Разработка методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии в геле тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.06, кандидат биологических наук Макаров, Михаил Михайлович

• Макаров, Михаил Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Макаров, Михаил Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6 1.1. Идентификация мяса и мясной продукции

1.1.1. Метод электорофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов.

1.1.2. Энзимологические методы 15 1.2 Иммунологические и молекулярногенетические методы идентификации продукции.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Цель и задачи исследования

2.2. Объекты и методы исследования 44 2.2.1 Методика выделения ДНК из мяса крупного рогатого скота.

2.2.2. Мечение биотином бактериальных ДНК методом ник-трансляции

2.2.3. Мечение ДНК методом «рассеянной затравки»

2.2.4. Методика получения меченых ДНК зондов с помощью полимеразной цепной реакции

2.2.5. Методика точечной ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с биотинилированной ДНК

2.2.6. Методика гибридизации нуклеиновых кислот с тритиевой меткой

2.2.7. Методика полимеразной цепной реакции

2.2.8. Методика определения видовой принадлежности мяса методом иммунодиффузии в геле

2.2.9. Статистическая обработка результатов

2.3 Результаты исследований

2.3.1. Разработка модификаций методов определения видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе 53 ПЦР

2.3.1.1. Разработка метода идентификации говядины на основе ПЦР и электрофоретического разделения амплификатов

2.3.1.2. Разработка модификации метода количественного определения ДНК говядины на основе ПЦР с меченными 59 нуклеозидтрифосфатами

2.3.2. Разработка модификаци методов определения видовой принадлежности мяса крупного рогатого скота на основе ДНК-зондов

2.3.3. Разработка тест-системы видовой принадлежности мяса и субпродуктов первой категории на основе реакции иммунодиффузии в геле

2.3.4. Приборная реализация методов идентификации мяса

2.3.4.1. Автоматизация методов идентификации мяса

2.3.5. Разработка тест-систем идентификации мяса для стационарных и полевых условий

2.3.5.1. Приборная реализация методов идентификации для нестационарных условий

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ 92 ВЫВОДЫ 93 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95 ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии в геле»

Важным аспектом ветеринарно-санитарной оценки и сертификации животноводческой продукции является ее идентификация и определение фальсифицирующих примесей. Эти положения отражены в «Правилах проведения сертификации пищевых продуктов и продовольственного сырья» (1999), в «Информации для потребителя Общие требования» (1997), в «Федеральном законе о безопасности и качестве пищевых продуктов» (1999), а также в «Правилах ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1988). Сертификация продовольственного сырья и пищевых продуктов животного происхождения осуществляется после ветеринарно-санитарной экспертизы, проводимой в соответствии с действующими ветеринарно-санитарными правилами («Правила проведения сертификации пищевых продуктов и продовольственного сырья» 1999).

Для обеспечения страны высококачественной продукцией возросла необходимость идентификации мяса и мясопродукции. Отсутствие такого контроля способствует появлению в оптовой и розничной торговле недоброкачественной и даже фальсифицированной мясной продукции, что представляет серьезную угрозу здоровью населения (Кабанова Е.М. 1999).

Ветеринарно-санитарная оценка пищевых продуктов включает в себя определение видовых, качественных, количественных и стоимостных характеристик товара. Важнейшим элементом этой оценки является идентификация товаров.

Используемые в настоящее время для идентификации пищевых продуктов органолептические, химические и гистологические методы позволяют осуществлять контроль качества товара (включая также ветеринарно-санитарный контроль), однако они имеют существенные ограничения в случае идентификации видовой принадлежности мяса и мясных продуктов близкородственных видов. Кроме того, большие трудности возникают при отсутствии морфологических критериев идентификации или после термической обработки (Гинцбург А.Л. 1999).

Перечисленные проблемы могут быть разрешены с использованием современных иммунологических и молекулярно-генетических методов.

Иммунохимические методы оценки видовой принадлежности продуктов животного происхождения включают методы иммунодиффузии, иммунофореза и иммуноферментного анализа.

При иммунодиффузии (метод Оухтерлони) соответствующая антисыворотка (например, к миоглобину свиньи) вносится в лунку агарозного геля, которая расположена напротив другой лунки, в которую помещается анализируемый экстракт (Черняева М.Н. 2001). В случае положительной серологической реакции - образования зоны преципитата в результате реакции антиген-антитело - подтверждается видовая принадлежность образца (а именно, свинина). Отрицательная серологическая реакция свидетельствует об отсутствии данного антигена в анализируемой смеси.

Методы ДНК-диагностики за рубежом используются для идентификации продовольственного сырья и пищевой продукции. Они позволяют проводить анализ с высокой чувствительностью и специфичностью. Анализ возможен после термической обработки продукции.

Несмотря на развитие иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования продукции, эти методы еще не нашли достаточно широкого применения в практике ветеринарно-санитарного контроля.

Для решения этих задач актуальным является разработка ускоренных методов идентификации мяса и определения фальсифицирующик примесей доступных для широкой практики, а также приборная реализация методов в виде автоматизированных систем и укладок для проведения анализа в нестационарных условиях.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Идентификация мяса и мясной продукции.

Идентификация продукции является одним из важнейших элементов ветеринарно-санитарной экспертизы и сертификации (Бутко М.П. 1984, Родин В.И., 1995, Хвыля С.И. 1998,).

Ветеринарно-санитарная экспертиза - совокупность мероприятий, позволяющих сделать обоснованные ветеринарно-санитарные оценки продуктов животного и растительного происхождения (Карелин А.И. и др.,

1990). Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса в основном изложена в «Правилах ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1988).

При сертификации мяса и мясных продуктов в системе сертификации ГОСТ Р основным нормативным документом, определяющим показатели безопасности, являются «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы. СанПиН 2.3.2.560-96» (1997).

За рубежом контроль качества мяса и мясных продуктов осуществляется в рамках различных систем сертификации. Международной организацией по стандартизации (ИСО) и Европейской организацией по контролю качества (ЕОКК) разрабатываются международные и европейские стандарты, унифицированные документы и различного рода рекомендации.

Комиссия Кодекс Алиментариус является международным органом, ответственным за выполнение программы стандартов на пищевые продукты, включая мясо и мясопродукты. Кодекс Алиментариус (Codex Alimentarius,

1991) содержит все международные стандарты, включая микробиологические нормы на продовольственное сырье и продукты питания, одобренные комиссией ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства (ФАО) и Всемирной организацией здравоохранения

ВОЗ). Согласно международным стандартам, исследования по ветеринарно-санитарной экспертизе мяса должны применяться на каждой ступени производства, начиная с ферм. Ответственность за безопасность и качество произведенного мяса разделяется между производителем и контролирующими органами.

Стабилизация продовольственного рынка не может быть решена без реализации системы мер в области обеспечения конкурентной способности пищевой продукции и продовольственного сырья.

Наилучших результатов в создании и выпуске конкурентно способной продукции можно достичь путем создания систем сертификации, отвечающих требованиям международных стандартов.

Это нужно еще и потому, что в связи с изменениями характера отечественного рынка за последние годы принимаются меры по интеграции российской экономики в мировую. Для этого необходимо максимально учитывать требования, предъявляемые к России при вступлении во Всероссийскую торговую организации (ВТО).

С этой целью технические регламенты не должны оказывать на торговлю более ограничительных воздействий, чем это необходимо для достижения законных целей, принимая в расчет риски, которые возникали бы при их невыполнении. Такими законными целями, являются, в частности, требования национальной безопасности; предотвращения обманной практики; защита здоровья или безопасности людей, жизни или здоровья животных или растений, либо охраны окружающей среды.

Члены ВТО должны способствовать использованию согласованных санитарных и фитосанитарных мер на основе международных стандартов, предписаний и рекомендаций, разработанных соответствующими международными организациями, включая Комиссию «Кодекс Алиментариус», Международное бюро по эпизоотии и соответствующие международные и региональные организации, действующие в рамках Международной конвенции по защите растений, без предъявления при этом членами требований внести изменения в их соответствующий уровень охраны жизни или здоровья людей, животных или растений.

При этом признается, что развивающиеся страны-члены могут сталкиваться с трудностями в плане соблюдения санитарных и фитосанитарных мер импортирующих стран- членов и, как следствие, в доступе к рынкам, а также выработки и применения санитарных или фитосанитарных мер в пределах собственных территорий.

С целью гармонизации санитарных и фитосанитарных мер государства должны основывать свои санитарные или фитосанитарные меры на международных стандартах, предписаниях или рекомендациях, когда таковые имеются.

Разработка критериев и методов оценки безопасности и качества продовольственного сырья и продукции животного происхождения является одним из важных элементов стандартизации и сертификации указанной продукции.

Под качеством сельскохозяйственного сырья и продукции понимается совокупность свойств, обеспечивающих её питательную ценность и безопасность для здоровья потребителя, надежность состава и сохранение потребительских свойств (Яепапс! в., 1993).

Безопасность продукции означает отсутствие токсичного, канцерогенного, мутагенного или иного неблагоприятного воздействия её на организм человека.

Ветеринарно-санитарная оценка животноводческой продукции и ветеринарно-санитарная экспертиза проводится на основе ветеринарно-санитарных правил. В настоящее время разработан проект Правил (ВетПиН 13.7.1-2000), который в целом соответствует международным требованиям. В правилах определены более совершенные методы исследований, например методы идентификации мяса и мясопродуктов на основе ДНК-диагностики.

Способы определения показателей безопасности и качества продовольственного сырья и продуктов питания, приведенные в 13 томе «Кодекса Алиментариус» основаны на органолептических, физико-химических, биохимических, иммунологических, микробиологических и других методах анализа. Различают арбитражные методы количественного анализа и скрининговые методы с качественной оценкой показателей (Ьиёке Н.За^Ьок ]., 1993).

Методы определения показателей безопасности и качества животноводческой продукции в России нормированы соответствующими ГОСТами и другими нормативными документами (Татулов Ю., 1997). Методы исследования, указанные в этих документах в основном базируются на тех же научно-методических подходах, что и международные методы контроля. Однако имеются отличия в плане чувствительности, процедурах пробоподготовки и проведения анализа.

Фасльсификация может рассматриваться как действия, направленные на ухудшение потребительских свойств товара или уменьшение его количества при сохранении наиболее характерных, но не существенных для его использования по назначению свойств (Писарева, 1996 ).

Мясо и продукты его переработки - колбасные изделия, мясокопчености, консервы, полуфабрикаты относятся к наиболее ценным продуктам питания, поэтому они попадают в разряд наиболее часто фальсифицируемых продуктов. Критерии идентификации мяса и мясных продуктов изложены в соответствующих нормативных документах («Мясо Технические условия и методы анализа» 1997, «Колбасы Технические условия и методы анализа» 1997, «Консервы мясные Технические условия» 1997).

При идентификации могут использоваться органолептические, морфологические, биохимические, иммунологические и молекулярно-биологические критерии.

Так, например, методом газовой хроматографии в экстрактах мышечной ткани различных видов животных определяли углеводороды, циклобутаноны и полиненасыщенные жирные кислоты, обеспечивающие межвидовые различия (Helle N et al., 1996). Изучали холестерин и его эфиры, жирнокислотный состав и основные физико-химические характеристики липидов и липопротеидов. Последние, методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности фракционировались на липопротеиды высокой и низкой плотности. По многим из этих показателей обнаружили определенные видовые различия, однако, на основании этого пока невозможно осуществлять количественную детекцию видовой принадлежности мяса и мясопродуктов (Paz de Pena M.,Concepción Cid M., 1998).

Видовую принадлежность сырого и после термообработки мяса крупного рогатого скота, кур и кроликов определяли масс-спектрометрическим анализом, выявляя различия в актинах, гемоглобинах, миоглобинах и альбуминах (Taylor A et al., 2000). Результаты анализов по заключению авторов были удовлетворительными, однако проведение таких тестов требовало сложного и дорогостоящего оборудования, что создавало определенные трудности. Методом электронного парамагнитного резонанса идентифицировали видоспецифичные пептиды тяжелых цепей атриал-специфичного миозина кур (Sakurai M et al., 1997). Он также не нашел широкого распространения.

Известен также метод, основанный на безинструментальном иммунохроматографическом анализе на бумажных стрипах с визуальной оценкой конечных результатов. Разрешающая способность подобных тестов должна находиться в пределах 100 нг/мл антигена в экстракте анализируемого мышечного образца.

Видовая детекция обработанных мясопродуктов может быть основана на термостабильных белках, сохранивших нативную конформацию, или отдельных тест-системах для денатурированных белков. Поэтому необходимы методы выявления как термостабильных, так и термолабильных видо - и органоспецифичных белков (Слесаренко H.A., Курмакаева Т.В., Якушев С.В 1999).

Наиболее перспективными в плане определения видовой принадлежности являются методы ДНК-диагностики, позволяющие проводить анализ как сырья, так и продукции, подвергнутой термической обработке (Fairbrother K.S.,Hopwood A.J.,Lockley A.K.,Bardsley R.G. 1998).

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Макаров, Михаил Михайлович

ВЫВОДЫ

Выбранная нуклеотидная последовательность для получения генных зондов и праймеров 5'-ТСССТОССТТОАОТТАССТОТС ВОБ-Ш;

5'-ОСССТОССААТТТТСАСОАТО В08-Ь2. позволяет идентифицировать говядину методом ПЦР и ДНКгибридизации в присутствии ДНК других видов животных.

С использованием генных зондов, меченных биотином и тритием, разработаны модификации методов и тест-системы идентификации говядины с чувствительностью, позволяющей выявлять 1% искомой ДНК в смеси с ДНК других видов животных. Время анализа 4-6 часов.

На основе ПЦР и электрофоретического детектирования амплификатов разработана методика и тест-система идентификации говядины, позволяющая проводить анализ искомой ДНК в термообработанных продуктах и в смеси с ДНК других видов животных. Время анализа 2-3 часа.

На основе полимеразной цепной реакции с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами и фотометрической регистрацией амплификатов разработаны модификации метода количественного определения видовой принадлежности мяса. Чувствительность количественного определения позволяет выявлять до 1% исследуемой ДНК в различных смесях, время анализа не превышает 2-3 часа.

Сходство и технологичность различных схем идентификации мяса на основе ДНК-зондов, меченных тритием или биотином, позволяет реализовать их на автоматизированном анализаторе биологических проб.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Макаров, Михаил Михайлович, 2002 год

1. Александрова H.A. и др. Методы оценки качества мяса и мясопродуктов, применяемые за рубежом.//М., 1997, 156 с.

2. Алёхина Л.Т., Андреенков В.И., Ивашов В.И. Современные методы анализа качества мяса и мясопродуктов.// «Мясная промышленность», АгроНИИТЭИММП, М., 1991,с. 35.

3. Антонов A.C. Молекулярные основы геносистематики // Изд. МГУ, М., 1980, с. 24-31.

4. Белоусова Р.В., Гончарова Т.М., Асеев Н.В. и др. Разработка способов и технических средств полевой индикации возбудителей инфекционных заболеваний животных на основе генных зондов // В кн.: Вопросы ветеринарной биологии, М., 1994, с. 68-70.

5. Бутко М.П. Организация и современные методы проведения ветеринарно-санитарной экспертизы. Киев 1984.

6. Вальехо-Роман К. М, Гибридизация ДНК В кн.: Молекулярные основы геносистематики // Изд-во МГУ, М., 1980, с.86-105.

7. Гинцбург А.Л. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов и решение задач медицинской микробиологии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1999, № 5, с. 22-26.

8. ГОСТ Р 54074-97. Продукты пищевые. Информация для потребителя. Общие требования.

9. ГОСТ Р 51481-99 (ИСО 6886-96) «Жиры и масла животные и растительные. Метод определения устойчивости к окислению (метод ускоренного окисления)». Дата введения 01.01.2001 г. с правом досрочного введения. Постановление № 637-ст. от 22.12.99 г.

10. ГОСТ 19496-93. Мясо. Методы гистологического исследования.

11. ГОСТ 23392-78. Мясо. Методы химического и микроскопического анализа свежести.

12. ГОСТ 23481-79. Мясо птицы. Метод гистологического анализа.

13. Дерюшева С.Е. Биотинилирование ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции // Труды ВНИИ генетики и разведения с/х животных, Санкт- Петербург, 1993, с.43-45.

14. Друца B.JI. Радиоизотопное мечение ДНК // В. кн.: Молекулярные основы геносистематики // М., изд. МГУ, 1980, с. 35-50.

15. Дрыгин Ю.Ф., Бузмаков A.B., Тетерина H.J1., Морозов С.Ю. Нерадиоактивная диагностика вирусных инфекций зондами "ДНК-перо ксидаза". // Молекулярная биология. 1992. т.26.

16. Езерская Е.Я., Галочкин В.А. Идентификация видоспецифичных мышечных белков сельскохозяйственных животных и птицы.// Сельскохозяйственная биология. Сер.биология животных, 1999, № 6, с.3-9.

17. Золотарев Ф.Н, Голубев Д.Б., Петров H.A. Метод точечной гибридизации в вирусологии.// Успехи современной биологии.- 1989.-том 108,-с. 375-382.

18. Кабанова Е.М. Определение видовой принадлежности мяса домашних и диких животных.// Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук, Чуваш, с.-х. акад. Чебоксары, 1999, 23 с.

19. Карелин А.И., Макаров В.А., Боровков М.Ф. Словарь ветеринарных, зоогигиенических и санитарных терминов. М.: Росагропромиздат., 1990.

20. Квятковская А.Ю. Разработка автоматизированных методов ДНК -диагностики эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного надзора.// Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М, 1998.

21. Колбасы. Технические условия и методы анализа.// М., 1997.

22. Комаров A.A., Обухов И.Л. Опредиление видовой принадлежности мясных ингридиентов в кормах для собак и кошек методом ПЦР. // Восьмой международный конгресс по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных. М., 2000, е., 27-28.

23. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Опредиление видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., е., 59-62.

24. Консервы мясные. Технические условия.// М., 1997.

25. Кузнецова Т.Г. Оценка морфологических свойств мясного сырья и колбасных изделий по микроструктурным показателям.// М.: Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук, 1997.

26. Макаров В.Б., Сафронов В.В. Цитогенетические методы анализа хромосом. М, «Наука», 1978.

27. Маккреди Б.Д., Чимера Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами // В кн. Молекулярная клиническая диагностика, М., изд. «Мир», 1999, с.496-506.

28. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., изд. «Мир»., 1994, с. 159172.

29. Мясо. Технические условия и методы анализа.// М., 1997.

30. Лори Т.А. Наука о мясе.// М., Пищевая прмышленность, 1973, с.198.

31. Наставление по применению тест-систем для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной ракции «БИГ». Утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ 2000.

32. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов // М., Экономика, 1996, стр. 84-95.

33. Обухов И.Л., Панин А.Н., Груздев К.Н. Использование ПЦР в практических ветеринарных лабораториях.// Ветеринария 1997, №2., с. 2427.

34. Петров Н.Б. Методы изучения реассоциации ДНК. В кн. Молекулярные основы геносистематики. Антонов A.C. М. ИздМГУ, 1980, с. 51-75.

35. Писарева В.М. Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва 1999.

36. Правила ветеринарного осмотра убойных жиаотных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов. Утв. Главным упрравлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР, 27 декабря 1983 г. М., ВО «Агропромиздат», 1988.

37. Правила проведения сертификации пищевых продуктов и продовольственного сырья.//М., 1999.

38. Родин В.И. Сравнительная оценка методов ветеринарно-санитарного контроля пищевого сырья и готовых продуктов.// Материалы международной научно-технической конференции «Пищевой белок и экология». М. 2000, с. 188-189.

39. Санитарные правила и нормы. СанПиН 2.3.2. 560-96. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов // М., 1997, п.6, с.22-50.

40. Сенченко B.C., Кабанова Е.М. Определение видовой принадлежности мяса по температуре вспышки наружного и внутреннего жира некоторых видов животных.// Кубанский государственный аграрный университет, 1999, Вып.375, с. 119-121.

41. Синагатуллина Э.М. Разработка тест-систем для выявления инфекционных агентов с использованием нерадиоактивных биотиниллированных ДНК-зондов // Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук, М., 1992.

42. Скалинский Е.И., Белоусов A.A. Микроструктура мяса.// М., Пищевая промышленность, 1978, с. 155-175.

43. Слесаренко H.A., Курмакаева Т.В., Якушев C.B. Морфологические критерии определения видовой принадлежности мяса.// Современные вопросы интенсификации кормления, содерж. животных и улучшения качества продуктов животноводства, М.,1999, с. 103-105

44. Стикланд Ю.Е. Получение зондов и их мечение.// В кн. Молекулярная клиническая диагностика. М, изд. «Мир», 1999, с. 329-372.

45. Татулов Ю. Качество свинины- одного из основных видов сырья мясной промышленности.// Свиноводство, 1997, № 6, с. 24-26.

46. Федеральный закон о качестве и безопасности пищевых продуктов.// Одобрен Советом Федерации 23 декабря 1999.

47. Фрумгарц Л.Ф., Киприянов С.М., Калачиков С.М. и др. Получение флуоресцентной меченой ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации.// Биоорганическая химия, 1986, №11, с. 15081513.

48. Хвыля С.И. Микроструктурный анализ, идентификация и фасильфикация мясных продуктов.// Пищевая промышленность, 1998, № 5, с. 68-69.

49. Хвыля С.И., Авилов В.В., Кузнецова Т.Г. Практическое применение гистологических методов анализа.// Мясная промышленность, 1994, №6, с.9-11.

50. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика.// М, изд. «Мир», 1999, с.558.

51. Чан Т.В.Т. Гибридизация нуклеиновых кислот.// В кн. Молекулярная клиническая диагностика. Методы, М., 1998, изд. «Мир», с. 374-394.

52. Черняева М.Н. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов. // Ветеринарнария, 2001, №6, с.47-50

53. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биотопов.// В кн. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М., изд. «Мир», 1999, с. 395-425.

54. Abraham J., Rajulu P.V. Species identification in unprocessed meats through agarose isoelectric focusing of urea-extracted proteins and myoglobin.// Indian J.anim.Sc., 1992, v. 62, № 1, p. 69-74.

55. Agrowal S., Cristodoulou C., Gait M. Efficient methods for attaching nonradioactive labels to the 5 ends of syntheticaligodeoxy ribonucleotides.// Nucl. Acid. Res. 1986. V. 14, p. 6227-6245.

56. Araki H. Et al. Histochemical properties of muscle fiber in breiler chickens.// Jap. Soc of Sci Fish. 1993, v.34, № 2, p. 137-144.

57. Arrand J. Preparation of nucleic acid probes: Nucleic acid hybridization: a practical approach // ED. By BD Hames, IRL Rpess, 1986, p. 40.

58. Badiani A.,Stipa S.,Nanni N.,Gatta P.P.,Manfredini M. Physical indices, processing yields, compositional parameters and fatty acid profile of three species of cultured sturgeon (genus Acipenser).// J.Sc.Food Agr., 1997, v.74, № 2, p. 257-264.

59. Baker R.F. Binding of DNA to cellulose nitrate filters under denaturing conditions // Anal. Biochem, 1977, v.78, p. 569-571.

60. Beneke B.,Hagen M. Eignung der PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion): Tierartennachweis in erhitzten Fleischerzeugnissen.// Fleischwirtschaft, 1998, Jg.78,N9.-S.1016-1019.

61. Bennet H.S. The structure and functional muscle.// Academic Press, New York, v.l, 1960, p. 137.

62. Bauer F., Rippel-Rachle B. Tierartenidentifizierung bei Fleisch und Fleischwaren.// Wien.tierarztl.Mschr, 1998, Jg.85,H.8.-S.260-266.

63. Boom R, Sol C, Beld M., Weel J., Goudsmit J., Wertheim-van Dillen. Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate DNA isolation Procedure Based on

64. Selective Binding of Bovin Alpha-Casein to Silica Particles // J. Clin. Microbiol, 1999, v.37, № 3, p.615-619.

65. Buntjer J.B.,Lamine A.,Haagsma N.,Lenstra J.A. Species identification by oligonucleotide hybridisation: the influence of processing of meat products.// J.Sc.Food Agr., 1999, v. 79, № 1, p. 53-57.

66. Britten R. J., Kohe D.E. Repeated sequences in DNA.// "Science", 1968, v.161, p.529-540.

67. Calvo J.H.,Zaragoza P.,Osta R. Random amplified polymorphic DNA fingerprints for identification of species in poultry pate.// Poultry Sc., 2001, v. 80, № 4, p. 522-524.

68. Cassiman I. Diagnosis of genetic diseases by probes // Acta clin. Belg, 1988, p. 181-184.

69. Chikuni K, Matsunaga T, Tanabe R. Determination of mitochondrial cytochrome B gene sequence for red deer and the differentiation of closely related deer meat. // Meat Sci, 1990, v. 49, № 4, p. 379-385.

70. Chou S., Merigan T.C. Rapid detection and quantitation of human cytomegalovirus in urine through DNA hybridization // New England Journal of Medicine., 1985, v. 308, p. 921-925.

71. Chu B.C.F., Wahl G.M., Orgel L.E. Derivatization of unprotected polynucleotides // Nucl. Acid Res., 1983, v. 11, p. 6513-6529.

72. Church R.B. Method for study of hybridization and reassociation of nucleic acids axtracted from cells of higher animals. In: Molecular techniques and approach in developmental biology, ed. by M. J. Chrispeels. N. Y., 1973, p. 223-301.

73. Coates P.J., Mak W.P., Slavin G., Ardenne A.J. Detection of singl copies of Epstein-Barr virus in paraffin wax sections by nonradioactive in situ hybridization // J. Clin. Pathol., 1991, v.44, № 6, p. 487-491.

74. Codex Alimentarius. Vol. 10, FAO, WHO, 1991, 223 p.

75. Cooper M.G. Species identification of meat product by standard methods.//Ed.Patt., 1985, v 6, p. 135-141.

76. Сох K.H., DeLeon D.V., Angerer L.M. Detection of mRNAs in sea unchin embryos by in situ hibridization using asymmetric RNA probes // Developmental Biology, 1987, v. 101, p.485-502.

77. Day P.J.R., Bevan I.S., Gurney S.J., Young L. S., Walker M.R. Synthesis in vitro and application of biotinylated DNA probes for human papiloma virus type 16 by utilizing the polimerase chain reaction. // Biochm.I. 1990. v.267,№l,p.l 19-123.

78. Demo P.,Poltarsky J.,Krska P.,Gracik P.,Fulop L. Identifikacia akostnych vad masa osipanych rozdielnych genotypov vyuzitim odlisnych hodnotiacich metod.// Zivocisna Vyroba, 1993, R.38, p.5, p. 457-469.

79. Denhardt D.T. A membrane filter technique for the detection of complementery DNA.// "Biochem. Biophys. Res. Commun.", 1966, v.23, p. 641-646.

80. Ding H.,Xu R.-J.,Chan D.K.O. Identification of broiler chicken meat using a visible/near-infrared spectroscopic technique.// J.Sc.Food Agr., 1999, v. 79, № 11, p. 1382-1388.

81. Erlich H.A. PCR technology.// Stockton Press, New York, 1989.

82. Fairbrother K.S.,Hopwood A.J.,Lockley A.K.,Bardsley R.G. Meat speciation by restriction fragment length polymorphism analysis using an alpha-actin cDNA probe.// Meat Sc., 1998, v.50, № 1, p. 105-114.

83. Fallcow S., Moseley S. Specific DNA probes in diagnostic microbiology // Патент США № 4358535, 10.11.1982,435/15.

84. Fei S.,0kayama T.,Yamanoue M.,Nishikawa I.,Mannen H.,Tsuji S. Species identification of meats and meat products by PCR.// Anim.Sc.Technol., 1996, v.67, № 10. p. 900-905.

85. Forster A., Modness J., Skingle D. Non-radioactive hybridization probes prepared by chemical labeling of DNA and RNA with novel reagent, photobiotin // Nuc. Acid Res., 1985, № 3, p.745.

86. Garger S., Turpen T. Use of RNA probes to detect plant RNA viruses // «Eth Enzymol., v.l 18, Orlando, 1986, p. 717-722.

87. Gillespie D., Spiegelman S. A quantive assay for DNA-RNA hybrids with DNA-RNA immobilized on a membrane // J. Molecul. Biol., 1965, v. 12, p.829-842.

88. Hames B.D., Higgins S.J. Nucleic acid hybridisation: a practical approach.// IRL Press, Oxford, 1985.

89. Hayashi K. Mannipulation of DNA by PCR. In. PCR the Polimerase chain reaction, Eds.: Mullis K.B., Ferre F. & Gibbs R.A., Birkhauser, 1994, p. 314.

90. Helle N. Et al. Methods of allocation DNA from chicken. // Arch. Fur Lebensmittelhygiene, 1996, v. 3, № 2, p. 48-51.

91. Heinert H.H. et al. The analysis of the beef forcemeat on the contents of the alimentary components. // Fleischwirtschaft, 1980, v. 2, p. 421-240.

92. Heinzelmann R. Beurteilung von Eber-, Zwitter-und Kryptorchiden (Binneneber) fleisch.// Fleischwirtschaft, 1999, Jg.79,N 9.-S.34-39.

93. Herrick J., Michalet X., Conti C., Schurra C., Bensimon A. Quantifying single gene copy number by measuring fluorescent probe lengths on combed genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sei., 2000, v. 97 (1), p 222-227.

94. Hoffmann K. Identification and determination of meat and foreign proteins by means of dodecylsulfat polyacrilamid gel electroforesis.// Ann. Nutr. Alim., 1977.-v.31, №2, -p.207-215.

95. Hopmar A., Wiegant J., Tesser G. A no-radioactive in situ hybridization method based on mercurated nucleic acid probes and sulfhydryl-hapten ligands // Nucl. Acud. Res., 1986, v. 14, № 16, p. 6471-6488.

96. Hopwood A.J., Fairbrother K.S., Lockley A.K., Bardsley R.G. An actin gene-related polymerase chain reaction (PCR) test for identification of chicken in meat mixtures.// Meat Sc., 1999, v. 53, № 4, p. 227-231.

97. Jannsen E. Method adapted to PhastSystem.// Z. Lebensm. Unterrs. Forsh.1986.-v. 182,-p.479-483.

98. Kim H. Et al. Applying of different methods for allocation DNA. // J. of Food Sei., 1986, v. 5, № 3, p. 68-71.

99. Kimpton C.P., Morris D.J., Corbit G. Sensitive non-isotopic DNA hybridisation assay or immerdiate-early antigen detection for rapid identification of human cytomegalovirus inurin// J. Virol. Meth., 1991, v.32, №1, p.189-199.

100. King N.L. Kurt L. Analysis of raw beef samples for adulterant meat species by enzyme staining of isoelectric focusing gels.// J. Food Sei.,—1982.-v.47,-p.1608-1612.

101. Koh M.C.,Lim C.H.,Chua S.B.,Chew S.T.JPhang S.T.W. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprints for identification of red meat animal species.// Meat Sc., 1998, v. 48, № 3/4, p. 275-285.

102. Kwiatek K.,Wojton B.,Rola J.,Rozanska H. The incidence of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. In meat, poultry and raw milk.// Bull.Veter.Inst.in Pulawy, 1992, v. 35, p. 7-11.

103. Lakshmi D., James D. A solution hybridization assay for the quantitation of prodynorphin mRNA // Mol. Brain Res., 1987, № 2, p. 173-176.

104. Langer P. R., Waldrop A.A., Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotimlabelled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes // Proc. Nat. Acad. Science., 1982, v.79, p. 4381-4385.

105. Leiser R., Schubert J. Nachweis phytopathogener Virren mit Hilfe der RNA-RNA-hydridisierung auf Filtern // Acta biotechnol, 1986, №1, p. 14-16.

106. Longer P. Enzymatic synthesis of biotin-labelekl polynucleotides novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1981, №11, p. 6633.

107. Ludke H.,Bargholz J.,Leiterer M. Wertbestimmende und Einige toxische Inhaltsstoffe in Fleisch und Verarbeitungsprodukten von Pute und Schwein. Schr.-R.// Verb.Dt.Landw.Unters.Forsch.-Anst., Darmstadt, 1993, № 37, -S. 669-672.

108. Macedo-Silva A.,Barbosa S.F.C.,Alkmin M.G.A.,Vaz A.J.,Shimokomaki M., Tenuta-Filho A. Hamburger meat identification by dot-ELISA.// Meat Sc., 2000, v. 56, № 2, p. 189-192.

109. Marmur J., Doty P. Heterogeneity in deoxyribonucleic acids. I. Dependens on composition of the configurational stbility of deoxyribonucleic acid.// "Nature", 1959, v. 183, p. 1427-1431.

110. Marmur J., Doty P. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acid. // J. Molecul. Biol., 1961, v.3, p.585-594.

111. Martin R., Haza A.I., Horales P. Detection and quantification of goats chees in ewes chees using a monoclonal antibody and two ELISA formats // J. Sc. FoodAgr. 1997, v.79, № 7, p. 35-41.

112. Martm R. H. Non-radioactive techiques for the labelling of nucleic acids // Biotech. Adv., 1991, v.79, p. 1043-1047.

113. Moio L., DiLuccia A., Addeo F. Fast isoelectric focusing of milk proteins on small ultrathin polyacrylamide gel containing urea. // Electrophoresis.-1989, v.10, p.535-539.

114. Moio L., Sasso M.L., Chianese L., Addeo F. Rapid detection of bovin milk in ovine, caprine and water buffalo milk or cheese by gel isoelectric focusing on PhastSystem. // Ital. J. Food Sci.,- 1990,- v.3,-. p. 71-176.

115. Mondini S.,Calocchio E.,Altissimi M.S.,Haouet M.N.,Cenci T. Validita dell'esame microscopico per la individuazione deH'origine delle farine di carne.// Selez.veter., 1999, № 7, p. 453-463.

116. Moore R., Schmid J. Gounder J and Stuley J Deoxyribonuclei acid Hology Among the Gaulobacters.// Inter J of Systemat. Bacter, 1978, v.28, №3, p.349-353.

117. Ouchterlony O. Progress in Allergy. 1958, v. 6, p. 30

118. Partis L.,Croan D.,Guo Z.,Clark R.,Coldham T.,Murby J. Evaluation of a DNA fingerprinting method for determining the species origin of meats.// Meat Sc., 2000, v. 54, № 4, p. 369-376.

119. Paz de Pena M.,Concepción Cid M.,Bello J. A method for identification of frozen meat used for production of cooked ham.// Meat Sc., 1998, v. 48, № 3/4, p. 257-264.

120. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White T.J. Target selection and optimization of amplification reaction // In: Diagnostic molecular microbiology, ASM, 1993, p. 88-102.

121. Rehbein H., Kress G., Schmidt T. Application of PCR-SSCP to cpecies identification of fishery products // J. of the Sci of Food and Agric., 1997, v. 74, № 1, p. 35-41.

122. Rehben H. Electrophoretic techniques for species identification of fichery products. Z, Lebensm. Unters Forsch., 1990, v. 191, p. 1-38.

123. Renand G. Perspectives d'amelioration genetique de la qualite de la viande.// Elevages beiges, 1993, № 12, p. 9-11.

124. Renz M., Kiirz C. A colorirnetric method for DNA hybridization // Nlicleic Acids Res., 1984. v. 12, № 8, p. 13435-13444.

125. Rusvai M., Belak S. Detection of bovine adenovirus nuclric acid sequences in nasal specimens by biotinylated DNA probes. 1992, №4, p.311-316.

126. Saiki R. X., Chu-An Chang B.S., Levenson C.H., Warren T.C., Bochm C.D., Kazazian J.H, ErilchH.A. //NewEng. J. Mod. 1988. v. 391. p. 537-541.

127. Sakurai M., Hikono H., Ohta M. Production and characterization of monoclonal antibodyes that zecognize bovine kit zeceptor. //Veter. Immunol. Immunopathol. 1997, v. 68, № 2/4, p. 101-112.

128. Serhir B., Dugord D., Jacques M., Higgins R., Harel J. Cloning and characterization gene (dexS) from Streptococcus suis.// GENE, 1997, № 190, p. 257-261.

129. Seymour C. Electrophoresis technology: food and reverage analysis.// Food Tech. Europe, 1993, Sept/Nov., p.127-152.

130. Shibata D., Martin W., Appiemen M. Detection of cytomegalovirus DNA in periferal blood of patients infected with human immunodefficiency virus.// Infec. Deseases 1988, №6, p. 1185-1192.

131. Skarpeid H.-J.,Moe R.E.,Indahl U.G. Detection of mechanically recovered meat and head meat from cattle in ground beef mixtures by multivariate analysis of isoelectric focusing protein profiles.// Meat Sc., 2001, v. 57, № 3jP. 227-234.

132. Swatland H.J. Early PSE detection.Ontario swine research rev.// Guelph,1997, 1997, p. 50-51.

133. Taylor A. Et al. Extraction and ESI-CID-Ms/Ms analysis of myoglobins fran different meat species // Food Sci. &Techn. Tod., 2000, v. 69, № 1, p. 8186.

134. Tchen P., Ranki M. Time-resolved fluoromentri, a sensitive method to quantify DNA-hybrids // Nucl. Acid Res., 1986, № 2, p. 1017-1028.

135. Tenover F. Studies ofantimicrobiol resistance genes using DNA probes // Antimicrob Ag Chemother, 1986, №5, p.721-725.

136. Tetu-Oporanu M,Cismileanu A,Barzoi D,Mitrea L.I. Identification of the species of origin of meat by the ID-SPECITEST reagents kit (Pasteur institute, Bucharest).// Studies and researches in veterinary medicine, Bucharest, 1999, v.7, p. 13-19.

137. Todd D, Creelan J. L, MeNulty M. S. Dot-hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe // J. Clin. Microbiol, 1991, v.29, № 5, p. 933-939.

138. Trainer G, Hobbs F. New methods for labeling nucleic acids with reporter groups // J. Cell. Biochem, 1989, suppl, №13, p. 289.

139. Varga C,Strelec V,Volk M. Poultry meat in the production of meat products.// Agriculture, 2000, v. 6, № 1, p. 49-52.

140. Wetmur J. G, Davidson W. Kinetics ofrenaturation of DNA // J. Mol. Biol, 1968, №31, p. 349-370.

141. Wolf C,Rentsch J,Hubner P. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification.// J.agr.Food Chem, 1999, v. 47, №4, p. 1350-1355.110

142. Wolf C.,Burgener M.,Hubner P.,Luthy J. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: differentiation of fish species.// Food Sc.Technol., 2000, v .33, №2, p. 144-150.

143. Yamanaka M.,Kudo T.,Itagaki Y.,Sato S.,Nakamura T. Sex identification of beef by polymerase chain reaction.// Anim Sc.J., 1999, v.70, № 8,p. 111-113.

144. Yman I. M. Meat and fish species identification by isoelectric focusing. // Food laboratory news, v.6, N2, 1990, p. 28-45.

145. Zimmermann S.,Zehner R.,Mebs D. Tierartenidentifizierung aus Fleischproben mittels DNA-Analyse.// Fleischwirtschaft, 1998, Jg.78,N 5,-S.530-533.1. МИНИСТЕРСТВО

146. СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА ОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ1. УТВЕРЖДАЮ

147. Заместитель руководителя Департамента ветеринарии Ми I гидт ерства сельского

148. Настоящие методические указания предназначены для ускоренной дентификации мяса и мясопродуктов посредством ПЦР.

149. Компонентами анализа являются: испытуемый материал (мясо, ясопродукты), реагенты для выделения ДНК, постановки ПЦР и проведения тектрофррёза. •1. Общие положения

150. В исследованиях используются коммерческие ПЦР диагностикумы, ■:ли реагенты для ПЦР содержащие праймеры для идентификации мяса шзличных животных: говядины, баранины, свинины, крольчатины, конины, мяса1. ТИЦЫ И Др.

151. Отбор и подготовка проб для исследования.

152. Пробы мяса и мясопродуктов отбирают по ГОСТ 7269-79.

153. Пробирку со смесью термостатируют 30 мин при 65°С.

154. После термостатирования пробирки со смесью центрифугируют при 5ООО & в течение 10 сек., если смесь содержит несолюбилизированный клеточный ;ебрис или другой нерастворимый осадок. Прозрачный супернатант целиком шреносят в чистую пробирку.

155. В пробирку с чистой смесью добавляют 20 мкл суспензии сорбента \fucleoS™ (перед использованием Шс1ео8™ следует интенсивно встряхнуть на юртексе).

156. Пробирку помещают на ротатор и перемешивают 10 мин (10-20б/мин).

157. Затем пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при 000^, в течение 10 сек.

158. Осторожно, не задевая осадка, удаляют супернатант с помощью стоматического дозатора или перестальтического насоса.

159. К осадку добавляют 200 мкл лизирующего реагента, тщательно еремешивают на вортексе до полного гомогенного состояния.

160. Добавляют в пробирку 1 мл рабочего раствора солевого буфера.

161. Перемешивают содержимое пробирки переворачиванием 5-10 раз.

162. Центрифугируют 10 сек. при 5000§.

163. Осторожно удаляют супернатант, не задевая осадка, с помощью втоматического дозатора или перестальтического насоса.

164. Добавляют в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешивают эдержимое пробирки на вортексе, центрифугируют при 5000 g в течение 10 сек., даляют супернатант с помощью насоса.218. Повторяют операцию 2.17.

165. Осадок сушат при температуре 65 °С в течение 4-5 мин.

166. В эту же пробирку вносят 50-100 мкл ЭкстраГена™.

167. Суспендируют содержимое пробирки на вортексе в течение 5-10 сек о получения гомогенной массы, после чего термостатируют 4-5 мин при 65 °С.

168. Еще раз суспендируют содержимое на вортексе перед знтрифугированием.

169. Центрифугируют при 10000 g в течение 1 мин.

170. Переносят супернатант, содержащий ДНК, в чистую пробирку.

171. ДНК можно хранить при минус 20 °С, до проведения реакции ПЦР.

172. Проведение ПЦР исследуемого фрагмента ДНК .

173. Перед началом работы вынимают из морозильника комплект реагентов 1я амплификации ДНК, размораживают содержимое пробирок, аккуратно еремешивают и помещают все пробирки в ледяную баню.

174. Маркируют соответствующим образом необходимое количество зооирок на 0.5 мл, а также одну пробирку для положительного контрольного зразца (+) и две пробирки отрицательного контрольного образца (-).

175. Таг-пол, мкл 1,2 1,8 2,4 3,0 3,6 4,2 4,8 5,4 6,0 6,6 7,21раймеры, мкл 1,2 1,8 2,4 3,0 3,6 4,2 4,8 5,4 6,0 6,6 7,2

176. Во все пробирки вносят по 15,0 мкл готового рабочего раствораупермикса.

177. Во все пробирки вносят по капле (20 мкл) разогретого (65-85 °С) .инойла (очень быстро застывает, поэтому у наконечника обрезается кончик и абирают сразу большой объем 200 мкл и немедленно раскапывается).

178. В пробирки, маркированные (-), вносят по 15 мкл отрицательного онтрольного образца.

179. В пробирки для анализируемых образцов вносят по 15 мкл исследуемой ,НК (п. 2.25.).

180. В пробирку, маркированную знаком (+), вносят 15 мкл положительного знтрольного образца.

181. После застывания агарозы (25-30 мин) осторожно, не повреждая ;рманы, вынимают гребенку, а платформу с агарозным гелем переносят из .hü очки в электрофоретическую камеру.

182. Смесь амплификата с бромфеноловым синим (15 мкл) вносят в лунку арозного геля под ТБЕ буфер.

183. Устанавливают крышку на камеру, подключают электрофоретическую меру к источнику питания (200 вольт, не более 15 вольт/см).

184. Через 20-30 мин (5 см прогона.образцов) электрофоретическую камеру ключают от источника питания, отсоединяют, провода от камеры и только после ого снимают крышку с электрофоретической камеры.

185. Вынимают платформу с агарозным гелем из электрофоретической к:ры, дают жидкости стечь с геля и осторожно промывают гель тиллированной водой. При работе с гелем, пропитанным этиднумом мидом, который является канцерогеном, надеть резиновые перчатки.

186. Помещают гель на экран трансиллюминатора, надевают защитную ку или устанавливают защитный экран, включают ультрафиолетовый г и анализируют полученные результаты.

187. Учет и оценка результатов.

188. В пробе из пробирки, маркированной (+), должна быть видна ¡ ящаяся полоска ДНК желтого цвета.

189. В пробе, маркированной (-), светящаяся полоска ДНК желтого цвета жна отсутствовать.6. Материалы и оборудование

190. Программируемый термостат (амплификатор).

191. Термостат для микропробирок, поддерживающий температуру 65+2 °С.

192. Микроцентрифуга, развивающая ускорение 12000g.64. Ротатор.65. Вортекс.

193. Электрофоретическая камера.

194. Источник постоянного тока.68. УФ-трансиллюминатор.69. Холодильник бытовой.610. Морозильник (-20 °С).

195. Плитка электрическая или СВЧ-печь.613. Водоструйный насос.614. Микропробирки (0,5 мл).615. Микропробирки (1,5 мл).

196. Колба коническая (250 мл).61 7. Колба мерная (200 мл и 1000 мл).618. Цилиндр мерный (500 мл).

197. Перчатки резиновые медицинские.

198. Спирт этиловый ректификованный 96%.621. Вода дистиллированная.

199. Комплект для выделения ДНК:622.1 . Раствор I- Lysis reagent (лизирующий).622.2. Раствор 2 Wash reagent (промывающий).622.3. Раствор 3 Saline buffer (элюирующий).622.4. Раствор 4 Elution buffer (элюирующий).622.5. Суспензия сорбента NucleoS.

200. Комплект для детекции ДНК:624.1 . TBE buffer (буфер для электрофореза).624.2. Aragose (арагоза).624.3. BP Dye (краска, бромфеноловый синий).624.4. BP Dye (краска, этидиум бромид).7. Условия хранения.

201. Комплект для выделения ДНК и комплект для детекции ДНК должны ;раниться при температуре 2-8°С в течение 12-мес.10

202. Комплект для амплификации ДНК должен храниться при температуре С в течение 2 мес.

203. Этиловый 70% спирт может храниться при температуре 2-8°С в течение месяцев в герметично закрытой посуде.

204. Рабочий раствор солевого буфера можно хранить в герметично ■.крытой посуде при температуре 2-8°С в течение 2 мес.

205. Рабочий раствор TBE буфера для электрофореза можно хранить при : ¡натной температуре в течение 2 мес.

206. УТВЕРЖДАЮ Заместитель руководителяпь, при этом в случае их взаимодействия образуется полоса преципитации жду противоположными лунками.

207. Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104 Меры массы по ГОСТ 7328

208. Микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) РТ-2 или «Ультратюракс» с частотой 8000 24000 об/мин

209. Центрифуга с устанавливаемой частотой вращения 3000 об/мин Центрифужные пробирки

210. Термостат с устанавливаемой температурой 37°С Водяная баня

211. Электроплитка с закрытой спиралью Холодильник бытовой

212. Трафарет-пробойник или инъекционная игла диаметром 2-3 мм сзаточенным плоским концом

213. Дозатор на 20 мкл с разовыми наконечниками

214. Липетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 5 мл по Х)СТ 29227 .

215. Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 250 мл исп. 2 по ГОСТ 1770

216. Цилиндр мерный 2-го класса точности вместимостью 50 мл по ГОСТ1770

217. Цилиндр мерный 2-го класса точности вместимостью 250 мл по ГОСТ 1770

218. Пробирки П-2-15-14/23 с притертыми стеклянными пробками Стеклянные бюксы, объемом около 20 мл с притертой пробкой Колбы конические со шлифом и притертой пробкой на 50 мл типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

219. Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336 Ступка фарфоровая № 4 (100 мм) с пестиком Стеклянная палочка Чашки Петри 100 х 15 мм

220. Стакан лабораторный вместимостью 400 мл по ГОСТ 25336 Фильтровальная бумага

221. Необходимые реактивы и материалы

222. Специфические диагностические сыворотки, преципитирующие >роточные белки крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота,ьи, курицы и индейки.

223. Бактериологический агар Дифко или аналогичной марки Борная кислота (обладает антимикробным действием), ч Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис-основание), ч.д.а. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), ч.д.а. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709

224. Порядок отбора проб и подготовка к проведению исследований

225. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и согласно действующей нормативной документации.

226. Пробы доставляют в лабораторию не позднее 6 часов после их отбора.

227. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. Три отсутствии такой возможности допускается хранение образцов не более ем 2 суток с момента отбора, при температуре 2 8° С, либо 3-6 месяцев, ри температуре - 20°С.

228. Приготовление буферного раствора. ' •43.1. Приготовление концентрированного буферного раствора.

229. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Раствор дательно перемешивают до растворения осадка.

230. Срок хранения раствора при комнатной температуре 2 недели.43.2. Приготовление готового буферного раствора.

231. В мерную колбу объемом 250 мл с помощью мерного цилиндра вносят мл концентрированного буферного раствора. Раствор в колбе доводят до тки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.44. Приготовление геля

232. Для приготовления геля навеску 3 г агара переносят в лабораторный кан и добавляют 200 мл готового буферного раствора, отмеренные с ющью мерного цилиндра. . '

233. Стакан помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного творения агара, периодически помешивая раствор стеклянной палочкой.

234. Порции готового геля по 40- 50 мл разливают в мерные колбы с ритертой пробкой.

235. Срок хранения геля 7-10 дней при температуре 8 10°С.

236. Подготовка проб для исследования

237. Навеску 5-7 г исследуемого образца (мясо, мясные полуфабрикаты,4арш, субпродукты), по возможности без жира и соединительной ткани, змельчают с помощью гомогенизатора или растирая в ступке.

238. Измельченную пробу помещают в стеклянный бюкс или пробирку с фитертой пробкой, добавляют 5 мл готового буферного • раствора, еремешивают и оставляют в холодильнике на 1-2 часа.

239. По окончании экстрагирования вытяжки переносят в центрифужные робиркй и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15-20 минут. В случае бразования на поверхности раствора жирового слоя его удаляют с помощью вернутой в трубочку фильтровальной бумаги.

240. Постановка реакции преципитации в геле

241. Готовый гель расплавляют в колбе на кипящей водяной бане и азливают в чистые обезжиренные чашки Петри слоем толщиной 2-3 мм тонадобится около 20 мл геля). При разливе геля чашки Петри должны аходиться на строго горизонтальной поверхности.

242. Вырезанные фрагменты геля удаляют из лунок с помощью тонкой иглы пи маленького пйнцета. . ''

243. Чашки Петри с исследуемым материалом закрывают крышкой имещают в термостат при 37 °С на 24 часа. Реакцию преципитацииенивают по наличию или отсутствию полосы преципитации между отивородожными лунками.

244. Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторной диагностики Департамен-------------------7. Учет результатов

245. Разработано: >ссийский научно-довательский1тут ветеринарной санитарии, ны и экологии1. В.В. Светличкин1. А.К. Кононенко1. Стай ля1. А.В.ГалкинJ