. Prusiner // Neurology. - 1990.-Vol.40. -№ l.-P. 110-117.

142. Silveira, J. The most infectious prion protein particles / J. Silveira, A. Hughson, R. Race et al. // Nature. - 2005. - Vol .437. - P. 57 - 61.

143. Somerville, R. A. Immunodetection of PrPSc in spleens of some scrapie infected sheep but not BSE infected cows / R. A. Somerville, C. R. Birkett, C.F. Farquhar// J. Gen. Virol. - 1997. - Vol.78. №. - P. 2389 - 2396.

144. Spraker, T. Distribution of protease resistant prion protein and spongiform encephalopathy in free ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease / T. Spraker, R. Zink, B. Cummings et al. // Vet. Pathol. - 2002.-Vol.39. - P. 546 - 556.

145. Thackray, A. Proteinase K sensitive disease associated ovine prion protein revealed by conformation dependent immunoassay / A. Thackray, L. Hopkins, R. Bujdoso // Biochem. J. - 2007. - Vol. 401. - №.2. - P. 75 - 83.

146. Tinning, C. Discrimination between scrapie and bovine spongiform encephalopathy in sheep by molecular size, immunoreactivity, and glycoprofile of prion protein / C. Thuring, J. Erkens, J. Jacobs et al. // J. Clin. Microbiol. - 2004. -Vol. 42. - P. 972 - 980.

147. Valleron, A.J. Estimation of epidemic size and incubation time based on age characteristics of vCJD in the United Kingdom / A.J. Valleron, P.Y. Boelle, R. Will, J.Y. Cesbron // Science. -2001. - Vol. 294. - P. 1726 - 1728.

148. Vernino, S. Autoimmune encephalopathies / S. Veraino, M. Geschwind, B. Boeve // Neurologist. -2007. - Vol. 13. - № 3. - P. 140 - 147.

149. Wadsworth, J.D. Using a highly sensitive immunoblotting assay / J.D. Wadsworth, S.F. Joiner, A.F. Hill et al. // Lancet. - 2001. - Vol. 358. - P. 171 -180.

150. Wadsworth, J. Tissue distribution of protease resistant protein in variant Creutzfeldt Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay / J. Wadsworth, S. Joiner, A. Hill et al. // The Lancet. -2002. - Vol. 358. - P. 151 -160.

151. Weissmann, C. PrP effects clarified / C. Weissmann // Curr. Biol. -1996.-V. 6.-P. 1359.

152. Weller, R.O. Iatrogenic transmission of Creutzfeldt-Jacob disease/ R.O. Weiler // Psychol Med. - 1989. - Vol.4. - №19. - P. 113.

153. Wells, G. A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle / G. Wells, A. Scott, C. Johnson, R. Gunning et al. // Vet. Ree. - 1987. - Vol.121. -P.419 420.

154. Wilesmith, J. An epidemiologist s view of bovine spongiform encephalopathy / J. Wilesmith // Philos Trans R Soc of London. - 1994. - Vol. 343. -P. 357-361.

155. Wilesmith, J A cohort study to examine maternally associated risk factors for bovine spongiform encephalopathy / J. Wilesmith, G. Wells, J. Ryan et al. // Vet. Ree. - 1997. - Vol.141. - P.239 - 243.

156. WHO Guidelines on Transmissible Spongiform Encephalopathies in relation to Biological and Pharmaceutical Products, 2003 (www.who.int/bloodproducts/publications/en/WHO_TSE_2003.pdf)

157. WHO Guidelines on Tissue Infectivity Distribution in Transmissible Spongiform Encephalopathies 2006 (http://www.who.int/ bloodproducts/cs/ TSEPUBLISHEDREPORT.pdf).

158. Zanusso, G. Prion protein expression in different species: analysis with a panel of new mAbs / G. Zanusso, D. Liu, S. Ferrari et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1998. - Vol.95. - P. 8812 - 8816.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.