Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.06, кандидат биологических наук Писарева, Вера Михайловна

• Писарева, Вера Михайловна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Писарева, Вера Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ. ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методические приемы идентификации и контроля качества

мяса и рыбы

1.1.1 .Органолептические методы исследования

1.1.2.Гистологические методы исследования

1.1.3. Химические методы исследования

1.2 Метод электрофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов

1.2.1.Электрофорез в нативных и денатурирующих условиях

1.2.2. Изоэлектрофокусирование (ИЭФ)

1.2.3, Иммунохимические методы определения видовой специфичности образцов мяса

1.3 Оценка дополнительных источников белка, используемых при производстве пищевых

продуктов

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Изоэлектрофокусирование

2.2.2. ЗБЭ- электрофорез

2.2.3. Денситометрия

2.3. Результаты исследования

2.3.1. Анализ видовой принадлежности мяса

сельскохозяйственных животных, птицы и субпродуктов изоэлектрофокусированием

2. 3.1.1.Выбор условий солюбилизации белков из мясных продуктов

2.3.1.2.Создание коллекции (атласа) электрофореграмм белков различных видов мяса и субпродуктов

2.3.1.3. Определение качественного и количественного

состава многокомпонентного фарша

2. 3.2. Анализ видовой принадлежности рыбы методом изоэлектрофокусирования

2.3.2.1.Выбор условий солюбилизации белков рыбы и создание коллекции (атласа) электрофореграмм белков различных видов рыбы

2.3.2.2.Определение видовой специфичности и количественная

оценка составляющих рыбного фарша

2.3.3. Анализ термообработанных продуктов электрофорети-

ческими методами

2.3.3.1 Анализ термообработанных продуктов методом 8Б8-электрофореза

2.3.3.2. Разработка способа экстракции белков колбасных изделий для анализа их электрофокусированием в стандартных полиакриламидных гелях

2.3.3.3. Выявление и полуколичественное определение

соевого наполнителя колбасного фарша

2.3.3.^Количественная оценка содержания соевых белков в колбасных изделиях

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом»

ВВЕДЕНИЕ

Становление рыночных отношений, их дальнейшее развитие и совершенствование требуют чёткого подхода к характеристикам пищевых продуктов. В связи с этим проблема многостороннего изучения пищевых продуктов была и будет актуальной независимо от общественных формаций и производственных отношений.

Экспертное и ветеринарно-санитарное исследование пищевых продуктов включает в себя оценку видовых, качественных, количественных и стоимостных характеристик товара. Важнейшим элементом этой оценки является идентификация товаров.

Цель идентификации- выявление и подтверждение подлинности конкретного вида и наименования продукта, а также соответствия требованиям научно-технической документации и информации о нём, указанной на маркировке и товарно-сопроводительных документах. Конечный результат идентификации носит альтернативный характер: выявляется либо соответствие, либо несоответствие продукта определённым требованиям. ' Отрицательный результат при идентификации свидетельствует о фальсификации товара.

Используемые в настоящее время для идентификации пищевых продуктов органолептические, химические и гистологические методы позволяют осуществлять контроль качества товара (включая также ветеринарно-санитарный контроль), однако они имеют существенные ограничения в случае идентификации видовой принадлежности мясных и$и рыбных продуктов, особенно если дело касается близкородственных видов.

Значительные трудности представляет также идентификация различных белковых добавок в мясных изделиях, избыточное содержание которых приводит к значительному снижению

качественных показателей продуктов. С каждым годом ассортимент препаратов, используемых в качестве таких добавок все более расширяется. Это и вторичные продукты переработки молока (обрат), и боенская кровь (плазма, сыворотка), и белок масличных культур. Относительно низкая себестоимость этих добавок и стала причиной все более часто встречающихся случаев фальсификации пищевых продуктов, в частности, колбасных изделий, консервов и других мясопродуктов.

Перечисленные проблемы могут быть разрешены с использованием современных электрофоретических методов. Эти методы используются в научных исследованиях, однако для применения с целью экспертизы пищевых продуктов и внедрения их в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов, а также создание атласа (коллекции) электрофореграмм различных белковых продуктов животного и растительного происхождения, который может в дальнейшем использоваться для идентификации исследуемых образцов.

Это направление открывает широкие перспективы в практике ветеринарной санитарии и экологии, дает возможность наиболее качественного анализа продуктов питания. Решение этой проблемы имеет как научное, так и практическое значение.

Цель настоящей работы - идентификация видовой принадлежности мясных, рыбных и других белковых продуктов животного и растительного происхождения, а также количественная оценка различных составляющих в нативных и термообработанных многокомпонентных мясных и рыбных продуктах

электрофоретическими методами.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать оптимальные способы экстрации белков из колбасных изделий для последующего их анализа электрофоретическими методами..

2. Определить характеристические видоспецифические белковые зоны, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности мяса или рыбы.

3. Создать атлас электрофореграмм белков мяса и субпродуктов различных видов животных.

4. Создать атлас электрофореграмм белков различных видов

рыбы.

5. Дать оценку содержания соевых добавок в колбасных изделиях.

На основе использования электрофоретических методов разработан новый способ анализа мясных и рыбных продуктов, позволяющий проводить определение видовой принадлежности исследуемых образцов мяса или рыбы, качественно и количественно оценивать составляющие многокомпонентного фарша, а также немясные белковые добавки в колбасных изделиях.

Создана коллекция электрофореграмм белков различных образцов мяса, рыбы и птицы. Установлены существенные различия в белковых спектрах мяса и субпродуктов различных видов животных, а также близкородственных видов рыбы. Определены видоспецифические «маркерные» белковые зоны, по которым проводится видовая идентификация.

Впервые метод изоэлектрофокусирования адаптирован для анализа вареных колбас. Это стало возможным благодаря разработке нового способа экстракции белков из термообработанных продуктов, заключающегося в обработке их 3% раствором Тритона X 100.

Разработанный метод существенно расширяет возможности сертификационных лабораторий и позволяет выявлять

- видовую фальсификацию мяса и рыбы (даже в тех случаях, когда тестируемые образцы лишены своих характерных морфологических признаков),

- видовую фальсификацию в продуктах переработки мяса и рыбы, в том числе в многокомпонентном фарше,

- оценивать содержание каждого из составляющих мясного или рыбного фарша,

- выявлять и оценивать содержание немясных добавок растительного происхождения в колбасных изделиях.

Результаты исследований вошли в "Методические рекомендации по определению видовой принадлежности белков животного и растительного происхождения в пищевых продуктах изоэлектрофокусированием", которые используются при проведении сертификационных испытаний мясных и рыбных продуктов в фирме «Тест».

: »

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Писарева, Вера Михайловна

Выводы

1. Использование метода изоэлектрофокусирования позволяет с высокой степенью точности идентифицировать видовую принадлежность белков животного и растительного происхождения.

2. Экспериментальным путем подобраны оптимальные условия для анализа методом изоэлектрофокусирования в системе РЬаз18уз1ет нативных образцов мяса и рыбы: для экстракции белков из этих образцов оптимально использовать 50мМ трис-НС1 буферный раствор рН 7.0 в объеме, вдвое превышающем навеску образца; наилучшее разделение белковых экстрактов достигается в полиакриламидных гелях с градиентом рН 3-9 при аппликации экстрактов мяса вблизи катода, а рыбы - вблизи анода.

3. Разработаны условия подготовки образцов вареных колбас для анализа методом изоэлектрофокусированйя: показано, что использование 3% раствора - Тритона XI00 обеспечивает достаточно полную экстракцию белков, необходимую для анализа в системе РЬаз18уз1ет.

4. На основе метода изоэлектрофокусирования в сочетании с денситометрией разработан способ качественной и количественной оценки различных составляющих многокомпонентного мясного и рыбного фарша: наличие в анализируемом фарше того или иного вида мяса (рыбы) устанавливается по выявлению на электрофореграмме фарша соответствующих видоспецифических «маркерных» зон; определение доли каждого компонента - по соотношению величины пиков соответствующих «маркерных» зон на денситограмме индивидуального образца мяса (рыбы) и в составе фарша.

5. Показана возможность использования метода 8В8-электрофореза в системе PhastSystem для анализа термообработанных продуктов (колбаса вареная, колбаса сырокопченая, мясо тушеное ).

6. На основе изоэлектрофокусирования в сочетании с денситометрией разработан метод количественной оценки содержания соевых белков в колбасных изделиях.

7. Создана коллекция электрофореграмм белка образцов мяса и субпродуктов различных видов животных и птиц, а также различных видов рыбы, которая апробирована в экспертизах по установлению видовой специфичности неизвестных образцов.

8. Разработаны «Методические рекомендации по определению видовой принадлежности белков животного и растительного происхождения в пищевых продуктах изоэлектрофокусированием», утвержденные В/О СОЮЗЭКСПЕРТИЗА Торгово-промышленной Палаты

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Писарева, Вера Михайловна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1.Аксюк И.Н., Пятницкая И.Н., Сомин В.И. Химический состав новых источников пищи и их биологическая ценность //■■ Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. - т.23, №4, 1978, с. 435-442.

2. Александрова H.A. и др. Методы оценки качества мяса и мясопродуктов, применяемые за рубежом. - М., 1997,. 156 с.

3. Алехина Л.Т. и др. Технология мяса и мясопродуктов.- М.: Агропромиздат.- 1988. - 321с.

4. Алёхина Л.Т., Андреенков В.И., Ивашов В.И. Современные методы анализа качества мяса и мясопродуктов. - В: "Мясная промышленность", АгроНИИТЭИММП, М., 1991. 3 5с.

5. Алехина Л.Т., Отряшенкова Л.М. Исследование и контроль мяса и мясопродуктов.-М.,:Агропромиздат,- 1985,- 116с.

6. Андреева А.И., Пелевина В.И., Александрова Т.И. Новые и улучшенные виды мясных продуктов (колбасных изделий с добавлением субпродуктов и белковых компонентов растительного и животного происхождения)// Мясная промышленность: Обзорная информация- М.:ЦНИИТЭИММП.-1982.-24с.

7. Батурин А.К. Питание населения России в 1989-1993гг // Вопросы питания.- 1994.-N3.-C.24-26.

8. Беленький Н.Г. и др. Методические рекомендации для использования экспресс- метода биологической оценки продуктов и кормовю- М.: ВАСХНИЛ.- 1976.- 12с.

9. Беляев М.П. и др. Справочник предельно допустимых концентраций вредных веществ в пищевых продуктах и среде обитания.- М.: Агропромиздат.- 1993.-86с.

10. Бойков Ю.И. и др. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства мяса и мясных продуктов.- М.: Легкая и пищевая промышленность.-1983.-68с.

11. Бойков Ю.И. Современные требования к качеству мясопродуктов //Ветеринария.-1987.-№10.-с.5-8.

12. БоровиковаЛ.А. и др. Исследование продовольственных товаров.- М. :Экономика.-1980.-34с.

13 Взоров В.И. Рыбные товары. - В: "Товароведение продовольственных товаров" под ред. Рукосуева А.Н., М., 1960, с. 8-24, 108-118.

14. Взоров В.И. Исследование химического состава рыбы. - В: "Сборник научных работ"., ВЗИСТ, М., 1956, с.7-9.

15. Витт С.В., Сапоровская М.Б., Беликов В.Н. Об анализе аминокислот методом газо-жидкостной хроматографии.// Журная аналитической химии.,- 1966, т.21, №2, с.227-231.

16. Воякин М.П. и др. Оптимизация вареных колбас с заданным химическим составом // Мясная индустрия СССР.—1981.- N 10.-с.26-28.

17. Вундерли X. Иммуноэлектрофорез в агаровом геле. В кн.: Аналитические методы белковой химии. Изд. Иностранной литературы, Москва, 1963,с. 167-178.

18. Горегляд Х.С., Макаров В.А., Чеботарев В.И. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства.-М.:Колос, 1981, 583с.

19. Горовой В.И., Есейчик В.И., Хиль Г.Н. Основные направления использования вторичных ресурсов на предприятиях пищевой промышленности. - В: "Пищевая промышленность", АгроНИИТЭИММП, М., 1987, с. 14-17.

20. ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести.

21. ГОСТ 9959-51. Продукты мясные. Общие условия проведения органолептической оценки.

22. ГОСТ 23481-79. Мясо птицы. Метод гистологического анализа.

23. ГОСТ 28825-90. Мясо птицы. Приемка.

24. ГОСТ 19496-93. Мясо. Методы гистологического исследования.

25. ГОСТ 23392-78. Мясо. Методы химического и микроскопического анализа свежести.

26. ГОСТ Р 50453-92 (ИСО 937-78). Мясо и мясные продукты. Определение содержания азота. (Арбитражный метод).

27. ГОСТ 25011-81. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка.

28. Гуринович Т.В. и др. Зависимость цвета свинины от характера автолиза // Мясная промышленность .-1989-№1. - с.23-24.

29. Детерман Г. Гель-хроматография. - М., Мир, 1970, 252с.

30. Долгов В.А. Методические аспекты и практическое применение ускоренной биологической оценки кормов.продуктов питания и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля.- Дисс. ...докт.вет.наук.- М.- 1992.- 198с.

31. Долгов В.А. Методические рекомендации для использования экспресс- метода биологической оценки продуктов и кормов.- М.: Агропромиздатю- 1992.-14с.

32. Долгов В.А. Ветеринарно-санитарные и экологические аспекты биотестированияю- М.: ВНИИВСГЭ.- 1993.- 74с.

33. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки.-М., Мир, 1976,-364с.

34. Жаринов А.И., Хлебников И,В., Мадалиев И.К. Вторичное белоксодержащее сырье: способы обработки и использования. - Мясная промышленность, 1993, №2, с.22-24.

35. Жаринов А.И. Краткие курсы по основам современных. технологий переработки мяса, под ред. Волкина М.П.,: М., 1994, 118с.

36. Журавская Н.К., Алёхина JI.T., Отряшенкова JI.M.

Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов,- М..: Агропромиздат, 1985, 296 с.

37. Кармас Э. Технология колбасных изделий.- М.: Легкая и пищевая промышленность.- 1981.- 256с.

38. Косой В.Д. Совершенствование процессов производства вареных колбас.- М.: Легкая и пищевая промышленность.-1983 .-271с.

39. Костенко Ю.Г. Актуальные вопросы ветеринарно-санитарного контроля // Мясная промышленность.-!995.-№2.- с.28-30.

40. Кроха Ю.А., Салаватулина Р.Н. Влияние белковых компонентов на качественные характеристики вареных колбасных изделий // Мясная промышленность.: Обзорная информация.- М.: ЦНИИТЭИММП.- 1984.-28с.

41. Костычев П.И. Состав разных рыбных продуктов. - Сельское хозяйство и лесоводство., 1986, т.14, с.38.

42. Крылова Н.И., Лесковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения., Пищевая промышленность, М., 1968, 316с.

43. Кузнецова Т.Г. Оценка морфологических свойств мясного сырья и колбасных изделий по микроструктурным показателям.-М.: Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук, 1997.

44. Лаврова Л.П., Крылова В.В. Технология колбасных изделий.-М., Пищевая промышленность, 1975,-343с.

45. Ленинджер А. Биохимия., М., Мир, 1974, с.94-99.

46. Лори Т.А. Наука о мясе.- М., Пищевая промышленность, 1973.198 с.

47. Маурер Г.Р. Диск-электрофорез. М., Мир, 1969,.247с.

. 48. Мицык В.Е., Николаенко А.Ф. Использование крови, мясных субпродуктов и молочного белка при производстве колбасных изделий // Мясная промышленность : Обзорная информация.- М.-ЦНИИТЭИММП.- 19722.-23с.

49. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н.

Идентификация и фальсификация пищевых продуктов. М.: Экономика, 1996, с.84-95.

50. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Под ред. Ю.А. Овчинникова, М., Москва, 1974, 462с.

51. Остерман М.Б. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот.-М., Наука, 1981, 288с.

52.0стерман М.Б. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами., - М., Наука, 1983, с.4-45.

53. Переплетчик P.P. Замораживание, упаковка и хранение мороженой рыбы., - ППИ, М., 1957, с. 12-15.

54. Перкель Т.П.,,: Журавская Н.К., Рогов И.А. Вопросы цветообразования комбинированных продуктов.// Мясная промышленность : Обзорная информация.- М.: ЦНИИТЭИММП.- 1981.-311с.

55. Покровский А.А. Некоторые проблемы биохимии питания.// Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева,- т. 10, №3, 1965, с.247-256.

56. Родина О.С. Биологическая оценка сырокопченых и сыровяленых колбас в зависимости от технологии их производства. Дисс. ... канд. биол. наук.- 1970.-172с.

57. Руководство по методам анализа качества и белопасности пищевых продуктов. Под ред. Скурихина И.М., Тутеляна В.А., М.: "Брандес", "Медицина", 1998, 232с.

58. Салаватулина P.M., Печникова А.Н., Любченко В.И.

Технологический процесс производства вареных колбасных изделий заданного химического состаава // Мясная и холодильная промышленность: Экспресс- информация / ВНИИХИМП.- 1989.-Вып.2.- с. 15-17

59. Серкл С.Д., Смит А.К. Соевые бобы: переработка и продукты. -В: «Источники пищевого белка», М.: Колос, 1979, с.67-87.

60. Скалинский Е.И., Белоусов A.A. Микроструктура мяса.-М.: Пищевая промышленность, 1978, с.155-175.

61. Сметании К.А. Основные показатели мирового рыболовства.// Рыбное хозяйство,- 1967, №10, с.69-74.

62. Современные методы исследования качества пищевых продуктов. (И.А. Снегирёва, Ю.Н.Жанко, Т.Г.Родина и др.), -М.: Экономика, 1976, 222с.

63. Соколов A.A. Физико-химические и биохимические основы технологии мясопродуктов. - М.: Пищевая промышленность, 1965, 490с.

64. Суханова Е.Ю. Рыба и рыбные товары. - В: «Справочник товароведа продовольственных товаров», часть 2, ГТИ, М., 1955, с.512-514, с.529.

65. Технология мяса и мясопродуктов. Под ред. Рогова И.А., -ВО «Агропромиздат», 1988, 576с.

66. Титов Е.И. и др. Продукты переработки зерновых в теънологии мясных продуктов // Мясная промышленность : Обзорная информация.-М.: АгроНИИТЭИММП.—1994.-26с.

67. Толстогузов В.Б. Искусственные продукты питания. - М.: Наука, 1978, 232с.

68. Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи. - М.: Агропромиздат, 1987, 303с.

69. Тутельян В.А. Современные приоритеты науки о питании // Вопросы питания.- 1994.- №3.- с. 12-13

70. Хейфец М.А. Санитарно-микробиологические исследования колбасных изделий.- Л.: Медицина.- 1986.-34с.

71. Хвыля С.И., Авилов В.В., Кузнецова Т.Г. Практическое применение гистологических методов анализа.// Мясная промышленность, -1994, №6, с.9-11.

72. Химический состав пищевых продуктов. Под ред. И.М.Скурихина и Волгарева М.Н., .-М.: ВО "Агропромиздат", 1987, 224с.

73. Шередека И.А., Ракчеев А.А. Торговля рыбой и рыбными товарами. ГТИ, М., 1957, 87с.

74. Шляпников С.В., Карпейский М.Я.и др. Применение метода газо-жидкостной хроматографии для количественного анализа аминокислот. // Биохимия,- 1965, т.ЗО, №3, с.457-462.

75. Эффат И.С. Разработка технологии вареной колбасы с использованием препарата " Soubean" - Дисс. ...канд.вет.наук.- М.: МГАПБ.- 1987.-139с.

76. Allen R.C. Isoelectric Focusing. In Gel Electrophoresis and Isoelectric focusing of Proteins.-Walter de Gruiter, Berlin and New York, 1984-p.76.

77. Andrews A. T. Molecular weight measurements and the use of gel concentration gradients. In Electrophoresis. Theory, techniques and biochemical applications.- Clarendon Press, Oxford, 1981-p.63-80.

78. Asghar A., Pearson A.M. Influence of ante- and post morten quolity. // Advancer in food research,- v.26., 1980, p.63-69.

79. Baldini P.P., Fornetta A.P. The use of soy ptoteins in the manufacture of some typical. Italian meat product: mor taclella solauei // Ind.conserve.- 1978.-vol.. 33.- n.4.-p.267-269

80. Baldwin A.R. Summary of the world soy protein conference.// J. American Chem. Oil Soc.,- 1974,- v.51, р.181А.

81. Bauer F. "Identifizierung nahe verwandter Tierarten mittels Ultradunnschicht-isoelektrischer Fokussierung" // 1981.- Proc.27 Eur. Fleischf. Kongr. 602

81. Bennett H.S. The structure and functional muscle.-Academic Press, New York, v. 1, 1960, p. 137.

82. Blay K., Darbe A. Getting of fly amino acids for gas chromatography. - Biochemical J., v.60, 1964, N7, p.8327- 8333.

83. Blay K., Darbe A. Some problems og quantity amino acid analysis

by gas chromatography. // Chem. Analyt.,- 1965,- V.47, N12, p.631-633/

84. Bourguin D. Einsatszmoglichkeiten von pflanzloichem Eiweib zur Herstellung von Flisch und wurstwarten.// Flieschwirtschafi.-1977.- v.57, №8, .-p.1413-1422.

85. Ctiiclis F. M. Pittsburgh Conf.\Anal. Chem. and Appl. SpectroscApresents PITTCON 95, New Orlean, LA, N3, 1995, p. 5-10.

86. Cruickshank P.A., Sheehan J.C. The Gas Chromatography of methyl ether from amino acids. // Analyt. Chem.,-1964,- v.36, N7, p.1191-119

87. Davis B.J. Disc Electrophpresis 2: Methods and Application .to human serum proteins.// Ann. N. Y. Acad. SCI., 1964,- v. 121, p. 404-427.

88. Deuel H., Newtom H. Fractionation of proteins by gel filtration.// Natural Plant Hydrocollois,- 1954,- v. 11, №51, p. 132.

89. Dlabka A. "Einsetzbarkeit der isoelektrofokussierung zur Tierartenidentifizierung aus frischem nativem muscelfleisch" // Tierarztl.Umschay.-1984.-v.39.- №4.-343.

90. Dlabka A. "Tierartendifferenzierung aus hitzesterilistiertem Fleisch mittels isoelektrofokussierung and anschliebender Silbertarbung."// B erl .Munch.Tierarztl. Wschr. - 1985.- v.98,-130-135.

91. Dominik W.S. Mechanism and theory in food chemistry.- New York..- 198889.—252p.

92. Dykes D.D., DeFurio C.M. and Polesky H.F. Isoelectric Focusing for ^Transferrin (TF) Subtypes in Parentage Testing // American Society of Clinical Pathologists.- 1983.-June.-p.725-727

93. FAO -WHO. Amino acid content of food and biological data on protein. // Nutritional Stud., 1970, N24, p.24-32.

94. Fischer L. Laboratory techniques in Biochemistry and Molecular Biology/ ed. by Work T. S. and Work E.- North Holland Publishing Co., Amsterdam-London, v.l, 1969, p. 157.

95. Fleming I., Lumbley J. Validation of new techniquies for the analysis of foods.// Food Sciens and technology today, 1995,- v.9, №2, p.84-85.

96. Fox P., Condon J. Food proteins . Applied sciences publishers.-London.- 1983.- p.46-49Fuhrlirig D.,Gersonde Ch. "Erfahrungen mit der isoelektrischen Fokussierung bei der Tierartenbestimmung"// Lebensm.gerichtl. Chemie .-1980.-v.34.-135-138.

97. Grundhhter F. Tierartbestimmungen in der Lebensmitteluberwaching mit Hilfe der Ultradunnschicht-isoelektrischen Fokussierung auf miniaturisierten Gelen. // Elektrophorse Forum A82.-Technische Unniversitat München.-1982.-174-177.

98. Haff L.A. Use of electrophoretic titration curves for predicting optimal chromatographic conditions for fast ion-exchange chromatography of proteins.// J. Chromatogr, 1983,- v. 266, -p. 409-425.

99. Haglund H. Method of biochemical Analysis. Ed. by Glick Interscience Publishers Inc., N.-Y., v.9, N2, 1971, p.41-49.

100. Hames B.D. An introduction to polyacrylamide gel electrophoresis. In Gel electrophoresis of proteins: a practical approach.- IRL Press Limited, London, Washington DC, 1981-p. 6-14.

101. Hayden A.R. Immunochemical detection of ovine, porcine and equine flesh in beef products with antisera to species myoglobin.// J. Food Sci., 1979.-v.44, p.494-500.

102. Hedrick J. L. Smith A. J. Size and charge isomer separation and ; estimation of molecular weight of proteins by Disc gel electrophoresis.//

Arch. Biochem. AndBiophys, -1988,-v. 126, p.968.

103. Hermansson A.M., Akesson C. Functional properties of added proteins correlated with properties of meat system. // J. Food Sci.,-1975.-v.40, p.595-610.

104. Hermansson A.M. Physico-chemical aspects of soy proteins structure formation.// J. Texture Stud., 1978, N9, p.33-37.

105. Herriot R.M. A rapid method for quantitativ estimation of proteins.

//Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1941.- v.46,- p.642- 645.

106. Heukeshoven J., Dernick R. Simplified method for silver staining of proteins in Polyacrylamide gels. // Electrophoresis, 1985.- v.6,- p. 103-112.

107. Hoffmann K. Identification and determination of meat and foreign proteins by means of dodecylsulfat Polyacrylamid gel electroforesis.// Ann. Nutr. Alim., 1977.-v.31, №2,-p.207-215.

108. Hoffmann K. Nachureis der Tierart bei Fleish und Fleischerzeugnissen Mitteilung.//

Fleischwirtschafi,-1997.- v. 77, №l,-p.38-40, p.58.

109. Hoffmann K., Penny I.F. Identifiz lerung von Soja und Fleischeineisc mittels Dodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Electroforose.// Fleischwirtschafi,-1971.- v. 51, - p. 317-378.

110. Hoffmann K., Penny I. F. Methode zur Identifizierung und quantitatizen Bestimmung von Fleisch und Fremdeiness mit Hilfe de SDS. Polyacrylamid-Electrophorese anf Flachgelen.// Fleischwirtschafi,-1973.- v. 53,- p. 252-254.

111. Hsam S.L.K., Schickle H.P., Westermeier R. Und Zeller F.J.

Identification of cultivars of crop species by Polyacrylamide electrophoresis.!.Commercial barley (Hordeum vulgare L.) cultivars grown in Germany. // Monatsschrift fur Brauwissenschaft.-1993.-№3.-86-94

112. Jannsen E. Method adapted to PhastSystem.// Z. Lebensm. Unterrs. Forsh., -1986.-v.182,- p.479-483.

113. Jovin T.M. Multiphasic zonp electrophoresis. I. Steady-state moving boundary systems formed by different electrolyte combinations.// Biochemistry,- 1973.- v. 12, - p. 871-890.

114. Kaiser Klaus-Peter, Matheis Gunter, Schweiger-Recknagel und Belitz Hans-Deiter Differenzierung pflanzlicher und tierischer Proteine

durch isooelectrische Focussierung in Agarosegel // Z.Lebensm Unters Forsch.- 1981.- V.173.- .468-470.

115. Kaiser K.P., Krause J. Analyytik von Proteinen in Lebensmitteln mit elektrophoretischen und chromatograpphischen Verfahren. // Z.Lebensm. Unters. Forsch.-1985.-v. 180,181 -201

116. Kaiser K.P., Matheis G., Kmilta-Durrmann C. & Belitz H.D.

Identifizierung der Tierart bei Fleisch, Fisch & abgeleiteten Produkten durch Proteindifferenzierung mit elektrophoreitischen Methoden.// Z.Lebensm Unters.Forsch.-1980,-170,-334-342.

117. Kaiser K.P., Matheis G., Kmilta-Durrmann C. & Belitz H.D.

Proteindifferenzierung mit elektrophoretischen Methoden bei.// Lebensm. Unters. Forsch.-1980, 171, 415-419

118. Kangethe E.K., Gathuma J.,M., Lindqvist K.J. Identification of the species of origin of fresh, cooked and canned meat and meat products using antisera to thermostable muscle antigents by Ouchterlony double diffusion test.// J. Sei. Food Agric.,-1986.- vol.37, - p.157-164..

119. King N.L. Kurt L. Analysis of raw beef samples for adulterant meat species by enzyme staining of isoelectric focusing gels.// J. Food Sei.,--1982.-v.47, -p.1608-1612.

120. King N.L. Species identification of cooked meats by enzymestaining of isoelectric focusing gels. //Meat Science.- 1984, 11, 59-72.

121. Kirchhoff E. & Rubach K. Differenzierung der Proteinfraktionen von Lebensmitteln pflanzlicher und tierischer Herkunft.// Lebensm. Gerichtl. Chemie.-1980, 34,27

122. Kramlova M., Pristoupil T.I. and Fricova V. Fist experience with the use of the Pharmacia PhastSystem for the characterization of haemoglobins by isoelectric focusing // Journal of Cromatography.- 1986.-№367.-p.443-445 * *

123. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriofage TH.// Nature,-19970.- v.227,- p. 680.

124. Lamaire W.H. Food in the year 2000. // Food Ingineering,-1985.-v.90, - N5, p.34-38.

125. Lehninger A. Biochemistry. The molecular basis of cell structures and function. - Word Publishers Inc., N.-Y., 1972, 154p.

126. Lice G.„ Carroll R., Abdollabi A. A microscopical stadu of the structure of meat emulsions and its relation to thermal stability // J. Food Sci.-1981.- vol. 456..- p.1789-1793

127. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. The classical and sensitive methods for measuring the concentration of proteins.// J. Biol. Chemistry, -1951.-v.193, - p.265-270.

128. Marchylo B.A. Fast gorizontal sodium dodecil sulphat gradient polyacrilamide gel electrophoresis for rapid wheat cultivar identification and analysis of high molecular weight glutenin subunits .// Cereal Chem.,-1989.-v.66, N3, - p.186-192.

129. Mattil F. Karl. Compositional, nutritional and functional properties, and quality criteria of soy protein concentrates and soy protein isolates.//! American Oil Chem. Soc.,- 1974.- v.51, -p.81A.

130. Meyer J.A. Brown W.L. et al. Effect of emulsifiers on stability of sausage emulsions.//Food Technol.,- 19964.-v.18, p.1796-1800.

131. Mitchell N.N. The nutritive vallue of protein // Physiol..Revs.-1924,-vol. 4.-424-478.

132. Mitchell N.N., Garman G.G. The biological value of mixtures of patent white flour and animal foods // J. Biol. Chem.- 1926.—vol.68.- p. 183215

133. Moio L., DiLuccia A., Addeo F. Fast isoelectric focusing of milk proteins on small ultrathin polyacrylamide gel containing urea. // Electrophoresis.- 1989, v. 10, p.535-539. ; ^

134. Moio L., Sasso M.L., Chianese L., Addeo F. Rapid detection of bovin milk in ovine, caprine and water buffalo milk or cheese by gel isoelectric focusing on PhastSystem. // Ital. J. Food Sci.,- 1990,- v.3,-. p. 71176.

135. Moor S., Stein W.H. Detection of protein composition by colone chromatography .//J. Biol. Chem.,-1954.- v.211, -p.893.

136. Morei M. H. Separation of durum wheat proteins by ultrathin- layer isoelectric focusing. - Electrophoresis, v.l 1, 1990, p.392-399.

137. Neuhoff V. Clear background and highly semsitive protein staning with Coomassie Blue dyes in polyacrilamide gels: a systematic analysis.-Electrophoresis, v. 6, 1985-p. 427-448.

138. Patterson R.M., Whittaker R.G., SpencerT.L. Improved species identification of raw meat by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.- J. Sci.Food Agric. vol.35, 1984, p.1018-1023.

139. Penny I. F., Hoffmann K. The detection of soya bean protein in meat products.- Proccedinge of the 17th Europien Meeting of meat Research workers, Bristol, 1971.- s.809.

140. PhastSystem Separation Technique.-Pharmacia AB, 1987.

141. PhastSystem Separation Technique. File NollO Pharmacia AB, 1986.

142. PhastSystem Separation Technique. File No 120 Pharmacia AB, 1986.

143. Rehbein H. Electrophoretic techniques for species identification of fichery products. - Z. Lebensm. Unters Forsch., 1990, v..191, - P.1-10.

144. Righetty P.G., Drysdale J.W. Isoelectric focusing in gels.-J. Chromatogr., v. 98, 1974-p. 271-321.

145. Rodbard D. Estimation of molecular weight by gel filtration and gel electrophoresis: //. Statistical and computational considerations. In Methods in protein separation : New York, 1976, vol.2, p. 181-218

146. Scopes R.K., Penny I.F. Subunit sizes of muscle proteins as determined by sodium dodecylsulfat gel electroforesis.- Biochim. Biophys. Alta, 1971.-p. 409-415.

147. See Y.P. The effects of high salt concentration in the samples on molecular weight determination in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.- Electrophoresis, v. 6, 1985-p. 382-387.

148. Seymour C. Electrophoresis technology: food and reverage analysis. - Food Tech. Europe, 1993, Sept/Nov., p. 127-131.

149. Slattery W.J., Sinclair A.J. Differenentiation of meat according to species by the electrophoretic separation of muscle lactate dehydrogenase and "esterase isoenzymes and isoelectric focusing of soluble muscle proteins.- Aust. Vet. J., 1983, v.60, p 47-51.

150. Sofos I.A., Allen L.C. Effect of lean meat sourse and levels of fat and soy protein on the properties of wiener // J. Food Sci..- 1974.- vol. 42.-№4.- p.575-578

151.Van-Heekken D.L., Thompson M.P. Application of PhastSystem to the resolution of bovine milk proteins on urea-polyacrylamide gel electrophoresis. - J. Dairy Sci., 1992, v.75 (5), p. 204-1210.

152. Vesterberger O. Methods in Microbiology/ ed. by I. R. Norris and D.W. Kibbons.- Academic Press, New York, 1971.-p.256.

153.Weiss H., Postel J., Gorg H. Barley cultivar discrimination: 2. Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing with immobilised pH gradients. - Electrophoresis. -1991, v.12, .p.323-338.

154. Widmer- Peterssen J., Nonnemann K. Using animal blood in the manufacture of meat products. - Fleischwiztschaft, v.60, 1980, N2, p.231-235.

155. Williams K. W., Soderberg L. A carrier ampholyte for isoelectric focusing.- International Laboratory , N1-2, 1979.

156. Wilson C.M. Studies and'critique of Amido Black 10B, Coomassie Blue R and Fast Green FCF as stain for proteins after polyacrylamide gel electrophoresis. - Anal. Biochem., N96, 1979, p.263-278.

157. Winter L.M. The identification of amino acids by gas chromatography . - Gas chromatogr., v.2, N1, 1964, p. 1-6.

158. Wolf W.I. Soybean proteins: their production, properties and food uses.- J. Amer. Oil Chem. Soc., v.48, 1971.- p. 484.

159. Wyckoff M. Polyacrylamide gel electrophoresis in sodium dodecyl sulfate-contaning buffers using multyphasic buffers systems: Properties of the stack, valid Rf-measurement, and optimized procedure.- Anal. Biochem., v. 78, 1977-p. 459-482.

160.Yman I.M. Meat and fish species identification by isoelectric focusing. - Food laboratory news, v.6, N2, 1990, p.28-31.

с 'Л/>шо#енж Л/

Утверждаю

Гендиректор ВО СОЮЗЭКСПЕРТИЗА

«Методические рекомендации по определению видовой принадлежности белков животного и растительного происхождения в пищевых продуктах изоэлектрофокусированием»

Зам. генерального директора ВО СОЮЗЭКСПЕРТИЗА . .Л.В.Богданова

Директор СОЭКС «ТЕСТ»

Писарева

Главный специалист СОЭКС «ТЕСТ»

.П.И. Котоврасов

*

1997

МЕТОД ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ БЕЖОВ

1. Назначение и сущность метода.

Метод предназначен для идентификации видовой принадлежности мясных, рыбных и других белковых продуктов животного и растительного происхождения, а также для количественной оценки различных составляющих в нативных и термообработанных многокомпонентных мясных и рыбных продуктах.

Метод основан на разделении белковой смеси в градиенте рН под действием постоянного электрического поля в полиакриламидном геле.

Сущность метода заключается в соответствующей экстракции белков из биологических объектов (нативных и термообработанных), нанесении экстракта образцов на полиакриламидный гель, проведении процесса электрофореза ( разделения) с использованием оптимального режима электрофореза в специальном электрофоретическом блоке прибора, последующей окраске гелей в окрашивающем блоке с использованием красителей Кумасси 11-250 и азотно-кислого серебра по разработанной схеме и выявление характеристических видоспецифических белков, по которым проводится идентификация видовой принадлежности мяса, рыбы или других белковых объектов.

Для определения количественного состава многокомпонентных смесей проводят денситометрию полученных электрофореграмм.

2. Аппаратура, реактивы и материалы.

■ Автоматизированная система «Phast System» (Pharmacia,Швеция).

■ Весы аналитические

■ Наборы стандартных готовых фирменных полиакриламидных гелей Phast Gel IEF .3-9 и Phast Gel IEF 4.0-6.5

■ Денситометр

■ Гомогенизатор Ultra-Turrax (ПСА-WERK,США)

■ Центрифуга «Eppendorf» 5415, («Eppendorf», США)

■ Термостат «Eppendorf)),(«Eppendorf»,США)

■ Одноканальные пипетки переменного объема «Колор» (изготовитель ЗАО «Лабсистема СПб» (№ по каталогу 4027482 - 0,5-Юмкл)

■ Воронки химические 30мл и 50мл, по ГОСТ 8613-64

■ Колбы мерные, вместимостью 50,100,250 и 1000мл, по ГОСТ 1770-74

■ Стаканы стеклянные лабораторные, вместимостью 50мл, по ГОСТ 10394-63 *

■ Цилиндры мерные, вместимостью 50 и 100мл, по ГОСТ 1770-64

■ Палочки стеклянные оплавленные, по ГОСТ 9111-59

■ Пробирки вместимостью 10 и 20м, по ГОСТ 1770-64

■ Вода дистиллировнная

■ 50мМ Na-фосфатный буферный раствор, pH 7

■ 20% трихлоруксусная кислота 1

30% этанол

10% уксусная кислота

0,02% Phast Gel Blue R в 30% этаноле, 10% уксусной кислоты, 0,1%

(весовой) сульфата меди

4% глицерин

4% уксусная кислота

3% Тритон Х-100

10% этанол

5% глутаровый альдегид 0,4% азотнокислое серебро 2% формальдегид 2,5% карбонат натрия 1,бг тиосульфата натрия 3,7 г. Трис - HCl

3. Подготовка к испытанию.

а) экстракция белков из нативных объектов.

К 1грамму исследуемрго образца приливали 5мл 50мМШа-фосфатного буферного раствора рН 7,0 и тщательно гомогенизировали. Затем гомогенат центрифугировали в течение 15 мин. при 16 000 об/мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и в дальнейшем использовали для анализа.

б) экстракция белков из термообработанных объектов.

К 1 грамму исследованного образца приливали 5мл 3% раствора Тритона Х-100 ( далее по пункту За).

4. Проведение испытаний (изоэлектрофокусирование).

Полиакриламидные гели помещали на охлаждающее плато в электрофоретический блок прибора. Для нанесения образцов на гель использовали аппликаторы 8/1, обеспечивающие одновременную автоматическую аппликацию на поверхность гелевых пластин 8 образцов по 1мкл. Аппликатор помещали с катодной стороны геля.

Оптимальный режим изоэлектрофокусирования для полиакриламидных гелей с градиентом рН 3-9 представлен в таблице 1.

Таблица 1

-щ-

этап напряжение сила тока мощность температура продолжит.

(V) (шА) (W) (*С) (Vh)

1 2000 2.5 3.5 15 75"

2 200 2.5 3.5 15 15 2

3 2000

2.5 3.5

15

410

В таблице 2 приведен оптимизированный режим изоэлектрофокусирования для полиакриламидных гелей с градиентом рН 5-8.

Таблица 2

этап напряжение сила тока мощность температура продолжит.

(V) (тА) (\¥) (*С) (VII) .

2000 2.5 3.5 15 75

200 2.5 3.5 15 15

2000 5.0 3.5 15 510

1

2

3

5. Окрашивание гелей.

После окончания изоэлектрофокусирования гели переносили в окрашивающий блок прибора.

а) Окрашивание геля красителем Кумасси К. 250 проводили по следующей схеме:

■ фиксация геля 30% раствором трихлоруксусной кислоты ( ТХУ ) в течение 5 мин. при 20*С.

■ отмывание амфолинов и ТХУ «отмывающим» раствором : 30% метанол и 10% уксусная кислота в дистиллированной воде ( 3:1:6 ) в течение 2-х минут при 20*С.

■ окрашивание белков в геле 0,02% раствором Кумасси 11250 в течение 10 мин. при 50*С.

■ удаление избытка красителя «отмывающим» раствором в течение 10 мин. при 50*С.

После окрашивания гели высушивали на воздухе.

б) Окрашивание геля методом серебрения включает следующие этапы:

■ фиксация белков раствором, содержащим 50% этанола и 10% кислоты в течение 2-х минут при 50*С. 3

■ обработка геля раствором глутарого альдегида в течение 6-и минут при 50*С.

■ двукратное отмывание дистиллированной водой по 2 мин. при 50*С.

■ обработка геля 0,25% раствором азотнокислого серебра А§1ЧОав течение 13 минут при 50*С.

■ двукратное отмывание избытка AgN03пo 30 секунд при 30*С.

■ проявление окраски последовательной инкубацией геля в 2,5% растворе

(^содержащем 0,015% формальдегида, в течение 0,5 и 4-х минут при 30*С.

■ остановка проявления 5% раствором уксусной кислоты в течение 2-х минут при 50*С.

■ консервация геля (предохраняет от пересыхания) в 10% растворе уксусной кислоты, содержащем 10% глицерина в течение 3-х минут при 50*С.

6. Обработка результатов

Денситометрирование гелей проводили на лазерном сканирующем денситометре, в результате получаем графическую денситограмму - электрофореграммы и таблицу, в которой приведены результаты

колличественной оценки каждого из пиков денситограммы. Из таблицы определяем величину пиков соответствующих маркерных видоспецифических белков в индивидуальном образце мяса (рыбы), а затем в образце, например, смешанного фарша.

А- величина маркерного пика в индивидуальном образце мяса (рыбы)

В- величина того же маркерного пика в многокомпонентном фарше.

Процентное содержание исследуемого образца в фарше (С) составляет: ОВ/Ах 100%

Для количественной оценки содержания соевых белков в колбасных изделиях денситометрируют электрофореграммы соевых белков различной концентрации (1%, 2% и 4%). Затем строится график зависимости плотности какой-либо маркерной зоны от концентрации общего соевого белка.

Содержание соевого белка в образцах колбасных изделий в дальнейшем определяется по этой калибровочной кривой, при условии проведения экстракции и электрофокусирования аналогичным методом.

За результат принимаем среднее арифметическое значение определений, выполненых для 3-х параллельных электрофореграмм исследуемого продукта. 4