Разработка способов определения видоспецифичных белков в мясном сырье и продуктах на основе электрофоретических методов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.05, кандидат биологических наук Астапова, Мария Сергеевна

• Астапова, Мария Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Астапова, Мария Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.1{

1.1. Характеристика мясной индустрии в Российской Федерации.ц

1.2. Обеспечение качества и безопасности мяса и мясопродуктов согласно закону «О техническом регулировании».

1.3. Проблемы идентификации мяса и аспекты фальсификации пищевых продуктов.

1.4. Методические приемы идентификации мяса и определения " фальсифицирующих примесей в сырье и пищевых продуктах.

1.4.1. Общая характеристика электрофоретических методов исследования.

1.5. Общая характеристика белков мышечной ткани.^

1.6. Содержание глютена в пищевых продуктах и его влияние на здоровье человека.

1.6.1. Общая характеристика глютена.

1.6.2. Использование глютена в пищевой промышленности.

1.6.3. Использование глютена в мясоперерабатывающей промышленности.

1.6.4. Контроль содержания глютена в пищевых продуктах.

1.6.5. Методы контроля содержания глютена в пищевых продуктах.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка способов определения видоспецифичных белков в мясном сырье и продуктах на основе электрофоретических методов»

Актуальность темы

Формирование в России рыночной экономики, увеличение объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе сырьем, полуфабрикатами и готовыми мясными продуктами, обуславливает возможность фальсификации продукции как по структуре, так и по видовой принадлежности сырьевых составляющих. Так, например, при производстве мясных продуктов могут быть использованы мясное сырье более низкого сорта, субпродукты или растительные добавки. Таким образом продукция, благополучная по микробиологическим и приемлемая по органолептическим и химическим показателям, может не соответствовать заявленному составу или иметь низкое качество.

В связи с этим актуальным становится вопрос о необходимости идентификации сырьевых компонентов в готовых мясных продуктах и полуфабрикатах.

Идентификация продукции согласно закону «О техническом регулировании» является одним из основных элементов подтверждения соответствия, а также позволяет предотвратить фальсификацию продукции и обман потребителя.

Цель идентификации - определить и подтвердить подлинность товара конкретного вида и наименования, в том числе его соответствие определенным требованиям и информации, указанной на этикетке или в товарно-сопроводительных документах.

При идентификации используются различные методические подходы, основанные на органолептических показателях [Хуршудян С.А., Смирнова Е.А., Чернуха И.М., Кузнецова Т.Г., 2008; Ткаль В.А., Окунев А.О., 2007]; иммуноферментном анализе, обладающем высокой специфичностью и чувствительностью [Самуйленко А .Я., Кузнецов Д.П., 2005; Лушников, К.В., Патрушев М.В., 2004; Ayaz N.D, Erol I., 2006; von Holst С. et al., 2006]; хроматографическом анализе [Астахов, A.B., Глазырин Е.М., 2007; Bellorini

S. et al., 2005]; биохимических [Светличкин B.B., Писарева B.M., Кононенко А.Б., 2004; Bermudo-Redondo, М.С. et al., 2005]; гистологических исследованиях, которые позволяют судить как о составе продукта в целом, так и дифференцировать особенности тканевых и клеточных структур [Хвыля С.И., Паршенкова P.P., 2008]. В настоящее время разработаны иммуноферментные экспресс-тесты, обладающие высокими показателями ' чувствительности и специфичности [Светличкин В.В., Панюшкин А.И. и др., 2008]. Методы ДНК-диагностики показали себя весьма чувствительными и специфичными способами идентификации мяса, позволяющими проводить анализ образцов, подвергшихся термической обработке [Пермяков А.Н., 2008; Светличкин В.В., Писарева В.М., Кононенко А.Б., 2004; Фомина Т.А., Минаева М.Ю., 2008; Martin I. et al., 2007].

Видовая идентификация может быть осуществлена с помощью современных электрофоретических методов. Эти методы уже применялись для идентификации отдельных видов мясного сырья в научных исследованиях (Писарева В.М., 1999; Горожанина Е.С., 2007). Однако для проведения экспертизы различных видов сырья и продукции в испытательных лабораториях необходимо расширить спектр определяемых белков. Кроме того, чтобы применять их в целях идентификации пищевых продуктов необходимо разработать и оптимизировать условия экстракции белков из нативных продуктов и продуктов, подвергшихся термической обработке, подобрать гели определенных видов, а также выбрать режимы проведения процесса электрофореза.

При подтверждении соответствия важно также определять другие белковые компоненты, прежде всего растительного происхождения, в частности глютен, которые могут входить в состав пищевых продуктов Глютен - это белковая фракция злаковых культур, таких как пшеница, рожь, ячмень. Особенно много этого белка содержится в зернах пшеницы. Глютен часто является компонентом привычных продуктов питания, его нередко добавляют в мясные и молочные продукты, что может вызывать у определенных групп людей аллергические реакции.

Определить содержание глютена в пищевом сырье и готовых продуктах питания можно с использованием методов иммуноферментного анализа (метод ELISA с моноклональными антителами) и полимеразной цепной реакции. Однако метод иммуноферментн'ого анализа относительно дорогостоящий, а метод ПЦР позволяет определять не сам глютен, а гены, кодирующие его синтез.

Поэтому актуальной является разработка метода определения содержания глютена на основе электрофоретического анализа.

Цель настоящей работы - разработка способов определения видоспецифичных белков в мясном сырье и продуктах на основе электрофоретических методов.

Задачи исследования

1. Разработать оптимальные условия экстракции саркоплазматических белков из мясного сырья и полуфабрикатов для последующего анализа методом изоэлектрофокусирования.

2. Разработать метод видовой идентификации мясного сырья по видоспецифичным зонам саркоплазматических белков на основе метода изоэлектрофокусирования.

3. Разработать методику количественного учета белковых компонентов мясных полуфабрикатов на основе метода изоэлектрофокусирования.

4. Провести валидацию метода видовой идентификации на основе метода изоэлектрофокусирования и создать атлас электрофореграмм и денситограмм фракционного состава саркоплазматических белков мышечной ткани сельскохозяйственных, промысловых животных и птицы разных видов.

5. Разработать методику определения содержания глютена в пищевых продуктах, в "том числе, мясных, подвергшихся термической обработке, на основе SDS-электрофореза и полимеразной цепной реакции.

6. Усовершенствовать схему определения видоспецифичных белков в продуктах животного и растительного происхождения с использованием электрофоретических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимальные условия экстракции саркоплазматических белков из мясного сырья и полуфабрикатов для последующего анализа методом изоэлектрофокусирования.

2. Метод видовой идентификации мясного сырья по видоспецифичным зонам саркоплазматических белков на основе метода изоэлектрофокусирования

3. Методика- количественного учета белковых компонентов мясных полуфабрикатов на основе метода изоэлектрофокусирования.,

4. Атлас электрофореграмм и денситограмм фракционного состава саркоплазматических белков мышечной ткани сельскохозяйственных, промысловых животных и птицы разных видов.

5. Методика определения содержания глютена в пищевых продуктах (в том числе, мясных), подвергшихся термической обработке, на основе SDS-электрофореза.

6. Методическое пособие для определения видовой принадлежности сырья животного происхождения методом изоэлектрофокусирования.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, 4 из них в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Астапова, М.С. Сравнительная оценка методов идентификации сырья животного и растительного происхождения и пищевых продуктов / Астапова М.С. // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - 2009. -№1. - С. 90-99.

2. Астапова, М.С. Идентификация сырья животного происхождения методом изоэлектрофокусирования /Астапова М.С. // Ветеринария и кормление. -2010. - №3. - С. 28-29.

3. Астапова, М.С. Определение видовой принадлежности мяса методом изоэлектрофокусирования / Астапова М.С. // Ветеринария. - 2010. - №9. - С. 57-59.

4. Астапова, М.С. Использование метода изоэлектрофокусирования при идентификации сырья животного происхождения / Астапова М.С. // Вестник РУДН. - 2б\0. - №2. - С. 65-72.

5. Астапова, М.С. Использование полимеразной цепной реакции для выявления глютена в пищевых продуктах / Астапова М.С., Тихомирова Т.А., Асади Е.В. // Вопросы питания. - 2010. - Т. 79. - №5,- С. 66-71.

Научная новизна

Разработаны оптимальные условия экстракции саркоплазматических белков из мясного сырья и полуфабрикатов для последующего анализа методом изоэлектрофокусирования.

На основе использования метода изоэлектрофокусирования разработан способ анализа мясного сырья по видоспецифичным зонам саркоплазматических белков, позволяющий определять видовую принадлежность мышечной ткани животных и птицы разных видов, а также проводить количественный учет белковых компонентов в мясных полуфабрикатах.

На основании проведенных исследований и разработанной методики выделения саркоплазматических белков с использованием метода изоэлектрофокусирования составлен атлас электрофореграмм и денситограмм фракционного состава саркоплазматических белков мышечной ткани сельскохозяйственных, промысловых животных и птицы разных видов в целях определения видовой принадлежности мясного сырья.

Разработана модифицированная методика выделения ДНК для определения содержание глютена на основе метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Разработан метод определения содержания глютена в пищевых, в том числе, мясных, продуктах, подвергшихся термической обработке, с использованием анионного детергента додецилсульфата натрия и этилового спирта разной концентрации на основе метода 8В8-электрофореза.

Предложена усовершенствованная схема определения видоспецифичных белков в продуктах животного и растительного происхождения с использованием электрофоретических методов исследования (изоэлектрофокусирования и 8Б8-электрофореза).

Практическая ценность

Разработанные методы позволяют определять видовую принадлежность мясного сырья и проводить количественный учет белковых компонентов в мясных полуфабрикатах, а также выявлять наличие добавок растительного происхождения, в частности глютена, в пищевых продуктах, подвергшихся термической обработке, и оценивать их количество.

Созданный атлас электрофореграмм и денситограмм фракционного состава саркоплазматических белков мышечной ткани животных и птицы разных видов можно использовать при установлении видовой принадлежности неизвестных образцов мышечной ткани, а также для выявления различных видов фальсификации мясного сырья.

Результаты работы могут быть использованы в испытательных лабораториях при идентификации сырья и пищевых продуктов.

На основании результатов исследований разработано «Методическое пособие по определению видовой принадлежности сырья животного происхождения методом изоэлектрофокусирования» (утверждено Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 21.02.2011 г.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2011г.);

- на расширенном совещании сотрудников лабораторий ГНУ ВНИИВСГЭ (2011 г.).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Астапова, Мария Сергеевна

выводы

1. Экспериментально разработанные условия пробоподготовки сырья, полуфабрикатов и мясной продукции обеспечивают максимальный выход саркоплазматических белков и глютена для видоспецифичной идентификации электрофоретическими методами в системе «PhastSystem».

2. Метод изоэлектрофокусирования позволяет проводить видовую идентификацию животных и птицы, в том числе близкородственных видов, по видоспецифичным зонам саркоплазматических белков независимо от пола и возраста.

3. Оптимальный градиент рН при разделении саркоплазматических белков для идентификации мяса животных и птицы разных видов составляет 3,0-9,0. Для дифференциации близкородственных видов используется изоэлектрофокусирование в узком градиенте рН 5,0-8,0 благодаря оптимальному разделению саркоплазматических белков в центральной части геля.

4. На основе метода изоэлектрофокусирования саркоплазматических белков в сочетании с денситометрией разработан способ количественного учета белковых компонентов мясных полуфабрикатов.

5. Созданный атлас электрофореграмм и денситограмм фракционного состава саркоплазматических белков мышечной ткани позволяет проводить идентификацию мяса сельскохозяйственных, промысловых животных и птицы разных видов.

6. Электрофореграммы фракционного состава саркоплазматических белков в сочетании с денситометрией могут быть использованы как стандарты для качественной и количественной идентификации мяса животных указанных видов.

7. Разработанная методика определения содержания глютена в пищевых, в - том числе, мясных продуктах, подвергшихся термической обработке, методом SDS-электрофореза позволяет определять его содержание на уровне 45 мг/кг.

8. На основании полученных результатов предложена усовершенствованная схема определения видоспецифичных белков в продуктах животного и растительного происхождения с использованием электрофоретических методов исследования (изоэлектрофокусирование и 808-электрофорез).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Астапова, Мария Сергеевна, 2011 год

1. Александрова H.A. Методы оценки качества мяса и мясопродуктов за рубежом. М.: 1997. - 156 с.

2. Алешков A.B., Окара А.И., Каленик Т.К. Методы распознавания фальсификации мясных продуктов // Хранение и переработка сельхозсырья. -2008.-№2.-С. 59-61.

3. Антипова JI.B. Методы исследования мяса и мясных продуктов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 2006. - 378 с.

4. Астахов A.B., Глазырин Е.М., Лапин В.А. Применение газовой хроматографии для анализа пищевых продуктов // Пищевая промышленность. 2007. — №3. — С.12-13.

5. Байдичева О.В., Хрипушин В.В., Рудакова Л.В. Цветометрия новый метод контроля качества пищевой продукции // Пищевая промышленность.2008.-№5. с. 20-22.

6. Боровков М.Ф., Швец О.М., Кириллов А.К. Определение видовой принадлежности мяса животных: Метод, пособие. — М.: АМБагро, 1998. 34 с.

7. Бутко М.П., Посконная Т.Ф. Ветеринарно-санитарные требования законодательства Евросоюза к убойным животным и мясной продукции // Мясная индустрия. 2007. - №4. - С. 4-11.

8. Ваврова М., Добеш М., Микулик А. Использование хроматографии для анализа мяса и мясопродуктов // Материалы 23-го Европейского конгресса научных работников мясной промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1980.

9. Галкин A.B., Комаров В.Н., Иванова Е.А. Иммуноферментный метод экспресс контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание потенциально опасных химических соединений // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. - №5. — С. 21-24.1.I

10. Гельгор В.И. Идентификация продуктов питания: проблем не стало меньше. // Пищевая промышленность. — 2009. №5. - С. 41-43.

11. Гиро Т.М., Деркин А.Н. Современные методы оценки показателей качества мясных продуктов // Мясные технологии. — 2008. — №4. С. 6-8.

12. ГОСТ Р 52601-2006 Мясо. Разделка говядины на отрубы. Технические условия. Введ. 01.01.2008.

13. ГОСТ Р 52986-2008 Мясо. Разделка свинины на отрубы. Технические условия. Введ. 01.01.2010.

14. Горбунова H.A. Горбатовские чтения: "Продовольственная безопасность с учетом специфики мясной промышленности" // Все о мясе.2009.-№6.-С. 6-7.

15. Гордынец С.А., Шалушкова Л.П., Петрушко С.А. Мясо телят сырье для производства продуктов детского питания // Мясная индустрия. - 2004. -№7.-С. 23-25.

16. Гугушвили H.H., Гудиев В.Г., Сенченко Б.С. Определение видовой принадлежности мяса домашних и диких птиц люминесцентным и фотоколориметрическим методами // Профилактика и лечение болезней животных. 2001. - №387 (415). - С. 160-163.

17. Гуринович Г.В. Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов использования нетрадиционных видов сырья в технологии мясных продуктов. Автореф. дис. .д-ра техн. наук: 05.18.04. Кемерово, 2007.-20 с.

18. Гутник Б.Е., Кузнецова O.A., Маслова Н.В. Стандарты инструмент технического регулирования и основа практики производства // Все о мясе.2010.-№4.-С. 4-6.

19. Данилова Н.С. Физико-химические и биохимические основы производства мяса и мясных продуктов. — М.: КолосС, 2008. — 280 е.: ил. -(Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

20. Драчева Л.В., Носкова Г.Н. Вольтамперометрический метод для контроля качества и безопасности пищевых продуктов // Пищевая промышленность. 2010. — №7. — С. 30-32.1.I

21. Езерская Е.Я., Галочкин В.А. Идентификация видоспецифичных мышечных белков сельскохозяйственных животных и птицы // Сельскохозяйственная биология. Сер. биология животных. 1999. - № 6. — С. 3-9.

22. Езерская Е.Я. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов // Ветеринария. -2001. 6. — С. 45-51.

23. Жаринов А.И., Юнякова А.О. Исседование фракционного состава белков мясного сырья // Мясные технологии. 2009. - №5. - С. 50-52.

24. Жиряева Е., Хайландт Т. Применение стандартов Codex Alimentarius в Российской Федерации // Пищевая промышленность. — 2006. №12. - С. 6-9.

25. Зайчик Б.Ц., Хуршудян С.А. Фальсификация пищевых продуктов в России история и современность // Пищевая промышленность. - 2009. — №8. -С. 22-25.

26. Идентификация, анализ и регистрация сортов, линий и гибридов кукурузы по зеину методами электрофореза и изоэлектрофокусирования: Метод, указания / Сост.: Конарев В.Г., Сидорова В.В., Тимофеева Г.И.; Под ред. В.Г. Конарева. Л.: ВИР, 1987. - 27 с.

27. Идентификация сортов злаковых трав электрофорезом проламинов: Метод, указания / Сост.: Конарев A.B. и др.; Под ред. И.П. Гаврилюк. Л.: ВИР, 1987.- 25 с.

28. Идентификация сортов пшеницы и ячменя методом электрофореза: Метод, указания / Сост.: Гаврилюк И.П., Гайденкова Н.В. и др. Под ред. В.Г. Конарева. Л.: ВИР, 1989. - 27 с.

29. Ишевский A.JI., Шульга A.C. Спектрофотометрия как метод контроля качества мясного сырья // Мясные технологии. — 2008. — №2. — С. 52-53.

30. Кабанов Е.М. Определение видовой принадлежности мяса домашних и диких животных. Автореф. дис. . канд. вет. наук. —Чебоксары, 1999. -23 с.

31. Калинин А.Я. Фальсификация и контрафакт в сфере пищевой промышленности // Методы оценки соответствия. 2008. -г № 4. - С. 19-20.

32. Клушевская Г.М. О текущей ситуации в процедуре подтверждения соответствия пищевых продуктов // Пищевая промышленность. 2010. - №5. -С. 19-21.

33. Ковалев Д.В. Система добровольной сертификации пищевойпродукции // Пищевая промышленность. — 2007. №12. - С. 10-11.

34. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных // Ветеринария. — 2000. №3. - С. 59-62.

35. Комарова И.Н., Серегин И.Г., Валихов А.Ф. Полимеразная цепная реакция современный метод выявления фальсификаций мясного сырья и продуктов // Мясная индустрия. — 2004. — №2. - С. 37-41.

36. Конарев В.Г. Белки пшеницы. Москва, 1980. - 352 с.

37. Крылова В.Б., Густова Т.В., Манджиева H.H. Использование нетрадиционного животного сырья в технологии мясных и мясорастительных консервов // Мясная индустрия. — 2010. — №11. С. 20-23.

38. Кудрявцев В.В. Особенности развития рынка мяса и мясных продуктов при вступлении России в ВТО // Мясная индустрия. 2006. - №12. - С. 19-22

39. Кудряшов Л.С. Оценка качества мясного сырья // Мясная индустрия. -2010.-№4.-С. 11-14.

40. Кузьмичева М.Б. Основные тенденции развития мясоперерабатывающей промышленности // Мясная индустрия 2009. — №8. -С. 5-9.

41. Курзина М.Н. Качество, безопасность, фальсификация мясной продукции // Пищевая промышленность. — 2006. № 4. - С. 75-76.

42. Лисицын А.Б., Веселова П.П. О техническом регулировании безопасности мяса и мясных продуктов // Мясная индустрия. 2004. - №11. -С. 28-30.1.I

43. Лисицын А.Б., Горбунова H.A., Небурчилова Н.Ф. Мясная промышленность России и перспективы ее развития // Все о мясе. 2009. -№2. - С. 4-7.

44. Логинов A.C., Глютеновая энтеропатия // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии. — 1993. Т.2. - №3. — С. 101-103.

45. Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевой продукции // Партнеры и конкуренты. 2004. - № 9 . - С. 36-39.

46. Маурер Г.Р. Диск-электрофорез. М.: Мир, 1969. - 247 с.

47. Медведева М.В., Мает Н.В. Электрофорез в полиакриламидном геле: учебно-метод. пособие. М.: МАКС-Пресс, 2008. - 28 с.

48. Методы исследования мяса и мясных продуктов. Лабораторный практикум / Забалуева Ю.Ю., Павлова С.Н., Лескова С.Ю. Улан-Удэ: ВСГТУ, 2005.-78 с.

49. Минаев М.Ю., Фомина Т.А. Полимеразная цепная реакция для идентификации мясного сырья и готовой продукции // Мясные технологии. -2008.-№2.-С. 34-36.

50. Недорезова Е. Контроль качества пищевых продуктов в системе технического регулирования // Пищевая промышленность. 2008. — №11. -С.8-10.

51. Нечаев А.Ю. Применение рН-метрии в процессе ветеринарно-санитарной экспертизы мяса // Мясная индустрия. 2007. - № 6. - С. 58-60.

52. Николаева М. А. Проблемы контрафакции и фальсификации товаров // Российская торговля. 2008. - № 5. - С. 22-24.

53. Никонов Ф.Б. Электронное устройство для контроля качества мяса // Пищевая промышленность. — 2008. — №5. — С. 24-25.

54. Новоселов Я. Б. Как помочь больным целиакией // Пищевая промышленность. — 2010. — №9. С. 71-75.

55. Остерман М.Б. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983 - 45 с.

56. Оценка качества и состава мясной продукции на продовольственном рынке России гистологическим методом / С. И. Хвыля, Р. В. Паршенкова, В. А. Пчелкина, С. С. Бурлакова: Сб. науч. тр. ВНИИМП. 2008. - С.185-197.

57. Парук А.П., Курмакаева Т.В. Использование биофизических методов при определении фальсификаций мяса // Практик. 2004. - №7-8. - С. 14-17.

58. Пермяков А.Н. Идентификация баранины и козлятины на основе реакции ПЦР: Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». 2008. - Т. 119. — С. 66-69.

59. Писарева В.М. Электрофоретический метод в анализе пищевых продуктов // Вопросы питания. 1998. - №3. - С. 41-42.

60. Платоненкова JI.C., Паничкова H.A., Рыбакова А.А, Артамошкина О.М. Электрофоретические методы исследования образцов тканей ценных видов рыб и млекопитающих: Метод, рекомендации. М.: ГУ ЭКЦ МВД России, 2001.-31 с.

61. Подкопаев Д. О. Метод ЭПР-спектрометрии для исследования биологических объектов и продуктов питания // Пищевая промышленность. -2010.-№7.-С. 33-34.

62. Попова A.B., Адаменко Д.Ю. Обеспечение качества и безопасности пищевой продукции путем внедрения системы НАССР // Пищевая промышленность. — 2009. — №3. — С. 67-70.

63. Посконная Т.Ф. Сравнительная оценка методов отечественного и международного контроля безопасности мяса и мясопродуктов: Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». -2008.-Т. 119.-С. 41-52.

64. Растительный белок / Пер. с фр. В.Г. Долгополова. Под ред. Т.П. Микулович. М.: Агропромиздат. - 1991. - 684 с.

65. Ревнова М.О., Романовская И.Э. Целиакия болезнь или образ жизни? — СПб.-2003.-156 с.

66. Рекомендации объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ Комиссии Кодекс Алиментариус касательно специальных диетических пищевых продуктов, предназначенных для людей, страдающих непереносимостью глютена в редакции от 16.11.2007 г.

67. Саляев Р. К. Электрофоретические методы анализа белков. -Новосибирск: Наука, 1981. -119 с.

68. Самуйленко А.Я.Кузнецов Д.П.Кузнецова C.B. Иммуноферментный анализ в ветеринарной медицине // Ветеринария сельскохозяйственных животных. 2005. - №9. - С. 22-24.

69. Светличкин В.В., Писарева В.М., Кононенко А.Б. Определение видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе имменодиффузии // Практик. 2004. - №7-8. - С. 28-31.

70. Светличкин В.В. Совершенствование контроля качества и безопасности продуктов животного происхождения в соответствии с требованиями Федерального закона о техническом регулировании. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. 2005. - Т. 117. - С. 134-139.

71. Субботина О. А. Аллергические реакции к белкам злаков. Автореф. дис. . канд. мед. наук. Москва, 1991. — 19 с.

72. Талибова А.Г., Колеснов А.Ю. Выявление происхождения сырья методом масс-спектрометрии // Мясные технологии. 2010. - №3. — С. 52-56.

73. Тихомирова Т.А., Горожанина Е.С., Ефремова A.C., Авылов Ч.К. Идентификация сырья и продуктов животного и растительного происхождения методом SDS-электрофореза // Все о мясе. — 2007. № 2. -С. 29-31.

74. Ткаль В.А., Окунев А.О., Глущенко Л.Ф., Шараева A.B. Контроль качества мясного сырья по цветовым характеристикам // Мясная индустрия. — 2007.-№6.-С. 61-64.

75. Троицкий Г. В., Ажицкий Г. Ю. Изоэлектрическое фокусирование белков в самоорганизующихся и искусственных рН-градиентах. — Киев: Наукова думка, 1984. 219 с.

76. Тюпаев И.М., Ляшенко Л.А., Газдаров В.М. Возрастная динамика метаболизма белка в скелетных мышцах крупного рогатого скота // Материалы годового отчёта ВНИИФБиП с.-х. животных. — Боровск. 1989.

77. Тюпаев И.М. Рост животных (морфофизиологические и биохимические аспекты). Учебно-метод. пособие. — Великие Луки: РИО ВГСХА, 2002. -62 с.

78. Тюпаев И.М., Кальницкий Б.Д. Миогенез и метаболизм основных белков поперечно-полосатой мышечной ткани сельскохозяйственных животных и птицы (обзор) // Сельскохозяйственная биология. 1996. - № 6. -С. 115-122.

79. Узаков Я.М. Пищевая ценность баранины и козлятины // Мясная индустрия. -"2005. №7. - С. 45-48.

80. Усанова O.E. Исследование белков мяса методом SDS-электрофореза // Конференция конкурс научно-инновационных работ молодых ученых и специалистов, 2008.

81. Хвыля С.И. Микоструктурный анализ, идентификация и фальсификация мясных продуктов // Пищевая промышленность. 1998. -№5.-С. 68-70.1.I

82. Хозяев В.И. Товароведение мяса боровой дичи, диких животных и нетрадиционного мясного сырья: Учеб. пособие. М.: Издательско-книготорговый центр «Маркетинг», 2002. — 236 с.

83. Хохлявин С.А., Михеева C.B. Система ХАССП в Европе и США: зарубежный опыт технического регулирования и его значение для России // Пищевая промышленность. 2006. - № 3. - С. 42-46.

84. Хубертус В. Химия мяса как пищевого продукта // Новое мясное дело. -2005. -№1. -С. 48-50.

85. Хуршудян С.А. Фальсифицированные пищевые продукты: классификация и определения // Пищевая промышленность. — 2008. № 10. — С. 86-87.

86. Хуршудян С.А., Смирнова Е.А. Роль органолептического анализа в идентификации пищевых продуктов // Пищевая промышленность. 2008. -№12.-С. 38-41.

87. Чернуха И.М., Кузнецова Т.Г., Селиванова Е.Б., Иванкин А.Н. Использование прибора «VOCmeter» для оценки свежести мяса // Мясная индустрия. 2008. -№3. - С. 49-51.

88. Чернуха И.М., Кузнецова Т.Г., Селиванова Е.Б., Марсакова Е.И. Современные подходы к объективной оценке качества мясного сырья и готовой продукции // Все о мясе. — 2010. №2. — С. 19-23.

89. Черняева М.Н., Галочкина В.А., Матвеев В.А., Езерская Е.Я. Количесвенный анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов Хранение и переработка сельхозсырья, №2, 2001, стр. 38-45.1.I

90. Шалимова О.А., Козлова Т.А., Зубарева К.Ю., Баскунов В.Б. Исследование скрытой фальсификации мясных продуктов методом ПЦР // Мясная индустрия. 2010. - № 4. - С. 28-30.

91. Шилина Н.М., Милюкова А.А., Смирнов И.А., Конь И.Я. Безглютеновая диета: проблемы лабораторного контроля // РМЖ. 2004. -№5.-С. 12-14.

92. Юшина Ю.К. , Усанова О.Е., Мищенко А.А. Определение белков сои в термически обработанных мясопродуктах методом иммуноферментного анализа// Все о мясе. 2010. - №6. - С. 58-59.

93. Abraham J., Rajulu P.V. Species identification in unprocessed meats through agarose isoelectric focusing of urea-extracted proteins and myoglobin // Indian J. anim. Sci. 1992. - Vol.62. - №1. - P. 69-74.

94. Aranishi F., Okimoto Т., Izumi S. Identification of gadoid species (Pisces, Gadidae) by PCR-RFLP analysis // J. of Appl. Genetics. 2005. - 46. - P. 69-73.

95. Aristoy M.-C., Toldra F. Deproteinization Techniques for HPLC Amino Acid Analysis in Fresh Pork Muscle and Dry-Cured Ham // J. of Agr. and Food Chem. 1991. - Vol.39. - №10. - P. 1792-1795.

96. Armstrong S.G., Leach D.N., Wyllie S.G. The use of HPLC protein profiles in fish species identification // Food Chem. 1992. - 44. - P. 147-155.

97. Ashmoor S.H., Monte W.C., Stiles P.G. Liquid chromatographicidentification of meats // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1998. - 71. - P. 397-403.i

98. Ataman C., Celik U., Rehbein H. Identification of some Aegean fish species by native isoelectric focusing // European Food Research and Technology. 2006. -222.-P. 99-104.

99. Ayaz Y:, Ayaz N.D., Erol I. Detection of species in meat and meat products using enzyme-linked immunosorbent assay // J. of Muscle Foods. 2006. - 17. -P. 214-220.

100. Bietz J.A., Wall J.S. Wheat gluten subunits: molecular weights determined by sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis // Cereal Chem. -1972.-Vol.49.-P. 416-430.

101. Bietz J.A., Wall J.S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol-soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure // Cereal Chem. -1980.-57.-P. 415-421.i i

102. Bermudo-Redondo M.C., Griffin P.B. et al. Monoclonal antibody-based competitive assay for the sensitive detection of celiac disease toxic prolamins // Analytica Chimica Acta. 2005. - 551. - P. 105-114.

103. Buntjer J.B., Lamine A., Haagsma N., Lenstra J.A. Species identification by oligonucleotide hybridisation: the influence of processing of meat products // J. Sci. Food Agric. 1999. - 79. - P. 53-57.

104. Chen T.Y., Shiau C.Y., Noguchi T., Wei C., Wwang D.F. Identification of puffer fish species by native isoelectric focusing technique // Food Chem. 2003." -83.-P. 475-479.

105. Clement R.L. A continuous acetic acid system for polyacrylamide gel electrophoresis of gliadins and other prolamins // Electrophoresis. 1988. — 9. — P. 90-93.

106. Codex Alimentarius Commission. Draft revised standard for gluten-free foods. Codex Alimentarius Alinorm 04/27/26, Appendix III, Rome. 2004. -P. 42-43.

107. Cota-Rivas M., Vallejo-Cordoba B.V. Capillary Electrophoresis for meat species differentiation // J. Capilary Electrophoresis. 1997. - Vol.4. - P. 195-199.

108. Denery-Papini S., Nicolas Y., Popineau Y. Efficiency and limitations of immunochemical assays for the testing of gluten-free foods // J. of Cereal Sci. -1999.-30.-P. 121-131.

109. Detection of gluten with SureFood® Allergen Gluten Congen. Art. № S3106. Version 1.0 E. Validation.

110. Dominguez E., Perez M.D., Puyol P., Calvo M. Use of Immunological Techniques for Detecting Species Substitution in Raw and Smoked Fish //

111. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung // A. Food Research and Technology. 1997. - Vol.204. - № 4. - P. 279-281.

112. Draft revised codex standard for foods for special dietary use for person intolerant to gluten (At Step 8 of the procedure). Alinorm 08/31/26, Appendix III, p. 50-51.

113. Ellis H.J., Rosen-Bronson ,S., O'Reilly N., Ciclitira P.J. Measurement of gluten using a monoclonal antibody against a coeliac toxic peptide of A gliadin // Gut.-1998.-43.-P. 190-195.

114. Fugate H.G., Penn S.R. Immunodiffusion technique for the identification of animal species // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1971. - 54. - P. 1152-1156.

115. Fumiere O., Veys P., Boix A., von Hoist Ch., Baeten V., Berben G. Methods of detection, species identification and quantification of processed animal proteins in feeding stuffs // Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2009. — 13(S). - P. 59-70.

116. Gershoni J.M., Palade G.E. Electrophoretic transfer of Proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to positively charged membrane filter // Anal. Biochem. — 1982. — Vol.124. P. 396-405.

117. Gershoni J.M., Palade G.E. Protein blotting: Principles and applications // Anal. Biochem.-1983.-Vol. 131.-P. 1-15.

118. Giovannacci I., Guizard C. et al. Species identification of meat products by ELISA // International J. of Food Sci. and Technol. 2004. - 39. - P. 863-867.

119. Hoffmann K. Identification and determination of meat and foreign proteins by means of dodecylsulfat poliacrylamid gel electrophoresis // Ann. Nutr. Alim. -1997.-Vol.31.-№2.-P. 207-215.

120. Hofmann K. Principal problems in the identification of meat species of slaughter animals using electrophoretic methods // In: Biochemical identification of meat species. Ed. R.L.S. Patterson. Elsevier, London. 1985. - P. 9-31.

121. Hsieh Y.H., Sheu S.C., Brigman R.C. Development of a monoclonal antibody specific to cooked mammalian meats // J. of Food Protection. 1998. -Vol.61. - Me.4. - P. 476-481.

122. Hvass A. Species differentiation in minced meat products by immunodiffusion // In R. L. S. Patterson (ed.), Biochemical Identification of Meat Species. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, NY. 1985. - P. 53-64.i

123. Jannsen E. Method adapted to PhastSystem // Z. Lebensm. Unterrs. Forsh. -1986. Vol.182. - P. 479-483.

124. Janssen F.W., Hagele G.H., Voorpostel A.M.B., De Baalj J.A. Myoglobin Analysis for Determination of Beef, Pork, Horse, Sheep, Kangaroo Meat in Blended Cooked Products // J. Food Sci. 1990. - Vol.55. - №6. - P. 1528-1530.

125. Kamiyama T., Kutsube Y., Imaizumi K. Serological identification of animal species of meat by a passive haemagglutination inhibition test using crossreacting albumin antiserum // Jap. J. Vet. Sci. 1978. - 40. - P. 653-661.

126. Kangethe E.K., Lindqvist K.J. Thermostable muscle antigens suitable for use in enzyme immunoassays for identification of meat from various species // J. of the Sci. of Food and Agric. 1987. - Vol.39. -№ 2. - P. 179-184.

127. Kim H., Shelef L.A. Characterization and identification of raw beef, pork, chicken and turkey meats by electrophoretic patterns of their sarcoplasmis proteins //J. Food Sci. 1986. - 51. - P. 731-741.

128. King N.L., Kurt L. Analysis of raw beef samples for adulterant meat species by enzyme-staining of isoelectric focusing gels // J. Food Sci. 1982. - Vol.47. -P. 1608-1612.

129. Kit for the qualitative detection of DNA from gluten-containing cereals SureFood® Allergen Gluten real-time PCR. Art.-№ S3106.

130. Koolmees P.A. Histology as an additional technique for species identification in meat products // In Bergwerff, A. A. (Ed). Species Identification in Meat Product. Utrecht, The Netherlands: ECCEAMST. 1999. - P. 35-41.

131. Martin I. et al. Detection of cat, dog, and rat/mouse tissues in food and animal feed using species-specific polymerase chain reaction // J. Anim. Sci. -2007.-85.-P. 2734-2739.

132. Moio L., Sasso M.L., Chianese L., Addeo F. Rapid detection of bovin milk in ovine, caprine and water buffalo milk or cheese by gel isoelectric focusing on PhastSystem // Ital. J. Food Sci. 1990. - Vol.3. - P. 71-176.

133. Mondini S., Calocchio E., Altissimi M.S., Haouet M.N., Cenci T. Reliability of the microscopic analysis for the animal species identification of meat meals // La Selezione Veterinaria. 1999. - №7. - P. 453-463.

134. Montowska M, Pospiech E. Species identification of meat by electrophoretic methods // Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 2007. - 6(1). - P. 5-16.

135. Murray I. et al. Macroscopic near-infrared reflectance spectroscopy // In: EUR 21124 Strategies and methods to detect and quantify mammalian tissues in feedingstuffs. Luxembourg: European Commission. — 2005. P. 156.

136. Obrovska I., Steinhauserova I., Nebola M. The application of the PCR method to the identification of meat species // Folia Veterinaria. — 2002. — 46(3). — P. 113-118.

137. Orth R.A., Bushuk W. Studies of glutenin. Comparison of preparative methods // Cereal Chem. 1973. - 50(1). - P. 109.

138. Osman M.A., Ashoor S.H., Marsh P.C. Liquidchromatographic identification of common fish species // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1987. -70. -P. 618-625.

139. Parisi E., Aguiari D. Methods of differentiating meats of different species of animals // In: Biochemical identification of meat species. Ed. R.L.S. Patterson. Elsevier Appl. Sci. Publ., London. 1985. - P. 40-49.

140. Patterson R.M., Whittaker R.H., Spencer T.L. Improved species identification of raw meat by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay// J. Sci. Food Agrie.-1984.-Vol.35.-P. 1018-1023.

141. Patterson R.L.S. Biochemical Identification of Meat Species. Elsevier Essex, UK.- 1995.i i

142. Plowman J.E., Herbert B.R. Identification of the species of origin of cooked fish by isoelectric focusing // Lebensm.-Wiss. Technol. -1992. 25. - P. 224-227.

143. Ramadass P., Misra D.S. Immune electrophoretic identification of meats of bullock, buffalo, goat, sheep, pig and chicken // Indian Veterinary J. 1981. -Vol.58.-P. 978-983.

144. Rao K.B.C.A., Rao V.K. Kowale B.N., Totey S.M. Sex-specific identification of raw meat from cattle, buffalo, sheep and goat // Meat Sci. — 1998. -48(3-4).-P. 275-285.

145. Righetty P.G., Drysdale J.W. Isoelectric focusing in gels // J. Chromatogr. -1974.-Vol.98.-P. 271-321.

146. Rodriguez M.A., García T., González I. et al. PCR identification of beef, sheep, goat, and pork in raw and heat-treated meat mixturex // J Food Protect. -2004.-67(1).-P. 172-177.

147. Ronald G. Berger, Richard P. Magean et al. Detection of Poultry and Pork in Cooked and Canned Meat Foods by Enzyme-linlked Immunosorbent Assays // J. Assoc. Off. Anal. Chem. -1998. Vol.71. - №2. - P. 406-409.

148. Rumbo M., Chirdo F.G. et al. Preparative fractionation of wheat prolamin by electrophoresis at pH 3.1 // J. of Agrie, and Food Chem. 1999. - 47. - P. 32433247.

149. Sawyer J., Wood C., Shanahan D., Gout S., McDowell D. Real-time PCR for quantitative meat species testing // Food Control. 2003. - 14(8). - P. 579-583.

150. Shaw F.D., Deane E.M., Cooper D.W. An immenodiffusion method for the identification of the species of origin of meat samples // Aust. Vet. J. — 1983. —60. -P. 25.

151. Sherikar A.T., Khot J.B., Jayarao B.M., Pillai S.R. Identification of origin of meats using commercially available antisera // Indian Veterinary Medical J. -1987.-Vol.11.-№3.-P. 1-7.

152. Skarpeid H.J., Kvaal K., Hildrum K.I. Identification of animal species in ground meat mixtures by multivariate analysis of isoelectricfocusing protein profiles // Electrophoresis. -1998. 19. - P. 3103-3109.

153. Skerritt J.H., Hill A.S. Monoclonal antibody sandwich enzyme immunoassays for determination of gluten in foods // J. of Agric. and Food Chem.- 1990.-38.-P. 1771-1778.

154. Sorell L., Lopez J.A., Valdes, I. et al. An innovative sandwich ELISA system based on an antibody cocktail for gluten analysis // FEBS Letters. 1988. -439.-P. 46-50.

155. Taylor A., Ponce-Alquicira E., Linforth R. Electrospray mass spectrometry // Food Science and Technology Today. 1993. - Vol.7. - №4. - P. 225-228.

156. Towbin H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications // Proc. Natl. Acad.- 1979. Vol.76. - P. 4350-4354.

157. Weiss H., Postel J., Gorg H. Barley cultivar discrimination: Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoeletric focusing with immobilized pH gradients // Electrophoresis. 1991. - Vol.12. - P. 323-338.i i i

158. Wintero A.K., Thomsen P.D., Davies W. A comparison of DNA hybridization, immunodiffusion, countercurrentimmuno electrophoresis and isoelectric focusing for detecting the admixture of pork to beef // Meat Sci. 1990. -27.-P. 75-91.

159. Yman I.M. Meat and fish species identification by isoelectric focusing // Food laboratory news. 1990. - Vol.6. - №2. - P. 28-31.

160. Zerifi C., Lanie C., Benard G. SDS-PAGE technique for species identification of cooked meat // Fleischwirtschaft. 1991. - 71. - P. 1060-1062.I

161. Российская академия сельскохозяйственных наук Отделение ветеринарной медицины

162. МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ по определению видовой принадлежности сырья животного происхождения методом изоэлектрофокусирования1. Москва-2011 г.1. УТВЕРЖДАЮ

163. Академик-секретарь отделения

164. Методическое пособие предназначено для специалистов научно-исследовательских учреждений и лабораторий, занимающихся вопросами ветеринарно-санитарного и экологического контроля продуктов, кормов и объектов окружающей среды.

165. Рецензент заведующий . лабораторией ветеринарно-санитарной экспертизы ГНУ ВНИИВСГЭ, профессор, доктор ветеринарных наук В.А. Долгов.

166. Методическое пособие рассмотрено и одобрено ученым советом и секцией «Ветеринарно-санитарной экспертизы» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 21.02.2011 г.).

167. Ответственный за выпуск заведующий сектором отделения ветеринарно-санитарной экспертизы Россельхозакадемии, к.б.н. Л.В. Бабышова1. Общие положения.

168. Проведение пробоподготовки исследуемых образцов для проведения идентификации белков животного происхождения методом изоэлектрофокусирования

169. Затем гомогенаты центрифугируют при 3000 мин-1 в течение 3-5 мин, отбирают 500 мкл супернатанта в полипропиленовые микроопробирки типа Eppendorf и центрифугируют при 13000 мин-1 в течение 10 мин.

170. Образцы наносят на аппликатор с 6 капиллярными каналами по 3,5 мкл, так как применение большего числа каналов усложняет количественный обсчет результатов.

171. Процедура проведения метода изоэлектрофокусирования

172. Электрофоретическое разделение проводят в варианте микроанализа в системе «РЬаз18у51ет» с использованием стандартных готовых полиакриламидных гелей «РЬаз10е1», содержащие амфолиты с градиентом рН 3,0 9,0 и рН 5,0 - 8,0.

173. Для получения более полной информации проводят денситометрию данных электрофореграмм с использованием лазерного сканирующего денситометра.

174. По интенсивности окрашивания (величине) пиков маркерных видоспецифических белков в модельных мясных смесях и в образцах смешанных фаршей можно вычислить долю каждого компонента (в процентах).

175. Процентное содержание искомого компонента в исследуемых образцах фаршевых изделий, приготовленных аналогичным образом, можно определять по этой калибровочной кривой.тттI1180

176. Козлятина (гель рН 3,0-9,0) Баранина (гель рН 3,0-9,0)200 400 600 800 1000

177. Расстояние до анода, усл. ед.120014001.; ^ * Н