Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Семенова, Маргарита Викторовна

• Семенова, Маргарита Викторовна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Семенова, Маргарита Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурные полисахариды клеточных стенок растений.

1.1. Строение пектина.

1.1.1. Основная цепь пектина.

1.1.2. Боковые цепи пектина.

1.1.3. Неуглеводные заместители в пектине.

Глава 2. Биодеградация пектина.

2.1 .Полигалактуроназы.

2.1.1. Гены, кодирующие синтез полигалактуроназ.

2.1.2. Структура и механизм действия полигалактуроназ.

2.1.3. Биохимические свойства энгЬ-полигалактуроназ A. niger.

2.2. Пектинэстеразы.

2.2.1. Структура и механизм действия пектинэстераз.

2.2.2. Влияние различных факторов на активность пектинэстераз. щ 2.3. Пектин- и пектатлиазы.

2.3.1. Структура и механизм действия пектин- и пектатлиаз.

2.3.2. Биохимические свойства пектин- и пектатлиаз.

Глава 3. Распространение в природе и использование пектиназ.

Глава 4. Грибы рода Aspergillus.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. Объекты исследования и методика эксперимента.

5.1. Материалы.

5.1.1. Микроорганизмы и условия культивирования.

5.1.2. Ферментные препараты.

5.1.3. Субстраты и реактивы.

5.2. Хроматографическое разделение препаратов и выделение ферментов.

5.3. Определение концентрации белка.

5.4. Определение биохимических характеристик ферментов.

5.5. Методы определения активности ферментов.

5.5.1. Определение активности к полисахаридным субстратам.

5.5.2. Определение активности к л-нитрофенильным производным Сахаров.

5.5.3. Определение пектинлиазной активности.

5.5.4. Определение пектинэстеразной активности.

5.5.5. Вискозиметрический метод определения общей пектиназной активности.

5.6. Определение кинетических параметров действия ферментов.

5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от рН и температуры.

5.8. Изучение рН- и термостабильности ферментов.

5.9. Исследование изменения ММР продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

5.10. Проведение гидролиза пектинов под действием ферментов.

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков.

5.12. Оценка способности ферментов к осветлению яблочного сока.

5.13. Оценка способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов. 59 III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Поиск и создание продуцентов пектиназ.

6.1. Мутагенез и селекция гриба A. japonicus.

6.2. Сравнение ферментного состава препаратов на основе исходного и мутантного штаммов A. japonicus.

6.3. Мутагенез и селекция гриба A. foetidus.

Глава 7. Выделение гомогенных пектиназ.

7.1. Выделение пектиназ A. japonicus.

7.1.1. Очистка полигалактуроназы.

7.1.2. Очистка пектинэстеразы.

7.1.3. Очистка пектинлиазы.

7.2. Выделение пектиназ A. foetidus.

7.2.1. Очистка полигалактуроназы.

7.2.2. Очистка пектинэстеразы.

7.3. Анализ препаратов A. niger и выделение основных пектиназ.

7.3.1. Субстратная специфичность препаратов A. niger.

7.3.2. Аналитическое фракционирование препарата A. niger.

7.3.3. Препаративное разделение препарата A. niger.

7.3.4. Очистка полигалактуроназ.

7.3.5. Очистка пектинэстеразы.

7.3.6. Очистка пектинлиазы.

Глава 8. Идентификация пектиназ с помощью масс-спектрометрического анализа их трипсиновых гидролизатов.

Глава 9. Свойства выделенных пектиназ.

9.1. Субстратная специфичность и кинетические параметры действия ферментов.

9.2. Влияние температуры и рН на активность и стабильность пектиназ.

9.3. Изучение механизма гидролиза пектинов под действием полигалактуроназ и пектинлиаз.

Глава 10. Взаимодействие ферментов при действии на пектины.

10.1. Явления синергизма и антагонизма в системах полигалактуроназа : пектинэстераза и пектинлиаза : пектинэстераза.

10.2. Глубокий гидролиз пектинов.

10.2.1. Гидролиз пектинов под действием индивидуальных пектиназ.

10.2.2. Гидролиз пектинов под действием исходных препаратов Aspergillus.

10.2.3. Взаимодействие пектиназ (PG 38 Af, РЕ А/и PL Aj) при глубокой деструкции пектинов.

10.2.4. Взаимодействие пектиназ A, niger при глубокой деструкции пектинов.

Глава 11. Испытания пектиназ in vitro.

11.1. Использование пектиназ для осветления яблочного сока.

11.2. Выявление способности пектиназных препаратов к увеличению питательной ценности кормов in vitro.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus»

Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов [1]. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве позволило существенно повысить глубину переработки пищевого сырья, улучшить органолептические свойства и создать новые виды пишевых продуктов, повысить усвояемость кормов и расширить сырьевую базу кормопроизводства.

Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения. Большую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (прежде всего, Bacillus subtilis), микроскопических грибов родов Aspergillus, Pénicillium, Trichoderma, а также актиномицетов Actinomyces, Streptomyces. При использовании в пищевой промышленности и фармакологии лидирующее место занимают препараты на основе ф/ грибов рода Aspergillus. Они используются как продуценты внеклеточных ферментов широкого спектра действия (пектиназ, амилаз, протеаз), а также для получения метаболитов (органических кислот, витаминов, жирных кислот и аминокислот) [2].

Пектиназы, продуцируемые промышленными штаммами грибов A. foetidus и A.niger, незаменимы при работе с ягодами, овощами и фруктами, а также с продуктами их переработки [3]. Пектиназы используются при приготовлении осветленных соков (яблочного, грушевого, виноградного), соков с мякотью (цитрусового, сливового, томатного) и пюре. Широкое распространение пектиназные препараты аспергиллов получили в виноделии. При приготовлении как соков, так и вин пектиназы используются на разных стадиях технологического процесса: при мацерации растительных тканей, при получении сока и увеличении его выхода, при подготовке сусла к брожению (в виноделии), при осветлении сока и вина и стабилизации готового продукта.

Ферментные препараты широко используются в птицеводстве и животноводстве в качестве добавок к кормам для повышения их питательной ценности, улучшения усвояемости кормов, а также для сохранения продуктивности при включении в корма дешевых, но трудноусвояемых или содержащих антипитательные вещества компонентов [4]. При использовании кормовых диет, включающих бобовые, возрастает роль ферментов пектолитического действия, так как пектин является основным компонентом полисахаридной части бобовых. Известно также, что пектиназные препараты на основе A. oryzae в настоящее время широко используются в пищевой промышленности Юго-Восточной Азии при получении продуктов на основе сои [5].

Ряд положительных характеристик грибов рода Aspergillus - широкий диапазон продуцируемых гидролитических ферментов [6], высокий уровень белковой секреции, а также безопасность их использования в пищевой промышленности и фармакологии [7] - способствует увеличению интереса к ним как промышленно значимым объектам. В связи с этим растет потребность в фундаментальных знаниях о механизмах действия и свойствах индивидуальных ферментов, чтобы понимать механизмы функционирования ферментного препарата и иметь возможность управлять каталитическим процессом при его практическом использовании.

На сегодняшний день наиболее полно описаны свойства внеклеточных ферментов пектиназного комплекса гриба A. niger [8-9]. В настоящее время ведутся поиски продуцентов ферментов пектолитического действия среди других видов Aspergillus.

В нашей лаборатории совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб A.japonicus - продуцент различных карбогидраз. До сих пор он рассматривался только как источник гемицеллюлаз (ксиланаз и ß-глюканаз), его пектиназный комплекс не изучался и в научной литературе не описан. Кроме того, перспективным продуцентом пектиназ является гриб A. foetidus-, в ИБФМ получен ряд мутантных штаммов этого гриба. Несмотря на то, что ферментные препараты на основе A. foetidus успешно используются в России в пищевой промышленности уже несколько десятков лет, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось.

Целью работы являлось изучение состава ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами грибов A, japonicus и A. foetidus, выделение в гомогенном виде основных ферментов пектиназного комплекса, изучение их биохимических и каталитических свойств, эффективности их действия на природные объекты (пектины из разных источников и яблочный сок), а также изучение взаимодействия пектиназ разной специфичности и выявление эффектов синергизма или антагонизма между ними. В качестве эталона для сравнения был использован промышленный пектиназный препарат Рапидаза Пресс ("Gist-Brocades", Нидерланды), производимый на основе гриба A. niger, были выделены и изучены его основные пектолитические ферменты.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Выбрать мутантные штаммы-продуценты пектиназ и получить с их помощью ферментные препараты с высокими пектиназными активностями.

• Разработать эффективный и экспрессный метод анализа состава препаратов на основе грибов Aspergillus и сравнить их ферментные комплексы.

• Разработать схему выделения в гомогенном виде основных пектиназ и изучить их свойства.

• Исследовать взаимодействие пектиназ различной специфичности при действии на пектины с разной степенью этерификации.

• Разработать лабораторную методику оценки эффективности действия пектиназ в процессе осветления яблочного сока. На основе разработанной методики сравнить эффективность действия индивидуальных пектиназ, их комбинаций, а также ферменшых препаратов.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Семенова, Маргарита Викторовна

выводы

1. Разработан хроматографнческий экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов грибов рода Aspergillus. С помощью этого метода определен ферментный состав лабораторных препаратов на основе ряда пектиназных штаммов A. foetidus (AJ) и A. japonicus (Aj) и коммерческого пектиназного препарата гриба A. niger {An) и проведено их сравнение. Показано, что грибы A. foetidus и A. niger продуцируют преимущественно пектиназы, гриб A. japonicus - гемицеллюлазы и пектиназы. Основное отличие заключалось в преобладании разных полигалактуроназ: установлено, что в ферментных комплексах A. japonicus и A. foetidus основная полигалактуроназная активность соответствовала ферменту с молекулярной массой 38 кДа (PG 38), в препарате A. niger - ферментам с молекулярными массами 57, 55 и 59 кДа (PG 57, PG 55 и PG 59).

2. Выделены в гомогенном виде пять полигалактуроназ (PG 38 Aj, PG 38 Af PG 57 An, PG 55 An и PG 59 An), три пектинэстеразы (РЕ Aj, РЕ Af, РЕ An) и две пектинлиазы (PL Aj, PL An). Изучены свойства выделенных пектиназ (субстратная специфичность по отношению к разным пектинам, кинетические параметры действия ферментов, влияние температуры и рН на активность и стабильность ферментов).

3. С помощью масс-спектрометрического анализа трипсиновых гидролизатов выделенных белков показана их высокая гомология с известными ферментами грибов Aspergillus. Установлена высокая гомология между PG 38 Aj и PG 38 Af. Обнаружен новый фермент - PG 59 An, не идентифицированный в белковых базах данных по молекулярным массам трипсиновых пептидов.

4. Исследован гидролиз цитрусовых пектинов с разной степенью этерификации (СЭ), а также пектинов из других растительных источников под действием гомогенных пектиназ. Показана высокая гидролитическая активность полигалактуроназ при их действии на полигалактуроновую кислоту и пектин со СЭ 26%, а также их способность снижать вязкость растворов цитрусового, яблочного и свекловичного пектинов. Пектинлиазы обладали высокой активностью при действии на высокоэтерифицирован-ные цитрусовый и яблочный пектины и практически не разрушали низкоэтерифициро-ванные субстраты. Установлено, что полигалактуроназы и пектинлиазы обладают эндо-деполимеразным типом действия на полимерные субстраты.

5. Исследовано взаимодействие ферментов разной специфичности при деструкции пектинов с разной СЭ. Показано, что при деструкции высокоэтери-фицированного пектина (СЭ -70%) полигалактуроназы проявляют синергизм с пектинэстеразами, а пектинлиазы и пектинэстеразы действуют в антагонизме.

6. Проведены испытания способности пектиназ осветлять яблочный сок. Показано, что индивидуальные полигалактуроназы и пектинлиазы способны осветлять сок, при этом добавление пектинэстеразы существенно увеличивает эффективность действия полигалактуроназы и уменьшает способность пектинлиазы осветлять сок. Обнаружено, что добавки ксиланаз приводят к увеличению эффективности действия пектинлиазы в данном процессе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Семенова, Маргарита Викторовна, 2005 год

1. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. A Wiley-Interscience Publication. John Wiley & Sons. Inc., 1998, 454 p.

2. Oxenboll K. Aspergillus enzymes and industrial uses. In: Powell K.A., Renwick A., Peberdy J.F. The genus Aspergillus: From Taxonomy and Genetics to Industrial Applications. Plenum Press, London, 1994, p. 147-154.

3. Grassin C., Fauquembergue P. Applications of pectinases in beverages. In: Visser J., Voragen A.G.J. Pectin and pectinases. Elsevier, Amsterdam, 1996, p. 453-462.

4. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. ДеЛи принт, Москва, 2002, 336 с.

5. Parzia M.W., Foster E.M. Determing the safety of enzymes used in Food Processing. J. Food Protection, 1983, 46, p. 453-468.

6. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. Мир, Москва, 1986, т.1, с. 71108.

7. И.Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Изд-во МГУ, Москва, 1995, 224 с.

8. Stephen A.M. Food Polysaccharides and Their Applications. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, 654 p.

9. Whitaker J.R., Voragen A.G., Wong D.W.S. Handbook of food enzymology. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 2003, 1108 p.

10. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. The pectic polysaccharides of primary cell walls. Methods Plant Biochem., 1990, 2, p. 415.

11. Schols H.A., Bakx E.J., Schipper D., Voragen A.G.J. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin. Carbohydr. Res., 1995, 279, p. 265-279.

12. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Ann. Rev. Biochem., 1984, 53, p. 625-663.

13. Thakur B.R., Singh R.K., Handa A.K. Chemistry and uses of pectin a review. Critical Reviews in Food Science and Nitrition, 1997, 37, p. 47-73.

14. Beldman G., Searle-van Leeuwen M.J.F., de Ruiter G.A., Siliha H.A., Voragen A.G.J. Degradation of arabinans by arabinases from Aspergillus aculeatus and Aspergillus niger. Carbohydr. Polymers, 1993, 20, p. 159-168.

15. Guillon F., Thibault J.-F. Enzymatic hydrolysis of the "hairy" fragments of sugarbeet pectins. Carbohydr. Res., 1989, 190, p. 97-108.

16. Oosterveld A., Grabber J.H., Beldman G.J.R., Voragen A.G.J. Formation of ferulic acid dehydrodimers through oxidative cross-linking of sugar beet pectin. Carbohydr. Res., 1997, 300, p. 179-189.

17. Sakai T., Sakamoto T., Hallaert J., Vandamme E.J. Pectin pectinases, and protopectinases: production, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol., 1993, 39, p. 213-294.

18. Pickersgill R., Smith D., Worboys K., Jenkins J. Crystal structure of polygalacturonase from Erwinia carotovora spp. Carotovora. J. Biol. Chem., 1998, 273, p. 24660-24664.

19. Petersen T.N., Kauppinen S., Larsen S. The crystal structure of rhamnogalacturonase A from Aspergillus aculeatus: a right-handed parallel beta helix. Structure, 1997, 5, p. 533544.

20. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of polygalacturonases produced by the hyphal fungus Aspergillus niger. Biotechnol. Appl. Biochem., 1990, 12, p. 150-160.

21. Bussink H.J.D., Kester H.C.M., Visser J. Molecular cloning, nucleotide sequence and expression of the gene encoding prepro-polygalacturonase II of Aspergillus niger, FEBS Lett, 1990, 273, p. 127-130.

22. Bussink H.J.D., Brouwer K.B., de Graaff L.H., Kester H.C.M., Visser J. Identification and characterization of a second polygalacturonase gene of Aspergillus niger. Curr Genet, 1991,20, p. 301-307.

23. Parenicova L., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. pgaA and pgaB encode constitutively expressed members of the Aspergillus niger endopolygalacturonase gene family. Biochem. J., 2000, 345, p. 637-644.

24. Parenicova L., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. pgaE encodes a fourth member of the endopolygalacturonase gene family from Aspergillus niger. Eur. J. Biochem., 1998, 251, p. 72-80.

25. Parenicova L., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. Characterization of novel endopolygalacturonase from Aspergillus niger with unique kinetic properties. FEBS Lett., 2000, 467, p. 333-336.

26. Ruttkowski E., Labitzke R., Khanh N.Q., Loffler F., Gottschalk M„ Jany K.-D. Cloning and DNA sequence analysis of a polygalacturonase cDNA from Aspergillus niger RH5344. Biochem. Biophys. Acta, 1990, 1087, p. 104-106.

27. Kester H.C.M., Küsters-Van Someren M.A., Muller Y., Visser J. Primary structure and characterization of an exopolygalacturonase from Aspergillus tubingensis. Eur. J. Biochem., 1996, 240, p. 739-746.

28. Baker D., Shiau A.K., Agard D.A. The role of pro regions in protein folding. Current Opinion in Cell Biology, 1993, 5, p. 966-970.

29. Yang Y., Bergmann C., Benen J., Orlando R. Identification of the glycosilation site and glycan structures of recombinant endopolygalacturonase II by mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1997, 11, p. 1257-1262.

30. Colangelo J., Licon V., Benen J., Visser J., Bergmann C., Orlando R. Characterization of the glycosilation of recombinant endopolygalacturonase I from Aspergillus niger. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, p. 1448-1453.

31. Stratilova E., Mislovicova D., Kacurakova M., Machova E., Kolarova N., Markovic O., Jornvall H. The glycoprotein character of multiple forms of Aspergillus polygalacturonase. J. Protein Chem., 1998, 17, p. 173-179.

32. Rao M.N., Kembhavi A.A., Pant A. Implication of tryptophan and histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation of the reaction mechanism. BBA, 1996, 1296, p. 167-173.

33. Whitehead M.P., Shieh M.T., Cleveland T.E., Cary J.W., Dean R.A. Isolation and characterization of polygalacturonase genes (pecA and pecB) from Aspergillus flavus. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61, p. 3316-3322.

34. Bussink H.J.D., Buxton F.P., Visser J. Expression and sequence comparison of the Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis genes encoding polygalacturonase II. Curr. Genet., 1991, 19,467-474.

35. Biely P., Benen J.A.E., Heinrichova K., Kester H.C.M., Visser J. Inversion of configuration during hydrolysis of alpha-1,4-galacturonidic linkage by three Aspergillus polygalacturonases. FEBSLett., 1996, 382, p. 249-255.

36. Rexova-Benkova L., Mrackova M. Active groups of extracellular endo-D-polygalacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. Biochem. Biophys. Acta, 1978, 523. p. 162-169.

37. Stratilova E., Dzurova M., Markovic O., Jornvall H. An essential tyrosine residues of Aspergillus polygalacturonase. FEBS Lett., 1996, 382, p. 164-166.

38. Pages S., Heijne W.H.M., Kester H.C.M., Visser J., Benen J.A.E. Subsite mapping of Aspergillus niger endopolygalacturonase II by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 2000, 275, p. 29348-29353.

39. Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. Kinetic characterization of Aspergillus niger N400 endopolygalacturonases I, II and C. Eur. J. Biochem., 1999, 259, p. 577-585.

40. D'hallewin G., Schirra M., Powell A.L.T., Greve L.C., Labavitch J.M. Properties of a polygalacturonase-inhibiting protein isolated from "Oroblanco" grapefruit. Physiol. Plant.,120, p. 395-404.

41. Shevchik V.E., Condemine G., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Baudouy J. Characterization of pectin methylesterase B, an outer membrane lipoprotein of Erwinia chrysanthemi 3937. Mol. Microbiol., 1996, 19, p. 455-466.

42. Markovic O., Jarosova A., Machova E., Slezarik A. Effect of oligomeric and polymeric D-galacturonans on the activity of pectinesterase from tomato, Aspergillus foetidus and Trichoderma reesei. Biología, Bratislava, 1996, 51, p. 293-297.

43. Oosterveld A., Beldman G., Searle-Van Leeuwen M.J.F., Voragen A.G.J. Effect of enzymatic deacetylation on gelation of sugar beet pectin in the presence of calcium. Carbohydr. Polymers, 2000, 43, p. 249-256.

44. Molgaard A., Kauppinen S., Larsen S. Rhamnogalacturonan acetylesterase elucidates the structure and function of a new family of hydrolases. Structure, 2000, 8, p. 373-383.

45. Lee M., Macmillan J.D. Mode of action of pectic enzymes. I. Purification and certain properties of tomato pectinesterases. Biochemistry, 1968, 7, p. 4005-4010.

46. Versteeg С. Pectinesterases from the orange fruit their purification, general characteristics and juice cloud destabilizing properties. PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, 1979.

47. Whitaker J.R. Microbial pectolytic enzymes. In: Fogarty W.M., Kelly C.T. Microbial Enzymes and Biotechnology. Elsevier Applied Science, London & New York, 1991, p. 133-175.

48. Roy C., Kester H.C.M., Visser J., Shevchik V.E., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Baudouy J., Benen J.A.E. Mode of action of five different endo-pectate lyases from Erwinia chrysantemi. J. Bacterial., 1999, 181, p. 3705-3709.

49. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Свойства пектинолитических лиаз Bacillus macerans. Биохимия, 2002, 2, с. 20-29.

50. Vitali J., Schick В., Kester H.C.M., Visser J., Jurnak F. The three-dimensional structure of Aspergillus niger pectin lyase В at 1.7-Â resolution. Plant Physiol., 1998, 116, p. 69-80.

51. Yonder M.D., Jurnak F. The refined three dimensional structure of pectate lyase С from Erwinia chrysantemi at 2.2 Â resolution implications for an enzymatic mechanism. Plant Physiol., 1995, 107, p. 349-364.

52. Pickersgill R., Jenkins J., Harris G., Nasser W., Robert-Baudouy J. The structure of Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1994, 1, p. 717723.

53. Linhardt R.J., Galliner P.M., Cooney C.L. Polysaccharide Lyases. Biotechnol. Appl. Biochem., 1986, 12, p. 135-179.

54. Scavetta R.D., Herron S.R., Hotchkiis A.T., Kita N„ Keen N.T., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J., Jurnak F. Structure of plant cell wall fragment complexed to Pel C. Plant Cell, 1999, 11, p. 1081-1092.

55. Attalah M.T., Nagel C.W. The role of calcium ions in the activity of an endo-pectic acid lyase on olygogalacturonides. J. Food Biochem., 1979, 1, p. 185-206.

56. Tardy F., Nasser W., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Comparative analysis of the five major Erwinia chrysantemi pectate lyases: enzyme characteristics and potential inhibitors. J. Bacteriol., 1997, 179, p. 2503-2511.

57. Lojkowska E., Masclaux C., Boccara M., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Characterization of the pelL gene encoding a novel pectate lyase of Erwinia chrysantemi 3937. Mol. Microbiol., 1995, 16, p. 1183-1195.

58. Shevchik V.E., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Pectate lyase Pel I of Erwinia chrysantemi 3937 belongs to a new family. J. Bacterial., 1997, 179, p. 73217330.

59. Pissavin C., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Biochemical characterization of the pectate lyase Pel Z of Erwinia chrysantemi 3937. Biochem. Biophys. Acta., 1998, 1383, p. 188-196.

60. Shevchik V.E., Kester H.C.M., Benen J.A.E., Visser J., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Characterization of the exo-pectate lyase Pel X of Erwinia chrysantemi. J. Bacteriol., 1999, 181, p. 1652-1663.

61. Barras F., van Gysegem F., Chatterjee A.K. Extracellular enzymes and pathogenesis of soft rot Erwinia. Annu Rev. Phytopathol., 1994, 32, p. 221-234.

62. Harmsen J.A.M., Kusters-van Someren M.A., Visser J. Cloning and expression of a second Aspergillus niger pectin lyase gene (PELA): Indications of a pectin lyase gene family in Aspergillus niger. Curr. Genet., 1990, 18, p. 161-166.

63. Gysler C., Harmsen J.A.M., Kester H.C.M., Visser J., Heim J. Isolation and structure of the pectin lyase D-encoding gene from Aspergillus niger. Gene, 1990, 89, p. 101-108.

64. Kusters-van Someren M.A., Flipphi M.J.A., de Graaff L.H., van den Broek H.C., Kester H.C.M., Hinnen A., Visser J. Characterization of the Aspergillus niger pelB gene: structure and regulation of expression. Mol. Gen. Genet., 1992, 234, p. 113-120.

65. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of pectin lyase B, a novel pectinolytic enzyme from Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett., 1994, 120, p. 63-68.

66. Voragen A.G.J. Characterization of pectin lyases on pectins and methyl oligogalacturonates. PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, Netherlands, 1972.

67. Mutenda K.E., Korner R., Christensen T.M.I.E., Mikkelsen J., Roepstorff P. Application of mass spectrometry to determine the activity and specificity of pectin lyase A. Carbohydr. Res., 2002, 337, p. 1213-1223.

68. Nasuno S. Further evidence on differentiation of Aspergillus sojae from Aspergillus oryzae by electrophoretic patterns of cellulose, pectin-Iyase, and acid proteinase. J. Microbiol, 1974, 20, p. 413-416.

69. Pilnik W., Voragen A.G.J. The significance of endogenous and exogenous pectic enzymes in fruit and vegetable processing. In: Fox P.F., ed. Food Enzymology. Applied Science, London, 1991, p. 303-336.

70. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. Элевар, Москва, 2000,512 с.

71. Беленко Е.Л., Иванченко В.И., Левченко С.В. Исследование качественного и количественного и количественного состава биополимеров в ягодах столового винограда. Виноград и вино России, 1994, 2, с. 23-25.

72. Godfrey Т., West S. Industrial enzymology, 2nd edition. Macmillan Press, London, 1996, 609 p.

73. Бойко В.А. Разработка и внедрение способов профилактики коллоидных помутнений шампанских вин. Автореферат дисс. канд. техн. наук, Ялта, 1989, 24с.

74. Miller N.J., Rice-Evans С.A. A novel method for measuring antioxidant capacity and application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clinical Science, 1993,84, p. 407-412.

75. Кислухина О.В., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Технология, Каунас, 1997, 184 с.

76. Will F., Schulz К., Ludwig М., Otto К., Dietrich Н. The influence of enzymatic treatment of mash on the analytical composition of apple juice. Internat. J. of Food Science and Technol., 2002, 37, p. 653-660.

77. Кислухина О.В., Доронин А.Ф., Жданова М.Л. Получение сока из яблок с применением цитолитических ферментных препаратов. Пищевая промышленность, 1994, 9, с. 28-29.

78. Will F., Bauckhage K., Dietrich H. Apple pomance liquefication with pectinases and cellulases analytical data of the corresponding juices. Eur. Food Res. and Technol., 2000, 211, p. 291-297.

79. Троян 3.A., Корастилева H.H., Юрченко H.B. Динамика пектиновых веществ при производстве яблочного сока. Пищевая промышленность, 1996, 11, с. 36-37.

80. Дульнева И.П., Каражия В.Ф., Тарыца В.Ф. Ферментные препараты для осветления сока. Пищевая промышленность, 1988, 7, с. 25-26.

81. Сахаров Ю.В., Линецкая А.Е. Средства для осветления и стабилизации и эффективноть их использования при обработке плодовых соков и вин. Виноград и вино России, 1999, 6, с. 31-34.

82. Салманова Л.С., Филонова Г.Л., Соболевская Т.Н. Применение ферментативного гидролиза в производстве плодово-ягодных, овощных соков и экстрактов из растительного сырья. Хранение и переработка сельхозсырья, 1995, 2, с. 38-44.

83. Rechner A. Influence of processing techniques on polyphenols and antioxidative capacity of apple and berry juices. PhD thesis, University of Giessen, Giessen, 2001.

84. Thorn C., Raper K.B. A manual of the Aspergilli. Williams and Wilkins, Baltimore, 1945.

85. Nikkuni S., Kosaka N., Suzuki C., Mori K. Comparitive sequence analysis on the 18S rRNA gene of Aspergillus oryzae, A. sojae, A. flavus, A. parasiticus, A. niger, A. awamori and A. tamari.J. Gen. Appl. Microbiol., 1996, 42, p. 181-187.

86. Parenicova L., Benen J.A.E., Samson R.A., Visser J. Evaluation of RELP analysis of the classification of selected black Aspergilli. Mycol. Res., 1997, 101, p. 810-814.

87. Naidu G.S.N., Panda T. Production of pectolytic enzymes — a review. Bioprocess Engineering, 1998, 19, p. 355-361.

88. Antier P., Minjares A., Roussos S., Viniegra-Gonzalez G. New approach for selecting pectinases producing mutants of Aspergillus niger well adapted to solid state fermentation. Biotech. Adv., 1993, 11, p. 429-440.

89. Maldonado M.C., de Saad A.M. Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state fermentations. J. Industr. Microbiol. Biotech., 1998, 20, p. 34-38.

90. Galiotou-Panayotou M., Rodis P., Kapantai M. Enhanced polygalacturonase production by Aspergillus niger NRRL-362 grown on supplemented citrus pectin. Lett. Appl. Microbiol., 1993, 17, p. 145-148.

91. Cavalito S.F., Areas J.A., Hours R.A. Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotech. Lett., 1996, 18, p. 251-256.

92. Bussink H.J.D., van den Homberg J.P.T.W., van den Ussel P.R.L., Visser J. Characterization of polygalacturonase-overproducing Aspergillus niger transformants. Appl. Microbiol. Biotech., 1992, 37, p. 342-329.

93. Bowman S.B., Zaman Z., Collinson L.P., Brown A.J.P., Dawes I.W. Positive regulation of the LPD\ gene of Saccharomyces cerevisiae by the HAP2/HAP3/HAP4 activation system. Mol. & Gen. Genet., 1992, 231, p. 296-303.

94. Bussink H.J.D., Buxton F.P., Fraaye B.A., de Graaff L.H. Visser J. The polygalacturonases of Aspergillus niger are encoded by a family of diverged genes. Eur. J. Biochem., 1992, 208, p. 83-90.

95. Остерман Jl.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва, 1985,536 с.

96. Roe S. Protein Purification Techniques. A practical approach. Oxford University Press, 2001.

97. Инструкции фирм производителей оборудования к приборам Econo System, Model 111 Cell, Mini Protean и Chromatography Workstation 700 ("Bio-Rad", США) и FPLC ("Pharmacia", Швеция).

98. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Мир, Москва, 1991, 544 с.

99. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. В: Варфоломеев С.Д. Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. ВИНИТИ, 1993, 25, 152 с.

100. Garcia Е., Johnson D.,Whitaker J.R., Shoemaker S.P. Assesement of endo-l,4-beta glucanase activity by a rapid colorimetric assay using disodium-2,2'-bicinchoninate. J. Food Biochem., 1993, 17, p. 135-145.

101. Collmer A., Reid J. Assay methods for pectic enzymes. In: Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 1988, 161, part B, p. 329-335.

102. Pitt D. In: Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 1988, 161, part B, p. 353.г

103. Schejter A., Marcus L. In: Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 1988, 161, part B, p. 366.

104. Гусаков А.В., Марков А.В., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 2002, 67, 6, с. 815-822

105. В.Е. Smith. Protein sequencing protocols. Humana Press, Totowa, 1997.

106. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов. ДеЛи, Москва, 2000, 256 с.

107. Pectinase assay. Dyadic International, Inc.

108. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, р-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus. Диссертация на соискание степени канд. хим. наук, МГУ, Москва, 2004, 177 с.

109. James P. Proteome research: mass spectrometry. Springer-Verlag, Berlin, 2001.

110. Rappsilber J., Moniatte M., Nielsen M.L., Podtelejnikov A.V., Mann M. Experienses and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research. Int. J. Mass Spectrom., 2003, 226, p. 223-237.