Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат медицинских наук Мазурова, Ирина Юрьевна

• Мазурова, Ирина Юрьевна
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Мазурова, Ирина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Принципы идентификации и типирования патогенных буркхольде- 13 рий сравнительным электрофоретическим анализом белков и серологическими методами

1.2 Современное состояние использования серологических и иммуно- 16 химических методов в дифференциации патогенных буркхольдерий

1.3 Использование иммуноблоттинга в дифференциации патогенных 21 буркхольдерий

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы микроорганизмов

2.2 Питательные среды, условия культивирования

2.3 Методы выделения и очистки антигенных комплексов

2.4 Компьютерная и статистическая обработка полученных результатов

ГлаваЗ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ ИМ

МУНОДИФФУЗИОННЫМИ МЕТОДАМИ

3.1 Унификация методик выделения антигенов

3.2 Изучение возможности применения преципитирующих антигенов 44 для дифференциации патогенных буркхольдерий

3.3 Изучение возможности дифференциации буркхольдерий в реакции 50 иммунодиффузии с живыми культурами

3.4 Использование антигенного состава буркхольдерий для дифферен- 55 циации с помощью иммуноэлектрофореза

Глава 4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕПРЯМОГО МЕТОДА ФЛУОРЕСЦИРУЮ- 61 ЩИХ АНТИТЕЛ С ИММУННЫМИ СЫВОРОТКАМИ К ВНЕКЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНАМ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БУРКХОЛЬ-ДЕРИЙ

Глава 5 ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ИМ- 63 МУННЫХ СЫВОРОТОК К КЛЕТОЧНЫМ И ВНЕКЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНАМ БУРКХОЛЬДЕРИЙ В ТВЕРДОФАЗНОМ ИММУ-НОФЕРМЕНТНОМ МЕТОДЕ

Глава 6 ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СУММАРНЫХ КЛЕТОЧ- 68 НЫХ БЕЖОВ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

6.1 Изучение возможности дифференциации буркхольдерий методом 69 сравнительного анализа спектров суммарных клеточных белков

6.2 Межвидовая дифференциация буркхольдерий и псевдомонад

6.3 Типирование буркхольдерий методом сравнительного электрофоре- 76 тического анализа

Глава 7 ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО СОСТАВА ПАТОГЕННЫХ БУРК- 83 ХОЛЬДЕРИЙ В ИММУНОБЛОТТИНГЕ

7.1 Характеристика антигенов буркхольдерий

7.2 Различия в составе клеточных антигенов, выявленные в иммуноб- 86 лоттинге с иммунными кроличьими сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий В. pseudomallei, В. mallei

7.3 Инфравидовая дифференциация буркхольдерий по составу внекле- 95 точных антигенов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий»

Среди представителей рода Burkholderia, насчитывающего более 30 видов микроорганизмов, большинство являются сапрофитами или фитопатогенами [91, 92]. Для медицинской практики имеет значение идентификация 2-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидоза), которые относятся ко II группе пато-генности и считаются потенциальными агентам биотерроризма [1, 11, 14, 36, 56, 129, 131, 138, 145]. Для России сап и мелиоидоз не являются эндемичными заболеваниями и относятся к числу «экзотических инфекций». Расширение транспортных связей со странами, в которых регистрируются случаи сапа и мелиоидоза (Монголия, Вьетнам, Турция, Ирак, Китай, Индия) не исключают заноса данных инфекций на территорию России. В национальных системах классификации особо опасных бактериальных патогенов Великобритании, США и Канады возбудители сапа и мелиоидоза также входят в ведущие группы по степени опасности для человека [145].

Сап — одно из тяжелых антропозоонозных инфекционных заболеваний, поражающий в естественных условиях преимущественно однокопытных, кошачьих, а также верблюдов. Среди людей заболевание носит отчетливый профессиональный характер (болеют, как правило, конюхи, ветеринары, кавалеристы, работники бактериологических лабораторий и т.п.). Сап на территории России в настоящее время официально не регистрируется, однако, вероятность заноса этой инфекции не может быть полностью исключена ввиду того, что возбудитель ее постоянно циркулирует в ряде пограничных стран (Монголия, Турция, Иран, Ирак, Китай), поражая людей, домашних и диких животных [59, 64, 109].

В отличие от сапа, мелиоидоз - инфекционное заболевание, распространенное в регионах с влажным субтропическим климатом. Существует классификация регионов, где встречается мелиоидоз [34, 120]. В первую группу входят страны Юго-Восточной Азии (Таиланд, Малайзия, Сингапур, Южный Вьетнам), имеющие эндемоэнзоотические очаги естественного происхождения и постоянно высокий уровень заболеваемости среди людей и животных [36, 37, 89, 94, 95, 131, 133]. Вторую группу составляют страны (Австралия, Иран, Турция, отдельные регионы Китая, Африки и Южной Америки), где имеются собственные природные очаги, возникшие позднее в результате заноса возбудителя [67, 95, 115]. В третью группу входят страны, в которых распространение возбудителя явилось следствием завоза животных, почвы и воды из эндемичных регионов. В четвертую группу входят практически все страны Западной Европы, в которых мелиоидоз выявляется среди лиц, побывавших в эндемичных зонах [120]. Публикации последних лет свидетельствуют о том, что нозоа-реал мелиоидоза неуклонно расширяется, охватывая все новые территории. Только за последнее десятилетие мелиоидоз зарегистрирован в Индии, Бразилии, странах Карибского бассейна, на островах Тихого океана [144, 158, 165]. Таким образом, есть все основания считать, что мелиоидоз из региональной проблемы отдельных стран приобрел глобальный характер, что вызывает серьезную озабоченность мировой медицинской общественности.

Учитывая высокую вероятность возможности заноса и формирования эндемичных очагов сапа и мелиоидоза на территории нашей страны, представляются актуальными исследования по разработке современных средств диагностики и методов внутривидовой дифференциации как средств эпидемиологического анализа вспышек этих заболеваний.

В настоящее время бактериологическая схема идентификации буркхоль-дерий, имеющих медицинское значение, разработана и эффективно используется [6, 14]. Однако, близость В. mallei и В. pseudomallei по геному, фенотипиче-ским признакам, в том числе и по антигенному составу, вносит трудности в дифференциацию этих микроорганизмов. Добавляет сложности в дифференциацию В. mallei и В. pseudomallei наличие близкородственного к возбудителю мелиоидоза непатогенного вида В. thailandensis, обладающего близкими биохимическими свойствами, антигенным составом [29, 166]. При этом факторы патогенности этих микроорганизмов до сих пор находятся в стадии активного изучения. Все вышеперечисленное определяет необходимость дальнейшего поиска различий в гено- и фенотипе этих микроорганизмов в целях совершенствования средств их дифференциации и типирования. Это же в полной мере относится и к средствам серологической диагностики, сравнительному электро-форетическому анализу, которые являются составной частью полифазной таксономии - современной системе идентификации и дифференциации микроорганизмов, основанной на комплексном применении бактериологических, биохимических, серологических, молекулярно-биологических, генетических методов исследования [6, 58, 110, 163, 166].

Из тестов, позволяющих дифференцировать микроорганизмы на уровне штаммов, успешно в таксономических целях при группировании бактерий использовался сравнительный электрофоретический анализ белков [24, 121]. Ранее применялся электрофоретический анализ для группирования ограниченного количества штаммов В. pseudomallei [20]. Поэтому актуальным явилось изучение электрофореграмм суммарных клеточных белков всех имеющихся в коллекционном центре ВолгоградНИПЧИ штаммов буркхольдерий, в целях межвидового и внутривидового группирования.

В схеме лабораторной диагностики патогенных буркхольдерий серологические методы по праву занимают позиции достоверных и информативных способов обнаружения специфических антигенов и антител к ним [111]. При этом, для получения диагностических препаратов применялись внутриклеточные, жгутиковые антигены, отдельные антигены из состава внутриклеточных (200 KDa, 800 кБа) [3, 4, 44, 45, 99], внеклеточные антигены отдельных штаммов В. pseudomallei [71, 81]. Перспективными для совершенствования серологических средств выявления и идентификации буркхольдерий являются: разработка новых серологических тестов, доработка применительно к изучаемым возбудителям имеющихся тестов, использование при получении антигенных препаратов иммунных сывороток к отдельным антигенам различных систем клетки [47]. Применение в качестве иммуногенных антигенов внеклеточных белков открывает перспективу получения иммунных сывороток для межвидовой дифференциации буркхольдерий [79].

Актуальность представленных в диссертации материалов подчеркивается их выполнением в рамках плановой государственной тематики ФГУЗ Волго-градНИПЧИ по лабораторной диагностике и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, а именно тем 052-2-10 «Идентификация и типирование возбудителей сапа и мелиоидоза на основе принципов полифазной таксономии», 043-306 «Антигенные комплексы патогенных буркхольдерий, обладающие функциональной и диагностической значимостью».

Цель работы: изучение возможностей дифференциации патогенных буркхольдерий с помощью сравнительного анализа состава клеточных и внеклеточных антигенов, выявляемых иммунологическими методами, в том числе электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и имму-ноблоттингом.

Задачи исследования:

1. Унифицировать методы получения антигенных комплексов буркхольдерий и иммунных сывороток к ним.

2. Провести сравнительный анализ составов клеточных и внеклеточных антигенов, выявленных иммунодиффузионными методами, в целях дифференциации патогенных буркхольдерий.

3. Оценить возможность дифференциации буркхольдерий методом имму-нофлуоресцентного анализа.

4. Сравнить дифференцирующую способность ТИФМ иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным антигенам в отношении патогенных буркхольдерий.

5. Провести сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий для их идентификации и типирова-ния.

6. Изучить возможность использования различий в спектрах перекрестных клеточных и внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноблоттинга, для межвидовой и внутривидовой дифференциации буркхольдерий. Научная новизна:

В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельности антигенного спектра патогенных буркхольдерий.

Разработаны унифицированные условия получения клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий и этапов сравнительного анализа в электрофорезе в ПААГ с ДСН и иммуноблоттинге.

Впервые проведен сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных и внеклеточных белков типичных штаммов В. mallei, В. pseudomallei, В. thailandensis, В. cepacia.

Использование иммунной сыворотки к внеклеточным белкам штамма В. thailandensis 264 впервые позволило дифференцировать патогенные виды буркхольдерий (В. mallei, В .pseudomallei) в реакции иммунодиф фузии в геле с живыми культурами.

Впервые оптимизирован алгоритм типирования В. mallei и В. pseudomallei на основе различий в их антигенном спектре. Сравнительный анализ электро-фореграмм внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноэлектрофо-реза, позволил выявить различия в составе антигенов буркхольдерий и провести дифференциацию возбудителей сапа и мелиоидоза.

Практическая ценность: На основании изучения чувствительности и специфичности кроличьих иммунных сывороток к антигенам авирулентных штаммов В. thailandensis установлена возможность замены используемых раннее при конструировании ме-лиоидозных и сапных диагностикумов иммунных сывороток к вирулентным штаммам В. pseudomallei на иммунные сыворотки к антигенам непатогенного вида В. thailandensis, что повышает безопасность и облегчает производство диагностических препаратов.

Материалы настоящего исследования использованы при написании глав «Сап» и «Мелиоидоз» в руководстве «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (Москва «Медицина» «Шико» 2009 г. - 472 с).

На основании сравнительного электрофоретического анализа суммарных клеточных белков проведено группирование имеющихся в коллекции Волго-градНИПЧИ штаммов В. р8еис1ота1Ш, обеспечившее наиболее высокий уровень маркирования этих штаммов.

Документация на оформление двух патентов зарегистрирована в Государственном реестре изобретений Российской Федерации: «Способ дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза преципитирующей антисывороткой» 2305557 от 10.09.2007 г. и «Способ дифференциации возбудителей мелиои доза и сапа методом иммуноэлектрофореза» № 2366715 от 10.09.2009 г.

Материалы диссертационной работы используются отделом подготовки специалистов по особо опасным инфекциям ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ в рамках учебных программ. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. набор клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий, полученный в унифицированных условиях в разных сериях, идентичен по своему составу;

2. сравнительный анализ состава клеточных и внеклеточных антигенов В. ЖаНапЛепьчя и В. рзеийотсйЫ, полученного иммунодйффузионными методами, показывает на близкое родство этих микроорганизмов и доказывает возможность применения в качестве тест-сывороток для антигенного анализа В. рзеи-с1ота1Ш иммунных сывороток к клеточным антигенам В. 1каИап(1еп$1з\

3. анализ антигенного состава патогенных буркхольдерий, полученного в реакции иммунной диффузии с живыми культурами и с иммунной сывороткой к внеклеточным антигенам В. thailandensis 264, позволяет дифференцировать штаммы В. pseudomallei и В. mallei\

4. выявленные с помощью иммуноэлектрофореза различия в составе внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий позволяют провести видовую дифференциацию возбудителей сапа и мелиоидоза;

5. сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков позволяет дифференцировать штаммы буркхольдерий на инфравидовом уровне, что дает возможность использования этого метода в эпидемиологическом анализе;

6. использование метода иммуноблоттинга с целью обнаружения антигенных фракций иммунными кроличьими сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий позволяет типировать штаммы В. pseudomallei.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Обо-ленск, 2006); XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоградский медицинский университет (Волгоград, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2008); Всероссийской научнопрактической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Мин. Обороны России» (Киров, 2008); международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология» (Екатеринбург, 2009); X межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Ставрополь, 2010).

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 2 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 разделов обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 168 источников, в том числе 62 отечественных и 106 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 34 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Мазурова, Ирина Юрьевна

Выводы:

1. Унификация условий при выделении клеточных и внеклеточных антигенов буркхольдерий, а также иммунных сывороток, обеспечивает идентичность исследуемого материала в разных сериях, тем самым повышая ценность исследований в сравнительном аспекте в целях разработки методов иммунологической идентификации патогенных буркхольдерий.

2. Сравнительный анализ клеточных и внеклеточных антигенов В. thailandensis и В. pseudomallei, полученных иммунодиффузионными методами, указывает на близкое родство этих микроорганизмов и доказывает возможность применения в качестве тест-сывороток для антигенного анализа патогенных буркхольдерий иммунных сывороток к клеточным антигенам В. thailandensis.

3. Применение для антигенного анализа патогенных буркхольдерий в реакции иммуннодиффузии с живыми культурами и иммунной сывороткой к внеклеточным антигенам В. thailandensis 264 позволил дифференцировать культуры В. pseudomallei от В. mallei.

4. Сравнительный анализ состава клеточных и внеклеточных антигенов, выявленного иммуноэлектрофорезом, обнаружил значительные различия в составе внеклеточных антигенов В. pseudomallei, В. thailandensis и В. mallei, которые позволили дифференцировать виды В. pseudomallei и В. mallei.

5. Изучение возможности применения полученных сывороток к внеклеточным антигенам в диагностике буркхольдерий в сравнении с сыворотками к клеточным антигенам методами ТИФМ и МФА выявило высокую специфичность иммунных сывороток к внеклеточным антигенам.

6. На основании сопоставления спектров суммарных клеточных белков, полученных методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия, проведена внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя мелиоидоза имеющихся в коллекционном центре ВолгоградНИПЧИ (4 группы на уровне сходства 89 %).

7. Сравнение электрофореграмм суммарных клеточных белков штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis, В. cepacia и набора гетерологичных видов бактерий позволило четко выделить штаммы буркхольдерий в отдельную группу, относящуюся к одному роду.

8. Использование иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов, полученных методом иммуноблоттинга с иммунными сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий дало возможность типировать изучаемые штаммы В. pseudomallei.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полифазная таксономия, предусматривающая сочетанное применение генетических, биохимических, иммунологических методик нашла в настоящее время широкое применение для окончательного определения таксономической позиции изучаемых близкородственных микроорганизмов [6, 163]. Типирова-ние — группирование штаммов внутри одного видаявляется одной из основных областей применения полифазной таксономии [15, 50]. Так как, изучаемые патогенные буркхольдерии и В. thailandensis обладают очень сходными феноти-пическими и генетическими свойствами, то применение для их дифференциации принципов и методов полифазной таксономии закономерно [29, 78, 85].

Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков и иммуноблоттинг успешно применялся и применяется в настоящее время для дифференциации многих микроорганизмов [16, 25, 84, 127], в том числе и возбудителей особо опасных инфекций [10, 82]. Угрозы возникновения вспышек опасных инфекционных заболеваний и акты биотерроризма, вызванные патогенными микроорганизмами, предопределили актуальность исследований, направленных на совершенствование иммунодиагностических средств обнаружения возбудителей этих инфекций, которые наряду с высокой чувствительностью и специфичностью, характеризуются простотой постановки реакций [3]. Выше изложенное, в полной мере относится к В. mallei и В. pseudomallei, возбудителям сапа и мелиоидоза, опасных заболеваний человека и животных [136, 148]. Серологические методы (гемагглютинация, РИД, ИЭФ, ТИФМ, ИФА) по прежнему используются для идентификации этих микроорганизмов и диагностики вызываемых ими инфекций в эндемичных регионах [100, 102].

В настоящее время в качестве Аг для получения иммунных сывороток используются клеточные Аг, отдельные выделенные и в различной степени очищенные антигенные комплексы, внеклеточные антигены, Аг различных систем клетки [22, 79, 102, 157]. Ранее отмечалось о перспективе использования ЭЦА для межвидовой дифференциации микроорганизмов [132]. Анализ опубликованных литературных источников показал недостаточное изучение внеклеточных Аг патогенных буркхольдерий, возможностей их использования в серологической дифференциации В. mallei и В. pseudomallei.

Исходя из этих данных следует считать перспективным дальнейшее изучение возможностей дифференциации патогенных буркхольдерий с помощью сравнительного анализа состава клеточных и внеклеточных антигенов, выявляемых иммунологическими методами, в том числе электрофорезом в полиак-риламидном геле с додецилсульфатом натрия и иммуноблоттингом.

При этом необходимо решать следующие задачи: унифицировать методы получения антигенных комплексов буркхольдерий и иммунных сывороток к ним, провести сравнительный анализ составов клеточных и внеклеточных антигенов, выявленных иммунодиффузионными методами, в целях дифференциации патогенных буркхольдерий, оценить возможность дифференциации буркхольдерий методом иммунофлуоресцентного анализа, сравнить дифференцирующую способность ТИФМ иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным антигенам в отношении патогенных буркхольдерий, провести сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий для их идентификации и типирования, изучить возможность использования различий в спектрах перекрестных клеточных и внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноблоттинга, для межвидовой и внутривидовой дифференциации буркхольдерий.

Безусловно, важнейшим условием достоверности сравнительного анализа составов антигенных комплексов микроорганизмов является воспроизводимость их препаративного выделения, которая достигается при унификации условий выделения, применение особо чистых химических реактивов, стандартных сред [16] .В наших исследованиях на примере выделения различных серий клеточных Аг из штаммов буркхольдерий с использованием стандартных сред фирмы «Difco» и унификации этапов исследований с применением особо чистых реактивов фирм «Sigma», «Amersham», показана стабильность и воспроизводимость выделенных клеточных Аг.

С помощью электрофореза в ПААГ с ДСН измерили мол. м. клеточных и внеклеточных Аг. Используя РИД, РИД с живыми культурами, ИЭФ, ТИФМ, ИФА, ИБ выявили различия в составе изучаемых Аг, оценили возможность использования этих различий при дифференциации В. pseudomallei и В. mallei.

Выделенные клеточные и внеклеточные Аг были охарактеризованы количественно. Так, концентрация клеточных Аг в суспензии, полученной после обработки 1 мл смеси (100 мг сырой бактериальной массы в 1 мл) составила после центрифугирования 12-18 мг/мл. Концентрация ЭЦА составляла 1,2-2 мг/мл. Спектр белковых фракций клеточных Аг после электрофореза в ПААГ с ДСН состоял из 34 - 47 фракций мол. м. которых составляла 10 - 120 кЕ>а, окрашенных Кумасси R-250. Спектр ЭЦА, полученный в электрофорезе в ПААГ с ДСН, после окраски гелей серебром, составлял 12-14 фракций, с диапазоном мол. м. 14 - 120 KDa. Значения полученных количественных характеристик белков и фракций соответствуют опубликованным данным по другим микроорганизмам [93, 107]. Клеточные Аг получены из ацетонвысушенных и живых клеток. Внеклеточные Аг получали после смыва культур, выращенных на твердой питательной среде, покрытой целлофаном [47].

Иммунодиффузионные методы широко использовались и используются для характеристики и сравнения Аг различных систем клетки. Достоинство этих методов состоит в том, что они позволяют выявлять нативные Аг, не выделяя их из суспензии [31]. РИД с использованием иммунных сывороток позволяет проводить полуколичественный анализ содержания Аг в исследуемых системах. В настоящее время РИД чаще используется для предварительной оценки состава Аг, титров Ат и специфичности получаемых кроличьих иммунных сывороток [63]. В нашей работе был проведен в РИД сравнительный анализ состава гомологичных и перекрестных клеточных Аг патогенных бурк-хольдерий, В. thailandensis и В. cepacia. Было установлено, что у штаммов

В. thailandensis 264 и В. pseudomallei С-141 количество Аг одинаковое - 3 шт., ас В. mallei 10230 - 2 шт. и с В. cepacia 25416 — 1 шт. То есть, количество перекрестных Аг убывает по мере уменьшения филогенетической близости анализируемых видов. Постановка РИД с иммунной сывороткой к клеточным Аг В. pseudomallei С-141 и клеточными Аг тех же штаммов выявило такое же количество преципитатов, что и при использовании в РИД сыворотки к В. thailandensis. Этим была установлена возможность использования иммунной сыворотки к В. thailandensis 264 в качестве тест-сыворотки при антигенном анализе В. pseudomallei. Таким образом, показано, что для получения требуемой тест-сыворотки возможно внести прогрессивные изменения, а именно, для выделения Аг необходимых для иммунизации животных, можно использовать вместо штаммов В. pseudomallei, являющегося микроорганизмом 2 группы па-тогенности, штаммы В. thailandensis, относящиеся к 4 группе патогенности [12].

С помощью РИД проведен сравнительный анализ перекрестных внеклеточных Аг патогенных буркхольдерий с применением иммунных сывороток к ЭЦА. Установлено, что максимальное количество линий преципитатов (3) обнаруживается между лунками с иммунными кроличьими сыворотками к ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis 264 и лунками с ЭЦА В. thailandensis 264 и В. pseudomallei С-141. То есть, показана высокая близость этих микроорганизмов. При использовании в РИД сыворотки к ЭЦА В. mallei 10230 между лункой с сывороткой и лунками с ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis 264 выявлено по 2 преципитата. Не выявлено линий преципитатов между лункой с сывороткой к В. mallei 10230 и лункой с ЭЦА В. cepacia 25416. Таким образом, использование иммунных сывороток к ЭЦА позволяет выявлять такие различия в составе перекрестных Аг, которые можно применить для дифференциации штаммов группы «pseudomallei» и штаммов В. cepacia.

В РИД с живыми культурами было изучено влияние состава питательной среды на секрецию буркхольдериями антигенов во внешнюю среду. Для этого были использованы питательные среды «Difco»: F-агар, L-arap, ТС А, в качестве тест-сыворотки, применена сыворотка к ЭЦА В. thailandensis 264. В опытах брали 7 штаммов В. mallei, 6 штаммов В. pseudomallei, 2 штамма В. thailandensis, 1 штамм В. cepacia. Установлено, что в РИД с живыми культурами на чашках с питательными средами F-arap и ТСА перекрестные Аг образовывались между сывороткой и культурами всех штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis, но отсутствовали между лунками с сывороткой и бляшками культур штаммов В. mallei. На чашке с L-агаром линии преципитатов образовались между лунками с иммунной сывороткой и бляшками культур всех штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis, и 2 штаммами В. mallei (Иванович и Muk-suwar). Проверка 60 штаммов В. pseudomallei, 14 штаммов В. mallei, 12 штаммов В. cepacia, 5 штаммов В. thailandensis, 16 штаммов псевдомонад на F-arape показала, что перекрестные Аг отсутствовали между культурами штаммов В. mallei и лунками с сывороткой к ЭЦА В. thailandensis 264. Выявленные данные использовали для разработки практического способа дифференциации В. pseudomallei и В. mallei, на который получен патент. В то же время, при использовании этой сыворотки и сывороток к ЭЦА других буркхольдерий в РИД с живыми культурами, перекрестные Аг были выявлены у большинства штаммов В. pseudomallei, В. thailandensis, В. cepacia. Наши данные согласуются с опубликованными ранее данными по срокам секреции внеклеточных белков штаммамов В. mallei [2].

ИЭФ из всех иммунодиффузионных методов, обладает наибольшей разрешающей способностью при анализе антигенного состава микроорганизмов и позволяет идентифицировать по электрофоретической подвижности отдельные Аг [30]. Проведенный анализ электрофореграмм клеточных Аг, полученных нами при помощи ИЭФ с иммунными кроличьими сыворотками к ЭЦА патогенных буркхольдерий и В. thailandensis показал, что наборы Аг В. pseudomallei и В. thailandensis, очень близки по количественному составу и электрофоретической подвижности [46]. Применение ИЭФ и сывороток к ним для сравнительного анализа спектра ЭЦА фильтратов буркхольдерий, выявило стойкие различия в наборах линий преципитаций, представленных на электрофоре-граммах. Наибольшее количество линий преципитатов выявляется при анализе гомологичных Аг В. pseudomallei и В. thailandensis и сывороток к ним. При использовании этих же сывороток для выявления перекрестных Аг на электрофо-реграммах ЭЦА В. mallei, было отмечено значительно меньшее количество Аг, по сравнению с набором Аг штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis. Так, практически отсутствовали перекрестные Аг штаммов В. mallei в анодной и катодной областях. В нейтральной зоне на электрофореграммах штаммов В. mallei присутствовала одна линия преципитатов. Учет выявленных устойчивых различий картин с линиями преципитаций ЭЦА на электрофореграммах В. pseudomallei, В. thailandensis, В. mallei полученных методом иммуноэлектро-фореза, позволили дифференцировать близкородствейные микроорганизмы В. pseudomallei и В. mallei. На основе разработанных данных получен патент «Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуно-электрофореза» № 2366715 от 10.09.2009 г [41].

МФА основан на использовании свойства специфичности иммунологической реакции и чувствительности флуоресцентной микроскопии. В отличие от иммунодиффузионных методов, МФА позволяет выявлять поверхностные Аг. Выявление гомологичных Аг специфическими Ат для данного микроорганизма, позволяет идентифицировать и сам микроорганизм. Также, МФА обладает быстротой и высокой чувствительностью, эти обстоятельства обеспечили методу широкое применение для индикации возбудителей многих инфекций, в том числе особо опасных. Проведенное нами сравнительное изучение сывороток к клеточным и внеклеточным Аг буркхольдерий в МФА показало, что иммунные кроличьи сыворотки к ЭЦА патогенных буркхольдерий и В. thailandensis выявляли клетки изучаемых штаммов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis со специфическим свечением на 3 (+++) и не выявляли клетки В. cepacia. Этот уровень специфичности метода позволил дифференцировать штаммы группы «pseudomallei» от штаммов В. cepacia.

ТИФМ, основанный на использовании ферментного маркера, фиксированного на Ат или Аг, присутствие которого позволяет зафиксировать реакцию «антиген-антитело», часто применяется для индикации возбудителей и ускоренной диагностики инфекционных болезней [61]. В работе были протестированы иммунные сыворотки к клеточным и внеклеточным Аг буркхольдерий методом ТИФМ на чувствительность и специфичность относительно Аг штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, В. thailandensis. Было показано, что использование поливалентных иммунных сывороток к внеклеточным Аг обеспечивает более высокую специфичность, но меньшую чувствительность при обнаружении Аг изучаемых штаммов, в отличие от использования сывороток к клеточным Аг.

Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков нашел широкое применение при таксономической дифференциации многих микроорганизмов. Успешно его применяли при группировании близкородственных микроорганизмов, дифференциация которых биохимическими, бактериологическими методами затруднена [161, 163]. Использовали электрофоретический анализ и при изучении патогенных буркхольдерий [19, 65, 101]. Основным условием объективного сравнения электрофореграмм является получение их в унифицированных условиях при использовании стандартных химических реактивов [116]. В своих исследованиях мы опирались на ранее полученные данные по выявлению влияния на воспроизводимость электрофореграмм состава питательной среды для выращивания бактерий, способов обработки проб [18]. Использование унифицированных условий получения суммарных клеточных белков, параметров электрофоретического разделения позволило получить воспроизводимые с высоким разрешением электрофореграммы, которые подверглись нумерическому анализу с целью проведения межвидовой и внутривидовой дифференциации буркхольдерий. Для выяснения возможности межвидового распределения на группы были взяты референтные штаммы изучаемых буркхольдерий В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. thailandensis 264, В. cepacia 25416 и 5 штаммов бактерий рода Pseudomonas. На основании результатов нумерического анализа штаммы были достоверно распределены на две группы: в первую вошли буркхольдерии, во вторую - остальные виды. Таким образом, метод электрофоретического анализа может быть эффективно применен для межродовой дифференциации.

На основании нумерического анализа электрофореграмм было проведено внутривидовое группирование 59 штаммов В. pseudomallei и 14 штаммов В. mallei, имеющихся в Коллекционном центре ВолгоградНИПЧИ. Штаммы возбудителя мелиоидоза на уровне коэффициента корреляции 89 % были распределены на 4 фенона. В первый фенон вошли 24 штамма, во второй - 13 штаммов, в третий — 10 штаммов, в четвертый - 6 штаммов. На этом уровне сходства 6 штаммов не вошли ни в одну из перечисленных групп, которые объединили в пятую группу.

Штаммы возбудителя сапа, обладающие высоким сходством фенотипов, на основе электрофоретического анализа были распределены на уровне сходства 89 % только на 2 группы (9 и 2 штамма в группе), не вошли в группы 2 штамма, коэффициент корреляции которых со штаммами 1 и 2 группы был ниже 89 %. Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что метод сравнительного электрофоретического анализа, обладающий высокой разрешающей способностью, позволяет проводить межвидовую дифференциацию и типирование патогенных буркхольдерий.

Метод ИБ с иммунными сыворотками в настоящее время применяется как для идентификации отдельных Аг, выделенных из клеток, так и для фракционирования смесий Аг. Последующий сравнительный анализ полученных иммуноэлектрофореграмм позволяет дифференцировать изучаемые микроорганизмы. Иммуноблоттинг применялся для дифференциации многих микроорганизмов, в том числе и возбудителей особо опасных инфекций. Так, с помощью

ИБ были дифференцированы бруцеллы, изолированные, в разных районах Сибири [32].

В работе изучена возможность дифференциации буркхольдерий на основе кластерного анализа иммуноэлектрофореграмм, фракции которых выявлены иммунными сыворотками. Для вычисления коэффициентов сходства применяли современные компьютерные программы. Избирательность иммуноблоттинга в сравнении с электрофорезом повышается за счет вовлечения в анализ как индивидуальных, так и перекрестных Аг изучаемых штаммов, выявленных иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным Аг буркхольдерий. Проведенные нами исследования показали, что применение для выявления Аг сывороток к внеклеточным Аг, делает возможным типирование штаммов В. pseu-domallei. Наибольшей дискриминирующей способностью обладали иммунные сыворотки против клеточных антигенов В. cepacia 25416, выявите меньшее количество перекрестных Аг в сравнении с сыворотками к В. pseudomallei и В. mallei. Как известно, штаммы В. mallei отличаются высоким сходством по фенотипическим признакам, что значительно затрудняет их типирование. Метод ИБ с сыворотками к внеклеточным Аг буркхольдерий также не позволил осуществить их дифференциацию.

Таким образом, проведенные исследования состава клеточных и внеклеточных Аг с применением иммунных кроличьих сывороток к этим Аг с использованием различных серологических методов не только позволили предложить в ряд новых способов дифференциации изучаемых патогенных буркхольдерий, но и изучить специфичность и чувствительность методов в зависимости от применяемых сывороток, проанализировать состав гомологичных и перекрестных Аг, а также показать перспективы дальнейших исследований в данной области.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Мазурова, Ирина Юрьевна, 2011 год

1. Агеева, Н.П. Фенотипическая характеристика мутантов Burkholderia mallei, дефектных по синтезу внеклеточных протеолитических ферментов / Н.П. Агеева, Л.К. Меринова, Д.В. Викторов // Вестник ВОЛГМУ. Волгоград, 2005.-№2.-С. 11-15.

2. Алексеев, В.В. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма / В.В. Алексеев, Н.Г. Тихонов, A.B. Липницкий // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 20 - 27.

3. Антитела / под ред. Д. Кэтти. М. - 1991. - Т. 2. - 382 с.

4. Антонов, В.А. Идентификация и внутривидовое типирование сапа и ме-лиоидоза: дис.докт. мед. наук: 03.00.07 / В.А. Антонов Волгоград, 2008. -297 с.

5. Антонов, В.А. Использование мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) и амплификации с произвольными праймерами (RAPD) для дифференциации штаммов возбудителя сапа / В.А. Антонов, В.В. Алтухова,

6. B.C. Замараев // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2007. - № 3. — С. 3 — 9.

7. Антонов, В.А. Молекулярно-биологические подходы к диагностике и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза / В.А. Антонов, В.И. Илюхин // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2005. - № 2.1. C. 3-8.

8. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев // Л.: Медицина, 1962. — 180 с.

9. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03. Утверждено Г.Г. Онищенко. — 2003. 77с.

10. Безопасность работы с микроорганизмами III IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08. Утверждено Г.Г. Онищенко. - 2009. - 77с.

11. Бейли, Н. Математика в биологии и медицине / Н. Бейли // М.: «Мир», 1970.-328 с.

12. Беляков, В.Д. Псевдомонады и псевдомонозы / В.Д. Беляков, Л.А. Ряпис, В .И. Илюхин М.: Медицина, - 1990. - 224 с.

13. Беляков, В.Д. Типирование возбудителей инфекционных болезней на современном этапе / В.Д. Беляков, Л.А. Ряпис, Г.Д. Каминский // Журн. мик-робиол. эпидемиол. иммунол. 1990. - С. 98 - 103.

14. Блохина, И.Н. Систематика бактерий (с основами геносистематики) / И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, A.C. Антонов Нижний Новгород, 1992. - 172 с.

15. Будченко, A.A. Сравнительный анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий / A.A. Будченко, В.И. Илюхин, Д.В. Викторов // Мол. генет. микробиол. и вирусол. — 2005. № 2. - С. 24 -28.

16. Будченко, A.A. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад: дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / A.A. Будченко — Волгоград, 1995. — 138 с.

17. Вееке, Б. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу / Б. Вее-ке // М.: «Мир», 1977. 216 с.

18. Викторов, Д.В. Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов: дис.докт. биол. наук: 03.00.07, 03.00.15 / Д.В. Викторов. Волгоград, 2008. — 265 с.

19. Гонтарь, И.П. К природе антигенов Pseudomonas pseudomallei общих для некоторых видов микроорганизмов / И.П. Гонтарь, С.М. Фарбер, В.И. Еф-ременко // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. — 1984. № 3 — С. 55 -57.

20. Дегтева, Г.К. Сопоставление белковых спектров стафилококков с помощью некоторых математических приемов / Г.К. Дегтева, И. Н. Блохина // Стафилококковые инфекции. Ленинград, 1972. — Т. 1. — С. 28.

21. Зайцев, A.A. Электрофоретический анализ водорастворимых белков из типичных и некоторых атипичных чумных и псевдотуберкулезных штаммов / A.A. Зайцев, Ю.А. Филимонова // НИПЧИ. Ставрополь, 1993. -19 с.-Деп. в ВИНИТИ 15.12.93, № 3063.

22. Зыкин, Л.Ф. Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций / Л.Ф. Зыкин // Ставрополь. 1986. - ч. 1. - С. 118 - 121.

23. Илюхин, В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1986. -№ 5. — С. 88-93.

24. Илюхин, В.И. Мелиоидоз / В.И. Илюхин, B.C. Замараев, В.П. Батманов // Диагн. возб. опасн. инфекц. болезней. — Саратов, 1998. Т.2. - С. 115 - 143.

25. Илюхин, В. И. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция / В.И. Илюхин, Т.В. Сенина, Н.Г. Плеханова // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2002. -№ 1.-С. 7 - 11.

26. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М. - 1987. - 472 с.

27. Иммунохимический анализ / под ред. Л.А. Зильбера. — М. — 1968. — 300 с.

28. Кулаков, Ю.К. Использование молекулярно-биологических методов идентификации бруцелл в сравнительном анализе штаммов, выделенных от больных собак / Ю.К. Кулаков, М.М. Желудков, Т.А. Толмачева // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2003. - №1. - С. 6 - 14.

29. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / Практ. ру-ков. / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. — М.: «Медицина», «Шико», 2009. -472 с.

30. Мелиоидоз // под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград. 1995. - 220 с.

31. Мерков, A.M. Санитарная статистика / A.M. Мерков, Л.Е. Поляков // Л.: Медицина, 1974. 184 с.

32. Онищенко, Г.Г. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов по вопросам противодействия биотерроризму / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина Волгоград, 2004. - 233 с.

33. Опасные инфекционные заболевания: учебное пособие (I и II части) / под ред. В.В. Алексеева. Волгоград: НП «Здоровье и экология». - 2006.- 368 с.

34. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. М.: Мир, 1997. - 2 т.

35. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Элек трофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман — М.: Наука, 1981.286 с.

36. Патент 2305557 РФ. Способ дифференциации возбудителей сапа и мелио-идоза преципитируюгцей антисывороткой / A.A. Будченко (РФ), И.Ю. Мазурова, В .И. Илюхин. № 2006100651/13; заявл. 10.01.2006; опубл. 10.09.2007. Бюл. № 25. 3 с.

37. Патент 2366715 РФ. Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза / A.A. Будченко (РФ), И.Ю. Мазурова, В.И. Илюхин. № 2008111417/17; заявл. 24. 03. 2008; опубл. 10.09.2009, Бюл. №25.-3 с.

38. Пивень, H.H. Патогенность Burkholderia pseudomallei как функция внеклеточных и поверхностных антигенов / H.H. Пивень, В.И. Илюхин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - № 6. - С. 94 - 99.

39. Пивень, H.H. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Автореф. дис. . докт. мед. наук: 03.00.07 / H.H. Пивень. Волгоград, 1997. - 41 с.

40. Пивень, H.H. Иммуногенность поверхностных и капсульных антигенов Burkholderia'mallei / H.H. Пивень, И.В. Авророва, С.И. Жукова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.- 2007.- № 1.- С. 47 52.

41. Пивень, H.H. Иммуногенность и гетерогенность поверхностного антигена 8 Burkholderia pseudomallei / H.H. Пивень, В.И. Смирнова, Д.В. Викторов // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - № 4. - С.75 - 78.

42. Пивень, H.H. Перекрестно-реагирующие антигены патогенных буркхоль-дерий и некоторых опасных возбудителей инфекционных болезней / H.H. Пивень, В.И. Илюхин, В.Б. Тимошин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 2. - С. 14-19.

43. Пивень, H.H. Преципитиногены возбудителя мелиоидоза и перспективы создания на их основе диагностических препаратов: дис.канд. мед. наук: 03.00.07 / H.H. Пивень. Волгоград, 1981. - 150 с.

44. Рыбкин, B.C. Метод иммуноферментного анализа в практике эпизоотоло-гического обследования природного очага чумы / B.C. Рыбкин, И.И. Чер-ченко, Л.Ф. Зыкин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. — 1986. -№ 5.-С. 107- 108.

45. Ряпис, Л.А. Молекулярная эпидемиология инфекционных болезней / Л.А. Ряпис, Н.Н Филатов, Н.Я. Салова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2003.-№ 5. - С. 49 - 53.

46. Санитарные правила: 1.2. Эпидемиология. СП 1.2. 001 94. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности // Госсанэпиднадзор России.-М., 1994.- 152 с.

47. Сап / под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград. - 1995. - 128 с.

48. Сенина, Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Т.В. Сенина. Волгоград, 2004. - 22 с.

49. Справочник по лабораторным методам исследования / под ред. Л.Д. Даниловой // СПб: Питер. 2003. - 736 с.

50. Стародуб, Н.Ф. В биохимических исследованиях белковый иммуноблотт и иммунодотт / Н.Ф Стародуб, В.П. Артюх, В.И. Назаренко // Укр. биохим. журн. 1987. - Т. 59. - № 3. - С. 108 - 120.

51. Тихонов, Н.Г. Биологический терроризм (проблемы противодействия) / Н.Г. Тихонов, A.B. Липницкий // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье, сб. науч. тр. / под ред. Н.Г.Тихонова. — Волгоград, 2000. С. 265 -271.

52. Храпова, Н.П. Иммунологическая диагностика мелиоидоза / Н.П. Храпова, Н.Г. Тихонов, B.C. Рыбкин // Мелиоидоз: сб. науч. тр. Волгоград, - 1995.-С. 57 - 68.

53. Чухланцев, Д.А. Использование ПНР для идентификации и межвидового дифференцирования возбудителей сапа и мелиоидоза / Д.А. Чухланцев, И.В. Маракулин, И.В. Дармов // Проблемы ООИ 2008. - вып. 97. - С. 63 -66.

54. Ширяев, Д.Т. Методы обнаружения возбудителя мелиоидоза в объектах внешней среды и другом материале / Д.Т. Ширяев, Л.А. Ряпис, Л.П. Кочет-кова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1976. - № 4. — С. 91 -95.

55. Яковлев, А.Т. Идентификация возбудителей чумы, сапа и мелиоидоза им-муноферментным методом / А.Т Яковлев, Л.Ф. Зыкин, В.Н. Метлин // Диагностика и профилактика чумы, холеры, сапа и мелиоидоза. Волгоград, 1983.-С. 86-87.

56. Яковлев, А.Т. Иммуноферментный анализ в микробиологии / А.Т. Яковлев, Л.Ф. Зыкин, B.C. Рыбкин // Изд-во Саратовского университета. 1990. - 112 с.

57. Ameri, М. Comparison of two commercial radial immunodiffusion assays for detection of bovine immunoglobulin G in newborn calves / M. Ameri, M.J. Wil-kerson // J. Vet. Diagn Invest 2008. - Vol. 20. - P. 333 - 336.

58. Anuntagool, N. Antigenic relatedness between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei I N. Anuntagool, S. Sirisinha // J. Microbiol. Immunol. -2002.-Vol. 46.-P. 143 150.

59. Anuntagool, N. Identification of specific antigens of Pseudomonas pseudomallei and evaluation of their efficacies for diagnosis of melioidosis / N. Anuntagool, P. Rugdech, S. Sirisinha // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 1232 -1236.

60. Anuntagool, N. Lipopolysaccharide heterogeneity among Burkholderia pseudomallei from different geographic and clinical origins / N. Anuntagool, V. Wuthiekanun, N.J. White // J. Trop Med Hyg. 2006. - Vol. 74 (3) - P. 348 -352.

61. Arakava, V. Chronic melioidosis. A report of the first case in Japan / V. Ara-kava, T. Mitsui, R. Miki // J. Jap. Asoc. Infec. Diseases. 1993. - Vol. 67. - № 2.-P. 154- 162.

62. Ashdown, L.R. Relationship and significance of specific immunoglobulin M antibody response in clinical and subclinial melioidosis / L.R. Ashdown // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol. 14. - P. 361 - 364.

63. Atkins, T. Characterisation of an acapsular mutant of Burkholderia pseudomallei identified by signature tagged mutagenesis / T. Atkins, R. Prior, K. Mack//J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51.-P. 539-553.

64. AuCoin, D. P. Identification of Burkholderia cepacia complex bacteria with a lipopolysaccharide-specific monoclonal antibody / D. P. AuCoin, R. B. Crumpl, P. Thorkildson // Med. Microbiol. 2010. - Vol. 59. - P. 41 - 47.

65. Baert, B. Multiple phenotypic alterations caused by a c-type cytochrome maturation ccmC gene mutation in Pseudomonas aeruginosa / B. Baert, C. Baysse, S. Matthijs//Microbiol.-2008.-Vol. 154.-P. 127- 138.

66. Biesiegel, U. Protein blotting / U. Biesiegel // Electrophoresis. 1986. Vol. 7, № l.-P.l - 18.

67. Boiron, P. Use of partially purified 54-kilodalton antigen for diagnosis of nocardiosis by Western blot (immunoblot) assay / P. Boiron, F. Piovost // J.Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - № 2. - P. 328 - 331.

68. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

69. Brett, P.J. Characterization of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia pseudomallei-like strains / P.J. Brett, D. DeShazer, D.E. Woods // Epidemiol. Infect. 1997. - Vol. 118. - P. 137 - 148.

70. Brett, P.J. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-like species / P.J. Brett, D. De Shazer, D.E. Woods // Intern. J. Syst. Bacteriol. -1998.-Vol. 48. P.317 - 320.

71. Brett, P.J. Heiss Burkholderia thailandensis oacA Mutants Facilitate the Expression of Burkholderia mallei-like O-Polysaccharides / P.J. Brett, M. N. Burtnick, C. Heiss // J. Infect. Immunol. 2010. - Vol. 10. - P. 1023 - 1033.

72. Brett, P.J. Isolation and characterization of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins / P.J. Brett, D.C. Mah, D. E. Woods // Infect. Immunology. 1994. Vol. 62.-P. 1914-1919.

73. Brett, P.J. Pathogenesis and immunity to melioidosis / P.J. Brett, D.E. Woods // Acta Tropica. 2000. - Vol. 74. - P. 201 - 210.

74. Broms, J.E. Helix Essential for a Type VI Secretion-Like System of Francisella tularensis / J.E. Broms, M. Lavander, A. Sjostedt // American Society for Microbiol. 2009. - Vol. 191, №. 8. - P. 2431-2446.

75. Burnie, J. Immunoblot analysis: a new method for fingerprinting hospital pathogens / J. Burnie, R.C. Matthews // J. Immunol. Methods. 1987. - Vol. 100, №1.2.-P. 41 -46.

76. Bvkova, S.A. Clusterization of halophilic and halotolerant eubacteria using whole-cell protein electrophoresis data / S.A. Bvkova, I.S. Zviagintseva, D.S. Akhiynin // Microbiol. 2000. - Vol. 69, № 5. - P. 649 - 703.

77. Chandler, J. R. Mutational Analysis of Burkholderia thailandensis Quorum Sensing and Self-Aggregation / J. R. Chandler, B. A. Duerkop, A. Hinz // J. of Bacteriol. 2009. - Vol. 191, №. 19. - P. 5901 - 5909.

78. Chantratita, N. Accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay using crude and purified antigens for serodiagnosis of melioidosis / N. Chantratita, V. Wu-thiekanun, A. Thanwisai // Clin. Vaccine Immunol. 2007. - V. 14, № 1. - P. 110-113.

79. Cheng, A. C. Positive serologic test results for Burkholderia pseudomallei in asymptomatic persons / A. C. Cheng, B. J. Currie, S. Peacock // Am. J. Trop. Med. Hyg.-2009.-Vol. 80.-P. 1065-1071.

80. Cheng, A. C. Humoral and cellular immune responses in adult geese induced by an inactivated vaccine against new type gosling viral enteritis virus / A. C. Cheng, S. Chen, M.S. Wang // J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol. 89. - P. 2410 -2418.

81. Choy, J. Animal melioidosis in Australia / J. Choy, M. Mayo, B. Currie // International congress on melioidosis. Bangkok, Thailand, - 1988. - P. 34 - 37.

82. Cipriano, R.C. Detection of vibrio anguillarum antigen by the dot blot assay / R.C. Cipriano, J.B. Pyle, C.E. Starliper // J.Wild Dis. 1985. - Vol. 21, № 3. - P. 211-218.

83. Coenye, T. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches / T. Coenye, P. Vandamme // Environ. Microbiol. -2003.-Vol. 5. -P. 719-729.

84. Coenye, T. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex / T. Coenye, P. Vandamme, R. W Govan // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, № 10.-P. 3427-3436.

85. Costas, M. Numerical analisis of electrophoretic protein patterns of methycillin-resistant strains of Staphylococcus aureus / M. Costas, M. Cookson, B.D. Cook-son // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27, № 1. - P. 65-85.

86. Dance, D. Melioidosis as an emerging global problem / D. Dance // International congress on melioidosis // Bangkok, Thailand, — 1988. — P. 29 32.

87. Dance, D. The global epidemiology of melioidosis an update / D. Dance // Wold melioidosis congress. - Perth, W. Australia, - 2001. - P. 14- 17.

88. Davies, R.L. Comparison of methods for the analysis of outer membrane antigens of Neisseria meningitides by western blotting / K.L. Davies, R.A. Wall, S.P. Borriello // J. Immunol. Methods. 1990. - Vol. 134. - № 2. - P. 215 - 226.

89. Franzen, C. Molecular technigues for detection, species differentiation, and phy-logenetic analysis of microsporida // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 12. - P. 243 -285.

90. Felgnera, P.L. A Burkholderia pseudomallei protein microarray reveals sérodiagnostic and cross-reactive antigens / P.L. Felgnera, M. A. Kayalab, A. Vigila // J. Clin. Microbiol. 2009. - Vol. 28. - P. 1073 - 1075.

91. Fomiatti, K.R. Use of the biological system for the identification of Burkholderia pseudomallei and their differentiation from other species of Burkholderia / K.R. Fomiatti, S. Benedict // Acta tropica. 2001. - № 11. - P. 46 - 49.

92. Geurtsen, J. Identification of active-site histidine and serine residues / J.Geurtsen, L. Steeghs, J. Hove // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 8248 -8259.

93. Gilmore, G. Use of antigens derived from B. pseudomallei, B. thailandensis, and B. cepacia in the indirect hemagglutination assay for melioidosis I G. Gilmore,

94. J. Barnes, N. Ketheesan // Clin. Vaccin. Immunol. 2007. - Vol. 14. - P. 1529 -1531.

95. Goodyear, A. Protection from pneumonic infection with Burkholderia species by inhalational immunotherapy / A. Goodyear, L. Kellihan, H. Bielefeldt-Ohmann // Infect. Immunol. 2009. - Vol. 77, №. 4. - P. 1579 - 1588.

96. Gotoh, N. Isolation and characterization of the outer-membrane proteins of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei / N. Gotoh, N.J. White, W. Chao-wagul / Microbiol. 1994. - Vol. 140. - P. 797 - 805.

97. Hagebock, J.M. Serological responses to the mallein test for glanders in solipeds / J.M. Hagebock, L.K. Schlater, W.M. Freriehs // J. Vet. Diagn. Invest. 1993.-Vol. 5, №9.-P. 97-99.

98. Hardy, L.N. Comparison of extracellular protein profiles of seven serotypes of mutans tsreptococci under controlled conditions / L.N. Hardy, Knox, K.W., Brown, R.A. // J. General Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 1389 - 1400.

99. Harris, P. N. A. Clinical features that affect indirect-hemagglutination-assay responses to Burkholderia pseudomallei / P. N. A. Harris, N. Ketheesan, L. Owens // Clin. Vacc. Immunol. 2009. - Vol. 16, № 6. - P. 924 - 930.

100. Harvey, S.P. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates / S.P. Harvey, J.M. Minter // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. - Vol. 44, №1. - P. 91 - 97.

101. Hodgson, K. Comparison of routine bench and molecular diagnostic methods in identification of B. pseudomallei / K. Hodgson, C. Engler, B. Govan // J. Clin.

102. Microbiol. 2009. - Vol. 47. - № 5. - P. 1578 - 1580.

103. Hoefer scientific instruments. 1988 - 1989. - P. 132 - 133.

104. Holland, D.T. Differentiation and Characterization of Enteroviruses by Computer-Assisted Viral Protein Fingerprinting / D.T. Holland, J. Senne, C.R. Peter // J. Clin. Microbiol. 1998. Vol. 36, № 6. - P. 1588-1594.

105. Inglis, T.A Comparison of rapid, automated ribotyping of Burkholderia pseu-domallei wich DNA macrorestriction analysis / T. A. Inglis, A. Clair, L. O'Reilly // Acta tropica. 2001. - № 11. - P. 47 - 50.

106. Inglis, J. J. The american society of tropical medicine and hygiene melioidosis risk in a tropical industrial environment / J. J. Inglis, A. Levy, A.J. Merritt // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2009. - Vol. 80 (1). - P. 78 - 84.

107. Jackman, P.J.H. Microbiol systematic s based on electrophoretic whole — cell protein patterns / P.J.H. Jackman // Methods in microbiology. 1987. — Vol. 19. -P. 1911 - 1915.

108. Keasey, S. L. Extensive Antibody Cross-reactivity among Infectious Gramnegative bacteria revealed by proteome microarray analysis / S. L. Keasey, K.E. Schmid, M. S. Lee // J. Molec. Cell. Proteomics. 2009. - Vol. 8. - P. 924 - 935.

109. Keluangkhot, V. Melioidosis / V. Keluangkhot, R. Pethouvanh, M. Strobel // Med. Mai. Infect. 2005. - Vol. 35, № 10. - P. 469 - 475.

110. Kersters, K. Identification and of bacteria by protein electrophoresis / K. Ker-sters, B. Rot, M. Vancanneyt // Program and Abstr. FEMS Meet. Granada.1993.-P. 29-30.

111. Koonpaew, S. Genome fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with melioidosis in Thailand / S. Koonpaew, M.N. Ubol, S. Sirisinha // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P.187 -191.

112. Kotani, H. Identification and isolation of mycoplasmas by immunobinding / H. Kotani, H. Huang, M. Carrity // J. Med. Sci. 1987. - Vol. 23, №. 6. - P. 752 -758.

113. Kunakorn, M. Gold blot for detection of immunoglobulin M (IgM)- and IgG-specific antibodies for rapid serodiagnosis of melioidosis / M. Kunakorn, B. Petchclai, K. Khupulsup // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29 - P. 2065 - ■ 2067.

114. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227, № 15. - P. 680-685.

115. Lee, W. Fingerprinting Candida albicans / W. Lee, J. Burnie, K. Matthews // J. Immunol. Methods. 1986. - Vol. 93, № 2. - P. 177 -182.

116. Levine, H.B. Immunization with an induced avirulent auxotrophic mutant of Ps. pseudomallei / H.B. Levine, R.L. Maurer // J. Immunol. 1958. - Vol. 81. - P. 433 -438.

117. Lim, K.P. Expression and purification of a recombinant scFv towards the exotoxin of the pathogen Burkholderia pseudomallei / K.P. Lim, H. Li, S. Nathan // J. Microbiol. 2004. - Vol. 42 (2) - P. 126 - 132.

118. Limmathurotsakul, D. Increasing incidence of human melioidosis in northeast Thailand / D. Limmathurotsakul, S. Wongratanacheewin, N.Teerawattanasook // J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol. 82.-P. 1113-1117.

119. Liu, P. Identification of pathogenic Pseudomonas by extracellular antigens / P. Liu// J. Bacteriol. 1961. - Vol. 7, № 81. - P. 28 - 35.

120. Mayo, M. An outbreak of melioidosis linked to an unchlorinated water supply / M. Mayo, N. Anstey, P. Donohoe // Wold Melioidosis Congress. Perth, W. Australia, -2 001. -P.36 - 38/

121. Naas, T. Genetic structures at the origin of acquisition of the p-Lactamase blaKPC gene / T. Naas, G. Cuzon, M. V. Villegas // Antimicrob. Agents Chemother. - 2008. - Vol. 52. - P. 1257 - 1263.

122. Naureen, A. / Comparative evalution of Rose Bengal plate agglutination test, mallein test, and some conventional serological test for diagnosis of eguine glanders // A Naureen, M. Sagib, G.Muhammad // J. Vet. Diagn. Invest. 2007. -Vol. 19.-P. 362-367.

123. Novem, V. Structural and biological diversity of lipopolysaccharides from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis / V. Novem, G. Shui, D. Wang // Clin, and Vaccine Immunol. 2009. - Vol. 16, No. 10. - P. 1420 - 1428.

124. Oakley, B.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in po-lyacrylamide gels / B.R. Oakley, D.R. Kirsch, N.R. Morris // Anal. Biochem. -1980.-Vol. 105.-P. 361 -363.

125. Pagnarith, Y. Emergence of Pediatric Melioidosis in Siem Reap, Cambodia / Y. Pagnarith, V. Kumar, J. Thaipadungpanit // J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol. 82. - P. 1106-1112.

126. Pilatz, S. Identification of Burkholderia pseudomallei genes required for the intracellular life cycle and in vivo virulence / S. Pilatz, K. Breitbbach, N. Hein // Infection and Immunit. 2006. - P. 3576 - 3586.

127. Pongsunk, S. Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood cultures by a monoclonal antibody assay / S. Pongsunk, N. Thirawattanasuk, N. Pi-yasangthong // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 11. - P. 3662 - 3667.

128. Reckseidler-Zenteno, S. L. Characterization of the type III capsular polysaccharide produced by Burkholderia pseudomallei / S. L. Reckseidler-Zenteno, D.-F. Viteri, R. Moore // J. Med. Microbiol. 2010. - Vol. 59. - P. 1403 - 1414.

129. Rolim, D. B. Environmental Isolates of Burkholderia pseudomallei in Ceara State, Northeastern Brazil / D.B. Rolim, M. F. G. Rocha, R. S. N. Brilhante // American Society Microbiol. 2009. - Vol. 75, №. 4. - P. 1215 - 1218.

130. Rotz, L.D. Public health assessment of potential biological terrorism agents / L.D. Rotz, A.S. Khan, S.R. Lillibridge // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, № 2. - P. 225 - 230.

131. Sarasombath, S. Characterization of monoclonal antibodies to protein antigen of Salmonella typhi / S. Sarasombath, S. Lertmemongkolchai, N. Banchuin // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - P. 508 - 512.

132. Sermswan, R.W. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis / R.W. Sermswan, S. Won-gratanacheewin, N. Anuntagool // J. Trop Med Hyg 2000. - Vol. 63. - P. 146

133. Shanks, J. Burkholderia mallei tssM encondes a putative deubiguitinase that is secreted / J. Shanks, M.N. Burtnick, P.J. Brett // Infect. Immunol. 2009. - Vol. 77, №. 4.-P. 1636- 1648.

134. Srisurat, N. Bacterial loads and antibody responses in BALB/c mice infected with low and high doses of B. pseudomallei / N. Srisurat, R.W. Sermswan, U. Tatawasart // J. Trop. Med. 2010. - Vol. 82. - P. 1102 - 1105.

135. Steinmetz, I. Purification and characterization of an exopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei / I. Steinmetz, M. Rohde, B. Brenneke // Infect. Immunol. 1995 - Vol. 63. - P. 3959 - 3965.

136. Stott, D.I. Immunoblotting and dot blotting / D.I. Stott // J. Immunol. Methods. 1989.-Vol. 119, №. 2.-P. 153 - 179.

137. Taketa, K. A tetrazolium method for staining peroxidase labels in blotting assays / K. Taketa, E. Ichickana, H. Taga // J. Immunol. Metods. 1986.-Vol. 95. -№ 1.-P.-71 -73.

138. Tan, K. S. Lim suppression of host innate immune response by Burkholderiapseudomallei through the virulence factor TssM / K. S. Tan, Y. Chen, Y.-C. Lim //J. Immunol. 2010. Vol. 184. - P. 5160 - 5170.

139. Tay, S. T. Sequence polymorphism and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the flagellin gene of Burkholderia pseudomallei / S. T. Tay, P. C. Cheah, S. D. Puthucheary // J. Clin. Microbiol. 2010. - Vol. 48, №. 4.-P. 1465 - 1467.

140. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications / H. Towbin, J. Staehelin, J. Gordon // Proc .Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P.4350 - 4354.

141. Vandamme, P. Differentiation of Campylobacters and Campylobacter — like organisms by numerical analis one-dimensional electrophoretic protein patterns / P. Vandamme, B. Rot, K. Kersters // Syst. and Appl. Microbiol. 1991. - Vol. 14, № 1. - P. 57-66.

142. Vandamme, P. Identification and population structure of Burkholderia stabilis sp. nov. (formerly Burkholderia cepacia genomovar IV) / P. Vandamme, E. Mahenthiralingam, B. Holmes // J. Clin. Microbiol. 2000.- Vol.38. - P. 10421047.

143. Vandamme, P. Polyphasic taxonomy in practice: the Burkholderia cepacia challenge / P.Vandamme, // WFCC Newsletter. 2002. - Vol. 34. - P. 17 - 24.

144. Whitlock, G. C. Burkholderia mallei cellular interactions in a respiratory cell model / G. C. Whitlock, A. Gustavo, L. Vsevolod // J. Med. Microbiol. 2009. -Vol. 58.-P. 554-562.

145. Woods, D.E. Burkholderia thailandensis El25 harbors f temperae bacteriophage specific for Burkholderia mallei / D.E. Woods, J.A. Jeddelok // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, № 14. - P.4003 - 4017.

146. Wuthiekanun, V. Rapid immunofluorescence microscopy for diagnosis of melioidosis / V. Wuthiekanun, V. Desakorn, G. Wongsuvan // Clinical and Diagnostic Laboratory immunology. 2005. - Vol. 8. - P. 555 - 556.

147. СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА ПРЕЦИПИТИРУЮЩЕЙ АНТИСЫВОРОТКОЙ

148. Патснтообладатель(ли): ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Ки)1. Автор(ы): см. на обороте1. Заявка №2006100651

149. Приоритет изобретения 10 января 2006 г. За^гистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 сентября 2007 г.

150. Срок действия патен та истекает 10 января 2026 г.

151. СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА

152. Патентообладатель(ли): Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (К11)1. Автор(ы): см, на обороте1. Заявка № 2008111417

153. Приоритет изобретения 24 марта 2008 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 сентября 2009 2.

154. Срок действия патента истекает 24 марта 2028 г.

155. Руководитель Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам1. Б.П. Симонов1. Ж Ж Жж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж жж ж ж ж ж ж ж ж ж ж жжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжж