«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИТРАТСИНТАЗЫ, ОСНОВНОГО ФЕРМЕНТА СИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОДУЦЕНТА ASPERGILLUS NIGER ШТАММ Л-» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Алексеев, Камиль Владимирович

• Алексеев, Камиль Владимирович
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Алексеев, Камиль Владимирович

Введение............................................................................................................................................4

Актуальность проблемы................................................................................................................4

Степень разработки........................................................................................................................5

Цели и задачи.................................................................................................................................6

Научная новизна............................................................................................................................7

Теоретическая и практическая значимость работы......................................................................8

Методология и методы исследования...........................................................................................8

Положения, выносимые на защиту...............................................................................................9

Степень достоверности и апробация результатов........................................................................9

Объем и структура диссертации..................................................................................................10

Глава 1. Обзор литературы..........................................................................................................11

1.1. Цитратсинтаза. Роль в клеточном метаболизме...........................................................11

1.2. Молекулярно-биологические характеристики цитратсинтазы....................................15

1.3. Биохимические характеристики цитратсинтазы..........................................................19

1.4. Структурная организация цитратсинтазы.....................................................................20

1.5. Механизм действия........................................................................................................22

Глава 2. Материалы и методы.....................................................................................................24

Материалы.................................................................................................................................... 24

Методы.........................................................................................................................................24

2.1. Среда и условия культивирования гриба Aspergillus niger..........................................24

2.2. Разработка и оптимизация методов разрушения клеток гриба Aspergillus niger........26

2.3. Молекулярно-генетическая часть исследования:.........................................................27

2.4. Биохимическая часть исследования:.............................................................................50

Глава 3. Результаты собственных исследований........................................................................62

3.1. Результаты молекулярно-биологической части исследования:...................................62

3.2. Результаты биохимической части исследования:.........................................................87

Глава 4. Обсуждение результатов исследования........................................................................96

Глава 5. Заключение..................................................................................................................105

Список сокращений и условных обозначений.............................................................................107

Приложение А..............................................................................................................................109

Таблица А. 1...................................................................................................................................109

Приложение Б..............................................................................................................................111

Схема Б.1....................................................................................................................................111

Рис. Б.1.......................................................................................................................................112

Приложение В..............................................................................................................................113

Литература.....................................................................................................................................114

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИТРАТСИНТАЗЫ, ОСНОВНОГО ФЕРМЕНТА СИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОДУЦЕНТА ASPERGILLUS NIGER ШТАММ Л-»»

Введение Актуальность проблемы

Лимонная кислота (3-гидрокси-3-карбоксипентандиовая кислота) является ключевым метаболитом и интермедиатом первого этапа цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса, ЦТК). Лимонная кислота (ЛК) обнаруживается во всех живых существах, начиная с бактерий и заканчивая растениями и животными, т.к. является неотъемлемым промежуточным соединением аэробного метаболизма.

С точки зрения производства и потребления ЛК является одним из важнейших биопродуктов. Ежегодное мировое производство ЛК превышает 1,6 миллиона тонн на 2009 год. Лимонная кислота и ее соли (цитраты) являются объектами многотоннажного биотехнологического производства и находят применение во многих отраслях промышленности, в первую очередь пищевой, фармацевтической, медицинской. Однако области применения ЛК ими не ограничиваются. Лимонная кислота и цитраты используются как хелатирующие агенты для комплексного связывания металлов в различных отраслях промышленности, как мономеры для производства функциональных и/или биоразрушаемых полимеров, а также в нефтедобыче и т.д. Поэтому потребление и соответственно производство ЛК возрастает с каждым годом [1-3].

На сегодняшний день ЛК в промышленных масштабах производится посредством ферментации мицелиального гриба Aspergillus niger на сахаросодержащих средах. Грибы рода Aspergilli, в частности A. niger, A. nidulans, A. oryzae, A. flavus, A. terreus являются наиболее важными для коммерческого использования, т.к. они способны в больших количествах продуцировать широкий спектр низкомолекулярных органических кислот (НМОК), а также ферменты и рекомбинант-ные белки. Гриб A. niger был выбран в качестве продуцента не случайно; он способен давать высокие выходы ЛК даже при низких значениях рН среды без секреции токсичных побочных продуктов [4].

Производство ЛК является старейшим и наиболее изученным из биотехнологических процессов [5]. Несмотря на это, а также на то, что метаболические пути, ведущие к образованию ЛК, к настоящему времени изучены достаточно хорошо, механизм, а главное причины сверхсинтеза цитрата остаются до сих пор неясными.

Ключевым ферментом синтеза ЛК является первый фермент ЦТК, цитратсинтаза (ЦС), катализирующий стереоспецифический синтез цитрата из ацетил-коэнзима А и оксалоацетата [6,7]. Цитратсинтаза обнаруживается в клетках почти всех живых существ. В мицелии гриба, культивированного на сахарозе или глюкозе, было показано, что фермент ЦС локализован в матриксе митохондрий [8].

Именно от активности и способности фермента к катализу зависят уровни синтеза лимонной кислоты, поэтому информация, полученная о ЦС, дает возможность увеличить образование целевого продукта грибом-продуцентом А. niger посредством внесения целенаправленных изменений в его геном. А изучение биохимических характеристик фермента позволит оптимизировать процесс ферментации с целью увеличения соотношения целевой продукт/сырье.

Множество важных деталей биотехнологических процессов производства ЛК остается неизвестным для исследователей в силу ограничения доступа к информации самими производителями.

Степень разработки

В настоящее время имеется ряд работ, посвященных ЦС из различных организмов. Наиболее глубоко изучены ЦС животных, в т.ч. человека, и дрожжей, для них были определены структура гена, белка и пространственная организация ЦС, строение и состав активных центров и механизм работы фермента. Помимо этого, для множества ЦС, в т.ч. грибных, были выявлены изо-формы, определены биохимические характеристики, которые тем не менее оказались весьма разнородны и зачастую противоречивы.

Несмотря на долгую историю изучения данного фермента сведения о его регуляции ограничивались лишь «классическими» биохимическими воззрениями, а именно ингибированием активности и доступностью субстрата. Однако, в последнее время, в виду расширения методической и научно-технической базы, в частности улучшения понимания регуляторных аспектов клеток, для животных и дрожжевых ЦС были выявлены потенциальные точки, приложения регуля-торных воздействий: пост-трансляционные модификации, механизмы регуляции биосинтеза и транспорта белков. Тем не менее новейшие данные пока не получили даже теоретического применения, приложения для ЦС грибов рода A. niger, что не может не вызывать удивления в виду распространенности информатических и вычислительных подходов в биологических науках.

На данный момент знания о ЦС из штаммов гриба A. niger ограничиваются лишь структурой гена с предполагаемой промоторной областью, некоторыми биохимическими характеристиками, адекватность которых таковым in vivo до сих пор находится под вопросом.

Не так давно был секвенирован геном некоторых штаммов гриба A. niger [9-11]. В свете чего был предпринят ряд попыток повысить продуктивность гриба по цитрату посредством внесения изменений в его геном, однако большинство из них не увенчалось успехом.

Ясное представление о развитии интереса в научном сообществе к ЦС дает график количества публикаций рис.1, в которых имеет место упоминание термина "citrate synthase ", за годы от 1940-х до 2015 года.

Рисунок 1. Статистика упоминания термина 'citrate synthase' в литературе.

20000 'I 18000 I 16000

5 14000

о

S о 12000 й .> 10000 S >5

е; s О J

sc (б *

е;

ю >

8000 6000 4000 2000 0

PubMEd Google Scholar ScienceDirect

<ь jh е- <ь

л43

оЛ

Jb

J*

е. e, rST ST

Годы

В нашей диссертационной работе впервые проведено исследование ЦС из отечественного промышленного гриба-продуцента А. niger штамм Л-4, в частности идентификация кодирующих ее генов, получение их копий, а также изучение транскрипции, трансляции, транспорта белка, созревания, определение экспрессионного профиля ЦС. Были изучены биохимические и кинетические параметры фермента в условиях ферментации ЛК.

Оценка экспрессии гена цитратсинтазы, тем более в динамике ферментации цитрата, сопоставление структуры гена ЦС с геном дикого штамма, выделенного из почвы, изменение активности фермента в ходе ферментационного процесса, возможные пути регуляции ЦС и реализации этого воздействия - ничего из того, что было приведено в данной диссертационной работе, в литературе, посвященной ЦС гриба А. niger, найдено не было.

Учитывая тот факт, что ЦС катализирует синтез цитрата, такого рода работа в перспективе позволит оптимизировать данный биохимический процесс на уровне грибной клетки. Кроме того, полученные результаты явятся факторами контроля состояния штамма-продуцента.

Цели и задачи

Целью диссертационной работы является изучение генетических и биохимических характеристик цитратсинтазы - ключевого фермента ЦТК - для определения её вклада в механизм сверхсинтеза лимонной кислоты грибом-продуцентом А. niger.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи: 1) Разработка эффективной методики разрушения клеток гриба А. niger Л-4 с целью выделения нуклеиновых кислот и белков.

2) Оптимизация методики выделения нуклеиновых кислот, качественно пригодных для проведения молекулярно-генетических исследований из данного биообъекта.

3) Получение гена ЦС посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) из гриба-продуцента и дикого штамма.

4) Секвенирование фрагментов гена ЦС и обработка полученных нуклеотидных последовательностей, в частности, выявление характеристических особенностей, а также идентификация потенциальных сайтов пост-трансляционных модификаций ЦС с привлечением биоинформатических методов.

5) Биоинформатическая обработка данных, с целью выяснения характеристик синтеза, созревания, транспорта и регуляции белка ЦС, а также особенностей пространственной организации фермента.

6) Определение профиля экспрессии гена ЦС в динамике ферментационного процесса.

7) Оптимизация метода аффинной хроматографии для выделения и очистки белка ЦС из клеток гриба А. niger Л-4.

8) Определение базовых биохимических характеристик белка, а также анализ динамики изменения активности ЦС в ходе ферментационного процесса.

Научная новизна

Научная новизна диссертационной работы заключается в том, что впервые проведен анализ экспрессии гена ЦС промышленного гриба-продуцента A. niger штамма Л-4, полученного во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых добавок (ВНИИПД), в динамике ферментации ЛК. Полученный экспрессионный профиль сопоставлен с изменениями в активности фермента в ходе процесса биосинтеза и аккумуляции ЛК.

Помимо этого, впервые для промышленного штамма-продуцента ЛК гриба A. niger Л-4 была получена нуклеотидная последовательность гена ЦС и сопоставлена с последовательностью дикого штамма, выделенного из почвы, и другими штаммами грибов из баз данных. С привлечением ряда биоинформатических средств проведена работа по поиску точек приложения ре-гуляторного воздействия на ген и белок ЦС штамма Л-4 и путей реализации такого воздействия, что ранее в литературе не описывалось. В работе также обобщен материал за более чем 40 лет исследований метаболизма грибов, что позволило в определенной степени объяснить феномен сверхсинтеза органических кислот.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы состоит в том, что полученные результаты расширяют существующие знания о гене и ферменте синтеза ЛК из гриба A. niger, а также открывают новые перспективы дальнейших путей развития стратегии исследования как ЦС, так и всего метаболического пути, ведущего к аккумуляции цитрата, что может быть использовано для усовершенствования как условий ферментации продуцента, так и его самого с целью увеличения выходов целевого продукта.

Прикладная значимость работы заключается в том, что методика определения активности ЦС в бесклеточных гомогенатах может быть использована в качестве одного из параметров мониторинга жизнедеятельности и биосинтетической активности гриба-продуцента в ходе процесса ферментации ЛК. Помимо этого, разработанная научно-методическая база может быть использована для создания и реализации стратегии увеличения биосинтетической способности по целевому продукту промышленного гриба-продуцента A. niger.

Методология и методы исследования

Для решения данной фундаментальной задачи, использовались следующие подходы и методы:

1. Разработка и оптимизация методики деструкции мицелия посредством жидкого азота и последующей механической гомогенизацией для выделения нуклеиновых кислот из клеток гриба A. niger. Выделение нуклеиновых кислот из разрушенных клеток мицелия с использованием модификации методики Хомчинского.

2. Оценка количественных и качественных характеристик полученных препаратов нуклеиновых кислот посредством спектрофотометрии, а также с использованием электрофореза в агарозном геле.

3. Использование полученных препаратов РНК в реакции обратной транскрипции и ПЦР Дальнейшее секвенированию амплифицированных фрагментов на аппаратном комплексе MegaBACE DNA Analysis System.

4. Последующая обработка полученной информации о нуклеотидной последовательности гена ЦС с помощью программных средств, а также для трехмерного моделирования молекулы белка с использованием компьютерных технологий. Проведение анализа первичной последовательности с привлечением интернет баз данных (БД) и биоинформатических средств и подходов.

5. Подбор референсного гена, оптимизация ПЦР и программных методов оценки денситометрических данных для проведения оценки экспрессии гена ЦС. Построение экспрессионного профиля ЦС в ходе ферментации ЛК.

6. Синтез аффинного сорбента на основе полимерной перекрестно сшитой матрицы и реактивного хлортриазинового красителя Reactive Red 120, в качестве лиганда, для выделения белка ЦС из клеток гриба. Проведение аффинной хроматографии с использованием полученного сорбента для выделения и очистки ЦС из мицелия гриба A. niger.

7. Исследование биохимических и кинетических характеристик полученного препарата фермента ЦС с использованием спектрофотометрических, электрофоретических и программных методов.

8. Определение динамики активности ЦС гриба-продуцента в течение ферментационного процесса синтеза ЛК. Сопоставление полученных данных с биосинтетическими параметрами ферментации.

Положения, выносимые на защиту

1. Уровень экспрессии гена цитратсинтазы гриба-продуцента A.niger Л-4 и её каталитическая активность изменяются в ходе культивирования в условиях ферментационного процесса.

2. Регуляция цитратсинтазы гриба A.niger штамма Л-4 реализуется как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровнях.

3. По данным биоинформатических исследований установлены потенциальные пути реализации контроля цитратсинтазы гриба A.niger штамма Л-4.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность и обоснованность результатов диссертационной работы обеспечена применением адекватных и современных биохимических и молекулярно-генетических методов, достаточным объемом выборок, а также статистической обработкой полученных данных.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на ряде конференций с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» и «Инновации в здоровье нации» ежегодно начиная с 2013 г., а также на VIII Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2015 г., на VIII международной заочной научно-практической конференции «21 century: fundamental science and technology» США, Северный Чарльстон.

Тематика работы была поддержана грантом Фонда содействия инновациям УМНИК.

По материалам и основным результатам диссертационного исследования опубликовано 12 работ, 3 из которых в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 2 глав собственных результатов исследования, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах и иллюстрирована 11 таблицами и 39 рисунком. Библиография включает 294 литературных источников.

Глава 1. Обзор литературы

Производство лимонной кислоты является старейшим и наиболее изученным биотехнологическим процессом [5]. В настоящее время ЛК производится в промышленных масштабах, посредством культивации на сахаросодержащих средах мицелиального гриба Aspergillus niger. Поэтому грибы рода Aspergilli, в частности A. niger и A. oryzae, являются наиболее важными для коммерческого использования. Многие из аспектов важных для проведения высокоэффективного глубинного процесса ферментации ЛК определены Шу и Джонсоном [12-14].

Метаболический путь, ведущий к образованию и накоплению ЛК давно известен, равно как и параметры ферментации, что в итоге обуславливает высокий выход целевого продукта в промышленных условиях (около 200 г/л лимонной кислоты с 240 г/л глюкозы или сахарозы) [15]. Критические параметры для производства ЛК грибом А. niger были определены эмпирически и включают в себя: высокую концентрацию углеводов, низкую конечную концентрацию марганца (~10 ppm), поддержание высокого содержания растворенного в культуральной жидкости кислорода, постоянное перемешивание и низкий рН [16-18]. Эти физические и химические условия важны для формирования правильной морфологии гриба-продуцента, влияющей на поддержание клеточных агломератов во взвешенном состоянии, что также критично для синтеза ЛК [15,1921]. Исследования последних 60 лет показали важность этих параметров, но многие вопросы о физиологических и биохимических механизмах, лежащих в основе этих эмпирически полученных условий ферментации, остаются без ответа.

Множество работ, связанных одной целью, увеличить производительность имеющихся штаммов продуцентов, посвящено изучению ряда ферментов гликолитического, пентозофосфат-ного путей, глиоксилатного шунта и пр., но, что удивительно, только единицы затрагивают ключевой фермент синтеза ЛК (цитрата) - цитратсинтазу.

1.1. Цитратсинтаза. Роль в клеточном метаболизме.

Цитратсинтаза (EC: 2.3.3.1) - это представитель небольшого семейства ферментов (IPR002020), способных напрямую образовывать углерод-углеродную связь, не нуждаясь в ионах металлов в качестве кофакторов (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002020).

Цитратсинтаза - ключевой фермент цикла трикарбоновых кислот (Кребса, ЦТК), катализирующий стереоспецифический синтез лимонной кислоты из ацетил-кофермента А и оксалоаце-тата [6,23]. Цитратсинтаза обнаруживается в клетках почти всех живых существ, в Escherichia coli она была впервые обнаружена в 1965 году [24]. В эукариотических клетках реакция синтеза цитрата происходит в митохондриях, как первый шаг ЦТК [23], причем ЦС находится только в этих органеллах, за исключением растений [25,26] и дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae [27,28]. В мицелии гриба, культивированного на сахарозе или глюкозе, было показано,

что фермент ЦС локализована в матриксе митохондрий [8,29]. Цитратсинтаза также является количественным маркером наличия интактных митохондрий [30], а также белковым маркером ми-тохондриального матрикса [31]. В настоящее время гены, кодирующие ЦС, были клонированы и секвенированы из множества видов грибов, в том числе A. niger, A. nidulans [32], & cerevisiae [27,28,33,34], Neurospora crassa [35], а также клеток ряда животных и растений.

Метаболический путь, ведущий к накоплению ЛК, был выяснен в ходе радиоизотопных исследований, проведенными в 1950-х годах Мартином, Льюисом, Шу, Клеландом и другими [36-39]. Первые работы, выполненные с 14С02 и 14С-меченным ацетатом, установили механизм формирования цитрата путем конденсации "активного ацетата" (ацетил-КоА) и оксалоацетата, которые были получены декарбоксилированием пирувата и карбоксилированием пирувата, соответственно. В исследовании Клеланд и Джонсон использовали меченную D-[3,4-14C] глюкозу, что подтвердило «С2 плюс С4» механизм, они также продемонстрировали, что ЦТК существенно

Рисунок 1-1 Упрощенная схема биосинтеза цитрата в клетках A. niger [15].

Pyruvate Pyruvate

>Glucose

I J

замедлялся в условиях производства ЛК [39]. Центральная реакция в синтезе НМОК (см.рис. 1-1) - это фиксация СО2 на молекуле пирувата с образованием оксалоацетата [4]. Таким образом, высокие выходы, наблюдаемые в процессе производства ЛК, возможны, потому что все шесть атомов углерода субстрата (глюкозы или в фруктозы) сохраняются в ше-стиуглеродном продукте, ЛК, под действием пи-руваткарбоксилазы и ЦС (см. рис.1-1) [15].

Citratew Synthase Citrate

Биосинтез цитрата из глюкозы или сахарозы включает в себя большое число ферментативных реакций, происходящих в двух разных клеточных ком-партментах, а именно, в цитозоле и митохондриях

(см. рис. 1-2).

Рисунок 1-2. Схема синтеза и экспорта ЛК в клетках гриба-продуцента А. niger [15].

Бис

31

Fru + G le

Il J 1

;uc —► Fru + Sic

31 , ,j

21 D-GlcA-5-lactone ~~

Environment GIcA Citrate Oxalate

26|Г27? 28Г Citrate Oxalate

PPP-

3, 4_

23 24

-G le -6 -P—«-Tre- 5 - P—Tre

25

Fru-2,6-DiP

CytûSûl

S

Fru-6-P =1

Fru-1. 5-DIP Glyc-3-P^DHAP

8J

1, 3-DIP-GlycA

1 3-P-GlycA

»II

2-P-GlycA

-Il

13l \ , Pyruvate-^OAA^= Mal , - Citrate &s-Acon

if "

Oxalate + Acetate

Itaconate sol

17

1E

Acetyl-CoA

19

OAA^=. Mal

После поступления из внешней среды в ци-тозоль, глюкоза и/или фруктоза фосфорилиру-ются с образованием глюкозо-6-фосфата и/или фруктозо-6-фосфата, которые являются ключевыми точками разветвления гликолиза, синтеза внутриклеточных запасающих соединений, синтеза компонентов клеточной стенки и пентозо-фосфатного пути. Фруктоза фосфорилируется гексокиназой, а глюкоза фосфорилируется либо глюкокиназой, либо гексокиназой [15]. Гены обоих этих ферментов А. niger были клонированы и охарактеризованы [40,41]. На основании свойств этих двух ферментов было предположено, что на глюкокиназу приходится большая часть фосфорилированной глюкозы при рН 7,5, в то время на гексокиназу приходится больше фос-форилированной глюкозы при рН 6,5 при ее концентрации более 0,5 мМ [41]. Далее фосфорили-рованная глюкоза через гликолитический путь в цитозоле превращается в пируват. Одна молекула пирувата декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА посредством митохондриального пируватдегидрогеназного комплекса, а другая кар-боксилируется до оксалоацетата в цитозоле пируваткарбоксилазой. Оксалоацетат транспортируется в митохондрии (через малат) и конденсируется в ЦТК с ацетил-КоА посредством цитрат-синтазы с образованием цитрата. Последний транспортируется из митохондрий в цитоплазму и далее во внеклеточное пространство [15,23,42].

В этом процессе цитратсинтаза является ключевым ферментом, который помимо своей прямой синтетической функции имеет еще и ряд других, в частности, он осуществляет регуляцию цикла Кребса, а также способствует транспорту цитрата из митохондрий в цитоплазму [7]. Реакция, катализируемая этим ферментом, играет важную роль в ^-окислении жирных кислот, а у растений также в фото-респираторном гликолятном пути [43]. Цитрат для клетки гриба А. niger имеет огромное физиологическое значение, являясь энергетическим субстратом, являясь интер-медиатом в реакциях синтеза аминокислот и жирных кислот, энергетическим субстратом, переносчиком ацильной группы, а также играет регуляторную роль, хелатно связывая некоторые субстраты и коферменты, к примеру, ионы Mg2+ и других бивалентных металлов, необходимые для

'CitrateiS- c/s-Aeon

MitöChöndriOn

катализа [44]. Помимо физиологического, цитрат имеет большое биологическое значение, выделяясь во внешнюю среду и понижая рН, тем самым в диких условиях уменьшая конкуренцию за питательные ресурсы со стороны других микроорганизмов, ингибируя их рост. Широко известно, что цитрат и другие низкомолекулярные двухосновные органические кислоты (НМОК), продуцируемые грибами, обладают способностью к хелатному связыванию металлов, что имеет большое значение для растворения и поглощения минерального фосфора из среды, посредством комплексообразования с Ca2+ [45]. Цитрат также играет существенную роль в разложении древесины и природном распаде лигнина [4,46,47]. Таким образом сверхсинтез лимонной кислоты дает грибам продуцентам НМОК ощутимые преимущества в природе по сравнению с другими орга-низмами-сапрофитами. Этими фактами объясняется природная способность гриба A. niger к синтезу цитрата в количествах, превышающих необходимые для клетки.

Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста гриба-продуцента минеральными компонентами среды (фосфором, ионами Fe, Mn, Cu, Zn) и одновременном избыточном содержании источника углерода. Однако высокая концентрация цитрата была бы губительна для клетки, если бы не эффективность системы элиминирования избытка цитрата. В ходе процесса ферментации рН от начального значения 6.8 - 7.2 может снижается до исключительно низких 3.0 и менее 2.0, в то время как внутри клетки поддерживается постоянное близкое к нейтральному значение рН ~ 7.5 (концентрация внутриклеточного цитрата величина довольно постоянная и колеблется от 2 до 3 мМ) [15,48]. Это достигается благодаря наличию процесса, протекающего параллельно синтезу цитрата (см. рис.1-2). Посредством цитратного челночного механизма, при повышении концентрации цитрата в матриксе митохондрий, он переносится через внутреннюю мембрану по градиенту концентрации белками переносчиками — специализированной транспортной системой, включающей трикарбоксилатный переносчик - citrate carrier (CIC, CC) [44,49].

Преодолев наружную мембрану митохондрии посредством простой диффузии и попав в цитозоль, цитрат распадается в реакции, катализируемой АТФ-зависимой цитратлиазой. В результате этой реакции образуется оксалоацетат, возвращающийся в митохондрию, и цитозоль-ный ацетил-КоА, вступающий в реакции синтеза и активации жирных кислот, протекающие в цитоплазме [15,42]. Этот процесс «утилизации» цитратлиазой лимонной кислоты наиболее выражен в фазе роста гриба, когда происходит наиболее активное накопление биомассы, это объясняется тем, что клеточная стенка гриба помимо полисахаридов содержит большое количество жиров [50,51]. Последний механизм регуляции содержания ЛК в клетках состоит в удалении цитрата из клетки во внешнюю среду через проницаемую для него клеточную стенку.

Цитратсинтаза — митохондриальный белок, кодируемый ядерными генами и осуществляющий свои функции в матриксе митохондрий [33]. Биосинтез матричной РНК осуществляется в

ядре, после чего транскрипт транспортируется в цитоплазму, где на рибосомах шероховатого эн-доплазматического ретикулума (ШЭПР) происходит синтез полипептида, далее подвергающегося созреванию. Транспорт в митохондрии кодируемых в ядре белков происходит посредством различных механизмов, локализованных на внешней и внутренней мембранах митохондрий. Компоненты внешней мембраны, которые ответственны за рекогницию препротеинов и их перенос через внешнюю мембрану, организованы в единый мультикомпонентный ТОМ - (translocase of the outer membrane) комплекс [52,53]. Препротеины распознаются специфическими рецепторами импорта и связываются с субъединицами ТОМ-комплекса, далее они транспортируются к белок-специфичному проводящему каналу, также известному как главная пора импорта/инсер-ции GIP (general import/insertion pore), которая транслоцирует белки через внешнюю мембрану митохондрии [52,54]. Далее перенос белка внутрь/из митохондрии осуществляется посредством двух механизмов, TIM - (translocase of the inner membrane) комплексов, локализованных на внутренней мембране и специфичных для различных групп белков. Посредством TIM-комплексов зрелый белок импортируется в митохондрии, где и выполняет свои функции [52,55,56].

Стоит, однако, заметить, что транспорт протеинов через митохондриальные мембраны посредством ТОМ- и TIM-комплексов изучен только у таких грибов как N. crassa и S. cerevisiae. Определение основных характеристик этих транспортных комплексов у грибов, в частности у A. niger, является задачей будущих исследований, что поможет пролить свет на регуляцию экспорта/импорта белков и пептидов через митохондриальные мембраны, а это в свою очередь может открыть новые взгляды на регуляцию метаболических путей как в митохондриях, так и в клетках в целом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алексеев, Камиль Владимирович, 2017 год

Литература

1. Dhillon,G.S. Recent Advances in Citric Acid Bio-production and Recovery /G.S.Dhillon, S.Gur-preet,S.K.Brar,M.Verma,D.T.Rajeshwar//Food Bioprocess Technol—2011—Vol.4,№4—P.505-529.

2. Kirimura, K. Citric Acid / K. Kirimura, Y. Honda, T. Hattori // Comprehensive Biotechnology. — 2011. — Vol. 1. — P. 135-142.

3. Yoshida, S. Identification and characterization of genes related to the production of organic acids in yeast / S, Yoshida, A, Yokoyama // J. Biosci. Bioeng. — 2012. — Vol. 113, № 5. — P. 556-561.

4. Plassard, C. Regulation of low-molecular weight organic acid production in fungi / C. Plassard, P. Fransson // Fungal Biol. Rev. — 2009. — Vol. 23, № 1-2. — P. 30-39.

5. Currie, J.N. The Citric Acid Fermentation of Aspergillus Niger / J.N. Currie // J. Biol. Chem. — 1917. — Vol. 31. — P. 15-37.

6. Wiegand, G. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. / Wiegand G., Remington S.J. // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. — 1986. — Vol. 15. — P. 97-117.

7. Nelson, D.L. Lehninger Principles of Biochemistry / D.L. Nelson, M.M. Cox. — 4th Edition. — NY.: W.H. Freeman and Company, 2005. — 1100 p.

8. Jaklitsch, W.M. Intracellular location of enzymes involved in citrate production by Aspergillus niger/W.M.Jaklitsch, C.P.Kubicek, M.C.Scrutton// Can.J.Microbiol. — 1991. — Vol. 37. — P.823-827.

9. Machida, M. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae / M. Machida, K. Asai, M. Sano, T. Tanaka, T. Kumagai, G. Terai, K.-I. Kusumoto, T. Arima, Y. Kashiwagi, K. Abe, K. Gomi, H. Hori-uchi, K. Kitamoto, T. Kobayashi, M. Takeuchi, D.W. Denning, J.E. Galagan, W.C. Nierman, J. Yu, D.B. Archer, J.W. Bennett, D. Bhatnagar, T.E. Cleveland, N. D. Fedorova, O. Gotoh, H. Horikawa, A. Ho-soyama, M. Ichinomiya, R. Igarashi, K. Iwashita, P.R. Juvvadi, M. Kato, Y. Kato, T. Kin, A. Kokubun, H. Maeda, N. Maeyama, J.-I. Maruyama, H. Nagasaki, T. Nakajima, K. Oda, K. Okada, I. Paulsen, K. Sakamoto, T. Sawano, M. Takahashi, K. Takase, Y. Terabayashi, J. R. Wortman, O. Yamada, Y. Yam-agata, H. Anazawa, Y. Hata, Y. Koide, T. Komori, Y. Koyama, T. Minetoki, S. Su-harnan,A.Tanaka,K.Isono,S.Kuhara,N.Ogasawara,H.Kikuchi//Nature.—2005.—Vol.438.—P.1157-61.

10. Wortman, J.R. The 2008 update of the Aspergillus nidulans genome annotation: a community effort / J.R. Wortman, J.M. Gilsenan, V. Joardar, J. Deegan, J. Clutterbuck, M.R. Andersen, D. Archer, M. Bencina, G. Braus, P. Coutinho, H. von Döhren, J. Doonan, A.J.M. Driessen, P. Durek, E. Espeso, E. Fekete, M. Flipphi, CG. Estrada, S. Geysens, G. Goldman, P.W.J de Groot, K. Hansen, S.D. Harris, T. Heinekamp, K. Helmstaedt, B. Henrissat, G. Hofmann, T. Homan, T. Horio, H. Horiuchi, S. James, M. Jones, L. Karaffa, Z. Karanyi, M. Kato, N. Keller, D.E. Kelly, J.A.K.W. Kiel, J.M. Kim, I.J. van der Klei, F.M. Klis, Frans A. Kovalchuk, N. Krasevec, C.P. Kubicek, B. Liu, A. Maccabe, V. Meyer, P. Mirabito, M. Miskei, M. Mos, J. Mullins, D.R. Nelson, J. Nielsen, B.R. Oakley, S.A. Osmani, T. Pakula, A. Paszewski, I. Paulsen, S. Pilsyk, I. Pocsi, P.J. Punt, A.F.J. Ram, Q. Ren, X. Robellet, G. Robson, B.

Seiboth, P. van Solingen, T. Specht, J. Sun, N. Taheri-Talesh, N. Takeshita, D. Ussery, P.A. VanKuyk, H. Visser, P.J.I. van de Vondervoort, R.P. de Vries, J. Walton, X. Xiang, Y.Z. Xiong, An Ping, B.W. Brandt, M.J. Cornell, C.A.M.J.J. van den Hondel, J. Visser, S.G. Oliver, G. Turner, // Fungal Genet. Biol. — 2009. — Vol. 46, № 1. — P. S2-S13.

11. Andersen, M.R. Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88 / M.R. Andersen, M.P. Salazar, P.J. Schaap, P.J.I. Van De Vondervoort, D. Culley, J. Thykaer, J.C Frisvad, K.F. Nielsen, R. Albang, K. Albermann, R.M. Berka, , I.V. Grigoriev, C P. Kubicek, D. Martinez, N.N.M.E. Van Peij, JA. Roubos, J. Nielsen, S.E. Baker, // Genome Res. — 2011. — Vol. 21. — P. 885-897.

12. Gerhardt, P. Citric Acid Fermentation of Beet Molasses / P. Gerhardt, W.W. Dorrell, I.L. Baldwin // J. Bacteriol. — 1946. — Vol. 52, № 5. — P. 555-564.

13. Shu,P. Effect of the Composition of the Sporulation Medium on Citric Acid Production by Aspergillus niger in Submerged Culture/P.Shu,M.J.Johnson//J.Bacteriol.—1947.—Vol.54.—P. 161.

14. Shu, P. The Interdependence of Medium Constituents in Citric Acid Production by Submerged Fermentation / P. Shu, M.J. Johnson // J. Bacteriol. — 1948. — Vol. 56, № 5. — P. 577-585.

15. Magnuson, J.K.. Organic acid production by filamentous fungi / J.K. Magnuson, L.L. Lasure // Adv. Fungal Biotechnol. Ind. Agric. Med. — 2004. — P. 307-340.

16. Schreferl, G. Inhibition of citric acid accumulation by manganese ions in Aspergillus niger mutants with reduced citrate control of phosphofructokinase / G. Schreferl, C.P. Kubicek, M. Röhr // J. Bacteriol. — 1986. — Vol. 165, № 3. — P. 1019-1022.

17. Mirminachi F. Citric Acid Fermentation and Heavy Metal Ions - I. Effects of Iron, Manganese and Copper /F.Mirminachi, A.Zhang, M.Röhr //Acta Biotechnol.—2002.—Vol.22,№ 3-4.—P.363-373.

18. Zhang A. Citric Acid Fermentation and Heavy Metal Ions - II. The Action of Elevated Manganese Ion Concentrations / A. Zhang, M. Röhr // Acta Biotechnol. — 2002. — Vol. 22, № 3-4. — P.375-382.

19. Ryoo, D. Fungal fractal morphology of pellet formation in Aspergillus niger / D. Ryoo // Biotechnol. Tech. — 1999. — Vol. 13, № 1. — P. 33-36.

20. Jianlong, W. Enhancement of citric acid production by Aspergillus niger using n-dodecane as an oxygen-vector / W. Jianlong // Process Biochem. — 2000. — Vol. 35. — P. 1079-1083.

21. Kristiansen, B. Citric acid biotechnology / B. Kristiansen, J. Linden, M. Mattey. — London, UK: Taylor and Francis, 2002. — P. 200.

22. Citrate synthase (IPR002020) [Electronic resource] // InterPro: Protein sequence, analysis & classification. URL: http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002020.

23. Krebs, H.A. Metabolic Pathways / H.A. Krebs, J.M. Lowenstein; ed. D.M. Greenberg. — NY: Academic Press, 1960. — 175 p.

24. Ashworth, J.M. Location of the structural gene for citrate synthase on the chromosome of

Escherichia coli K12 / J.M. Ashworth, H L. Kornberg, D L. Nothmann // J. Mol. Biol. — 1965. — Vol. 11. — P. 654-657.

25. Beevers, H. Microbodies in Higher Plants / H. Beevers // Annu. Rev. Plant Physiol. — 1979. — Vol. 30, № 1. — P. 159-193.

26. Tolbert, N.E. Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes / N.E. Tolbert // Annu. Rev. Biochem. — 1981. — Vol. 50. — P. 133-157.

27. Jia, Y.K. The CIT3 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a second mitochondrial isoform of citrate synthase / Y.K. Jia, A.M. Becam, C.J. Herbert //Mol.Microbiol.—1997.—Vol.24— P.53-59.

28. Graybill, E.R. Functional comparison of citrate synthase isoforms from S. cerevisiae / E.R. Gray-bill, MF. Rouhier, C.E. Kirby, J.W. Hawes //Arch.Biochem.Biophys—2007. — Vol. 465. — P. 26-37.

29. Kubicek, C.P. Industrial Applications: Production of organic acids by filamentous fungi / C.P. Kubicek,P.Punt,J.Visser;ed.M.Hofrichter.—Heidelberg:Springer Berlin Heidelberg,2011.—215-234 p.

30. Graham, J.M. Preparation of crude subcellular fractions by differential centrifugation / J.M. Graham // Scientific World Journal. — 2002. — Vol. 2. — P. 1638-1642.

31. Ernster, L. Membranes of Mitochondria and Chloroplasts: Outer membrane of mitochondria / L. Ernster, B. Kuylenstierna; ed. E.V.N.R. Racker. — NY: Princeton, 1970. — P. 172-212.

32. Park, B.W. Cloning and characterization of the citA gene encoding the mitochondrial citrate synthase of Aspergillus nidulans / B.W. Park, K.H. Han, C.Y. Lee, C.H. Lee, P.J. Maeng // Mol. Cells. — 1997. — Vol. 7, № 2. — P. 290-295.

33. Suissa, M. Isolation of the nuclear yeast genes for citrate synthase and fifteen other mitochondrial proteins by a new screening method Mordechai / M. Suissa, K. Suda, G. Schatz // EMBO J. — 1984. — Vol. 3, № 8. — P. 1773-1781.

34. Kim, K.S. Saccharomyces cerevisiae contains two functional citrate synthase genes / K.S. Kim, M.S. Rosenkrantz, L. Guarente // Mol. Cell. Biol. — 1986. — Vol. 6, № 6. — P. 1936-1942.

35. Ferea, T. Characterization of the cit-1 gene from Neurospora crassa encoding the mitochondrial form of citrate synthase / T. Ferea, E.T. Contreras, T. Oung, E.J. Bowman, B.J. Bowman // Mol. Gen. Genet. — 1994. — Vol. 242, № 1. — P. 105-110.

36. Martin, S.M. Citric acid formation from 14CO2 by Aspergillus niger / S.M. Martin, P.W. Wilson , R.H. Burris // Arch. Biochem. — 1950. — № 26. — P. 103-111.

37. Lewis, K.F. Studies on the Mechanism of Citric Acid Production in Aspergillus Niger / K.F. Lewis, S. Weinhouse //J.Am.Chem.Soc. — 1951. —Vol. 73, № 6. — P. 2500-2503.

38. Bomstein, R.A., Johnson M.J. The mechanism of formation of citrate and oxalate by Aspergillus niger. // J. Biol. Chem. 1952. Vol. 198, № 1. P. 143-153.

39. Cleland, W.W. Tracer experiments on the mechanism of citric acid formation by Aspergillus niger / W.W. Cleland, M.J. Johnson // J. Biol. Chem. — 1954. — Vol. 208, № 2. — P. 679-689.

40. Panneman, H. Cloning and biochemical characterisation of an Aspergillus niger glucokinase. Evidence for the presence of separate glucokinase and hexokinase enzymes / H. Panneman, G.J. Ruijter, H.C. van den Broeck, E.T. Driever, J. Visser // Eur.J.Biochem.—1996.— Vol. 240, № 3. — P. 518-525.

41. Panneman, H. Cloning and biochemical characterisation of Aspergillus niger hexokinase--the enzyme is strongly inhibited by physiological concentrations of trehalose 6-phosphate / H. Panneman, G.J. Ruijter, H.C. van den Broeck, J. Visser // Eur.J.Biochem. 1998. — Vol. 258, № 1. — P. 223-232.

42. Kubicek, C.P. Citric Acid Fermentation / C.P. Kubicek, M. Röhr, H.J. Rehm // Critical Reviews in Biotechnology. — 1985. — Vol. 3, № 4. — P. 331-373.

43. Liu, J.H. Function of a citrate synthase gene (MaGCS) during postharvest banana fruit ripening / J.H. Liu, G.H. Chi, C.H. Jia, J.B. Zhang, B.Y. Xu, Z.Q. Jin // Postharvest Biol. Technol. — 2013. — Vol. 84. — P. 43-50.

44. Karaffa, L. Aspergillus niger citric acid accumulation: do we understand this well working black box? / L. Karaffa, C.P. Kubicek // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2003. — Vol. 61. — P. 189-196.

45. Jones, D.L. Organic acids in the rhizosphere - a critical review / D.L. Jones // Plant Soil. — 1998.

— Vol. 205, № 1. — P. 25-44.

46. Ruijter, G.J.G. Oxalic acid production by Aspergillus niger: an oxalate-non-producting mutant produces citric acid at pH 5 and in the presence of manganese / G.J.G. Ruijter, P.J.I. van de Vondervoort, J. Visser // Microbiol. — 1999. — Vol. 145. — P. 2569-2576.

47. Dhillon, G.S. Utilization of different agro-industrial wastes for sustainable bioproduction of citric acid by Aspergillus niger / G.S. Dhillon, S.K. Brar, M.T. Verma, D. Rajeshwar // Biochem. Eng. J. — 2011. — Vol. 54, № 2. — P. 83-92.

48. Ruijter, G.J.G. Properties of Aspergillus niger citrate synthase and effects of citA overexpression on citric acid production / G.J.G. Ruijter, H. Panneman, D.B. Xu, J. Visser // FEMS Microbiol. Lett. — 2000. — Vol. 184. — P. 35-40.

49. Current Topics in Cellular Regulation, Vol. 33: From Metabolite, to Metabolism, to Metabolon / A. Levitzki, P. Boon Chock, E.R. Stadtman. NY:Science,Academic Press,Inc.,1992.—Vol.33.—P.442.

50. Johnston, I.R. The composition of the cell wall of Aspergillus niger / I.R. Johnston // Biochem. J.

— 1965. — Vol. 96, № 3. — P. 651-658.

51. Walton, J.D. Deconstructing the Cell Wall / J.D. Walton // Plant Physiol. — 1994. — Vol. 104.

— P.1113-1118.

52. Ahting, U. The TOM Core Complex: The General Protein Import Pore of the Outer Membrane of Mitochondria / U. Ahting, C. Thun, R. Hegerl, D. Typke, F.E. Nargang, W. Neupert, S. Nussberger, // J. Cell Biol. — 1999. — Vol. 147, № 5. — P. 959-968.

53. Cheng, T.-L. Identification and characterization of the mitochondrial targeting sequence and mechanism in human citrate synthase / T.-L. Cheng, C.-C. Liao, W.-H. Tsai, C.-C. Lin, C.-W. Yeh, CF. Teng, W.-T. Chang // J. Cell. Biochem. — 2009. — Vol. 107, № 1. — P. 1002-1015.

54. Kiebler, M. Identification of a mitochondrial receptor complex required for recognition and membrane insertion of precursor proteins / M. Kiebler, R. Pfaller, T. Söllner, G. Griffiths, H. Horstmann, N. Pfanner, W. Neupert // Nature. — 1990. — Vol. 348, № 6302. — P. 610-616.

55. Koehler, C.M. Import of mitochondrial carriers mediated by essential proteins of the intermembrane space / C.M. Koehler, E. Jarosch, K. Tokatlidis, K. Schmid, R.J. Schweyen, G.Schatz // Science. — 1998. — Vol. 279, № 5349. — P. 369-373.

56. Kirimura, K. Cloning and sequencing of the chromosomal DNA and cDNA encoding the mitochondrial citrate synthase of Aspergillus niger WU-2223L / K. Kirimura, M. Yoda, I. Ko, Y. Oshida, K. Miyake, S. Usami // J. Biosci. Bioeng. — 1999. — Vol. 88, № 3. — P. 237-243.

57. Маргелис, Л. Роль симбиоза в эволюции клетки / Л. Маргелис. — М.: Мир, 1983. — 352 c.

58. Gerike, U. Citrate synthase and 2-methylcitrate synthase: structural, functional and evolutionary relationships / U. Gerike, D.W. Hough, N.J. Russell, ML. Dyall-Smith, M.J. Danson, // Microbiology. — 1998. — Vol. 144 — P. 929-935.

59. Russell, R.J. Structural adaptations of the cold-active citrate synthase from an Antarctic bacterium /R.J.Russell,U.Gerike,M.J.Danson,D.W.Hough,G.L.Taylor//Structure.—1998.—Vol.6.—P.351-361.

60. Beeckmans, S. Some structural and regulatory aspects of citrate synthase / S. Beeckmans // Int. J. Biochem. — 1984. — Vol. 16, № 4. — P. 341-351.

61. Sutherland, K.J. Citrate synthase from the thermophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum. Cloning and sequencing of the gene / K.J. Sutherland, C.M. Henneke, P. Towner, D.W. Hough, M.J. Danson. // Eur. J. Biochem. — 1990. — Vol. 194, № 3. — P. 839-844.

62. Patton, A.J. Does Escherichia coli possess a second citrate synthase gene? / A.J. Patton, D.W. Hough, P. Towner, M.J. Danson // Eur. J. Biochem. — 1993. — Vol. 214, № 1. — P. 75-81.

63. Lesk, A. Introduction to Bioinformatics / A. Lesk. — 3rd ed. — Oxford: Oxford University Press, 2008. — P. 474 p.

64. Rosenkrantz, M. Mitochondrial and nonmitochondrial citrate synthases in Saccharomyces cerevisiae are encoded by distinct homologous genes / M. Rosenkrantz, T. Alam, K.S. Kim, B.J. Clark, P.A. Srere, LP. Guarente // Mol. Cell. Biol. — 1986. — Vol. 6, № 12. — P. 4509-4515.

65. Evans, C.T. Isolation, nucleotide sequence, and expression of a cDNA encoding pig citrate synthase / C.T. Evans, D.D. Owens, B. Sumegi, G. Kispal, P.A. Srere // Biochemistry. — 1988. — Vol. 27, № 13. — P. 4680-4686.

66. Unger, E.A. Isolation of a cDNA encoding mitochondrial citrate synthase from Arabidopsis thaliana / E.A. Unger, J.M. Hand, A.R. Cashmore, A.C. Vasconcelos // Plant Mol. Biol. — 1989. — Vol. 13, № 4. — P. 411-418.

67. Numata, O. Tetrahymena 14-nm filament-forming protein has citrate synthase activity / O. Nu-mata, T. Takemasa, I. Takagi, M. Hirono, H. Hirano, J. Chiba, Y. Watanabe // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1991. — Vol. 174, № 2. — P. 1028-1034.

68. Fukaya, M. Cloning of genes responsible for acetic acid resistance in Acetobacter aceti / M. Fu-kaya, H. Takemura, H. Okumura, Y. Kawamura, S. Horinouchi, T. Beppu // J. Bacteriol. — 1990. — Vol. 172, № 4. — P. 2096-2104.

69. Heinzen, R.A. Sequence and linkage analysis of the Coxiella burnetii citrate synthase-encoding gene / R.A. Heinzen, M.E. Frazier, L P. Mallavia // Gene. — 1991. — Vol. 109, № 1. — P. 63-69.

70. Bhayana, V. Amino acid sequence of Escherichia coli citrate synthase / V. Bhayana, H.W. Duckworth // Biochemistry. — 1984. — Vol. 23, № 13. — P. 2900-2905.

71. Gavel, Y. Cleavage-site motifs in mitochondrial targeting peptides / Y. Gavel, G. von Heijne // Protein Eng. — 1990. — Vol. 4, № l. P. — 33-37.

72. Dudek, J. Mitochondrial protein import: Common principles and physiological networks / J. Dudek, P. Rehling, M. van der Laan // Biochim.Biophys.Acta.—2013.—Vol.1833, № 2. — P. 274-285.

73. Liao, X.S. Intramitochondrial functions regulate nonmitochondrial citrate synthase (CIT2) expression in Saccharomyces cerevisiae / X.S. Liao, W.C. Small, P.A. Srere, R.A. Butow // Mol. Cell. Biol. — 1991. — Vol. 11, № 1. — P. 38-46.

74. Sumegi, B. Channeling of TCA cycle intermediates in cultured Saccharomyces cerevisiae / B. Sumegi, A.D. Sherry, C R. Malloy // Biochemistry. — 1990. — Vol. 29, № 39. — P. 9106-9110.

75. Gurr, S.J. The structure and organization of nuclear genes of filamentous fungi / S.J. Gurr, S.E. Unkles, J R. Kinghorn // Spec. Publ. Soc. Gen. Microbiol. — 1987. — № 22. — P. 93-139.

76. Dave, K. Utility of Aspergillus niger citrate synthase promoter for heterologous expression / K. Dave, N.S. Punekar // J. Biotechnol. — 2011. — Vol. 155, № 2. — P. 173-177.

77. Jones, M.G. The first filamentous fungal genome sequences: Aspergillus leads the way for essential everyday resources or dusty museum specimens? / M.G. Jones // Microbiology. — 2007. — Vol. 153, № 1. — P. 1-6.

78. Kubicek, C.P. Regulation of citrate synthase from the citric acid-accumulating fungus, Aspergillus niger / C.P. Kubicek, M. Röhr // Biochim. Biophys. Acta. — 1980. — Vol. 615, № 2. — P. 449-457.

79. de Jongh, W. A. Enhanced citrate production through gene insertion in Aspergillus niger / W.A. de Jongh, J. Nielsen // Metab. Eng. — 2008. — Vol. 10. — P. 87-96.

80. Ruijter, G.J.G. Overexpression of phosphofructokinase and pyruvate kinase in citric acid-producing Aspergillus niger / G.J.G. Ruijter, H. Panneman, J. Visser // Biochim. Biophys. Acta — 1997.

— Vol. 1334. — P. 317-326.

81. Torres, N. V. Optimization of nonlinear biotechnological processes with linear programming: Application to citric acid production by Aspergillus niger / N.V. Torres, E.O. Voit, C. Gonzalez-Alcon // Biotechnol. Bioeng. — 1996. — Vol. 49. — P. 247-258.

82. Remington, S. Crystallographic refinement and atomic models of two different forms of citrate synthase at 2.7 and 1.7 A resolution / S. Remington, G. Wiegand, R. Huber // J. Mol. Biol. — 1982. — Vol. 158, № 1. — P. 111-152.

83. Roccatano, D. Investigation of the mechanism of domain closure in citrate synthase by molecular dynamics simulation / D. Roccatano, A.E. Mark, S. Hayward // J. Mol. Biol. — 2001. — Vol. 310. — P.1039-1053.

84. Goodsell, D.S. Citrate Synthase / D.S. Goodsell, T. Scripps // RCSB PDB Mol.—2007.— P. 1-2.

85. Патент РФ 2007125728/13, 10.09.2009. Шарова Н.Ю., Позднякова Е.А., Выборнова Т.В., Кулев Д.Х. Дмитрий Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы. // Патент России № 1811697. 1993. Бюл. № 40.

86. Tucker, K.G. Mycelial morphology: The effect of spore inoculum level / K.G. Tucker, C.R. Thomas // Biotechnol. Lett. — 1992. — Vol. 14, № 11. — P. 1071-1074.

87. Bernstein, J.A. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays / J.A. Bernstein, A.B. Khodursky, P.-H.

Lin, S. Lin-Chao, S.N. Cohen // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. — 2002. — Vol. 99, № 15. — P. 9697-9702.

88. Sharova, L. V. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells / L.V. Sharova, A. Sharov, T. Nedorezov, Y. Piao, N. Shaik, M. Ko, S.H. Minoru // DNA Res. — 2009. — Vol. 16, № 1. — P.45-58.

89. Burden, D. Guide to the homogenization of biological samples / D. Burden // Random Prim. — 2012. — № 12. — P. 1-25.

90. Krieg, P.A. A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis / P.A. Krieg. — London: John Wiley & Sons, 1996. — 464 p.

91. Chomczynski, P. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on / P. Chomczynski, N. Sacchi // Nat. Protoc.

— 2006. — Vol. 1, № 2. — P. 581-585.

92. Sallau, A.B. Aspergillus niger-specific ribonucleic acid extraction method / A.B. Sallau, F.N. Hen-riquez, A.J.Nok, S.Ibrahim, C.Sommerville, C.Roberts//J.Yeast Fungal Res.—2013.—Vol.4— P.58-62.

93. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook. — 3rd ed. — USA, Cold Spring:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. — P. 999.

94. Quantifying and Storing RNA [Electronic resource]. URL: http://www.molecularcloning.com/index.php?prt=71.

95. Абрамова, З.И. Исследование белков и нуклеиновых кислот / З.И. Абрамова. — Казань: Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина, 2006. — 157 c.

96. Assessing RNA Quality [Electronic resource]. URL: http://www.lifetechnologies.com/ru/ru/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/tech-notes/assessing-rna-quality.html.

97. Okonechnikov, K. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit / K. Okonechnikov, O. Golosova, M. Fursov // Bioinformatics. — 2012. —Vol. 28, № 8. — P. 1166-1167.

98. Jensen, L.J. STRING 8 — a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms / L.J. Jensen, M. Kuhn, M. Stark, S. Chaffron, C. Creevey, J. Muller, T. Doerks, P. Julien, A. Roth, M. Simonovic, P. Bork, C. von Mering // Nucleic Acids Res. — 2009. — Vol. 37 — P. D412-6.

99. Szklarczyk, D. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored / D. Szklarczyk, A. Franceschini, M. Kuhn, M. Simonovic, A. Roth, P. Minguez, T. Doerks, M. Stark, J. Muller, P. Bork, L.J. Jensen, C. von Mering // Nucleic Acids Res. — 2011. — Vol. 39 — P. D561-8.

100. Claros, M.G. Computational Method to Predict Mitochondrially Imported Proteins and their Targeting Sequences /M.G.Claros,P.Vincens//Eur.J.Biochem. — 1996. — Vol. 241, № 3. —P.779-786.

101. Emanuelsson, O. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools / O. Eman-uelsson, S. Brunak, G. von Heijne, H. Nielsen // Nat. Protoc. — 2007. — Vol. 2, № 4. — P. 953-971.

102. Neuberger, G. Prediction of peroxisomal targeting signal 1 containing proteins from amino acid sequence / G. Neuberger, S. Maurer-Stroh, B. Eisenhaber, A. Hartig, F. Eisenhaber // J. Mol. Biol. — 2003. — Vol. 328, № 3. — P. 581-592.

103. Neuberger, G. Motif refinement of the peroxisomal targeting signal 1 and evaluation of taxon-specific differences / G. Neuberger, S. Maurer-Stroh, B. Eisenhaber, A. Hartig, F. Eisenhaber // J. Mol. Biol. — 2003. — Vol. 328, № 3. — P. 567-579.

104. Duckert, P. Prediction of proprotein convertase cleavage sites / P. Duckert, S. Brunak, N. Blom // Protein Eng. Des. Sel. — 2004. — Vol. 17, № 1. — P. 107-112.

105. Petersen, T.N. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions / T.N. Petersen, S. Brunak, G. von Heijne, H. Nielsen // Nat. Methods. — 2011. — Vol. 8, № 10. — P. 785-786.

106. Xue, Y. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy / Y. Xue, J. Ren, X. Gao, C. Jin, L. Wen, X. Yao // Mol. Cell. Proteomics. — 2008. — Vol. 7, №9. — P.1598-1608.

107. Trost, B. Computational prediction of eukaryotic phosphorylation sites / B. Trost, A. Kusalik // Bioinformatics. — 2011. — Vol. 27, № 21. — P. 2927-2935.

108. Ismail, H.D. RF-Phos: A Novel General Phosphorylation Site Prediction Tool Based on Random Forest / H.D. Ismail, A. Jones, J.H. Kim, R.H. Newman, D.B.Kc // Biomed Res.Int. — 2016. Vol.2016.— P.1-12.

109. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond / T. Hunter //Cell.—2000.—Vol.100. — P. 113-127.

110. Newman, R.H. Toward a systems-level view of dynamic phosphorylation networks / R.H. Newman, J. Zhang, H. Zhu // Front. Genet. Frontiers. — 2014. — Vol. 5. — P. 263.

111. Boersema, P.J. Phosphopeptide fragmentation and analysis by mass spectrometry / P.J. Boersema, S. Mohammed, A.J.R. Heck // J. Mass Spectrom. RF-Phos: A Novel General Phosphorylation Site Prediction Tool Based on — 2009. — Vol. 44, № 6. — P. 861-878.

112. Newman, R.H. Construction of human activity-based phosphorylation networks / R.H. Newman, J. Hu, H.-S. Rho, Z. Xie, C. Woodard, J. Neiswinger, C. Cooper, M. Shirley, H.M. Clark, S. Hu, W. Hwang, J.S. Jeong, G. Wu, J. Lin, X. Gao, Q. Ni, R. Goel, S. Xia, H. Ji, K.N. Dalby, M.J. Birnbaum, P.A. Cole, S. Knapp, A.G. Ryazanov, D.J. Zack, S. Blackshaw, T. Pawson, A.-C. Gingras, S. Desiderio, A. Pandey, B E. Turk, J. Zhang, H. Zhu, J. Qian //Mol.Syst.Biol.—2013.—Vol.9 — P. 655.

113. Blom, N. Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites / N. Blom, S. Gammeltoft, S. Brunak // J. Mol. Biol. — 1999. — Vol. 294, № 5. — P. 1351-1362.

114. Ingrell, C.R. NetPhosYeast: prediction of protein phosphorylation sites in yeast / C.R. Ingrell, M L. Miller, O.N. Jensen, N. Blom // Bioinformatics. — 2007. — Vol. 23, № 7. — P. 895-897.

115. Horn, H. KinomeXplorer: an integrated platform for kinome biology studies / H. Horn, E.M. Schoof, J. Kim, X. Robin, ML. Miller, F. Diella, A. Palma, G. Cesareni, L.J. Jensen, R. Linding // Nat. Methods. — 2014. — Vol. 11, № 6. — P. 603-604.

116. Dou, Y. PhosphoSVM: prediction of phosphorylation sites by integrating various protein sequence attributes with a support vector machine / Y. Dou, B. Yao, C. Zhang // Amino Acids. — 2014. — Vol. 46, № 6. — P. 1459-1469.

117. Huang, H.-D. KinasePhos: a web tool for identifying protein kinase-specific phosphorylation sites / H-D. Huang, T.-Y. Lee, S.-W. Tzeng, J.-T. Horng //Nucleic Acids Res.—2005.—Vol.33—P.226-229.

118. Wong, Y.-H. KinasePhos 2.0: a web server for identifying protein kinase-specific phosphorylation sites based on sequences and coupling patterns / Y.-H.Wong, T.-Y. Lee, H.-K. Liang, C.-M. Huang, T-Y. Wang, Y.-H. Yang, C.-H. Chu, H.-D. Huang, M.-T. Ko, J.-K. Hwang // Nucleic Acids Res. — 2007.

— Vol. 35. — P. W588-94.

119. Xue, Y. GPS 2.1: enhanced prediction of kinase-specific phosphorylation sites with an algorithm of motif length selection / Y. Xue, Z. Liu, J. Cao, Q. Ma, X. Gao, Q. Wang, C. Jin, Y. Zhou, L. Wen, J. Ren // Protein Eng. Des. Sel. — 2011. — Vol. 24, № 3. — P. 255-260.

120. Petersen, B. A generic method for assignment of reliability scores applied to solvent accessibility predictions / B. Petersen, T. N. Petersen, P. Andersen, M. Nielsen, C. Lundegaard // BMC Struct. Biol.

— 2009. — Vol. 9, № 9. — P. 51.

121. Allfrey, V.G. Structural Modifications of Histones and their Possible Role in the Regulation of RNA Synthesis / V.G. Allfrey, A.E. Mirsky // Science. — 1964. — Vol. 144, № 3618. — P. 559.

122. Pazin, M.J. What's up and down with histone deacetylation and transcription? / M.J. Pazin, J.T. Kadonaga // Cell. — 1997. — Vol. 89, № 3. — P. 325-328.

123. Kim, S.C. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey / S.C. Kim, R. Sprung, Y. Chen, Y. Xu, H. Ball, J. Pei, T. Cheng, Y. Kho, H. Xiao, L. Xiao, N.V. Grishin, M. White, X.-J. Yang, Y. Zhao // Mol. Cell. — 2006. — Vol. 23, № 4. — P. 607-618.

124. Choudhary, C. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions / C. Choudhary, C. Kumar, F. Gnad, M L. Nielsen, M. Rehman, T.C. Walther, J.V. Olsen, M. Mann // Science. — 2009. — Vol. 325, № 5942. — P. 834-840.

125. Zhao, S. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation / S. Zhao, W. Xu, W. Jiang, W. Yu, , S.M. Hancock, F. He, L. Qin, J. Chin, P. Yang, X. Chen, Q. Lei, Y. Xiong, K.-L. Guan // Science. — 2010. — Vol. 327, № 5968. — P. 1000-1004.

126. Lu, Z. Bioinformatic analysis and post-translational modification crosstalk prediction of lysine acetylation / Z.Lu, Z.Cheng, Y.Zhao, S.L.Volchenboum //PLoS One.—2011.— Vol.6 —P. e28228.

127. Sakaguchi, K. DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade / K. Sakaguchi, J.E. Herrera, S. Saito, T. Miki, M. Bustin, A. Vassilev, C.W. Anderson, E. Appella // Genes Dev. — 1998. — Vol. 12, № 18. — P. 2831-2841.

128. Brooks, C.L. Ubiquitination, phosphorylation and acetylation: the molecular basis for p53 regulation / C.L. Brooks, W. Gu // Curr. Opin. Cell Biol. — 2003. — Vol. 15, № 2. — P. 164-171.

129. Feng, L. Functional analysis of the roles of posttranslational modifications at the p53 C terminus in regulating p53 stability and activity / L. Feng, T. Lin, H. Uranishi, W. Gu, Y. Xu, // Mol. Cell. Biol. — 2005. — Vol. 25, № 13. — P. 5389-5395.

130. Caron, C. Regulatory cross-talk between lysine acetylation and ubiquitination: role in the control of protein stability /C.Caron,C.Boyault,S.Khochbin//Bioessays — 2005. —Vol. 27, № 4. — P.408-415.

131. Garcia, B.A. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells / B.A. Garcia, J.J. Pesavento, C.A. Mizzen, N.L. Kelleher, // Nat. Methods. — 2007. —Vol. 4, № 6. — P. 487-489.

132. Taverna S.D. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini / S.D. Taverna, B.M. Ueberheide, Y. Liu, A.J. Tackett, R.L. Diaz, J. Shabanowitz, B.T. Chait, D.F. Hunt, C D. Allis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2007. — Vol. 104—P.2086-2091.

133. Yang, X.-J. Lysine acetylation: codified crosstalk with other posttranslational modifications / X-J. Yang, E. Seto // Mol. Cell. — 2008. — Vol. 31, № 4. — P. 449-461.

134. Yang, X.-J. The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men / X.-J. Yang, E. Seto // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. — 2008. — Vol. 9, № 3. — P. 206-218.

135. Protein Modification Sites: Citrate synthase, mitochondrial [Electronic resource] // ProteomScout. URL: https://proteomescout.wustl.edu/proteins/111467/modifications..

136. Batra, P.P. Effect of lysine modification on the secondary structure of ovalbumin / P.P. Batra,

M.A. Roebuck, D. Uetrecht // J. Protein Chem. — 1990. — Vol. 9, № 1. — P. 37-44.

137. Xu, X. Helix formation in model peptides based on nucleolin TPAKK motifs / X. Xu, L.G. Cooper, P.J. DiMario, J.W. Nelson // Biopolymers. — 1995. — Vol. 35, № 1. — P. 93-102.

138. Liu, Z. CPLA 1.0: an integrated database of protein lysine acetylation/Z.Liu,J.Cao,X.Gao, Y. Zhou, L.Wen,X.Yang,X.Yao,J.Ren,Y.Xue // Nucleic Acids Res. — 2011. — Vol. 39 — P. D1029-34.

139. Liu, Z. CPLM: a database of protein lysine modifications / Z. Liu, Y. Wang, T. Gao, Z. Pan, H. Cheng, Q. Yang, Z. Cheng, A. Guo, J. Ren, Y. Xue // Nucleic Acids Res.—2014.—Vol.42—P.D531-6.

140. Kiemer, L. NetAcet: prediction ofN-terminal acetylation sites / L. Kiemer, J.D. Bendtsen, N. Blom // Bioinformatics. — 2005. — Vol. 21, № 7. — P. 1269-1270.

141. Hou, T. LAceP: lysine acetylation site prediction using logistic regression classifiers / T. Hou, G. Zheng, P. Zhang, J. Jia, J. Li, L. Xie, C. Wei, Y. Li // PLoS One. — 2014. — Vol. 9, № 2. — P. e89575.

142. Suo, S.-B. Position-Specific Analysis and Prediction for Protein Lysine Acetylation Based on Multiple Features / S.-B. Suo, J.-D. Qiu, S.-P. Shi, X.-Y. Sun, S.-Y. Huang, X. Chen, R.-P. Liang // PLoS One. — 2012. — Vol. 7, № 11. — P. e49108.

143. Li, A. Prediction of NE-acetylation on internal lysines implemented in Bayesian Discriminant Method / A. Li, Y. Xue, C. Jin, M. Wang, X. Yao // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2006. — Vol. 350, № 4. — P. 818-824.

144. Li, T. Characterization and prediction of lysine (K)-acetyl-transferase specific acetylation sites / T. Li, Y. Du, L. Wang, L. Huang, W. Li, M. Lu, X. Zhang, W.-G. Zhu // Mol. Cell. Proteomics. — 2012. — Vol. 11, № 1. — P. M111.011080.

145. Wang, L. ASEB: a web server for KAT-specific acetylation site prediction / L. Wang, Y. Du, M. Lu, T. Li // Nucleic Acids Res. — 2012. — Vol. 40 — P. W376-9.

146. Li, T. Systematic identification of Class I HDAC substrates / T. Li, B. Song, Z. Wu, M. Lu, W-G. Zhu // Brief. Bioinform. — 2014. — Vol. 15, № 6. — P. 963-972.

147. Xie, Z. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones / Z. Xie, J. Dai, L. Dai, M. Tan, Z. Cheng, Y. Wu, J.D. Boeke, Y. Zhao // Mol. Cell. Proteomics. — 2012. — Vol.11, №5.—P.100-107.

148. Zhang, Z. Identification of lysine succinylation as a new post-translational modification / Z. Zhang, M. Tan, Z. Xie, L. Dai, Y. Chen, Y. Zhao // Nat.Chem.Biol— 2011—Vol.7,№1—P.58-63.

149. Weinert, B.T. Lysine succinylation is a frequently occurring modification in prokaryotes and eukaryotes and extensively overlaps with acetylation / B.T. Weinert, C. Schölz, S.A. Wagner, V. Ies-mantavicius, D. Su, J.A. Daniel, C. Choudhary // Cell Rep. — 2013. — Vol. 4, № 4. — P. 842-851.

150. Choudhary, C. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling / C. Choudhary, B.T. Weinert, Y. Nishida, E. Verdin, M. Mann // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. — 2014. — Vol. 15, № 8. — P. 536-550.

151. Lin, H. Protein Lysine Acylation and Cysteine Succination by Intermediates of Energy

Metabolism / H. Lin, X. Su, B. He // ACS Chem. Biol. — 2012. — Vol. 7, № 6. — P. 947-960.

152. Xu, H.-D.SuccFind: a novel succinylation sites online prediction tool via enhanced characteristic strategy /H.-D.Xu,S.-P.Shi,P.-P.Wen,J.-D.Qiu//Bioinformatics.—2015.—Vol.31,№23.—P.3748-3750.

153. Xu, Y. iSuc-PseAAC: predicting lysine succinylation in proteins by incorporating peptide position-specific propensity / Y. Xu, Y.-X. Ding, J. Ding, Y.-H. Lei, L.-Y. Wu, N.-Y. Deng // Sci. Rep.

— 2015. — Vol. 5. — P. 10184.

154. Jia, J. iSuc-PseOpt: Identifying lysine succinylation sites in proteins by incorporating sequence-coupling effects into pseudo components and optimizing imbalanced training dataset / J. Jia, Z. Liu, X. Xiao, B. Liu, K.-C. Chou // Anal. Biochem. — 2016. — Vol. 497. — P. 48-56.

155. Jia, J. pSuc-Lys: Predict lysine succinylation sites in proteins with PseAAC and ensemble random forest approach / J.Jia, Z.Liu, X.Xiao,B.Liu,K.-C.Chou//J.Theor.Biol.—2016.—Vol.394.—P.223-230.

156. Chen, H. MeMo: a web tool for prediction of protein methylation modifications / H. Chen, Y. Xue, N. Huang, X. Yao, Z. Sun // Nucleic Acids Res. — 2006. — Vol. 34 — P. W249-53.

157. Qiu, W.-R. et al. iMethyl-PseAAC: identification of protein methylation sites via a pseudo amino acid composition approach / W.-R. Qiu, X. Xiao, W.-Z. Lin, K.-C. Chou // Biomed Res. Int. 2014. — Vol. 2014. — P. 947416.'

158. Shien, D.-M. Incorporating structural characteristics for identification of protein methylation sites / D.-M. Shien, T.-Y. Lee, W.-C. Chang, J. B.-K. Hsu, J.-T. Horng, T.-Y. Wang, H. D. Huang // J. Comput. Chem. — 2009. — Vol. 30, № 9. — P. 1532-1543.

159. Qiu, W.-R. iUbiq-Lys: prediction of lysine ubiquitination sites in proteins by extracting sequence evolution information via a gray system model / W.-R. Qiu, X. Xiao, W.-Z. Lin, K.-C. Chou, // J. Biomol. Struct. Dyn. — 2015. — Vol. 33, № 8. — P. 1731-1742.

160. Radivojac, P. Identification, analysis, and prediction of protein ubiquitination sites / P. Radivojac, V. Vacic, C. Haynes, R.R. Cocklin, A. Mohan, J.W. Heyen, M.G. Goebl, L.M. Iakoucheva, // Proteins.

— 2010. — Vol. 78, № 2. — P. 365-380.

161. Chen, Z. Towards more accurate prediction of ubiquitination sites: a comprehensive review of current methods, tools and features / Z. Chen, Y. Zhou, Z. Zhang, J. Song // Brief. Bioinform. — 2015.

— Vol. 16, № 4. — P. 640-657.

162. Chen, Z. Prediction of ubiquitination sites by using the composition of k-spaced amino acid pairs /Z.Chen,Y.-Z.Chen,X.-F.Wang,C.Wang,R.-X.Yan,Z.Zhang//PLoS One.—2011.—Vol.6.—P.22930.

163. Chen, Z. hCKSAAP_UbSite: improved prediction of human ubiquitination sites by exploiting amino acid pattern and properties / Z. Chen, Y. Zhou, J. Song, Z. Zhang // Biochim. Biophys. Acta. — 2013. — Vol. 1834, № 8. — P. 1461-1467.

164. Lu, C.-T. DbPTM 3.0: an informative resource for investigating substrate site specificity and functional association of protein post-translational modifications / C.-T. Lu, K.-Y. Huang, M.-G. Su, T.-

Y. Lee, N.A. Bretaña, W.-C. Chang, Y.-J. Chen, Y.-J. Chen, H.-D. Huang // Nucleic Acids Res. —2013.

— Vol. 41 — D295-305.

165. Huang, K.-Y. dbPTM 2016: 10-year anniversary of a resource for post-translational modification of proteins / K.-Y. Huang, M.-G. Su, H.-J. Kao, Y.-C. Hsieh, J.-H. Jhong, K.-H. Cheng, H.-D. Huang, T.-Y. Lee // Nucleic Acids Res. — 2016. — Vol. 44, № D1. — P. D435-46.

166. Pejaver, V. The structural and functional signatures of proteins that undergo multiple events of post-translational modification / V. Pejaver, W.-L. Hsu, F. Xin, A.K. Dunker, V.N. Uversky, P. Radivojac // Protein Sci. — 2014. — Vol. 23, № 8. — P. 1077-1093.

167. Garnier, J. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins / J. Garnier, D. Osguthorpe, B. Robson // J. Mol. Biol. — 1978.

— Vol. 120, № 1. — P. 97-120.

168. Garnier, J. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence / J. Garnier, J.F. Gibrat, B. Robson // Methods Enzymol. — 1996. — Vol. 266. — P. 540-553.

169. Jones, D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices / D.T. Jones // J. Mol. Biol. — 1999. — Vol. 292, № 2. — P. 195-202.

170. Bryson,K. Protein structure prediction servers at University College London/K.Bryson, L.J. McGuffin,R.L.Marsden,J.J.Ward,J.S.Sodhi,D.T.Jones//Nucleic AcidsRes.—2005.—Vol.33—P.36-8.

171. Webster, D.M. Methods in molecular biology: Protein Structure Prediction / D.M. Webster, D.G. Higgins, W.R. Taylor; ed. D.M. Webster. — NJ, Totowa : Humana Press, 2000. — Vol. 143. — P. 410.

172. Schneider, M. The Swiss-Prot protein knowledgebase and ExPASy: providing the plant community with high quality proteomic data and tools / M. Schneider, M. Tognolli, A. Bairoch // Plant Physiol. Biochem. — 2004. — Vol. 42, № 12. — P. 1013-1021.

173. Guex, N. Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer: a historical perspective / N. Guex, M.C. Peitsch, T. Schwede // Electrophoresis. — 2009.

— Vol. 30 Suppl 1, № S1. — P. S162-73.

174. Biasini, M. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information / M. Biasini, S. Bienert, A. Waterhouse, K. Arnold, G. Studer, T. Schmidt, F. Kiefer, T.G.Cassarino,M.Bertoni,L.Bordoli,T.Schwede//Nucleic Acids Res.—2014.—Vol.42—P.252-8

175. Kiefer, F. The SWISS-MODEL Repository and associated resources / F. Kiefer, K. Arnold, M. Künzli, L. Bordoli, T. Schwede // Nucleic Acids Res. — 2009. — Vol. 37 — P. D387-92.

176. Berman, H. The worldwide Protein Data Bank (wwPDB): ensuring a single, uniform archive of PDB data / H. Berman, K. Henrick, H. Nakamura, J.L. Markley // Nucleic Acids Res. — 2007. — Vol. 35 — P. D301-D303.

177. Bordoli, L. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace / L. Bordoli, F. Kiefer, K. Arnold, P. Benkert, J. Battey, T. Schwede // Nat. Protoc. Nature—2009.—'Vol.4.—P.1-13.

178. Söding, J. Protein homology detection by HMM-HMM comparison / J. Söding // Bioinformatics.

— 2005. — Vol. 21, № 7. — P. 951-960.

179. Benkert, P. QMEAN server for protein model quality estimation / P. Benkert, M. Künzli, T. Schwede // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37, № Web Server issue. P. W510-4.

180. Benkert P., Biasini M., Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. // Bioinformatics. — 2011. — Vol. 27, № 3. — P. 343-350.

181. Ramachandran, G.N. Stereochemistry of polypeptide chain configurations / G.N. Ramachandran, C. Ramakrishnan, V. Sasisekharan // J. Mol. Biol. — 1963. — Vol. 7. — P. 95-99.

182. Lovell, S.C. Structure validation by Calpha geometry: phi,psi and Cbeta deviation / S.C. Lovell, I.W. Davis, W.B. Arendall, P.I.W. de Bakker, J.M. Word, M.G. Prisant, J.S. Richardson, D C. Richardson // Proteins. — 2003. — Vol. 50, № 3. — P. 437-450.

183. Sonnhammer, E. A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences / E. Sonnhammer, G. von Heijne, A. Krogh // Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. — 1998. — Vol. 6. — P. 175-182.

184. Krogh, A. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes / A. Krogh, B. Larsson, G. von Heijne, E.L. Sonnhammer // J. Mol. Biol. — 2001.

— Vol. 305, № 3. — P. 567-580.

185. Möller, S. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions / S. Möller, M.D. Croning, R. Apweiler // Bioinformatics. — 2002. — Vol. 18, № 1. — P. 218.

186. McPherson, M.J. PCR: The basics / M.J. McPherson, S.G. Moller. — 2nd ed. — NY.: Taylor & Francis Group, 2006. — P. 305.

187. Spriewald, B.M. Differential role for competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction and intracellular cytokine staining as diagnostic tools for the assessment of intragraft cytokine profiles in rejecting and nonrejecting heart allografts / B.M. Spriewald, M. Hara, A. Bushell, S. Jenkins, P.J. Morris, K.J. Wood // Am. J. Pathol. — 2000. — Vol. 157, № 5. — P. 1453-1458.

188. Souazé, F. Quantitative RT-PCR: Limits and accuracy / F. Souazé, A. Ntodou-Thomé, C.Y. Tran, W. Rostène, P. Forgez // Biotechniques. — 1996. — Vol. 21, № 2. — P. 280-285.

189. BiochemLabSolutions [Electronic resource]. URL: biochemlabsolutions.com.

190. Girish, V. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ / V. Girish, A. Vijayalakshmi // Indian J. Cancer. — 2004. — Vol. 41, № 1. — P. 47.

191. Gassmann, M. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry / M. Gassmann, B. Grenacher, B. Rohde, J. Vogel // Electrophoresis. — 2009. — Vol. 30, № 11. — P. 1845-1855.

192. Jiang ,Y. Physiological Response, Cell Wall Components, and Gene Expression of Switchgrass under Short-Term Drought Stress and Recovery / Y. Jiang, Y. Yao, Y. Wang. // Crop Sci. — 2012. — Vol. 52, № 6. — P. 2718.

193. Parvin, R. Purification and some properties of yeast citrate synthase / R. Parvin, D.E. Atkinson // Arch. Biochem. Biophys. — 1968. — Vol. 128, № 8. — P. 528-533.

194. Srere, P. A. Citric Acid Cycle / P.A.Srere//Methods Enzymol—1969—Vol.13,№1945 —P.3-11.

195. Moriyama, T. Purification of Rat and Rat Liver Citrate Synthases. Physical, Kinetic, and Immunological Studie /T.Moriyama,P.A.Srere//J.Biol.Chem— 1971—Vol.246,№10—P.3217-3223.

196. Wang, A.H.-J. A crystallographic investigation of citrate synthase from pig and chicken heart muscle / A.H.-J.Wang, M L Sherman, A. Rich // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1978. —Vol. 82, № 1. — P. 150-156.

197. Beeckmans, S. Purification and Physicochemycal Characterization of Chicken Heart Citrate Synthase / S. Beeckmans, L. Kanarek // Int. J. Biochem. — 1983. — Vol. 15, № 4. — P. 469-478.

198. Kispal, G. Studies on yeast peroxisomal citrate synthase / G. Kispal, P.A. Srere // Arch. Biochem. Biophys. — 1991. — Vol. 286, № 1. — P. 132-137.

199. HaeckelR, R. Purification and allosteric properties of yeast pyruvate kinase / R. Haeckel, B. Hess, W. Lauterborn, K.H. Wüster // Hoppe. Seylers. Z. Physiol. Chem. — 1968—Vol.349,№5—P.699-714.

200. Staal, G.E.J. Human erythrocyte pyruvate kinase. Its purification and some properties / G.E.J. Staal, J.F. Koster, H. Kamp, L. Van Milligen-Boersma, C. Veeger // Biochim. Biophys. Acta - Enzymol. — 1971. — Vol. 227, № 1. — P. 86-96.

201. Labrou, N.E. Theory and Practice of Biochromatography: Immobilised synthetic dyes in affinity chromatography / N.E. Labrou, Y.D. Clonis; ed. A.M. Vijayalakshmi. — Netherlands: Harwood Academic Publishers, 2002. — P. 544.

202. Labrou, N.E. Dye-ligand affinity adsorbents for enzyme purification / N.E. Labrou // Mol. Biotechnol. — 2002. — Vol. 20, № 1. — P. 77-84.

203. Magdeldin, S. Affinity Chromatography: Principles and Applications / S. Magdeldin, A. Moser; ed. S. Magdeldin. — Croatia, Rijeka: InTech, 2012. — P. 3-29.

204. Subramanian, S. Dye-ligand affinity chromatography: the interaction of Cibacron Blue F3GA with proteins and enzymes / S. Subramanian // CRC Crit. Rev. Biochem.—1984.—Vol.16,№2.—P.169-205.

205. Thompson, S.T. Blue dextran-sepharose: an affinity column for the dinucleotide fold in proteins / S.T.Thompson, K.H.Cass,E.Stellwagen//Proc.Natl.Acad.Sci.USA— 1975 —Vol.72,№2—P.669-672.

206. Hondmann, D.H. Screening method for large numbers of dye-adsorbents for enzyme purification / D.H. Hondmann, J. Visser // J. Chromatogr. — 1990. — Vol. 510. — P. 155-164.

207. Small, D.A. Affinity labelling of enzymes with triazine dyes. Isolation of a peptide in the catalytic domain of horse-liver alcohol dehydrogenase using Procion blue MX-R as a structural probe / D.A. Small, C R. Lowe, T. Atkinson, C.J. Bruton // Eur. J. Biochem. — 1982. — Vol. 128, №1.—P.119-123.

208. Zhang, F. Ozonation of the purified hydrolyzed azo dye Reactive Red 120 (CI) / F. Zhang, A.

Yediler, X. Liang, A. Kettrup // J. Environ. Sci. Health. A. Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. — 2002.

— Vol. 37, № 4. — P. 707-713.

209. Auta, M. Batch adsorbtion of Reactive Red 120 from waste waters using activated carbon from waste tea / M. Auta // Int. J. Adv. Eng. Technol. — 2012. — Vol. 3, № 3. — P. 24-28.

210. Melissis, S.C. New family of glutathionyl-biomimetic ligands for affinity chromatography of glutathione-recognising enzymes / S.C. Melissis, D.J. Rigden, Y.D. Clonis // J. Chromatogr. A. — 2001.

— Vol. 917, № 1-2. — P. 29-42.

211. Labrou, N.E. Biomimetic-dye affinity adsorbents for enzyme purification: application to the one-step purification of Candida boidinii formate dehydrogenase / N.E. Labrou, A. Karagouni, Y.D. Clonis // Biotechnol. Bioeng. — 1995. — Vol. 48, № 3. — P. 278-288.

212. Burton, S.J. Design and applications of biomimetic anthraquinone dyes / S.J. Burton, C.V. Stead, C.R. Lowe // J. Chromatogr. A. — 1988. — Vol. 455. — P. 201-216.

213. Ochoa, S. Biosynthesis of dicarboxylic acids by carbon dioxide fixation. I. Isolation and properties of an enzyme from pigeon liver catalyzing the reversible oxidative decarboxylation of l-malic acid / S. Ochoa, A H. Mehler, A. Kornberg // J. Biol. Chem. — 1948. — Vol. 174. — P. 979-1000.

214. Briggs, G. A Note on the Kinetics of Enzyme Action / G. Briggs, J. Haldane // Biochem J. — 1925. — Vol. 19, № 2. — P. 338-339.

215. Dixon, M. Enzymes / M. Dixon, E. Webb — 2nd Ed. — London: Longmans, 1964. — P. 950.

216. Cornish-Bowden, A. Fundamentals of Enzyme Kinetics / A. Cornish-Bowden — 4th ed. — NY: Wiley-Blackwell, 2012. — P. 510.

217. Florini, J.R. Graphical determination of the dissociation constants for two substrate enzyme systems / J.R. Florini, C.S. Vestling // Biochim. Biophys. Acta. — 1957. — Vol. 25. — P. 575-578.

218. Goudar,C.T. Parameter estimation using a direct solution of the integrated Michaelis-Menten equation/C.T.Goudar,J.R.Sonnad,R.G.Duggleby//Biochim.Biophys.—1999.—Vol.1429—P.377-383.

219. Goudar, C.T. Progress curve analysis for enzyme and microbial kinetic reactions using explicit solutions based on the Lambert W function / C.T. Goudar, S.K. Harris, M.J. Mclnerney, J.M. Suflita // J. Microbiol. Methods. — 2004. — Vol. 59, № 3. — P. 317-326.

220. Brunelle, J.L. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE) / J.L. Brunelle, R. Green // Methods Enzymol. — 2014. — Vol. 541. — P. 151-159.

221. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / U.K. Laemmli // Nature. — 1970. — Vol. 227, № 5259. — P. 680-685.

222. Quality assessment of total RNA [Electronic resource]. URL: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html..

223. Lovett, J.S. Molecular weights of the ribosomal ribonucleic acid of fungi / J.S. Lovett, J.A. Haselby // Arch. Mikrobiol. — 1971. — Vol. 80, № 3. — P. 191-204.

224. Tkacz, J.S. Advances in fungal biotechnology for industry, agriculture and medicine / J.S. Tkacz, L. Lange. — New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2004. — P. 1-454.

225. Rotmistrovsky, K. A web server for performing electronic PCR / K. Rotmistrovsky, W. Jang, G.D. Schuler // Nucleic Acids Res. — 2004. — Vol. 32 — P. W108-12.

226. Qu, W. MFEprimer: Multiple factor evaluation of the specificity of PCR primers / W. Qu, Z. Shen, D. Zhao, Y. Yang, C. Zhang // Bioinformatics. — 2009. — Vol. 25, № 2. — P. 276-278.

227. Qu, W. MFEprimer-2.0: a fast thermodynamics-based program for checking PCR primer specificity/W.Qu,Z.Shen,D.Zhao,Y.Yang,C.Zhang//Nucleic Acids Res.—2012.—Vol.40—P.205-208.

228. Cline, J. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases / J. Cline, J.C. Braman, H.H. Hogrefe // Nucleic Acids Res. — 1996. — Vol. 24, № 18. — P. 3546-3551.

229. Bailey, T L. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching / T.L. Bailey, M. Boden, F A. Buske, M. Frith, C.E. Grant, L. Clementi, J. Ren, W.W. Li, W.S. Noble // Nucleic Acids Res. — 2009.

— Vol. 37 — P. W202-8.

230. Henikoff, S. Automated assembly of protein blocks for database searching / S. Henikoff, J.G. Henikoff // Nucleic Acids Res. — 1991. — Vol. 19, № 23. — P. 6565-6572.

231. Henikoff, S. Protein family classification based on searching a database of blocks / S. Henikoff, J.G. Henikoff // Genomics. — 1994. — Vol. 19, № 1. — P. 97-107.

232. Yogev, O. Dual targeting of mitochondrial proteins: mechanism, regulation and function / O. Yogev, O. Pines // Biochim. Biophys. Acta. — 2011. — Vol. 1808, № 3. — P. 1012-1020.

233. Murray, S.L.. Metabolic and developmental effects resulting from deletion of the citA gene encoding citrate synthase in Aspergillus nidulans / S.L. Murray, M.J. Hynes // Eukaryot. Cell. — 2010.

— Vol. 9, № 4. — P. 656-666.

234. Meyer, U. The glycosylphosphatidylinositol (GPI) signal sequence of human placental alkaline phosphatase is not recognized by human Gpi8p in the context of the yeast GPI anchoring machinery / U. Meyer, P. Fraering, R. Bosson, I. Imhof, M. Benghezal, C. Vionnet, A. Conzelmann // Mol. Microbiol. — 2002. — Vol. 46, № 3. — P. 745-748.

235. Ferguson, M.A. Glycosylphosphatidylinositol Anchors / M.A. Ferguson, T. Kinoshita, G.W. Hart.

— Cold Spring: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009. — P. 143162

236. Levental, I. Greasing their way: lipid modifications determine protein association with membrane rafts / I. Levental, M. Grzybek, K.Simons // Biochemistry. American Chemical Society. — 2010. — Vol. 49, № 30. — P. 6305-6316.

237. Cheng, H. dbPPT: a comprehensive database of protein phosphorylation in plants / H. Cheng, W. Deng, Y. Wang, J. Ren, Z. Liu, Y. Xue // Database. — 2014. — Vol. 2014 — P. 1-8.

238. Ullah, S. dbPAF: an integrative database of protein phosphorylation in animals and fungi / S. Ul-lah, S. Lin, Y. Xu, W. Deng, L. Ma, Y. Zhang, Z. Liu, Y. Xue // Sci. Rep. — 2016. — Vol. 6. — P.23534.

239. UniProt [Electronic resource]. URL: http://www.uniprot.org

240. ProteomeScout Portal [Electronic resource]. URL: https://proteomescout.wustl.edu.

241. Pel, H.J. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88 / H.J. Pel, J.H. de Winde, D.B. Archer, P.S. Dyer, G. Hofmann, P.J. Schaap, G. Turner, R.P. de Vries, R. Albang, K. Albermann, M.R. Andersen, J.D. Bendtsen, J.A.E. Benen, M. van den Berg, S. H.J. Kools, CP. Kubicek, P.A. van Kuyk, J. Lauber, X. Lu, M. van H. Wedler, H.A.B. Wösten, A.-P.Zeng,A.vanOoyen,J.Visser,H.Stam//Nat.Biotechnol.—2007.—Vol.25,№ 2.—P.221-231.

242. Kosti, I. Comparative analysis of fungal protein kinases and associated domains / I. Kosti, Y. Mandel-Gutfreund, F. Glaser, B.A. Horwitz // BMC Genomics. — 2010. — Vol. 11, № 1. — P. 133.

243. Ji, L.L. Enzymatic down regulation with exercise in rat skeletal muscle / L.L. Ji, F.W. Stratman, H.A. Lardy // Arch. Biochem. Biophys. — 1988. — Vol. 263, № 1. — P. 137-149.

244. Siu, P.M. Citrate synthase expression and enzyme activity after endurance training in cardiac and skeletal muscles / P.M. Siu, DA. Donley, R.W. Bryner, S.E. Alway // J. Appl. Physiol. — 2003. —Vol. 94, № 2. — P. 555-560.

245. PTM-BioLabs [Electronic resource] // Succinylation, Yet A Novel PTM Pathway for Biological Regulation, But Ready to Be Investigated. URL: http://ptm-biolab.com/succinylation-2/.

246. Sillero, A. Isoelectric point determination of proteins and other macromolecules: oscillating method / A. Sillero, A. Maldonado // Comput. Biol. Med. — 2006. — Vol. 36, № 2. — P. 157-166.

247. Kozlowski, L P. IPC - Isoelectric Point Calculator / L P. Kozlowski // Biology Direct. — 2016.

— Vol. 11, № 55. — P. 1-16.

248. Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook: Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server //, Humana Press / E. Gasteiger, C. Hoogland, A. Gattiker, S. Duvaud, M.R. Wilkins, R.D. Appel, A. Bairoch, A.; ed. J.M. Walker. — Zurich: Humana Press, 2005. — P. 571-607.

249. Peptide Property Calculator [Electronic resource] URL: http://biotools.nubic.northwestern.edu/proteincalc.html.

250. Ciechanover, A. How are substrates recognized by the ubiquitin-mediated proteolytic system? / A. Ciechanover, A.L. Schwartz // Trends Biochem. Sci. 1989. — Vol. 14, № 12. — P. 483-488.

251. Varshavsky, A. The N-end rule pathway of protein degradation / A. Varshavsky // Genes Cells. — 1997. — Vol. 2, № 1. — P. 13-28.

252. Guruprasad, K. Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition: a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence / K. Guruprasad, B.V. Reddy, M.W. Pandit // Protein Eng. — 1990. — Vol. 4, № 2. — P. 155-161.

253. Ikai, A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins / A. Ikai // J. Biochem. — 1980.

— Vol. 88, № 6. — P. 1895-1898.

254. Kyte, J. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F.

Doolittle // J. Mol. Biol. — 1982. — Vol. 157, № 1. — P. 105-132.

255. Yachdav, G. PredictProtein — an open resource for online prediction of protein structural and functional features / G. Yachdav, E. Kloppmann, L. Kajan, M. Hecht, T. Goldberg, T. Hamp, P. Hönigschmid, A. Schafferhans, M. Roos, M. Bernhofer, L. Richter, H. Ashkenazy, M. Punta, A. Schlessinger, Y. Bromberg, R. Schneider, G. Vriend, C. Sander, N. Ben-Tal, B. Rost // Nucleic Acids Res. — 2014. — Vol. 42 — P. W337-343.

256. Remmert, M. Lightning-fast iterative protein sequence searching by HMM-HMM alignment / M. Remmert, A. Biegert, A. Hauser, J. Söding // Nat Methods. — 2011. — № 6. — P. 1-15.

257. Larson, S.B. Structure of pig heart citrate synthase at 1.78 A resolution / S.B. Larson, J.S. Day, C. Nguyen, R. Cudney, A. McPherson // Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. — 2009. — Vol. 65, № 5. — P. 430-434.

258. Flory,P.J. Statistical mechanics of chain molecules/P.J.Flory.—NY:IntersciPub.,1969.—P.432.

259. Bayer, E. Evidence from inhibitor studies for conformational changes of citrate synthase / E. Bayer, B. Bauer, H. Eggerer // Eur. J. Biochem. — 1981. — Vol. 120. — P. 155-160.

260. Hansel, B.C., Powell G.L. Regulation of Enzymes by Fatty Acyl Coenzyme A. / B.C. Hansel, G.L. Powell // 1984. — Vol. 259, — № 3. — P. 1423-1430.

261. Karpusas, M. Proposed mechanism for the condensation reaction of citrate synthase: 1.9-Ä structure of the ternary complex with oxaloacetate and carboxymethyl coenzyme A / M. Karpusas, B. Branchaud, S.J. Remington // Biochemistry. — 1990. — Vol. 29, № 9. — P. 2213-2219.

262. Merklinger, E. Membrane integration of a mitochondrial signal-anchored protein does not require additional proteinaceous factors / E. Merklinger, Y. Gofman, A. Kedrov, A.J.M. Driessen, N. Ben-Tal, Y. Shai, D. Rapaport // Biochem. J. — 2012. — Vol. 442, № 2. — P. 381-389.

263. Sternberg,S.R. Biomedical Image Processing /S.R.Sternberg//Comp.—1983.—Vol.16—P.22-34.

264. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. [Electronic resource]. — 2012. — P. 47. — URL: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf.

265. Hames, B.D. Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach. / B.D. Hames — 3d ed. — UK: Oxford University Press, 1998. — P. 373.

266. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice / R. Westermeier, T. Naven. — 4th ed. — Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2005. — P. 426.

267. National Library of Medicine [Electronic resource] // MeSH Descriptor Data. URL: https://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=Prealbumin.

268. Zhi, W. Renaturation of citrate synthase : Influence of denaturant and folding assistants / W. Zhi, S.J. Landry, L.M. Gierasch, P.A. Srere // Protein Science. — 1992. — Vol.2 — P. 522-529.

269. Cordewener, J. A permeabilized cell assay system for studying enzyme regulation and localisation in Aspergillus niger / J. Cordewener, R. Busink, J. Visser // J. Microbiol. Methods. — 1989. — Vol. 10.

— P. 231-240.

270. Srere, P. A. The citrate cleavage enzyme. I. Distribution and purification / P.A. Srere // J. Biol. Chem. — 1959. — Vol. 234. — P. 2544-2547.

271. Johansson, C. Evidence that Citrate Synthase Operates by an Ordered Ternary-Complex Mechanism / C. Johansson, G. Pettersson // Eur. J. Biochem. — 1974. — Vol. 388. — P. 383-388.

272. Johansson, C. Substrate-inhibiton by acetyl-CoA in the condensation reaction between oxaloacetate and acetyl-CoA catalyzed by citrate synthase from pig heart / C. Johansson, G. Pettersson // Biochim. Biophys. Acta. — 1977. — Vol. 484, № 1. — P. 208-215.

273. Beard, D.A. Detailed enzyme kinetics in terms of biochemical species: study of citrate synthase / D A. Beard, K.C. Vinnakota, F. Wu // PLoS One. — 2008. — Vol. 3, № 3. — P. e1825.

274. Lescovac, V. Comprehensive Enzyme Kinetics / V. Lescovac. — New York: Kluwer Academic Publishers, 2004. — P. 451.

275. Team:Wageningen [Electronic resource] // Engineering_morphology. URL: http://2013.igem.org/Team:Wageningen_UR/Engineering_morphology.

276. Патент №2317995 27.02.2008 Данилевич В.Н., Гришин Е.В. Способ получения ассоциированной с клеточными оболочками денатурированной геномной ДНК дрожжей или грамположительных бактерий // Патент РФ №2317995. 2008. Бюл. № 22.

277. Felenbok,B. Ethanol catabolism in Aspergillus nidulans: a model system for studying gene regulation/B.Felenbok,M.Flipphi,I.Nikolaev//Prog.Nucl.Acid.Res.—2001.—Vol.69.—P.149-204.

278. Drysdale, M.R. The Aspergillus niger carbon catabolite repressor encoding gene, creA / M.R. Drysdale, S.E. Kolze, J.M. Kelly // Gene. — 1993. — Vol. 130, № 2. — P. 241-245.

279. Ruijter, G.J.G. Carbon repression in Aspergilli / G.J.G. Ruijter, J. Visser // FEMS Microbiol. Lett.

— 1997. — Vol. 151. — P. 103-114.

280. Min, I.S. Differential expression of citA gene encoding the mitochondrial citrate synthase of Aspergillus nidulans in response to developmental status and carbon sources / I.S. Min, J. Bang, S. Young, W. Soon, C.H. Lee, P.J. Maeng // J. Microbiol. — 2010. — Vol. 48, № 2. — P. 188-198.

281. Kato,M. An overview of the CCAAT-box binding factor in filamentous fungi: assembly, nuclear translocation, and transcriptional enhancement /M.Kato// Biosci. Biotech. Biochem.—2005.— Vol.69—P.663-672.

282. Johansson, C.J. Evidence that Citrate Synthase Operates by an Ordered Ternary-Complex Mechanism / C.J. Johansson, G. Pettersson // Eur. J. Biochem. — 1974. — Vol. 42, № 2. — P.383-388.

283. Ratledge, C. Life is not that simple / C. Ratledge, G.J.G. Ruijter // FEMS Microbiol Lett. — 2000.

— Vol. 189, № 2. — P. 317-318.

284. Ahmed, A.U. Import Of Nuclear-Encoded Mitochondrial Proteins. A Cotranslational Perspective /A.U.Ahmed,P.R Fisher//Intern. Review of Cell and Molecular Biology.—2009.—'Vol.273—P.49-68.

285. Schmidt, O. Regulation of mitochondrial protein import by cytosolic kinases / O. Schmidt, A.B. Harbauer, S. Rao, B. Eyrich, R.P. Zahedi, D. Stojanovski, B. Schönfisch, B. Guiard, A. Sickmann, N. Pfanner, C. Meisinger // Cell. — 2011. — Vol. 144, № 2. — P. 227-239.

286. Behnia, R. Targeting of the Arf-like GTPase Arl3p to the Golgi requires N-terminal acetylation and the membrane protein Syslp / R. Behnia, B. Panic, J.R.C. Whyte, S. Munro // Nat. Cell Biol. — 2004. — Vol. 6, № 5. — P. 405-413.

287. Lee J. Mitochondrial localization of CNP2 is regulated by phosphorylation of the N-terminal targeting signal by PKC: implications of a mitochondrial function for CNP2 in glial and non-glial cells /J.Lee,R.C.O'Neill,M.W.Park,M.Gravel,P.E.Braun//Mol.Cell.Neurosci.—2006.—Vol.31—P.446-462.

288. O'Rourke, B. Mitochondrial Protein Phosphorylation as a Regulatory Modality: Implications for Mitochondrial Dysfunction in Heart Failure / B. O'Rourke, J.E. Van Eyk, D.B. Foster // Congest. Hear. Fail. — 2011. — Vol. 17, № 6. — P. 269-282.

289. Merrill, R.A. N-terminal phosphorylation of protein phosphatase 2A/Bß2 regulates translocation to mitochondria, dynamin-related protein 1 dephosphorylation, and neuronal survival / R.A. Merrill, A.M. Slupe, S. Strack // FEBS J. — 2013. — Vol. 280, № 2. — P. 662-673.

290. 0rtenblad, N. Reduced insulin-mediated citrate synthase activity in cultured skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes: Evidence for an intrinsic oxidative enzyme defect / N. 0rtenblad, M. Mogensen, I. Petersen, K. Hajlund, K. Levin, K. Sahlin, H. Beck-Nielsen, M. Gaster // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. — 2005. — Vol. 1741, № 1-2. — P. 206-214.

291. Newman, J.C. Mitochondrial protein acylation and intermediary metabolism: regulation by sirtuins and implications for metabolic disease / J.C. Newman, W. He, E. Verdin // J. Biol. Chem. — 2012. — Vol. 287, № 51. — P. 42436-42443.

292. Kawauchi, M. Fungus-specific sirtuin HstD coordinates secondary metabolism and development through control of LaeA / M. Kawauchi, M. Nishiura, K. Iwashita // Eukaryot. Cell. American Society for Microbiology. — 2013. — Vol. 12, № 8. — P. 1087-1096.

293. Walsh, K. Compensatory regulation in metabolic pathways—responses to increases and decreases in citrate synthase levels / K. Walsh, M. Schena, A.J. Flint, D.E. Koshland // Biochem. Soc. Symp. — 1987. — Vol. 54. — P. 183-195.

294. Патент РФ № 1811697, 05.03.1991. В.М. Голубцова, В.П. Ермакова, Е.С. Минц, Т.А. Никифорова, А.В. Галкин, В.М. Финько, В.Н. Жданова Штамм гриба Aspergillus niger -продуцент лимонной кислоты // Патент СССР № 1811697. 1991. Бюл. № 28.