Разработка ПЦР-тест-систем для видовой идентификации и количественной оценки мясного сырья в составе мелкоизмельченных полуфабрикатов и готовых мясных продуктов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.06, кандидат ветеринарных наук Комарова, Ирина Николаевна

• Комарова, Ирина Николаевна
• кандидат ветеринарных наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Комарова, Ирина Николаевна

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и готовой продукции.

1.2 Виды фальсификаций мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий.

1.3 Органолептические и морфологические показатели видовой принадлежности мяса и мясных продуктов.

1.4 Физико-химические показатели видовой принадлежности мяса и мясных продуктов.

1.5 Инструментальные методы идентификации и выявления фальсификаций видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов.

1.6 Сущность полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.7 Применение метода ПЦР для видовой идентификации мясного сырья и продуктов животного происхождения.

1.8 Количественная оценка содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий с использованием метода ПЦР.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка ПЦР-тест-систем для видовой идентификации и количественной оценки мясного сырья в составе мелкоизмельченных полуфабрикатов и готовых мясных продуктов»

Актуальность темы диссертации. Формирование в России рыночных условий развития общества, резкое увеличение объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе мясным сырьем, полуфабрикатами и готовыми мясными продуктами, предопределяют возможность различной их фальсификации но структуре и видовой принадлежности сырьевых составляющих. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное мясное сырье, продукцию второго и третьего сортов, реализуя их как продукцию высокого качества.

В последние годы на рынках и торговых предприятиях нашей страны заметно увеличился сбыт фальсифицированных продовольственных, в том числе мясных товаров как отечественного, так и импортного производства. Принятые в России законы «О ветеринарии» (14.05.93), «О защите прав потребителя» (05.12.95), «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (30.03.99), «О качестве и безопасности пищевых продуктов» (02.01.02), направленные на строгое соблюдение определенных требований к сырью и продукции, еще не обеспечивают полного исключения фальсификации различных продуктов.

Показатели качества и безопасности сырья и продуктов животного происхождения, определяемые в Системе обязательной сертификации ГОСТ Р, представлены в Санитарных правилах и нормах (СанПиН 2.3.2. 1078-01). По данным ряда исследований, мясные продукты, не отвечающие требованиям Правил ветсанэкспертизы, ГОСТ и других нормативных документов, составляют в отдельных торговых предприятиях и на рынках до 12-35% от числа всех проверенных партий. Имеются случаи реализации фальсифицированных продуктов, сопровождавшихся ветеринарными документами и сертификатами соответствия, указывающими на их подлинное происхождение и проведенный лабораторный контроль качества.

В настоящее время особенно остро стоит вопрос о необходимости более достоверного определения, как видовой принадлежности блочного мясного сырья, так и состава мясных мелкоизмельченных продуктов. Это обусловлено тем, что из-за фальсификации мясного сырья по видовому составу не только изменяются потребительские свойства готовых изделий, но и возникает опасность для здоровья потребителей.

Наибольшего беспокойства у ветеринарных специалистов вызывают возможные подмены в продуктах мясного сырья мясом животных, пораженных прионами или вирусами, создающими большой риск в эпизоотическом и эпидемическом отношениях (губкообразные энцефалопатии, африканская чума свиней, ящур и другие), а также мясом, импорт которого в нашу страну по каким-либо причинам запрещен. Кроме того, фальсификация видовой принадлежности мясного сырья в многокомпонентных мясных продуктах может нанести большой моральный вред той категории потребителей, национальные или религиозные воззрения которых не позволяют употреблять мясо отдельных видов скота и пгицы.

Известно, что используемые в настоящее время методы органолептического, физико-химического и микробиологического контроля дают возможность наделаю определить свежесть и безопасность в инфекционном отношении мясного сырья и готовых мясных изделий. Но с их помощью нельзя установить видовой состав мяса в продуктах, особенно если количество видоизмененной мышечной ткани незначительное по отношению к основному сырью.

Выявление различных фальсификаций с помощью таких иммунологических методов исследования, как РА, РП, РИД и ИФА, не всегда достигает цели, так как эти методы не позволяют надежно выявить наличие подложного мяса, содержащегося в количестве менее 10-20% от общей массы продукта. Более того, указанные методы практически не пригодны для исследования мясного сырья близкородствештых видов животных и мясных продуктов, прошедших термическую обработку выше 48-57°С.

Помимо идентификации сырьевых составляющих мясных полуфабрикатов и готовых мясных изделий существует необходимость количественной оценки процентного соотношения мясных фальсифицирующих примесей к основному мясному сырью, а также дифференцирование умышленно произведенного подлога от технически неизбежной контаминации пищевого сырья, возникающей в процессе технологической обработки мяса.

Достаточно точными и надежными методами исследования мясного сырья, позволяющими провести количественный анализ исследуемых компонентов продукта, оказались некоторые варианты иммуноферментного анализа (ELISA). Однако термическая обработка продуктов при 80°С в течение 30 мин, при 100°С - 20 мин, или 121°С - 10 мин, отрицательно влияет на чувствительность и специфичность данного метода и не позволяет выявлять в образцах примеси отдельных видов мяса в количестве менее 20%. Кроме того, с помощью ELISA оказалось невозможным дифференцировать мясо близкородственных видов животных и птицы, что снижает надежность применения данного метода (54).

Наиболее перспективными для определения видовой принадлежности тканей животного происхождения в составе мясного сырья и продуктов, в том числе подвергшихся термической обработке, являются методы ДНК-диагностики и, в особенности, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). По сравнению с традиционными способами видовой детекции, установление видовой принадлежности мяса при помощи ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа.

В последнее время метод ПЦР находит практическое применение при диагностике инфекционных заболеваний человека и животных, генотипировании различных микроорганизмов и вирусов, оценке их вирулентности и определении устойчивости к антибиотикам, генодиагностике и генетической дактилоскопии, пренатальной диагностике и биологическом контроле препаратов крови (13,16, 28, 32, 40,41,161).

В настоящее время предложены всевозможные модификации ПЦР, разрабатываются новые амплификационные технологии, основанные на репликации как ДНК-, так и РНК-фрагментов. Несмотря на то, что использование метода полимеразной цепной реакции для видовой идентификации тканей животного и растительного происхождения получило высокую оценку зарубежных специалистов, в нашей стране это направление не нашло еще широкого практического применения в области ветеринарно-санитарной экспертизы. Для решения этой проблемы необходима разработка эффективных и адаптированных к различным объектам исследований ПЦР-тест-систем качественного и количественного анализов видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка ПЦР-тест-систем для видовой идентификации и количественной оценки измельченного мясного сырья в составе мясных полуфабрикатов и готовых мясных изделий.

В задачи исследований входило:

• конструирование видоспецифичных праймеров для идентификации ДНК крупного рогатого скота, свиньи и курицы методом ПЦР и определение наиболее эффективной методики выделения ДНК из мясного сырья и готовых продуктов;

• оптимизация процесса амплификации по температурному и временному профилям реакции;

• изучение специфичности и чувствительности разработанных однолокусных и мультилокусной ПЦР-тест-систем;

• создание контролей ложноположительных и ложноотрицательных результатов разработанных ПЦР-тест-систем;

• разработка внутренних стандартов для количественного определения ДНК крупного рогатого скота, свиньи и курицы методом конкурентной ПЦР;

• калибровка внутренних стандартов и определение точек эквивалентности для количественной оценки ДНК исследуемых видов животных методом конкурентной ПЦР;

• сравнительный анализ влияния условий хранения и термической обработки мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР-методов видовой идентификации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Комарова, Ирина Николаевна

3. ВЫВОДЫ

1. Наиболее оптимальным молекулярно-генетическим маркером для видовой идентификации ДНК крупного рогатого скота, свиней и кур на основании анализа уровня межвидового полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК сельскохозяйственных животных и птицы является митохондриальный ген цитохрома Ь.

2. Наименее трудоемким методом выделения ДНК из мясного сырья и готовых продуктов, обеспечивающим высокое качество очистки нуклеиновых кислот и исключающим необходимость измерения концентрации выделенной ДНК, является метод аффинной сорбции ДНК на магнитном силикагеле в присутствии солей гуанидина.

3. Однолокусные тест-системы "BOV ПЦР-ядро", "SUS ПЦР-ядро" и "GUL ПЦР-ядро" для идентификации тканей крупного рогатого скота, свиней и кур, соответственно, а также мультилокусная тест-система "PECUS ПЦР-ядро» для одновременной идентификации тканей трех видов животных обладают 100% специфичностью и имеют предел чувствительности, соответствующий 0,1% тканей анализируемого вида животного в исследуемом материале.

4. Сконструированы положительные, отрицательные, а также универсальный внутренний контроли, позволяющие оценить качество выделенной ДНК и получить информацию о работе всей амплификационной системы с целью предотвращения получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР.

5. Разработана методика количественного определения ДНК животного происхождения, основанная на принципе конкурентной ПЦР, позволяющая оценить размеры выявляемых фальсификатов и дифференцировать умышленно произведенный подлог от технически неизбежной контаминации мясного сырья тканями гетерологичных видов.

6. Экспериментально подтверждены более высокие специфичность и чувствительность ПЦР методов идентификации мясного сырья при различных способах его хранения и технологической обработки, по сравнению с иммунологическими методами.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для практического применения в ветеринарных и научных испытательных лабораториях с целью выявления фальсифицирующих примесей говядины, свинины и курятины в составе мясного сырья и готовых мясных изделий наиболее целесообразно использовать ПЦР-тест-системы "BOV ПЦР-ядро", "SUS ПЦР-ядро" и "GUL ПЦР-ядро", соответственно.

2. При проведении скринингового анализа большого количества мясных проб рекомендуется использовать мул ьтил оку сную ПЦР-тест-систему "PECUS ПЦР-ядро», что позволит одновременно выявлять наличие в измельченном мясном сырье фальсифицирующих примесей говядины, свинины и курятины.

3. Для количественного определения ДНК различных видов животных нами предлагается методика, реализующая принцип конкурентной ПЦР, основанной на коамплификации исследуемой ДНК-матрицы с количественно охарактеризованным внутренним стандартом.

4. При арбитражном исследовании фальсификатов целесообразно использовать ПЦР-тест-системы, с помощью которых можно в течение 2 рабочих дней надежно определить видовое происхождение мясных составляющих мелкоизмельченного сырья или готовых продуктов из него.

164

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Комарова, Ирина Николаевна, 2005 год

1. Акаевский А.И. Анатомия домашних животных. М.: Колос, 1962. - 582 с.

2. Арбитражный процессуальный кодекс РФ: комментарий. М.: АгроНИИТЭИММП, 1992. - 59 с.

3. Арбитражный процессуальный кодекс РФ: комментарий. М.: Юридическая литература, 1994. - 239 с.

4. БатингГ., Контор Ч., Коллинз Ф. Анализ генома. Методы. М.: Мир, 1990. -С.176-190.

5. Боровков М.Ф., Швец О.М., Кириллов А.К. Определение видовой принадлежности мяса животных // Методическое пособие. М.: АМБагро, 1998.-34 с.

6. Бородин КГ. Оценка тенденций развития импорта и экспорта агропродовольственной продукции России со странами дальнего зарубежья // Вопросы статистики, № 11 М., 2001. - С. 24-27.

7. Вальехо-Роман КМ. Гибридизация ДНК / В кн.: Молекулярные основы геносистематики. М.: МГУ, 1980. - С. 85-105.

8. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология, т.25, вып.4. М.: Наука, 1991. С. 926-936.

9. Ветров B.C., Коваленко И.А., Шалушкова Л.П. Переработка и хранение сельскохозяйственной продукции // Мат. общего собрания Академии аграрных наук респ. Беларусь «Аграрная наука на рубеже XXI века». -Минск, 2000. С. 293-298.

10. Губин С.Н. Видовые особенности шейных позвонков мелких жвачных и плотоядных // Ветеринария, № 5. М., 1992. - С. 92.

11. М.Долгов В.А., Светличкин В.В., Доля Е.А., Квятковская А.Ю. К вопросу создания и применения тест-системы на основе генного зондирования в практике ВСЭ // Сбор. науч. тр. «Проблемы ветеринарной санитарии и экологии». М., 1996. - С. 112-119.

12. ХЪ.Езерская Е.Я. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов // Ветеринария, № 6. М., 2001. - С.45.

13. Езерская Е.Я., Галочкин В А. Идентификация видоспецифичных мышечных белков сельскохозяйственных животных и птицы // С/х биология. Серия: биология животных , №6.-М., 1999. С. 3-9.

14. Житенко П.В. Технология продуктов убоя животных. М.: Колос, 1984. -236 с.21 .Журавская Н.К. Исследование и контроль качества мяса // Ветеринария, №8. -М., 1996. С.94-96.

15. Иванова М.М., Лазарев В.Н., Белоусова Р.В., Народницкий Б.С. Современные методы ДНК-диагностики // Лекция. М., 1997. - 20 с.

16. Кабанова Е.М. Определение видовой принадлежности мяса домашних и диких животных // Автореф. дисс. Чебоксары, 1999. - 23 с.

17. Комаров А.А., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н., Шипулин Г.А. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных // Ветеринария, № 3. М., 2000. - С. 59-62.

18. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. М.: Дрофа, - 2004.

19. Лычников Д., Николаева М., Гильмитова И. Идентификация и фальсификация товаров: причины и следствия // Международный сельскохозяйственный журнал, №3.-М., 1993.-С. 61-64.

20. Макаров В.А. Ветеринарно-санитарная экспертиза пищевых продуктов на рынках и в хозяйствах: Справочник. М.: Колос, 1992. - 304 с.

21. Макаров М.Ю. Разработка тест-систем идентификации мяса и мясопродуктов на основе ДНК-диагностики // Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». -Щелково, 2000. С. 388-389.

22. Маккерди Б.Д., Чимера Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами / В кн.: Молекулярная клиническая диагностика. М.: Мир, 1999. - С. 496-506.

23. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1994. - С. 159-172.

24. Методика обнаружения генетически модифицированной ДНК в пищевых продуктах и полуфабрикатах: Инструкция по применению набора реагентов "SILICA М". М.: ООО Компания Биоком, 2004. - 11 с.

25. Методические рекомендации МЗ РФ по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. М., 1995.

26. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев: Штиинца, 1982.-304 с.

27. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов. М.: Экономика, 1996. - С. 84-95.390 качестве и безопасности пищевых продуктов: Федеральный Закон. М., 1999.-41 с.

28. Обухов И.Л. Применение ПЦР в ветеринарии // Аграрная Россия, № 2. М., 2002. С. 62-64.41 .Обухов И.Л., Панин А.Н., Груздев К.Н. Использование ПЦР в практических ветеринарных лабораториях // Ветеринария, № 2. М., 1997. - С.22-27.

29. Панин А.Н., Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н. Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР // Ветеринария, № 7.-М., 1997.-С. 19-21.

30. Платоненкова Л.С., Паничкина Н.А., Рыбакова А.А. Артамошкина О.М. Электрофоретические методы исследования образцов тканей ценных видов рыб и млекопитающих: Метод, реком. М., 2001.

31. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене животных продуктов / Под ред. И.В. Шура. М.: Колос, 1965. - 427 с.

32. Светличкин В.В. Теоретическое обоснование и разработка тест-систем ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля: Автореф. дисс. М., 2002. - 40 с.

33. Сенченко Б.С. Определение видовой принадлежности мяса птицы по особенностям анатомического строения костей скелета // Профилактика и лечение болезней животных, вып. 387 (415). Краснодар, 2001. - С. 158-160.

34. Тарасов С.А. Случаи судебно-ветеринарной экспертизы на мясокомбинате // Ветеринария, № 6. М., 1993. - С. 53-54.

35. Фрумгарц Л.Ф. и др. Получение флуоресцентной меченой ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации // Биоорганическая химия, №11. М., 1986.-С. 1508-1513.

36. Чепурной И.П. Идентфикация и фальсификация продовольственных товаров. М.: Дашков и К°, 2002. - 460 с.

37. Черняева М.Н., Галочкин В.А., Матвеев В.А, Езерская Е.Я. Количественный анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов // Хранение и переработка с/х сырья, №2. М., 2001. - С. 38-43.

38. ЬЪ.Шакирова Т.Ф. Видовые особенности строения осевого скелета домашних птиц// Ветеринария, № 3. -М., 1995. С. 82.

39. Экспертиза пищевых продуктов (нормативные материалы). Пермь, 1992. -304 с.

40. Abdulmamjood A. Identification of ostrich meat by RFLP- analysis of cytochrome b gene // Food science. 2002, v.67, № 5, p. 118-124.

41. Abdulmamjood A. Snail species identification by RFLP-PCR and designing of species-specific oligonucleotide primers // Food science. 2001, v.66, № 9, p. 134141.

42. Allsup T.N. A comparison of the agar gel immuno-diffusion (AGID) and counter-immunoelectrophoresis (CIE) tests for species identification of imported red meat and offal // Meat Sci. 1987, v.20, p. 49 -128.

43. Andrew J. et al. An actin gene-related PCR test for identification of chicken in meat mixtures // Meat Sci. 1999, (353), p.227-231.

44. Beneke В., Hagen M. Applicability of PCR for the detection of animal species in heated meat products // Fleischwirtscaft. 1998, № 78, p.1016-1019.

45. Bickley J., Short J.K., McDowell D.G., Parkes H.C. PCR detection of Listeria monocytogenes in diluted milk and reversal of PCR inhibition caused by calcium ions //Lett. Appl. Microbiol. 1996, № 22, p. 153-158.

46. Burgener M., Hubner P. Mitochondrial DNA enrichment for species identification and evolutionary analysis // Lebensm. Unters. Forsch. 1998, № 207, p. 261-263.

47. Byrne C.E., Downey G., Troy D.J., Buckley D.J. Non-destructive prediction of selected quality attributes of beef by near-infrared reflectance spectroscopy between 750 and 1098 nm // Meat Sci. 1998, v.49, p. 399-409.

48. Callaway AS. et al. High-throughput transgene copy number estimation by competitive PCR // Plant mol. biol. rep. 2002, v.20, p.265-277.

49. Calvo J.H., Zagaroza P., Osta R. Random amplified polymorphic DNA fingerprints for identification of species in poultry pate // Poultry science. 2001, v.80, № 4, p.522-524.

50. Chen F.C., Hsieh Y.H. Detection of pork in heat-processed meat products by monoclonal antibody-based ELISA // J. AOAC Int. 2000, v. 83, p.79-85.

51. Chikuni K. et al. Polymerase chain reaction assay for detection of sheep and goat meats // Meat Sci. 1994, v.37, p.337-345.

52. Cipriano F., Palumbi S.R. Rapid genotyping techniques for identification of species and stock identity in fresh, frozen, cooked and canned whale products // Internet

53. Clydesdale F.M. Critical review // Food science and nutrition. 2001, v.41, p. 413450.

54. Cooper M.G. Species identification of meat product by standard methods / Ed. by Patt.- 1985, v.6,p.l35-141.

55. Cota-Rivas M., Vallejo-Cordoba B.V. Capillary electrophoresis for meat species differentiation // J. Capillary Electrophoresis. 1997, v.4, p. 195-199.

56. Coyne V.E., James M.D., Reid Sh.J., Rybicki E.P. Molecular biology techniques manual: standard PCR protocol. 1994, Юр.

57. Crouse C.A., Schumn J. Investigation of species specificity using nine PCR-based human STR systems // J. of forensic science. 1995, v.40, № 6, p.327-332.

58. De Lomas J.C., Sunzeri F.L., Bush M.P. False-negative results by PCR due to contamination by glove powder // Transfusion. 1992, № 32, p.83-85.

59. Demeulemester С et al. Improved ELISA and dot-blot methods for the detection of whey proteins in meat products // J. of the Sci. of Food and Agricult. 1991, v.56, p. 325-333.

60. Denhardt D.T. A membrane filter technique for the detection of complementery DNA//Biochem. Byophys. Res. Commun. 1966, v.23, p.641-646.

61. Dincer В., Spearow J.L., Cassens R.G., Greaser M.L. The effects of curing and cooking on the detection of species origin of meat products by competitive and indirect ELISA techniques // Meat science. 1987, v.20, p.253-256.

62. Dominguez E., Perez M.D., Puyol P., Calvo M. Use of immunological techniques for detecting species substitution in raw and smoked fish // Food Research and Technology. 1997, v.204, № 4, p. 279-281.

63. Ebbehoj K.F., Thomsen P.D. Differentiation of closely related spesies by DNA hybridisation//Meat Sci.- 1991, v.30, p. 359-366.

64. Ebbehoj K.F., Thomsen P.D. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization // Meat Sci. 1991, v.30, p.221-234.

65. Erdbrugger W. et al. Protein-kinase-C izoenzymes in rat and human cardiovascular tissues // Brit. J. of Pharmacology. 1997, v. 120, № 2, p. 177-186.

66. Erlich H.A. PCR technology. Stockton Press, N.Y. - 1989.

67. Espinoza E.O., Kirms M.A., Filipek M.S. Identification and quantitation of source from hemoglobin of blood and blood mixtures by high-performance liquid chromotography// J. Forensic Sci. 1996, v. 41, p.804-811.

68. Fair brother K.S. Meat speciation by restriction fragment length polymorphism analysis using an a-actin cDNA probe // Meat Sci. 1998, v.50, № 1, p.105-114.

69. Fei S. et al. Species identification of meats and meat products by PCR // Anim. Sc. Technol. 1996, v.67, № 10, p.900-905.

70. Griffiths N.M., Billington M.J. The use of an ELISA procedure for the determination of meat in compound meat products // J. of the Sci. of Food and Agricult. 1984, v.35, p. 909-914.

71. Hamm R. Heating of muscle systems / In The Physiology and Bio-chemistry of Muscle As a Food / Ed. by E.J. Briskey, R.G. Cassens, J.C. Trautman, 1st ed. -Univ. of Wisconsin Press, Madison, WI, 1966.- p. 363.

72. Hargin K. Survey of misdescription of tuna species in tuna products // Information sheet — 2000, № 1.

73. Hashimoto Y., Yasui T. Researches on the detection of meat by serological test //J. of Faculty Agricult. Hokkaido. 1957, v.50, p. 171.

74. Haurowitz F. The internal structure of protein molecules // Experentia. 1949, v.9, p. 347.

75. Haurowitz F. The nature of protein molecule: Problems of protein structure // J. of Cell Сотр. Physiol. 1956, v.47 (Suppl. 1), p.l.

76. Hayashi K. Mannpulation of DNA by PCR / In PCR the Polimerase chain reaction / Ed. by Mullis et al. - 1994, p.3-14.

77. Hayden A.R. Determination of residual species serum albumin in adulterated ground beef// J. of Food Sci. 1978, v.43, p. 476-478.

78. Hayden A.R. Use of antisera to heat-stable antigens of adrenals for species identification in thoroughly cooked beef sausages // J. Food Sci. 1981, v.46, p. 1810-1813.

79. Helm M.B., Warnecke M.O., Saffle R.L. Gamma globulin isolated from rabbit antiserum for rapid detection of meat adulteration // J. of Food Sci. 1971, v.36, p.998-1000.

80. Herman L. Determination of the animal origin of row food by species-specific PCR//J. of dairy research.-2001, v. 68, №3, p. 429-236.

81. Hiernert H.H., Klinger A. Species-specific protein differentiation. Determination of species by polyacrylamide gel electrophoresis // Fleischwirtschhaft. 1978, b.58, № 9, s.1490-1491.

82. Higuchi R„ Fockler C.f Dollinger G„ Watson R. Kinetic PCR analysis: Realtime monitoring of DNA amplification reactions // BioTechnol. 1993, v.ll, p. 1026-1030.

83. Hitchcock C.H.S. et al. Determination of soya proteins in food using an ELISA procedure // J. of the Sci. of Food and Agricult. 1981, v.32, p. 157-165.

84. Hitchcock C.H.S. Opportunities and Incentives for developing food immunoassays //J. of Food Sci. 1988, v.10, p. 3-16.

85. Hofmann K., Muller E., Fischer K. Detection of animal meals in feedstuffs // Fleischwirtschaft. 1999, у.19, № 10, p.92-95.

86. Hopwood A.J. at al. An actin gene-related PCR test for identification of chicken in meat mixtures // Meat Sci. 1999, v.53, № 4, p.227-231.

87. Hsiesh Y.H.P., Johnson M.A., Wetzstein C.J., Green N.R. Detection of species adulteration in pork products using agar-gel immunodiffusion and ELISA // J. of Food Quality. 1996, v.19, p. 1-13.

88. Hunt D.J., Parkes H.C., Lumley I.D. Identification of the species of origin of raw and cooked meat products using oligonucleotide probes // Food chemistry. -1997, №60, p.437-442.

89. Hunt D.J., Parkes H.C., Lumley I.D. Identification of the species of origin of raw and cooked meat products using oligonucleotide probes // Food Chem. 1997, v.60, p. 437-442.

90. Innis M.A. et al. Optimization of PCRs / In PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, California, 1990. p. 16-21.

91. Inoue H.I. et al. Species identification of blood and bloodstains by high-performance liquid chromatography // Int. J. Legal Med. 1990, v. 104, p.9-12.

92. Isigidi C. A PCR-based test for species-specific determination of heat treatment conditions of animal meals as an effective prophylactic method for bovine spongioform encephalopathy // Meat Sci. 2001, v.57, № 1, p.35-41.

93. Janssen F.W., Voortman G., Gaaij J.A. Detection of wheat gluten, whey protein, casein, ovalbumin, and soy protein in heated products by electrophoresis, blotting, and immunoperoxidase staining // J. of Agricult. and Food Chem. 1987, v.35, p. 563-567.

94. Jobes C. et al. Evolution and recombinantion of the bovine DNA repeats // J. Mol. Ev. 1995, v.41, p. 277-283.

95. Jones S.J., Patterson R.L.S. A modified indirect ELISA procedure for raw meat speciation using crude anti-species antisera and stabilized immunoreagents // J. of the Sci. of Food and Agricult. 1986, v.37, p.767-775.

96. Jones S.J., Patterson R.L.S. Recent developments in meat speciation // J. of Food Sci. 1988, v.10, p. 121-126.

97. Kang'ethe E.K., Jones S.J., Patterson R.L.S. Identification of the species origin of fresh meat using an ELISA procedure // Meat Science. 1982, v.7, p. 229-240.

98. Karpas A.B., Myers W.L., Serge D. Serological identification of species of origin of sausage meats // J. of Food Sci. 1970, v.36, p. 150.

99. Kauzmann W. Structural factors in protein denaturation // J. of Cell Сотр. Physiol. 1956, v.47 (Suppl. 1), p.l 13.

100. Kim H., Shelef LA. Characterization and identification of raw beef, pork, chicken and turkey meats by electrophoretic patterns of their sarcoplasmic proteins // J. Food Sci. 1986, v.51, p. 731 -741.

101. Kitchin PA., Szotyori Z., Fromholc C., Almond N. Avoidance of false positives // Nature. 1990, v.344, № 6263, p.201.

102. Kocher T.D. et al. Dynamies of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers // Proceedings national academy of sciences USA. 1989, v.86, p.6196-6200.

103. LaddE.F. Adulterated food products // Bulletin № 63. Fargo, U.S.A. - 1904. -534 p.

104. Lee J.C., Chang G. Random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD PCR) fingerprints in forensic species identification // Forensic science. 1994, v.67, p.103-107.

105. Lenstra J.A., Buntjer J.B., Janssen F.W. On the origin of meat DNA techniques for identification in meat products // Vet science tomorrow. — 2001, № 2.

106. Lockley A.K., Bardsley R.G. DNA-based method for food authentication // Food science and technology. 2000, v.l 1, № 2, p.67-77.

107. Lockley A.K., Jones C.G., Bruce J.S., Franclin S.J., Bardsley R.G. Colorimetric detection of immobilised PCR products generated on a solid support // Nucleic acids research. 1997, № 25, p.1313-1314.

108. Lumley I.D., Patel I., Stanley C.J. Studies on the specificity of some commercially available antisera used in the analysis of meat products // J. of Food Sci.- 1988, v.10, p. 285-288.

109. Macedo-Silva A. Hamburger meat identification by dot-ELISA // Meat Sci. -2000, v.56, № 2, p.189-192.

110. Manz J. Detecting heat-denatured muscle proteins by means of ELISA: determining kangaroo muscle proteins // Fleeschwirtschaft. 1983, v.63, p. 1767.

111. Manz J. Detecting heat-denatured muscle proteins by means of ELISA: // Fleeschwirtschaft. 1985, v.65, p.497-499.

112. Matsunaga T. et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay // Meat Sci. 1999, № 51, p.143-148.

113. Meyer R., Candrian U., Luthy J. Detection of pork in heated meat products by the PCR // J. Assoc. of Anal. Chem. 1994, № 77, p.617-622.

114. Meyer R., Hofflein C., Luthy J., Candrian U. PCR-RFLP analysis: a simple method for species identification in food // J. of AOAC international. 1995, v.78, №6, p. 1542-1551.

115. Milgrom F., Witebsky E. Immunological studies on adrenal glands // Immunol. 1962., v.5, p.46.

116. Mondini S., Calocchio E., Altissimi M.S., Haouet M.N., Cenci T. Reliability of the microscopic analysis for the animal species' identification of meat meals // La Selezione Veterinaria. 1999, № 7, p.453-463.

117. Monin G. Recent methods for predicting quality of whole meat // Meat Sci. -1999, v.49, p. 231-243.

118. Montiel-Sosa J.F. Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mt-DNA // J. of agricultural and food chemistry. 2000, v. 48, № 7, p.2829-2892.

119. Munson K., Haefele R., Taylor P. Competitive PCR on the "Wave" nucleic acid fragment analysis system // Application Note. 2000, p. 1-4.

120. Murray B.W., McClymont R.A., Strobeck C. Forensic identification of ungulate species using restriction digests of PCR-amplified mitochondrial DNA // J. of forensic science. 1995, v.40, p.943-951.

121. Nakajima H. et al. Degradation of a PCR product by a heatstable deoxyribonuclease (Dnase) produced from Yersinia enterocolitica II Microbiol. Immunol. 1994, № 38, p.153-156.

122. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997, v.25, p. 2516-2521.

123. Patterson R., Jones S. Species identification in heat processed products // Proceedings of the Congress of Meat Sci. and Technology. 1989, № 35, p.529-536.

124. Persing D.H. et al. Target selection and optimization of amplification reaction / In: Diagnostic molecular microbiology. ASM, 1993. - p.88-102.

125. Pyz-Lukasik R. Metody identyfikacji gatunkowej miesa // Medycyna weterynarjna. 1998, № 11, p.732-736.

126. Quintero J. et al. Use of mtDNA direct PCR sequencing and PCR-restriction fragment length polymorphism methodologies in species identification of canned tuna // J. of agricultural and food chemistry. 1998, v.46, № 4, p. 1662-1669.

127. Rehbein H. et al. Application of PCR SSCP to species identification of fishery products // J. of the science of food and agriculture. - 1997, v.74, № 1, p.35-41.

128. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O.F. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA extraction solutions // Int. J. Food Microbiol. 1992, № 17, p.37-45.

129. Rust S., Funke H., Assman G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR) a highly specific one-step procedure for easy mutation detection // Nucleic acids research. - 1993, № 21, p.3623-3629.

130. Schwagele F. Validation of immunological and gentechnical methods // Fleischwirtschaft. 2001, v.81, № 2, p.78-81.

131. Seibel P. et al. A method for quantitative analysis of deleted mitochondrial DNA by PCR in small tissue samples // Methods of molecular cell biology. 1991, №2, p. 147-153.

132. Shericar A.T., Khot J.B., Jayarao B.M., Pillai S.R. Identification of origin of meat using commercially available antisera // J. of Indian veter. med. 1987, v.l 1, № 1, p. 1-7.

133. Shu-Chu S. et al. Application of capillary alectrophoresis for identification of the authenticity of bird's nests // Food Drug Anal. 1998, v.6, p. 455-464.

134. Singer D.S., Parent L.J., Ehrlich R. Identification and DNA sequence of an interspersed repetitive DNA element in the genome of miniature swine // Nucleic acids res. 1987, v.15, p.2780.

135. Skarpeid H.J., Kvaal K., Hildrum K.I. Identification of animal species in ground meat mixtures by multivariate analysis of isoelectric focusing protein profiles // Electrophoresis. 1998, v. 19, p.3103-3109.

136. Straub J.A., Hertel C., Hammes W.P. Limits of a PCR-based detection method for genetically modifies soya beans in wheat bread production // Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1999, № 208, p.77-82.

137. Sun Y.L., Lin C.S. Establishment and application of a fluorescent PCR-RFLP method for identifying porcine, caprine and bovine meats // J. of agricultural food chemistry. 2003, v. 51, № 7, p. 1771-1776.

138. Tajima К et al. PCR detection of DNAs of animal origin in feed by primers based on sequences of short and long interspersed repetitive elements // Bioscience of biotechnological biochemistry. 2002, v.66, p.2247-2250.

139. Takara Sh. Competitive PCR guid // Takara Shuzo Co. Ltd., p.1-12

140. Tartaglia M. et al. Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds: a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials // J. of food protection. 1998, v.61, p.513-518.

141. Taylor A., Ponce-Alquicira E., Linforth R. Electrospray mass spectrometry // Food Sci. and Technol. Today. 1993, v.7, № 4, p. 225-228.

142. Tseng S.Y. et al. An homogeneous fluorescence polymerase chain reaction assay to identify Salmonella II Anal. Biochem. 1997, v.245, p. 207-212.

143. Unseld M, Beyermann В., Brandt P., Hiesel R. Identification of the species of origin of highly processed meat products by mitochondrial DNA sequences // PCR methods and applications. 1995, № 4, p.241-243.

144. Walker J .A. et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification // Analytical biochemistry 2003, № 316, p.259-269.

145. Wang A.M., Doyle M. V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the PCR // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989, v.86, p. 9717-9721.

146. Wang J., Xu В., Wang В., Wang S. Detection of bovine-derived materials in import animal feed and food by PCR assay // Wei sheng yan jiu. 2003, v.32, № 1, p. 26-29.

147. WATT poultry statistical yearbook. 1999, v.38, № 9.

148. Whittaker R.G., Spenser T.L., Copland J.W. An ELISA assay for species identification of raw meat // J. of the Sci. of Food and Agricult. 1983, v.34, p. 1143-1148.

149. Wilkinson D.T. Prime and shine while saving time intergen's Amplifluor™ allows direct detection of PCR products // Scientist. 1999, v. 13, p. 16.

150. Wintero A.K., Thomsen P.D., Davies W. A comparison of DNA-hybridization, immunodiffusion, countercurrent immunoelectrophoresis and isoelectric focusing for detecting the admixture of pork to beef// Meat Sci. 1990, v.21, № 1, p.75-85.

151. Wittwer C.T. et al. "The LightCycler™ " a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control // Biotechniques. 1997, v.22, p. 176181.

152. Wolf C., Luthy J. Quantitative competitive (QC) PCR for quantification of porcine DNA //Meat Sci. -2001, v.51, № 2, p. 161-168.

153. Yasue H., Wada Y. A swine SINE (PRE-1 sequence) distribution in swine-related animal species and its phylogenetic analysis in swine genome // Anim. genet. 1996, v.27, p.95-98.

154. Zimmermann K., Mannhalter J. W. Technical aspects of quantitative competitive PCR // Biotechniques. 1996, v.21, p.268.1. УТВЕРЖДАЮ1. АКТ25 октября 2004 г.г. Москва

155. С помощью ПЦР-тест-систем "BOV ПЦР-ядро", "SUS ПЦР-ядро" и "GUL ПЦР-ядро" проводили исследования 4 проб измельченного мясного сырья, поступившего из испытательного центра «Биотест» Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

156. Мясо поступило в кусках массой 250-400 г в изрезанном виде с температурой 0-4°С. Отдельные куски имели розовый цвет, один из них выделялся не только цветом, но и по консистенции.

157. МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

158. МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛ

159. Кафедра ветеринарно-санитарной эк<

160. ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ «BOV-ПЦР ЯДРО", "SUS-ПЦР ЯДРО"!! "GUL-ПЦР ЯДРО" ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МЯСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СВИНЕЙ И КУР МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

161. Методические рекомендации для самостоятельной работы студентов специальности 310800-Ветеринария и 310500 — Ветерннарно-санитарнаяэкспертиза1. Москва 2005

162. МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

163. МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

164. Кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы

165. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЯСНОГО СЫРЬЯ И ГОТОВЫХ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

166. Методические указания для самостоятельной работы студентов специальности 310800 — Ветеринария и 310500 ~ Ветеринарно-санитарнаяэкспертиза1. Москва 2005