Разработка ПЦР-тест-систем для идентификации парвовируса и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Козлова, Александра Дмитриевна

• Козлова, Александра Дмитриевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Козлова, Александра Дмитриевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Парвовнрусная инфекция свиней (ПВИС)

1.1 Клинические признаки

1.2 Пути передачи

1.3 Патогенез

1.4 Характеристика возбудителя

Классификация

Морфология и геном вируса

Устойчивость

Антигенная вариабельность

Патогенность

1.5 Диагностика ПВИС

2. Реп роду ктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)

2.1 Клинические признаки

2.2 Пути передачи

2.3 Патогенез

2.4 Характеристика возбудителя

Классификация

Морфология и химический состав

Устойчивость

Организация генома РРСС

Генетическая вариабельность вируса РРСС

2.5 Диагностика РРСС

3. Заключение по обзору литературы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

4.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

4.2. Биологический материал, использованный в работе

4.3. Проведение ПЦР-анализа

4.3.1. Экстракция НК методом осаждения изопропанолом

4.3.2. Экстракция НК наборами Qiagen

4.3.3. Проведение ПЦР (ПВС) и ОТ-ПЦР (вирус РРСС)

4.4. Клонирование ДНК и кДНК в плазмиду pGEM-t

4.5. Клонирование ДНК в фаг A,gtl0

4.6. Очистка продуктов ПЦР

4.7. Секвенирование

4.8. Проведение филогенетического анализа

Результаты исследований

5. Разработка тест-системы для выявления ДНК парвовируса свиней

5.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции ДНК ПВС

5.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов

5.3. Подбор оптимальных условий амплификации

5.4. Введение контрольных образцов

5.5. Анализ чувствительности тест-системы

6. Разработка тест-снстемы для выявления и генотипнрования вируса репродуктивно-респнраторного синдрома свиней

6.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции РНК вируса РРСС

6.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов

6.3. Подбор оптимальных условий амплификации

6.4. Введение контрольных образцов

6.5. Анализ чувствительности тест-системы

7. Выбор метода экстракции нуклеиновых кислот

7.1. Подбор условий экстракции НК из спермы с использованием метода осаждения изопропанолом

7.2. Использование наборов <31а§еп

8. Исследование вакцин против РРСС

9. Исследование биологического материала от свиней

9.1. Обнаружение образцов, содержащих ДНК ПВС

9.2. Обнаружение образцов, содержащих РЖ вируса РРСС

9.3. Расследование вспышек, вызванных вирусом РРСС

9.4. Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса РРСС

9.5. Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в 2009-2013гг

9.6. Анализ образцов на наличие смешанных инфекций

10. Проведение комиссионных испытаний

11. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления ДНК ПВС

11.1. Сравнение с набором реагентов №1 (производство Россия)

11.2. Сравнение с набором реагентов №2 (производство Россия)

12. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления РНК вируса РРСС

12.1. Сравнение с наборами реагентов №1 и №2 (производство Россия)

12.2. Сравнение с набором реагентов №3 (производство Россия)

12.3. Сравнение с набором реагентов №4 (производство Франция)

ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

BHQ Black Hole Quencher

FRT Fluorescent Real-Time

LAMP loop-mediated isothermal amplification

National Center for Biotechnology Information - Национальный

NCBI

центр биотехнологической информации

ORF open reading frame (открытая рамка считывания) loop-mediated isothermal amplification с обратной

OT-LAMP

транскрипцией

РАМ porcine alveolar macrophages

PBS phosphate buffer solution

PPV porcine parvovirus

PRSSV porcine reproductive and respiratory syndrome virus

RFLP restriction fragment length polymorphism

TaqF Thermus aquaticus

BKO внутренний контрольный образец

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат

ИФА иммуноферментный анализ

кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

К+ положительный контрольный образец

К- отрицательный контрольный образец этапа амплификации

коп/мл количество копий НК в мл

КК культура клеток

НК нуклеиновые кислоты

н.п. нуклеотидных пар

ОКО отрицательный контрольный образец этапа экстракции НК

ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПВС парвовирус свиней

ПВИС парвовирусная инфекция свиней

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

РРСС репродуктивно-респираторный синдром свиней

РТГА реакция торможения гемагглютинации

РГА реакция гемагглютинации

ТЕ-буфер буфер на основе Триса и ЭДТА

ЦПД цитопатическое действие

шт. штамм

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка ПЦР-тест-систем для идентификации парвовируса и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней»

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность темы.

Парвовирус свиней (ПВС) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома (РРСС) являются вирусными этиологическими агентами репродуктивных патологий свиноматок, которые широко распространены в мире.

Так по данным Ковалишина В.Ф. среди импортируемого поголовья репродуктивная патология в 28% случаев вызвана вирусом РРСС (наиболее распространенный вирусный этиологический агент) и в 4% — парвовирусом, в случае респираторной патологии вирус РРСС является этиологическим агентом в 60% случаев и уступает по распространенности только цирковирусу 2 типа [3].

ПВС и РРСС характеризуются следующими нарушениями: абортами, рождением мертвых, мумифицированных и нежизнеспособных поросят [12, 54, 55, 104]. Также возможно коинфицирование животного вирусом РРСС и ПВС [1].

Парвовирусная инфекция и РРСС могут протекать в виде бессимптомного носительства. При этом животные-вирусоносители выделяют вирус в окружающую среду и являются источниками заражения здоровых животных. Поэтому для эффективной диагностики этих заболеваний необходимо использование современных методов лабораторной диагностики.

Классическим методом диагностики вирусных болезней является выделение вируса на культуре клеток, однако, этот метод длительный, дорогостоящий и трудоемкий. В РФ широко применяются ИФА и РТГА для обнаружения специфических антител. Данные методы не позволяют дифференцировать поствакцинальные антитела от постинфекционных, выявлять вирусоносителей при обследовании вакцинированного поголовья и исследовать сперму. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющий

выявлять вирусный геном даже при низкой вирусной нагрузке в любом биологическом материале.

Важной задачей является своевременное выявление ПВС, который может длительное время персистировать в стаде и проявляться только у супоросных свиноматок, не имеющих иммунитета к данному возбудителю.

Таким образом, разработка диагностикумов для выявления ПВС и вируса РРСС являются актуальными направлениям ветеринарной диагностики.

2. Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлась разработка тест-систем для выявления ДНК парвовируса свиней и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реальном времени».

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать праймеры и зонды, оптимизировать условия ПЦР для обнаружения НК парвовируса свиней и вируса РРСС, создать рекомбинантные положительные контроли.

2. Определить аналитическую специфичность и чувствительность тест-систем.

3. Провести комиссионные испытания, утвердить нормативную документацию и внедрить в лабораторную практику тест-системы для выявления парвовируса свиней и генотипирования вируса РРСС.

4. Идентифицировать ПВС и провести филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ.

3. Научная новизна работы.

Сконструированы оригинальные праймеры и зонды для амплификации и детекции ДНК ПВС и генотипирования РРСС.

Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью -5x10" коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5x10 коп/мл в сперме.

Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью -103 коп/мл РНК

вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5x103 коп/мл в сперме.

При проведении филогенетического анализа установлено, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов, отличаются от вакцинных штаммов и относятся к первому и второму субтипам европейского генотипа вируса.

В результате секвенирования показано, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из свинокомплексов отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики данной болезни на территории нашей страны.

4. Практическая значимость работы.

Разработана нормативная документация по применению следующих тест-систем: 1) «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней; 2) «РРСС» для выявления и генотипирования вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции.

ПЦР-тест-система «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в «реальном времени» внедрена в ветеринарную практику с 2010 года, тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС - с 2013 года. Рекламаций на данные тест-системы не поступало.

При проведении сравнительного анализа ПЦР-наборов, применяемых на территории РФ, установлено, что разработанная тест-система «ПВС»

имеет в 100 раз большую чувствительность, чем тест-система №1 и в 10 раз, чем тест-система №2. Показано, что только тест-система «РРСС» в образцах из 16-ти неблагополучных свинокомплексов выявляла вирус РРСС в отличие от тест-систем №1, №2 и имела чувствительность в 10 раз выше, чем наборы реагентов №3 и №4 в 4-х пробах патматериала.

5. Основные положения, выносимые на защиту Разработанная тест-система для выявления ДНК парвовируса свиней

методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» обладает 100% специфичностью и выявляет 5x102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних

о

органов и 5x10 коп/мл в сперме.

Разработанная тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС обладает 100% специфичностью и выявляет 103 коп/мл РНК вируса РРСС в

л

крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5x10 коп/мл в сперме.

Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в 2009-2013гг.

Сравнительный анализ чувствительности и специфичности тест-систем, применяемых в отечественной ветеринарной практике.

6. Публикации.

По результатам работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендуемых ВАК (1 статья в печати).

7. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение собственных

исследований, выводы. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 151 источник, в том числе 144 иностранных.

8. Апробация результатов работы

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГБУ «ВГНКИ» (2010-2013 гг.), научных семинарах ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (2010-2013гг.). Основные материалы диссертации были опубликованы и доложены на:

- III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010г.);

- VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010г.);

- 11-й молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011г.);

- международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011г.);

- VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014» (Москва, 2014г.).

9. Личный вклад соискателя

Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора.

Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации и техническую поддержку сотрудникам ФГБУ

ВГНКИ: к.б.н. Яцентюк С.П.; ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии: к.б.н. Астаховой Т.С., к.б.н. Кулешову К.В.; сотрудникам института медицины труда: Войцеховской Я.А.; Браславской С.И.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС)

1.1 Клинические признаки

Парвовирусная инфекция свиней в большинстве случаев протекает бессимптомно [80, 81, 82]. Клиническая картина развивается в основном у серонегативных свиноматок и зависит от срока супоросности.

Заражение до 36 дня супоросности приводит к прохолостам, рассасыванию эмбрионов и возврату в охоту [92]. При заражении свиноматок на 40 - 70 день супоросности, после кальцификации скелета плодов, наблюдаются мумификация, мертворождения: возможны аборты [84, 104]. После 70 дня супоросности плоды становятся иммунокомпетентными [84], и, несмотря на трансплацентарное заражение гибели плодов не наблюдается [137, 12]. Однако есть данные, что высокопатогенные штаммы (например, шт. Kresse) могут вызывать гибель даже у иммунокомпетентных плодов [148].

Поскольку передача вируса от плода к плоду происходит довольно медленно (в течение 10-14 дней) [99], то в одном помете могут быть как мумифицированные, мертворожденные, живые слабые так и совершенно здоровые поросята [9, 12, 104, 112].

В стабильно неблагополучных хозяйствах заболевание проявляется чаще у ремонтных свинок (осеменение заканчивается безрезультатно). У основных свиноматок (иммунные) беременность протекает нормально. В первично инфицированных хозяйствах нарушение воспроизводительной функции отмечают как у ремонтных, так и у основных свиноматок. При этом оплодотворяемость маток снижается и составляет 25-37%, а мертворождаемость возрастает до 100% [4].

У животных других возрастных групп парвовирусная инфекция обычно протекает бессимптомно [80, 81, 82]. В редких случаях ПВС может быть

12

этиологическим агентом диарей [110, 74], кожных поражений [89, 109, 114, 148], инфекционных негнойных миокардитов [37, 105].

1.2 Пути передачи

От инфицированных животных вирус выделяется с абортированными и мумифицированными плодами, последом, плацентой, носовыми и вагинальными выделениями, слюной, фекалиями, мочой и спермой [7, 141, 147].

Заражение происходит при алиментарном и аэрогенном попадании вируса в организм животного. Передача вируса от матери потомству происходит трансплацентарно [136, 98]. Кроме того распространенным является половой путь заражения, при осеменении инфицированными хряками или инфицированной спермой [84, 92]. Также возможно распространение вируса через кровь при массовых обработках животных (кастрация, вакцинация и др.)

1.3 Патогенез

При оральном заражении виремия наблюдается на 3-10 день, в то время как после внутримышечного заражения вирус в крови обнаруживается уже на 1-6 день [136, 84]. На 23-30 день после орального заражения свиноматок вирус проникает через плаценту в плод [84]. Размножение вируса происходит во всех органах и тканях организма в клетках лимфоидной системы.

Вирус проникает в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза или макропиноцитоза после связывания с сиаловой кислотой на поверхности мембраны [17]. Размножение ПВС происходит в Т- и B-лимфоцитах, в то время как в макрофаги и моноциты вирус проникает, но не реплицируется [118]. Для репликации вируса клетки должны находиться в S-фазе митоза, когда активны клеточные полимеразы [118].

При отсутствии условий, способствующих репликации вируса, он может находиться в цитоплазме клеток до 21 дня (время наблюдения в эксперименте) [118].

Вирус выделяется с фекалиями в течение 10 дней после заражения [147], виремия наблюдается на 3-10 день [136]. ПВС обнаруживается у поросят в лимфатических узлах в течение 28 недель, в легких в течение 6 недель после внутриутробного инфицирования [67].

1.4 Характеристика возбудителя

Классификация

Парвовирус свиней представитель рода Parvovirus, подсемейства Parvovirinae, семейства Parvoviridae.

Семейство Parvoviridae включает подсемейство Parvovirinae, в которое входят роды Parvovirus, Erythrovirus, Dependovirus, Amdovirus, Bocavirus и подсемейство Densovirinae, в которое входят роды Densovirus Iteravirus, Brevidensovirus, Pefudensovirus и неклассифицированные виды подсемейства [70].

Наибольшее значение для ветеринарии имеет род Parvovirus, представителями которого являются парвовирусы собак, кошек, норок, крыс, кроликов, кур, гусей, крупного рогатого скота, свиней [98].

Морфология и геном вируса

Зрелые вирионы парвовируса свиней - мелкие, около 20-28 нм в диаметре [102] частицы кубической симметрии [27, 24] не имеющие оболочки и липидов с молекулярной массой 5,3х106 Да [27, 7].

Геном представлен одноцепочечной молекулой ДНК длиной около 5000 нуклеотидов [123], кодирующей 4 основных белка: 3 капсидных (VP1, VP2, VP3) и один неструктурный (NS) белок. В вирионы упаковывается только отрицательная (геномная) цепь [123, 14].

Геном содержит два промотора (две открытые рамки считывания ORF). Промотор Р4 инициирует экспрессию неструктурных белков (NSI, NS2 и возможно, NS3), которые участвуют в ряде репликативных функций. Промотор Р40 вовлечен в экспрессию структурных белков VP1, VP2 и VP3 [13, 123].

Ранее сообщалось, что левая рамка считывания кодирует только один неструктурный белок (NS1) с мол. массой 84 кДа [101, 123]. Белок NS1 впервые был выявлен как иммунопреципитирующий продукт в ПВС-инфицированных клеточных лизатах, но не обнаруживался в самих вирионах [101]. Белок NS1 появляется в инфицированных клетках в начале синтеза вирусной ДНК и, вероятно, необходимым для репликации вирусной ДНК [101]. Позже было показано, что в результате транскрипции гена NS получаются 3 продукта. Транскрипт длиной 4,7 kb не подвергается сплайсингу и кодирует белок NS1 с мол. массой 75,5кДа. Два другие транстрипта подвергаются сплайсингу до 3,3 kb (кодирует белок NS2 с мол. массой 18,1 кДа) и до 2,9 kb (кодирует белок NS3 с мол. массой 12,4 кДа) [14].

Последовательность ДНК, кодирующая неструктурные белки, высоко консервативна у всех парвовирусов [123]. Правая рамка считывания парвовируса свиней кодирует 3 структурных белка - VP1, VP2, VP3 с молекулярными массами 83000, 64000 и 60000 соответственно [102], хотя у большинства парвовирусов есть только 2 капсидных белка. В 2012 году появлялась информация о штамме ПВС, также содержащем только 2 капсидных белка VP1 и VP2 и не имеющим белка VP3 [25].

Белок VP1 участвует в связывании вирусной ДНК с ДНК хозяина для стабилизации вирусной одноцепочечной ДНК и начала репликации [145]. Также VP1 принимает участие в упаковке вирусного генома [145] и может вызывать выработку антител [144].

Белок VP2 является основной антигенной областью, на которую вырабатываются антитела, и которая играет важную роль в диагностике и иммунопрофилактике парвовирусной инфекции [131, 149].

Белок VP3 образуется в результате протеолитического расщепления белка VP2 [102, 123].

Устойчивость

Парвовирус свиней устойчив к действию различных физических и химических факторов. Сохраняет инфекционность при pH от 3 до 9 и 37°С в течение 3 часов, но полностью инактивируется при pH 2 в тех же условиях. Выдерживает нагревание 37°С в течение недели, при 56°С - 2 суток, при 70°С - 2 часа, при 80°С инактивируется за 5 мин [27].

Обработка вируса 20% этанолом в течение 18 часов при 4°С не снижает его инфекционности. Не наблюдалось снижения гемагглютинирующей активности при хранении вируса в течение 6 месяцев при -20С [27].

Инактивируется 3% гипохлоритом натрия и 5% гидроксидом натрия при комнатной температуре за 5 минут [22].

Антигенная вариабельность

На нуклеотидном уровне ПВС отличается от парвовирусов других животных, но по антигенным свойствам парвовирусы почти всех животных идентичны [98]. Белковые последовательности парвовируса свиней имеют высокую гомологию с парвовирусами собак, кошек и крыс [123].

ПВС агглютинирует эритроциты человека, обезьяны, морской свинки, кошки, цыпленка, крысы и мыши, но не агглютинирует эритроциты перепела, овцы и теленка [27,138].

С 2009г. появляется информация, что различные изоляты парвовируса свиней могут генетически и антигенно различаться. Через 35 дней после вакцинации штаммами парвовируса генотипа 1 (шт. IDT и шт. Stendal), свиней заражали высокопатогенным штаммом парвовируса генотипа 2 (шт.

PPV-27a). В результате было показано, что после заражения наблюдались более высокие титры антител, чем после вакцинации, и выделялась вирусная ДНК из плодов инфицированных свиноматок [147]. Из этого были сделаны выводы, что вакцинация от парвовируса штаммами генотипа 1 не защищает от инфицирования и последующего вирусовыделения при заражении генотипом 2.

Патогенность

Парвовирус свиней различается по патогенности между изолятами. Выделяют четыре группы штаммов:

виремию, не пересекают плацентарный барьер [117];

2. вирулентные (шт. NADL-8, IAF-76) - вызывают виремию, пересекают плацентарный барьер и поражают плоды, не достигшие иммунокомпетентности [97];

3. высоковирулентные (шт. Kresse, IAF-A54) - способны убивать иммунокомпетентные плоды [114], ассоциированы с дерматитами [109];

4. штаммы, ассоциированные с энтеритами (IAF-A83) [110]. Штаммы NADL-8 и Kresse имеют различную тропность [108]. Так шт.

Kresse проявляет большую тропность к тканям мозга и селезенки, чем шт. NADL-8. При этом непатогенные штаммы (NADL-2) отличаются от патогенных (шт. Kresse) единичными заменами в капсидном гене VP1/VP2 [13].

1.5 Диагностика ПВИС

ГПЖС шничеш тпдап v инфи/даодада впдаые

i -»¿i

супоросных свиноматок и в большинстве случаев протекает бессимптомно у всех остальных групп животных. В связи с этим, лабораторные исследования играют решающую роль при постановке диагноза й выявлении инфицированных животных.

В лабораторной практике применяются вирусологические (выделение вируса на КК), серологические (выявление вирусного антигена или антител) и молекулярно-генетические методы. Каждый метод имеет свои

преимущества и недостатки.

Метод выделения вируса на культуре клеток позволяет с большой

долей достоверности сказать, какой вирус вызвал заболевание, но довольно

длителен, трудоемок и имеет ряд существенных ограничений. Для выделения парвовируса свиней используют первичные и вторичные культуры клеток

почки плодов свиньи (8К, РК-15), также используются культуры клеток из

фаллопиевых труб и семенников (РТ, РРТ) [13, 60, 63]. Для улучшения

репликации вируса клетки должны находиться в Б фазе (фаза синтеза ДНК),

т.к. на этом этапе клеточного цикла происходит синтез клеточных ДНК-

полимераз [118, 27]. При размножении вируса в культуре клеток он вызывает

цитопатическое действие (ЦПД) [60, 27, 138]: округление клеток, пикноз и

лизис клеток [98], а также появление внутриядерных телец-включений [60,

27]. Однако ЦПД не может использоваться для идентификации вируса и

определения его титра. Для данных целей применяют различные методы

окрашивания [27] или используют иммунофлуоресцентную микроскопию

для наблюдения за развитием ПВС в КК [93].

Для выделения вируса на культуре клеток используют внутренние органы больных животных (легкие, сердце, паховые лимфатические узлы, миндалины, тимус, селезенку, тонкий кишечник, печень, почки и поджелудочную железу), сыворотку крови, вагинальные смывы [27, 85, 84]. Лучше всего вирус выделяется из легких, лимфатических узлов, миндалин, тимуса и селезенки [85]. Выделить парвовирус из погибших и мумифицированных плодов удается не всегда, т. к. инфекционность вируса медленно, но неизбежно снижается после гибели плода [97]. Также к недостаткам метода можно отнести сложности получения первичной КК не инфицированной ПВС [7], длительность, трудоемкость и высокую стоимость анализа [84].

В связи со всем вышеизложенным выделение ПВС на КК редко используется для рутинной диагностики. В лабораторной практике для диагностики ПВС используют обнаружение вирусных антигенов (в реакциях гемагглютинации и нейтрализации) или антител (в реакции торможения гемагглютинации и методом ИФА), а также выявление вирусного генома методом ПЦР [2].

РГА является распространенным методом лабораторной диагностики в нашей стране. Метод применятся для выявления вирусного антигена в сыворотке крови и внутренних органах свиноматок, поросят и абортированных плодов длиной менее 16 см, т.е. инфицированных до 70 дня супоросности. Плоды длиной более 16 см (более поздних сроков супоросности) могут использоваться, только если другой материал получить невозможно. Мумифицированные плоды и мертворожденные поросята, инфицированные после 70 дня супоросности, содержат антитела связанные с антигеном [7, 2], которые мешают выявлению вирусного антигена в РГА, что значительно ограничивает возможности применения метода.

РТГА широко применяется для лабораторной диагностики на территории РФ. Метод служит для выявления и количественной оценки титра антител к парвовирусу свиней в сыворотке крови свиноматок и плодов, но может использоваться и для выявления вирусного антигена [83, 7]. Преимуществами метода являются время получения результата и отсутствие необходимости покупки дорогостоящего оборудования. Антитела в РТГА обнаруживаются через 6-9 дней после заражения живым вирусом и могут сохраняться годами [81]. По литературным данным дополнительная обработка сывороток крови 2М 2-меркаптоэтанолом приводит к разрушению ^М, но не влияет на Разрушенные ^М не выявляются в РТГА. Снижение титра антител в сыворотке крови в 16 раз и более после обработки их 2-меркаптоэтанолом свидетельствует о том, что после заражения животного парвовирусом прошло не более 20-40 дней. [7]. Таким образом, можно подтвердить острую фазу заболевания.

Недостатком метода является невозможность дифференцировать постинфекционные антитела от поствакцинальных и молозивных, которые могут сохраняться в организме поросят до 16-26 недель [81, 116]. Низкопатогенные штаммы при заражении после 70 дня супоросности не вызывают гибели иммунокомпетентных плодов, так согласно исследованиям D. R. Redman et al [137] и P. A. Bachmann et al [12] внутриматочное заражение поросят после 72-101 дня супоросности приводило к рождению клинически здоровых, но ПВС-инфицированных поросят.

Для обнаружения вирусоспецифических антител возможно применение метода ИФА. Данный метод обладает большей чувствительностью по сравнению с РТГА и при этом не требует дополнительной предобработки сывороток для удаления термолабильных и термостабильных ингибиторов агглютинации и неспецифических гемагглютининов.

Также для обнаружения антител к ПВС используются методы РН и РДП. В настоящее время эти методы не применяются для рутинной диагностики.

В последние годы в лабораторной диагностике все более широко начинают применяться молекулярно-генетические методы исследований, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [100, 85, 11], изотермическая амплификация (LAMP) [29, 134] и секвенирование.

За последнее время появилось много работ по использованию метода ПЦР для выявления ПВС в различном биологическом материале от свиней [11,44, 85, 136].

Метод обладает высокой чувствительностью, специфичностью по сравнению с другими методами исследования [2, 85, 100], так, например, было показано, что чувствительность ПЦР в 105-106 раз выше, чем метод гемагглютинации [44, 136]. Кроме того метод позволяет исследовать такие материалы, как сперма и фекалии, которые не подходят для работы с культурой клеток [141, 147]. Было показано, что ПЦР выявляет вирусную

ДНК в плодах, подвергшихся аутолизу и дающих отрицательный результат при исследовании культуральным методом или в РТГА.

В качестве гена мишени для выявления ДНК парвовируса свиней чаще всего используются VP2 и NS1 гены, как наиболее консервативные участки генома [11, 100, 136].

Материалом для исследования методом ПЦР являются абортированные и мумифицированные плоды, плацента или послед, внутренние паренхиматозные органы от свиноматок (лимфатические узлы, селезенка, легкие), поросят или абортированных плодов; кровь или сыворотка крови, фекалии и сперма [85, 100, 141]. У свиноматок вирус наиболее часто выявляется в легких, лимфатических узлах, тимусе, селезенке, почах и матке [85], а у плодов в сердце, селезенке, легких и семенниках [136, 98].

У хряков-производителей болезнь протекает без видимых клинических признаков, но они выделяют вирус со спермой в течение 2-3 недель после заражения [4]. Вирус не оказывает непосредственного действия на сперматозоиды [120], однако генитальная локализация парвовируса у хряков является одной из причин репродуктивных нарушений у свиноматок [92]. Методом ПЦР ДНК парвовируса свиней обнаруживалась в семенной жидкости и несперматозоидной клеточной фракции спермы [141]. Однако даже при получении отрицательного результата при исследовании спермы вирус обнаруживался в семенниках и эпидидимисе [16, 34].

Таким образом, можно сказать, что метод ПЦР позволяет выявлять ДНК парвовируса в различном клиническом материале, обладает высокой чувствительностью, специфичностью и может быть рекомендован для рутинной лабораторной диагностики.

2. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)

2.1 Клинические признаки

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС, "синее ухо", эпизоотический поздний аборт) - вирусное контагиозное заболевание,

характеризующееся массовыми абортами у свиноматок на последней стадии супоросности, преждевременными родами, рождением нежизнеспособного приплода, поросят с уродствами, а также сопровождается признаками поражения респираторных органов [138].

Впервые заболевание было зарегистрированная в 1987 году в США и Канаде, а в 1990 году обнаружено в Западной Европе и некоторых других странах [17, 18, 85].

Клинические проявления РРСС сходны как в Северной Америке, так и в Европе и зависят от возраста животных и стадии супоросности свиноматок [139]. Тяжесть заболевания варьирует между стадами от бессимптомного течения до опустошительных вспышек и зависит от штамма вируса, иммунного статуса хозяина, сопутствующих инфекций и других факторов [139,35,42, 49, 130, 111].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Козлова, Александра Дмитриевна, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ануфриев, П.А., Першина С.И. Клинико-эпизоотологический мониторинг при применении вакцин против РРСС + ГТВИС и ТГС / П.А. Ануфриев, С.И. Першина // Ветеринарная патология. - 2003. - № 3. - С.46-48

2. Елисеева, О.В. Выявление парвовируса свиней и вирусспецифических антител методами полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа / О.В. Елисеева // Вопросы вирусологии. — 2008. -№6.-С.46-48.

3. Ковалишин, В.Ф. Диагностика инфекционных болезней импортируемых в Россию свиней / В.Ф. Ковалишин // Инновационные пути развития свиноводства в России: материалы международной конференции. -Москва, 2009. — С.77-85.

4. Парвовирусная инфекция свиней / В.И. Семенцов, И. А. Болоцкий, А.К. Васильев, C.B. Пруцаков, В.В. Юсов, А.Е. Лаврова, С.А. Аксененко // Ветеринария Кубани. - 2008. - №4 [Электронный ресурс]. -URL: http://www.kubanvet.ru/journal 15755553.html (дата обращения 27.12.13)

5. Русалеев, B.C. Проблемы и перспективы вакцинопрофилактики актуальных бактериальных инфекций свиней на свинокомплексах Российской Федерации / B.C. Русалеев // Российский Ветеринарный Конгресс, секция Проблемы инфекционной патологи свиней - М., 2010 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.narvac.eom/vetdoc/files/files/3.html. (дата обращения 27.12.13)

6. Сообщение о вспышке в Иркутской области в 2007 г. [Электронный ресурс]. - URL: http://www.oie.int/wahis 2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page refer= MapFullEventReport&reportid:=r6410 (дата обращения 28.12.13)

7. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных: монография / Сюрин В.Н., Самуйленко А .Я., Соловьев Б.В.. Фомина Н.В. // Москва. - 2001. - 928с.

8. A comparison of virus isolation, immunohistochemistry, fetal serology, and reverse-transcription polymerase chain reaction assay for the identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus transplacental infection in the fetus / J.E. Benson, M.J. Yaeger, J. ChristopherHennings, K. Lager, K.J. Yoon. // J. Vet. Diagn. Invest. - 2002. - Vol.14. - P. 814

9. A current assessment of the role of porcine parvovirus as a cause of fetal porcine death / W.L. Mengeling, K.M. Lager, J.J. Zimmerman, N. Samarikermani, G.W. Beran // J. Vet. Diagn. Invest. - 1991. - Vol.3. -P.33-35.

10. Albina, E. Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): an overview / E. Albina // Vet. Microbiol. - 1997. - Vol.55 -P.309-316.

11. A TaqMan-based real-time polymerase chain reaction for the detection of porcine parvovirus / H.Y. Chen, X.K. Li, B.A. Cui, Z.Y. Wei, X.S. Li, Y.B. Wang, L. Zhao, Z.Y. Wang // J. Virol. Methods. - 2009. - Vol.156. -P.84-88

12. Bachmann, P.A. Experimental In Utero Infection of Fetal Pigs with a Porcine Parvovirus / P.A. Bachmann, B.E. Sheffy, J.T. Vauhan. // Infect. Immun. -1975. - Vol.12, №3 -P.455-460.

13. Bergeron, J. Genome Organization of the Kresse Strain of Porcine Parvovirus: Identification of the Allotropic Determinant and Comparison with Those of NADL-2 and Field Isolates / J. Bergeron, B. Hebert, P. Tijssen // J. Virol. - 1996.-Vol.70, №4.-P.2508-2515.

14. Bergeron, J. Genomic organization and mapping of transcription and translation products of the NADL-2 strain of porcine parvovirus / J. Bergeron, J. Menezes, P. Tijssen // Virology. - 1993. - Vol.197 - P.86-98.

15. Birch D. E. Simplified hot start PCR / D. E. Birch // Nature. -1996. -Vol.381, №6581. - P. 445-446

16. Biront, P. Porcine Parvovirus (P.P.V.): Infection in Boars I. Possibility of a Genital Localization in the Boar after Oronasal Infection / P. Biront, P. Bonte // Zentralbl Veterinarmed B. - 1983. - Vol.30. -P.541-545.

17. «Blue ear» disease of pigs / DJ. Paton, I.H. Brown, S Edwards, G. Wensvoort // Vet. Rec. - 1991. - Vol.128. - P.617

18. «Blue ear» disease of pigs. / G. Wensvoort, C. Terpstra, J. Pol, M. White //Vet. Rec. - 1991. - V. 128. - P.574.

19. Boisvert, M. Multiple pathways involved in porcine parvovirus cellular entry and trafficking toward the nucleus / M. Boisvert, S. Fernandes, P. Tijssen // J. Virol. - 2010. - Vol.84,№ 15. - P.7782-7792.

20. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom // JCM. - 1990. - Vol.28, №3. - P. 495-503

21. Botner, A. Diagnosis of PRRS / A. Botner // Vet. Microbiol. - 1997. -Vol.55.-P.295-301.

22. Brown, T.T. Laboratory evaluation of selected disinfectants as virucidal agents against porcine parvovirus, pseudorabies virus, and transmissible gastroenteritis virus / T.T. Brown // Am. J. Vet. Res. - 1981. - Vol.42. - P. 10331036.

23. Cavanagh, D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae / D. Cavanagh // Arch. Virol. - 1997. - Vol.142. - P.629-633.

24. Chapman, M.S Structure, sequence, and function correlations among parvoviruses / M.S. Chapman, M.G. Rossmann // Virology. - 1993. - Vol.194. -P.491-508.

25. Characterization of the capsid protein VP2 gene of a virulent strain NE/09 of porcine parvovirus isolated in China / Y.G. Xu, L.C. Cui, H.W. Wang, G.C. Huo, S.L. Li // Res. Vet. Sci. - 2013. - Vol.94. - P.219-224.

26. Characterization of the carrier state in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection / D.C. Horter, R.M. Pogranichniy, C.C. Chang, R.B. Evans, K.J. Yoon, J.J. Zimmerman // Vet. Microbiol. - 2002. -Vol.86(3). -P.213-228.

27. Cartwright, S.F. A small haemagglutinating porcine DNA virus: I. Isolation and properties / S.F. Cartwright, M. Lucas, R.A. Huck // J. Comp. Pathol. - 1969. - Vol.79. - P.371-377.

28. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332) / D.A. Benfield, Nelson E.A., Collins J.E., Harris L., Goyal S.M., Robison D., Christianson W.T., Morrison R.B., Gorcyca D., Chladek D. //J. Vet. Diagn. Invest. - 1992. - Vol 4, №2. - P. 127-133

29. Chen, C.M. Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification / C.M. Chen, S.J. Cui // J. Virol. Methods. - 2009. -Vol.155, №2.-P.122-125

30. Cheon, D.S. Comparison of virus isolation, reverse transcription-polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus fromnaturally aborted fetuses and stillborn piglets / D.S. Cheon, C. Chae // J. Vet. Diagn. Invest. -2000.-Vol. 12(6).-P.582-587.

31. Cho, J.G. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus / J.G. Cho, S.A.Dee // Theriogenology. - 2006. - Vol.66. - P.655-662.

32. Choi, Y.K. Retrospective analysis of etiologic agents associated with respiratory diseases in pigs / Y.K. Choi, S.M. Goyal, H.S. Joo // Can. Vet. J. -2003.-Vol.44.-P.735-737.

33. Chronological immunohistochemical detection and localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in gnotobiotic pigs / K.D. Rossow, D.A. Benfield, S.M. Goyal, E.A. Nelson, J. Christopher-Hennings, J.E. Collins //Vet. Pathol. - 1996. - Vol.33(5). -P.551-556.

34. Clinical virologic and histopathologic observations of induced porcine parvovirus infection in boars / B.J. Thacker, H.S. Joo, N.L. Winkelman, A.D. Leman, D.M. Barnes // Am. J. Vet. Res. - 1987. - Vol.48. - P.763-767.

35. Comparative pathogenicity of nine US porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates in a five-week-old cesarean-derived, colostrum-deprived pig model / P.G. Halbur, P.S. Paul, X.J. Meng, M.A. Lum, J.J .Andrews, J.A. Rathje // J. Vet. Diagn. Invest. - 1996. - Vol.8, №1. - P. 11-20.

36. Comparative infection efficiency of porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates on MA104 cells and porcine alveolar

macrophages / M.F. de Abin, G. Spronk, M. Wagner, M. Fitzsimmons, J.E. Abrahante, M.P. Murtaugh // Can. J. Vet. Res. - 2009. - Vol.73(3). - P.200-204.

37. Complete Genome Sequence of a Novel Porcine Parvovirus in China / X.-F. Dai, Q.-J. Wang, S.-J. Jiang, Z.-J. Xie // J. Virol. - 2012. - Vol.86. -P.13867.

38. Cryo-electron tomography of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: organization of thenucleocapsid / M.S. Spilman, C. Welbon, E. Nelson, T. Dokland // J. Gen. Virol. - 2009. - Vol.90. - P.527-535.

39. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates / S. Dea, C.A. Gagnon, H. Mardassi, B. Pirzadeh, D. Rogan // Arch. Virol. -2000. - Vol. 145(4). -P.659-688.

40. Definition of subtypes in the European genotype of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: nucleocapsid characteristics and geographical distribution in Europe / T. Stadejek, M.B. Oleksiewicz, A.V. Scherbakov, A.M. Timina, J.S. Krabbe, K. Chabros, D. Potapchuk // Arch. Virol. -2008. - Vol.153. -P.1479-1488.

41. Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested polymerase chain reaction / H.K. Chung, C. Choi, J. Kim, C. Chae // J. Vet. Diagn. Invest. - 2002. - Vol. 14(1). - P.56-60.

42. Detection and duration of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in semen, serum,peripheral blood mononuclear cells, and tissues from Yorkshire, Hampshire, and Landrace boars / J. Christopher-Hennings, L.D. Holler, D.A. Benfield, E.A. Nelson // J. Vet. Diagn. Invest. - 2001. - Vol.l3(2). -P.133-142.

43. Detection of economically important viruses in boar semen by quantitative RealTime PCR technology / P.A. van Rijn, G.J. Wellenberg, R.

Hakze-van der Honing, L. Jacobs, P.L. Moonen, H. Feitsma // J. Virol. Methods. -2004. - Vol. 120(2). - P. 151 -160.

44. Detection of porcine parvovirus DNA by the polymerase chain reaction assay using primers to the highly conserved nonstructural protein gene, NS-1 / R.M. Soares, E.L. Durigon, J.G. Bersano, L.J. Richtzenhain // J. Virol. Methods. - 1999. - Vol.78. - P. 191-198.

45. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boar semen by PCR / J. Christopher-Hennings, E.A. Nelson, J.K. Nelson, R.J. Hines, S.L. Swenson, H.T. Hill, J.J. Zimmerman, J.B. Katz, M.J. Yaeger, C.C. Chase, et al. // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol.33(7). - P. 1730-1734.

46. Detection of U.S., Lelystad, and European-Like Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses and Relative Quantitation in Boar Semen and Serum Samples by Real-Time PCR / A. Wasilk, J.D. Callahan, J. ChristopherHennings, T. A. Gay, Y. Fang, M. Dammen, M.E. Reos, M. Torremorell, D. Poison, M. Mellencamp, E. Nelson, W.M. Nelson // J. Clin. Microbiol. - 2004. -Vol.42(10). -P.4453-4461.

47. Development and evaluation of a novel reverse transcription loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for detection of type II porcine reproductive and respiratory syndrome virus / Gao M., J. Cui, Y. Ren, S. Suo, G. Li, X. Sun, D. Su, T. Opriessnig, X. Ren // J. Virol. Methods. - 2012. -Vol. 185(1). - P. 18-23.

48. Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for thedetection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / G. Balka, A. Hornyak, A. Balint, Z. Benyeda, M. Rusvai. // J. Virol. Methods. - 2009. - Vol. 158. - P.41-45.

49. Differences in susceptibility of Duroc, Hampshire and Meishan pigs to infection with a high virulence strain (VR2385) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) / P.G. Halbur, M.F. Rothschild, B.J. Thacker, X.-J. Meng, P.S. Paul, J.D. Bruna. // J. Anim. Breed. Gene. - 1998. - Vol.115. -P.181-189.

50. Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain from North American field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF5 / R.D. Wesley, W.L. Mengeling, K.M. Lager, D.F. Clouser, J.G. Landgraf, M.L. Frey. // J. Vet. Diagn. Invest. - 1998. -Vol.10(2). - P.140-144.

51. Diagnosis of persistent or prolonged porcine reproductive and respiratory syndrome virus infections / D. Benfield, J. Nelson, K. Rossow, C. Nelson, M. Steffen, R. Rowlan // Vet. Res. - 2000. - Vol.31. - P.71-71.

52. Direct detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus by reversepolymerase chain reaction (RT-PCR) / P. Suarez, R. Zardoya, C. Prieto, A. Solana, E. Tabares, J.M. Bautista, J.M. Castro // Arch. Virol. -1994.-Vol.135.-P.89-99.

53. Dokland, T. The structural biology of PRRSV / T. Dokland // Virus Res. -2010. - Vol.154. -P.86-97.

54. Done, S.H. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): a review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects / S.H. Done, D.J. Paton, M.E. White / Br. Vet. J. - 1996. - Vol.152(2). - P. 153-174.

55. Endemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of nursery pigs in two swineherds without current reproductive failure / G.W. Stevenson, W.G. Van Alstine, C.L. Kanitz, K.K. Keffaber // J. Vet. Diagn. Invest. - 1993. - Vol.5(3). - P.432-434.

56. Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages via receptor-mediated endocytosis / H.J. Nauwynck, X. Duan, H.W. Favoreel, P. Van Oostveldt, M.B. Pensaert // J. Gen. Virol. - 1999. - Vol.80.-P.297-305.

57. Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions or porcine reproductive and respiratory syndrome virus / E.H.J. Wissink, M.V. Kroese, H.A.R. van Wijk, F.A.M. Rijsewijk, J.J. Meulenberg, P.J.M. Rottier // J. Virol. - 2005. - Vol.79. - P. 12495-12506.

58. Experimental porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in one-, four-, and 10-week-old pigs / K.D. Rossow, E.M. Bautista, S.M. Goyal, T.W. Molitor, M.P. Murtaugh, R.B. Morrison, D.A. Benfield, J.E. Collins // J. Vet. Diagn. Invest. - 1994. - Vol.6(l). -P.3-12.

59. Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows / W.T. Christianson, J.E. Collins, D.A. Benfield, L. Harris, D.E. Gorcyca, D.W. Chladek, R.B. Morrison, H.S. Joo // Am. J. Vet. Res. -1992. - Vol.54(4). - P.485-488.

60. Foni, E. Characterization of a parvovirus isolated from a pig fetus / E. Foni, G.L. Gualandi, L. Capucci // Microbiologica. - 1989. - Vol. 12(3). - P.277-280.

61. Functional mapping of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus capsid protein nuclearlocalization signal and its pathogenic association / Y. Pei, D.C. Hodgins, C. Lee, J.G. Calvert, S.K. Welch, R. Jolie, M. Keith, D. Yoo // Virus Res. - 2008. - Vol. 135(1). - P. 107-114.

62. Gagnon, C.A. Differentiation between porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restrictionfragment length polymorphism of their ORFs 6 and 7 genes / C.A. Gagnon, S. Dea // Can. J. Vet. Res. - 1998. -Vol.62(2). - P. 110-116.

63. General characteristics and viral susceptibility of a newborn pig kidney (NPK) continuous culture / M. Ferrari, M.N. Losio, G.L. Gualandi, R. Di Lernia, I. Manocchio // Microbiologica. - 1989. - Vol.12, №4. - P.329-334.

64. Genetic Diversity Characterization of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates in Romania, Based on Phylogenetic Analysis / M. Zaulet, M.R. Gurau, V. Petrovan, L. Buburuzan // Int. J. Mol. Sci. - 2012. -Vol.13.-P. 12046-12061.

65. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States / V. Kapur, M.R. Elam, T.M. Pawlovich, M.P. Murtaugh // J. Gen. Virol. - 1996. - Vol.77 (6) - P. 1271-1276.

66. Gradil, С. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: seminal transmission / C. Gradil, C. Dubuc, M.D. Eaglesome // Vet. Rec. - 1996. -Vol.138(21). -P.521-522.

67. Gradil, C.M. Persistence of Porcine Parvovirus in Swine Infected In Utero and Followed through Maturity / C.M. Gradil, H.S. Joo, T.W. Molitor // J. Vet. Med. - 1990. - Vol.37 - P.309-316.

68. Halbur, P.G. Update on abortion storms and sow mortality / P.G. Halbur, E. Bush // Swine Health. Prod. - 1997. - Vol.5(2). - P.73.

69. Hopper, S.A. An outbreak of blue-eared pig disease (porcine reproductive and respiratory syndrome) in four pig herds in Great Britain / S.A. Hopper , M.E. White , N. Twiddy // Vet .Rec. - 1992. - Vol. 131 (7). - P. 140-144

70. ICTVdB Index of Viruses [Электронный ресурс]. - URL: http://ictvdb.bio-mirror.cn/Ictv/fs parvo.htm (дата обращения 27.12.13)

71. Identification of a genetically diverse sequence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Slovenia and the impact on the sensitivity of four molecular tests / I. Toplak , D. Rihtaric, P. Hostnik, J. Grom, M. Stukelj, Z. Valencak // J. Virol. Methods. - 2012. - Vol. 179. - P. 51 -56.

72. Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcinealveolar macrophages / X. Duan, H.J. Nauwynck, H.W. Favoreel, M.B. Pensaert // J. Virol. - 1998. - Vol.72(5). -P.4520-4523.

73. Identification of genetically diverse sequences (ORF 5) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in a swine herd / S.A. Dee, M. Torremorell, K. Rossow, C. Mahlum, S. Otake, K. Faaberg // Can. J. Vet. Res. -2001. - Vol.65(4). - P.254-260.

74. Identification of parvovirus-like virus particles in intestinal crypt epithelial cells of pigs with diarrhea / G.E. Duhamel, T.W. Bargar, B.J. Schmitt, T.W. Molitor, W. Lu //J. Vet. Diagn. Invest. - 1991. - Vol.3. -P.96-98.

75. Identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in semen and tissues fromvasectomized and nonvasectomized boars / J.

Christopher-Hennings, E.A. Nelson, J.K. Nelson, K.D. Rossow, J.L. Shivers, M.J. Yaeger, C.C. Chase, R.A. Garduno, J.E. Collins, D.A. Benfield // Vet. Pathol. -1998. - Vol.35(4). - P.260-267.

76. Immune responses in pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) / E. Albina, L. Piriou, E. Hutet, R. Cariolet, R. L'Hospitalier // Vet. Immunol. Immunopathol. - 1998. - Vol.61 - P.49-66.

77. Indirect fluorescent IgM antibody response of pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome syndrome virus / H.S. Joo, B.K. Park, S.A. Dee, C. Pijoan // Vet. Microbiol. - 1997. - Vol.55. - P.303-307.

78. Insemination of susceptible and preimmunized gilts with boar semen containing porcine reproductive and respiratory syndrome virus / C. Prieto, P. Suarez, I. Simarro, C. Garcia, S. Martin-Rillo, J. M. Castro // Theriogenology. -1997. - Vol.47. - P.647-654.

79. In vivo detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA by in situ hybridization atdifferent times postinfection / J.H. Sur, V.L. Cooper, J.A. Galeota, R.A. Hesse, A.R. Doster, F.A. Osorio // J. Clin. Microbiol. -1996. - Vol.34(9). - P.2280-2286.

80. Johnson, R.H. Experimental infection of piglets and pregnant gilts with a parvovirus / R.H. Johnson, D.F. Collings // Vet. Rec. - 1969. - Vol.85, №16. - P.446-447.

81. Johnson, R.H Observations on the epidemiology of porcine parvovirus / R.H. Johnson, C. Donaldson-Wood, U. Allender // Aust. Ve.t J. - 1976. -Vol.52(2). - P.80-84.

82. Johnson, R. H. Transplacental infection of piglets with a porcine parvovirus / R.H. Johnson, D.F. Collings // Vet. Rec. - 1971. - Vol.89. - P.570-572.

83. Joo, H.S. A standardised haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody / H.S. Joo, C.R. Donaldson-Wood, R.H. Johnson // Aust. Vet. J. - 1976. - Vol.52(9). - P.422-424.

84. Joo, H.S. Observations on the Pathogenesis of Porcine Parvovirus Infection / H.S. Joo, C.R. Donaldson-Wood, R.H. Johnson // Arch. Virol. - 1976. -Vol.51.-P.123-129.

85. Keffaber, K.K. Reproductive failure of unknown etiology / K.K. Keffaber // Am. Assoc. Swine Pratt. Newsletter - 1989. - Vol. 1. - P. 1-9.

86. Kim, J.A Comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs / J. Kim, C. Chae // J. Vet. Diagn. Invest. - 2004. - Vol.16. - P.45-50.

87. Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences / M. Kimura // J. Mol. Evol. - 1980. - Vol.16 - P. 111-120

88. Kleiboeker, S.B. Concurrent use of reverse transcription-polymerase chain reaction testing of oropharyngeal scrapings and paired serological testing for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in sows / S.B. Kleiboeker, J.R. Lehman, T.J. Fangman // Swine Health. Prod. - 2002. -Vol.10, №6.-P.251-258.

89. Lager, K.M. Porcine parvovirus associated with cutaneous lesions in piglets / K.M. Lager, W.L. Mengeling // J. Vet. Diagn. Invest. - 1994. - Vol.6. -P.357-359.

90. Larochelle, R Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in paraffin-embedded tissues: comparison of immunohistochemistry and in situ hybridization / R. Larochelle, R. Magar // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol.63. -P.227-235.

91. Larochelle, R. Immunohistochemical detection of swine influenza virus and porcine reproductive and respiratorysyndrome virus in porcine proliferative and necrotizing pneumonia cases from Québec / R. Larochelle, R. Sauvageau, R. Magar// Can. Vet. J. - 1994. - Vol.35(8). -P.513-515.

92. Lucas, M.H. Genital infection of pigs with porcine parvovirus / M.H. Lucas, S.F. Cartwright, A.E. Wrathall // J. Comp. Pathol. - 1974. - Vol.84(3). -P.347-350.

93. Lucas, M.H. Fluorescent antibody technique in the study of three porcine viruses: Transmissible gastroenteritis virus, vomiting and wasting disease virus, and the parvovirus 59e/63 / M.H. Lucas, P. Napthine // J. Comp. Pathol. -1971. - Vol.81. -P.l 11-117

94. Magar, R. Immunohistochemical detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using colloidal gold / R. Magar, R. Larochelle, Y. Robinson // Can. J. Vet. Res. - 1993. - Vol.57(4). - P.300-304.

95. Mechanical transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by mosquitoes, Aedes vexans (Meigen) / S. Otake, S.A. Dee, K.D Rossow, R.D Moon, C. Pijoan // Can. J. Vet. Res. - 2002. - Vol.66(3). - P.l91-195.

96. Meng, X.J., Paul PS, Halbur PG. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the 3'-terminal genomic RNA of the porcine reproductiveand respiratory syndrome virus / X.J. Meng, P.S. Paul, P.G. Halbur // J. Gen. Virol. -1994. - Vol75. - P. 1795-1801.

97. Mengeling, W. L. Pathogenesis of in utero infection: experimental infection of 5-week-old porcine fetuses with porcine parvovirus / W.L. Mengeling, R.C. Cutlip // Am. J. Vet. Res. - 1975. - Vol.36. - P. 1173-1177.

98. Mengeling, W.L. The effect of porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance / W.L. Mengeling, K.M. Lager, A.C. Vorwald // Anim. Reprod. Sci. - 2000. - Vol. 60.-P. 199-210.

99. Mengeling, W. L. Transplacental infection and embryonic death following maternal exposure to porcine parvovirus near the time of conception / W.L. Mengeling, P.S. Paul, T.T. Brown //Arch. Virol. - 1980. - Vol.65(l). - P.55-62.

100. Molecular basis for porcine parvovirus detection in dead fetuses / V.H. Wolf, M. Menossi, G.B. Mourao, M.S. Gatti // Genet. Mol. Res. - 2008. -Vol.7.-P.509-517.

101. Molitor, W.T. Identification and characterization of a porcine parvovirus nonstructural polypeptide / W.T. Molitor. J.S. Joo, M.S. Collett / J. Virol. - 1985. - Vol.55 -P.554-559.

102. Molitor, T.W. Porcine parvovirus: virus purification and structural and antigenic properties of virion polypeptides / T.W. Molitor, H.S. Joo, M.S. Collett // J. Virol. - 1983. - Vol.45. - P.842-854.

103. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus / G. Wensvoort, C. Terpstra, J.M. Pol, E.A. ter Laak, M. Bloemraad, E.P. de Kluyver, C. Kragten, L. van Buiten, A. den Besten, F. Wagenaar et al. // Vet. Q. -1991. - Vol. 13(3). - P. 121-130.

104. Nielsen, J. Experimental in utero infection of pig foetuses with porcine parvovirus (PPV) / J. Nielsen, L. Ronsholt, K.J. Sorensen // Vet.Microbiol. - 1991. - Vol.28. -P.l-11.

105. Non-suppurative Myocarditis in Piglets Associated with Porcine Parvovirus Infection / D.M. Bolt, H. Hitni, E. Mtiller, A.S. Waldvogel // J. Сотр. Path. - 1997.-Vol. 117.-P. 107-118.

106. OIE terrestrial manual [Электронный ресурс]. - URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2.08.07 PRRS.pdf (дата обращения 27.12.13)

107. Open reading frame 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apoptosis / P. Suarez, M. Diaz-Guerra, C. Prieto, M. Esteban, J.M. Castro, A. Nieto, Ortin J. // J. Virol.- 1996. -Vol.70(5). - P.2876-2882.

108. Oraveerakul, K. Tissue tropisms of porcine parvovirus in swine / K. Oraveerakul, C.S. Choi, T.W. Molitor // Arch. Virol. - 1993. - Vol.130. - P.377-389.

109. Parvovirus Infection In Pigs With Necrotic And Vesicle-Like Lesions / J.I. Kresse, W.D. Taylor, W.W. Stewart, K.A. Fernisse // Vet.Microbiol. - 1985. -Vol.10.-P.525-531.

110. Parvovirus-like Particles Associated with Diarrhea in Unweaned Piglets / S. Dea, M.A.S.Y. Elazhary, G.P. Martineau, J. Vaillancourt // Can. J. Comp. Med. - 1985. - Vol.49. -P.343-345.

111. Pathogenesis and antigenic characterization of a new East European subtype 3 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate / U.U. Karniychuk, M. Geldhof, M. Vanhee, J. Van Doorsselaere, T.A. Saveleva, H.J. Nauwynck // BMC Vet. Res. - 2010. - Vol.6. - P.30-39.

112. Pathogenesis of porcine parvovirus infection: pathology and immunofluorescence in the foetus / H.S. Joo, C.R. Donaldson-Wood, R.H. Johnson, R.S.F. Campbell // J. Comp. Path. - 1977. - Vol.87. -P.383-391.

113. Pathogenesis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Infection in Mid-gestation Sows and Fetuses / W.T. Christianson, C.-S. Choi, J.E. Collins, T.W. Molitor, R.B. Morrison, H.-S. Joo // Can. J. Vet. Res. -1993. - Vol.57. - P.262-268.

114. Pathogenicity of a skin isolate of porcine parvovirus in swine fetuses / C.S. Choi, T.W. Molitor, H.S. Joo, R. Gunther// Vet. Microbiol. - 1987. - Vol.15. -P. 19-29.

115. Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus inexperimentally induced infections of mystery swine disease (synonym: porcine epidemic abortion andrespiratory syndrome (PEARS)) / J.M. Pol, J.E. van Dijk, G. Wensvoort, C. Terpstra // Vet. Q. - 1991. - Vol.13. -P.137-143.

116. Paul, P.S. Duration and biological half-life of passively acquired colostral antibodies to porcine parvovirus / P.S. Paul, W.L. Mengeling, E.C. Pirtle //Am. J. Vet. Res. - 1982. -Vol.43(8). - P. 1376-1379.

117. Paul, P.S. Evaluation of a modified live-virus vaccine for the prevention of porcine parvovirus-induced reproductive disease in swine / P.S. Paul, W.L. Mengeling // Am. J. Vet. Res. - 1980. - Vol.41 (12). - P.2007-2011.

118. Paul, P.S. Replication of Porcine Parvovirus in Peripheral Blood Lymphocytes, Monocytes, and Peritoneal Macrophages / P.S. Paul, W.L. Mengeling, T.T Brown // Infect. Immun. - 1979. - Vol.25, №3. -P.1003-1007

119. Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in a swine operation / R. Bilodeau, D. Archambault, S.A .Vezina, R. Sauvageau, M. Fournier, S. Dea // Can. J. Vet. Res. - 1994. - Vol.58(4). - P.291-298.

120. Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in serum and semen of adult boars / J. Christopher-Hennings, E.A. Nelson, R.J. Hines, J.K. Nelson, S.L. Swenson, J.J. Zimmerman, C.L. Chase, M.J. Yaeger, D.A. Benfield //J. Vet. Diagn. Invest. - 1995. - Vol.7(4). -P.456-464.

121. Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A. and Europe / X.J. Meng, P.S. Paul, P.G. Halbur, M.A. Lum // Arch. Virol. - 1995. -Vol. 140(4).-P.745-755.

122. Plagemann, P.G. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: origin hypothesis / P.G. Plagemann // Emerg. Infect. Dis. - 2003. - Vol.9(8). -P.903-908.

123. Porcine parvovirus: DNA sequence and genome organization / A.I. Ranz, J.J. Manclus, E. Diaz-Aroca, J.I. Casal // J. Gen. Virol. - 1989. - Vol.70. -P.2541-2553.

124. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) diagnostics: Interpretation and limitations / J. Christopher-Hennings, K.S. Faaberg, M.P. Murtaugh, E.A. Nelson, M.B. Roof, E.M. Vaughn, K.-J. Yoon, J. Zimmerman // Swine Health. Prod. - 2002. - Vol.10, №5. - P.213-218.

125. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: a persistent infection / R.W. Wills, JJ. Zimmerman, K.J. Yoon, S.L. Swenson, M.J. McGinley, H.T. Hill, K.B. Piatt, J. Christopher-Hennings, E.A. Nelson // Vet. Microbiol. -1997.-Vol.55.-P.231-240.

126. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of gnotobiotic pigs: sites of virusreplication and co-localization with MAC-387 staining at 21 days post-infection / S.R. Lawson, K.D. Rossow, J.E. Collins, D.A. Benfield, R.R. Rowland // Virus Res. - 1997. - Vol.51 (2). - P. 105-113.

127. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: morphological, biochemical and serological characteristics of Quebec isolates associated with acute and chronic outbreaks of porcine reproductive and respiratory syndrome / H. Mardassi, R. Athanassious, S. Mounir, S. Dea // Can. J. Vet. Res. - 1994. -Vol.58(1). - P.55-64.

128. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: routes of excretion / R.W. Wills, J.J. Zimmerman, K.J. Yoon, S.L. Swenson, L.J. Hoffman, M.J. McGinley, H.T. Hill, K.B. Piatt // Vet. Microbiol. - 1997. - Vol.57(l). - P.69-81.

129. Prieto, C. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar: a review / C. Prieto, J.M. Castro // Theriogenology. - 2005. -Vol.63(1). - P.1-16.

130. Probability of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection as a function ofexposure route and dose / J.R. Hermann, C.A. Muñoz-Zanzi, M.B. Roof, K. Burkhart, J.J. Zimmerman // Vet. Microbiol. - 2005. -Vol.110.-P.7-16.

131. Production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity / C. Martínez, K. Dalsgaard, J.A.López de Turiso, E. Cortés, C. Vela, J.I. Casal // Vaccine. - 1992. - Vol.10, №10. - P.684-690.

132. Quantitation of target molecules from polymerase chain reaction-based limiting dilution assays / A.G. Rodrigo, P.C. Goracke, K. Rowhanian, J. I. Mullins // AIDS Res Hum Retroviruses. - 1997. - V.13(9). - P.737-742

133. Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strainsof porcine reproductive and respiratory syndrome virus / C. Egli, B. Thur, L. Liu, M.A. Hofmann // J. Virol. Methods. -2001. - Vol.98(l). - P.63-75.

134. Rapid detection of porcine parvovirus DNA by sensitive loopmediated isothermal amplification / H.T. Chen, J. Zhang, S.H. Yang, L.N. Ma, Y.P. Ma, X.T. Liu, X.P. Cai, Y.G. Zhang, S. Liu // J. Virol. Methods. - 2009. -Vol.158.-P.100-103.

135. Rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome viral nucleic acid in blood using afluorimeter based PCR method / M. Spagnuolo-Weaver , I.W. Walker , S.T. Campbell, F. McNeilly, B.M. Adair, G.M. Allan // Vet. Microbiol. - 2000. - Vol.76(l). - P. 15-23.

136. Real-time PCR to detect and analyze virulent PPV loads in artificially challenged sows and their fetuses / L.F. Miao, C.F. Zhang, C.M. Chen, S.J. Cui // Vet. Microbiol. -2009. - Vol.138. - P. 145-149.

137. Redman, D.R. Porcine parvovirus: natural and experimental infections of the porcine fetus and prevalence in mature swine / D.R. Redman, E.H. Bohl, L.C. Ferguson // Infect. Immun. - 1974. - Vol. 10(4). - P.718-723.

138. Reproductive failure in wild boars associated to porcine parvovirus infection and in vivo and in vitro characterization of the causal isolate / C.F. Zhang, C.P. Song, C.M. Chen, S.J. Cui, L.F. Miao // Trop. Anim. Health. Prod. -2010.-Vol.42(8).-P.1611-1613.

139. Rossow, K.D. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus / K.D. Rossow // Vet. Pathol. - 1998. - Vol.35(l). - P.l-20.

140. Shedding of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mammary gland secretions of sows / E.A. Wagstrom, C.C. Chang, K.J. Yoon, J.J. Zimmerman //Am. J. Vet. Res. -2001. - Vol.62, №12. - P. 1876-1880.

141. Simultaneous detection and differentiation between porcine circovirus and porcine parvovirus in boar semen by multiplex seminested polymerase chain

reaction / J. Kim, D.U. Han, C. Choi, C. Chae // J. Vet. Med. Sci. - 2003. -Vol.65(6).-P.741-744.

142. Snijder, E.J. The molecular biology of arteriviruses / E.J. Snijder, J.J. Meulenberg // J. Gen. Virol. - 1998.-Vol.79.-P.961-979.

143. Studies on the carriage and transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by individual houseflies {Musca domestica) / S. Otake, S.A. Dee, R.D. Moon, K.D. Rossow, C. Trincado, C. Pijoan // Vet. Rec. - 2004. Vol.154.-P.80-85.

144. The epitope of the VP1 protein of porcine parvovirus / H.L. Xie, Z. Wang, S.J. Cui, C.F. Zhang, Y.D. Cui / Virol. J. - 2010. - Vol.7. - P. 161.

145. Tullis, G.E. The minor capsid VP1 of the autonomous parvovirus minute virus of mice is dispensible for encapsidation of progeny single-stranded DNA but is required for infectivity / G.E. Tullis, L.R. Burger, D.J. Pintel / J. Virol. - 1993.-Vol.67.-P.131-141.

146. Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses by a multiplex PCR assay / S.A. Gilbert, R. Larochelle, R. Magar, H.J. Cho, D. Deregt // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol.35(l). - P.264-267.

147. Vaccination against porcine parvovirus protects against disease, but does not prevent infection and virus shedding after challenge infection with a heterologous virus strain / A. Jozwik, J. Manteufel, H.J. Selbitz, U. Truyen // J. Gen. Virol. - 2009. - Vol.90. - P.2437-2441.

148. Whitaker, H.K. Parvovirus infection in pigs with exudative skin disease / H.K. Whitaker, S.M. Neu, L.W. Pace // J. Vet. Diagn. Invest. - 1990. Vol.2, №3.-P.244-246.

149. Xu, Y.G. Induction of immune responses in mice after intragastric administration of Lactobacillus casei producing porcine parvovirus VP2 protein / Y.G. Xu„ Y.J. Li // Appl. Environ. Microbiol. - 2007. - Vol.73. - P.7041-7047.

150. Yaeger, M.J. Evidence for the transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in boar semen / M.J. Yaeger, T. Prieve, J.

Collins,J. Christopher-Hennings, E. Nelson, D. Benfield // Vet. Ree. - 1996. -Vol.138(21). -P.521-522.

151. Zhang, J. Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. / J. Zhang, T.L. Madden // Genome Res. - 1997. - V.7. - P.649-656.