Разработка системы морфометрического анализа для скрининга эффектов нестабильности генома в гигиенических исследованиях: на примере наноматериалов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.02.01, кандидат биологических наук Мошков, Николай Евгеньевич
- Специальность ВАК РФ14.02.01
- Количество страниц 113
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мошков, Николай Евгеньевич
1.7 Заключение по главе 1
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Культура клеток и условия экспериментов
2.2 Наноматериалы и контрольные вещества
2.3 Морфометрический анализ
2.4 Цитогенетический анализ
2.5 Методы статистического анализа данных
2.6 Объем проведенной работы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Площадь ядра ФГА-стимулированного лимфоцита и её связь с объемом ядра
3.2 Расчет погрешности измерения площадей клеточных ядер, их отношений и сумм
3.2.1 Формирование тестовых изображений двуядерных клеток
3.2.2 Расчет точности измерения площадей отдельных клеточных ядер на основе искусственно полученных тестовых изображений
3.2.3 Расчет точности вычисления суммы ядерных площадей 81+82
3.2.4 Расчет точности вычисления отношения ядерных площадей 81/82
3.3 Интервальная оценка морфометрических индексов на основе данных о распределениях погрешностей отдельных измерений
3.4 Эффекты модельных мутагенов
3.4.1 Исследование эффектов ]М-метил-]Ч-нитро-Ы-нитрозогуанидина
Цитогенетический анализ
Морфометрический анализ
Анализ корреляционных взаимосвязей
3.4.2 Исследование эффектов латекса для фагоцитоза
Цитогенетический анализ
Морфометрический анализ
Анализ корреляционных взаимосвязей
3.5 Исследование эффектов магнетита в кремниевой оболочке Ре304(8Ю2)
Цитогенетический анализ
Морфометрический анализ
Анализ корреляционных взаимосвязей
3.6 Исследование эффектов нановолокон и ультрадисперсной формы гидроксида алюминия
Цитогенетический анализ
Морфометрический анализ
Анализ корреляционных взаимосвязей
3.7 Исследование эффектов НЧ и микрочастиц диоксида титана
(природный анатаз)
3.7.1 Цитогенетический анализ, диоксид титана
Морфометрический анализ
Анализ корреляционных взаимосвязей между морфометрическими и цитогенетическими индексами
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Результаты исследования тест систем как показатель информативности метода морфометрии для задач оценки генотоксичности ИМ
4.1.1 МННГ, анализ результатов исследования
4.1.2 Микрочастицы латекса, анализ результатов исследования
4.1.3 Выводы из результатов исследования эффектов МННГ и латекса
4.2 Анализ взаимосвязей морфометрических и цитогенетических индексов на основе результатов исследований наноматериалов
4.2.1 Генотоксическая активность
4.2.2 Обобщенный анализ корреляционных взаимосвязей
4.2.3 Информативность морфометрических индексов
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ
5.1 Заключение
5.2 Выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
МТТ - 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide
АТФ - аденозинтрифосфат
ИП - индекс пролиферации ядер
ИР - индекс репликации ядер
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
МКЧ - микрочастицы
МННГ - Ы-метил-Ы-нитро-Т^-нитрозогуанидин
МЯ - микроядро
НВ - нановолокна
НМ - наноматериал
НПМ - нуклеоплазменный мост
НЧ - наночастица
УД - ультрадисперсия
ЦКБ - цитокинетический блок
ЦХВ - цитохалазин В
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Гигиена», 14.02.01 шифр ВАК
Нестабильность генома как критерий выбора генотоксикантов, приоритетных для гигиенической регламентации в атмосферном воздухе2010 год, кандидат биологических наук Легостаева, Татьяна Борисовна
Анализ клеток с микроядрами в оценке пролиферации эпителия щитовидной железы2005 год, кандидат медицинских наук Гансбургский, Михаил Андреевич
Оценка мутагенного действия факторов окружающей среды микроядерным методом на клетки органов выделительной системы2006 год, кандидат биологических наук Шереметьева, Светлана Михайловна
Оценка цитогенетического эффекта факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека2005 год, кандидат биологических наук Коваленко, Мария Александровна
Научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности2002 год, доктор биологических наук Сычёва, Людмила Петровна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка системы морфометрического анализа для скрининга эффектов нестабильности генома в гигиенических исследованиях: на примере наноматериалов»
Введение
Активное развитие технологий способствует высоким темпам разработки новых веществ и материалов. Наиболее яркими представителями современных материалов являются наноматериалы (НМ), каждый из которых обладает специфическими свойствами [1,2], связанными с пространственной структурой его молекул. В связи с малой изученностью механизмов биологического действия НМ, оценку токсикологических свойств (в том числе генотоксичности, как одного из важнейших компонентов токсикологической характеристики) для каждого такого вещества следует выполнять индивидуально [3, 4, 5, 1].
Динамичность развития нанотехнологий и появления новых НМ требует создания системы скрининга, которая бы позволила быстро и надежно выявлять среди них потенциально опасные вещества. Поскольку обычные для токсикологических исследований эксперименты на животных продолжительны, трудоемки и для исследования НМ требуют разработки специальных условий эксперимента, наиболее перспективными для генетико-токсикологического скрининга представляются методы in vitro (входят в список рекомендованных как в РФ, так и в странах ЕС [2, 6]), основанные на культивировании клеток животных, человека, а также ряда клеточных линий. В генетической токсикологии скрининг должен быть направлен на выявление эффектов нестабильности генома, которые при этом могут проявляться в виде целого комплекса изменений: образования повреждений ДНК, асимметрии деления ядер, анеуплоидии, изменения митотической и пролиферативной активности, клеточной гибели. В настоящее время надежно и несколькими методами определяются только повреждения ДНК (в тесте на индукцию хромосомных аберраций [7, 8, 9], в микроядерном тесте [10, 11, 12], в Comet assay [13, 14, 15] и пр.). В то же время, такое серьезное повреждение генома, как асимметрия распределения генетического материала в процессе деления клетки, являющееся одной из наиболее серьезных предпосылок для опухолевой трансформации клеток [16, 17, 18],
определяется только при использовании полногеномной FISH-окраски (fluorescence in situ hybridization [19]). Этот метод очень дорог, требует специального оборудования и в России практически не выполняется. Мы же предположили, что асимметрию распределения генетического материала можно определить при сравнении площадей ядер в двуядерных клетках, регулярно образующихся при блоке цитотомии. Этот эффект стандартно применяется в методе микроядерного теста [10, 20], поэтому использование последнего в комплексе с морфометрическим анализом ядер двуядерных клеток (который достаточно часто применяют в современных исследованиях одноядерных клеток [21, 18, 22]) может стать надежным и простым инструментом выявления асимметрии деления ядер.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: на примере эффектов, индуцированных наноматериалами на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях блока цитотомии, разработать метод морфометрического анализа площадей клеточных ядер в двуядерных клетках, пригодный для скрининга нестабильности генома. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Создать математическое описание и методическую базу для анализа симметрии площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся при культивировании клеток крови человека в условиях цитокинетического блока.
2. Проанализировать изменения симметрии площадей ядер двуядерных клеток в культурах лимфоцитов крови человека, экспонированных стандартным мутагеном, а также нано- и микроформами ряда материалов, предполагаемых к применению в различных областях техники, в частности, при водоподготовке.
3. Провести сравнительный анализ цитогенетических эффектов, индуцированных теми же веществами, с использованием расширенного протокола микроядерного теста, и сравнить полученные результаты с данными морфометрического анализа.
4. На основании полученных данных обосновать алгоритм и критерии использования морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках для экспресс-прогноза эффектов нестабильности генома на клетках крови человека, культивированных в условиях блока цитотомии. НАУЧНАЯ НОВИЗНА
1. Предложен новый подход к морфометрическому анализу, основанный на сравнении площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся из одной материнской при культивировании лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока; созданы его математическое обоснование и методическая база.
2. Разработана система морфометрических показателей, которые могут быть использованы для скрининга эффектов нестабильности генома человека, индуцированных действием НМ, применимая также для анализа эффектов химических соединений и других видов воздействий.
3. Впервые показано, что при экспозиции лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока НЧ магнетита в оболочке из силиката, микро- и НЧ диоксида титана, нановолокнами (НВ) и микродисперсией (УД) гидроксида алюминия, а также М-метил-1чГ-нитро-]Ч-нитрозогуанидином, дающим истинный раствор, и микрочастицами латекса, наблюдаются:
a. дозозависимое повышение частоты клеток с микроядрами (МЯ) и нуклеоплазменными мостами (НПМ), причем для НМ преимущественно среди клеток, прошедших 2й митотический цикл за время культивирования, а также повышение частоты апоптоза и укорочении клеточного цикла у значительного числа клеток, способных к делению;
b. в клетках, прошедших 2й митотический цикл - дозозависимое повышение доли асимметричных 3-ядерных клеток;
c. дозозависимые изменения площадей ядер и степени их симметрии в двуядерных клетках, прошедших 1 митотический цикл.
4. Выявлены повторяющиеся высокоуровневые корреляции между
морфометрическими индексами, определенными по соотношению и сумме площадей ядер в двуядерных клетках, и рядом цитогенетических показателей, характеризующих нестабильность генома в клетках, прошедших второй митоз, что доказывает релевантность разработанного подхода для выявления и прогноза эффектов нестабильности генома, включая анеуплоидию.
5. Показано, что увеличение степени асимметрии площадей ядер в двуядерных клетках ассоциировано с повышением частоты генетических повреждений в клетках, прошедших второй митоз, а увеличение суммарной площади ядер - с ускорением пролиферации клеток в культуре. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
1. Для решения задач генетико-токсикологического скрининга разработан простой и быстрый способ отбора соединений для дальнейшего углубленного изучения эффектов нестабильности генома, позволяющий в несколько раз сократить продолжительность рабочего времени на анализ по сравнению с цитогенетическим исследованием.
2. Создана минимальная система морфометрических индексов, которые могут быть использованы для скрининга эффектов нестабильности генома человека, индуцированных действием генотоксикантов, включая НМ.
3. Разработанный математический аппарат и созданная методика анализа делают метод пригодным для автоматизации.
4. Получен патент РФ №2467329 «Способ экспресс-оценки степени потенциальной генотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплодии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях цитокинетического блока», Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Приоритет изобретения: 03 марта 2011г., Зарегистрировано в
Гос.реестре (публикация) 20 ноября 2012г. Срок действия - до 03 марта 2031г.
5. Получена справка о внедрении результатов в научно практическую деятельность по изучению канцерогенной активности, подписанная заместителем председателя комисси по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре РФ профессором Пылевым Л.Н.
Личный вклад автора заключается в участии в работе на всех этапах ее проведения: выборе цели и постановке задач, планировании экспериментов и их проведении, разработке математического описания и методики морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, проведении цитогенетического анализа в микроядерном тесте с использованием расширенного протокола и морфометрического анализа эффектов стандартного мутагена МННГ и микрочастиц латекса, а также НЧ магнетита в оболочке из силиката, микро- и НЧ диоксида титана, НВ и УД гидроксида алюминия, разработке подходов к статистическому анализ и - по разработанной методике - статистической обработке комплекса морфометрических индексов и данных цитогенетического анализа эффектов нестабильности генома, обосновании выбора критериев и разработке алгоритма морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках. Часть исследований проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетического мониторинга ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздрава России.
ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Математический аппарат метода морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, который базируется на близости формы ядра ФГА-стимулированного лимфоцита к эллипсоиду (8 < 9%) и наличии прямой слабостепенной зависимости между площадью и объемом ядра.
2. Стандартный мутаген МННГ, а также НВ и УД гидроксида алюминия, микрочастицы латекса, НЧ и микрочастицы диоксида титана и НЧ магнетита в оболочке из силиката индуцируют в лимфоцитах крови человека,
культивируемых в условиях блока цитокинеза, повышение уровней нестабильности генома, причем различия в индукции генотоксических эффектов нано- и микродисперсных материалов наблюдаются преимущественно в клетках, прошедших 2 и более митотических цикла. Некоторые различия в эффектах одних и тех же материалов на клетках разных доноров обусловлены, преимущественно, разницей в индивидуальных особенностях пролиферативной активности клеток каждого донора в культуре.
3. Для всех изученных соединений обнаружены повторяющиеся значимые корреляции:
a. между частотами генетических повреждений в клетках, прошедших второй митоз, и отношением площадей ядер в двуядерных клетках;
b. между показателями пролиферативной активности лимфоцитов в культуре и суммарной площадью ядер в двуядерных клетках.
4. Алгоритм морфометрического анализа в двуядерных клетках, основанный на оценке изменений средних значений соотношения (81/82) и суммы (81+82) площадей ядер, эффективен для скрининга эффектов нестабильности генома.
Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга ФГБУ НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина МЗ РФ в рамках следующих Государственных тем: «Исследование закономерностей регулируемой структурно-энергетической саморганизации фазоассоциированной воды для формирования питьевых вод с направленным биологическим действием», «Разработка и внедрение в практику профилактической токсикологии методов испытаний химических веществ по их влиянию на здоровье человека, гармонизированные с рекомендациями ОЭСР», «Эпидемиологическое обоснование модели оценки вклада факторов среды обитания в формирование экологически зависимых заболеваний и их причинной обусловленности».
Апробация диссертации проведена 06 июля 2012 г на совместном заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских
диссертаций ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России (протокол №12 от 12.07.2012). Материалы диссертации доложены на: I Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 08» (Москва, 3-5 декабря 2008); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, (Москва, 21-27 июня 2009); VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010); III Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech 2010» (Москва, 1-3 ноября 2010); пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды обитания и пути их решения» (14-15 декабря 2011); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011), IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые ученые за устойчивое развитие страны в глобальном мире» (Москва, 27-28 сентября 2012), а также Conference of International Society for Environmental Epidemiology (ISEE 2009), "Environmental, Food and Global Health" (Ирландия, Дублин, 25-29 августа 2009) и 42 Annual Meeting of European Environmental Mutagenic Society (EEMS) (Польша, Варшава, 16-21 сентября 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, описания результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 113 страницах машинописи, включая приложения, иллюстрирован 56 таблицами и 34 рисунками. Указатель литературы содержит 106 источников.
Глава 1. Современное состояние проблемы оценки генетической безопасности наноматериалов
1.1 Токсикология НМ и НЧ
Физические и химические свойства НМ существенно отличаются от свойств аналогичных материалов в макроскопическом состоянии [3], что в основном связано с квантовыми взаимодействиями в нанокластерах и высоким отношением площади поверхности НЧ к их объему [3, 5]. В соответствии с методическими рекомендациями [1] в наноразмерном состоянии можно выделить ряд физико-химических особенностей поведения веществ, определяющих их потенциальную склонность к токсичности:
1. Увеличение химического потенциала веществ на межфазной границе высокой кривизны. Вследствие этого существенно изменяется растворимость, реакционная и каталитическая способность НЧ и их компонентов.
2. Большая удельная поверхность НМ. Это может приводить, в частности, к увеличению продукции свободных радикалов и активных форм кислорода и далее к повреждению биологических структур.
3. Высокая адсорбционная активность. Многие НМ обладают гидрофобными свойствами и несут электрический заряд, что усиливает процессы адсорбции на них различных токсикантов и их способность проникать через барьеры организма.
4. Небольшие размеры и разнообразие форм НЧ. Вследствие этого НЧ могут связываться с нуклеиновыми кислотами, белками, встраиваться в мембраны клеток и клеточных органелл, проникать в клеточные органеллы и, тем самым, изменять функции биоструктур.
5. Высокая способность к аккумуляции. НЧ не распознаются защитными системами организма, не подвергаются биотрансформации и не выводятся из организма. Это ведет к накоплению и передаче НМ и НЧ по пищевой цепи, что увеличивает их поступление в организм человека. Следует обратить
внимание, что НЧ могут не вызывать иммунный ответ. Процессы переноса НЧ в окружающей среде с воздушными и водными потоками, их накопление в почве, донных отложениях могут также значительно отличаться от поведения частиц веществ более крупного размера.
В связи с указанной спецификой существуют определенные сложности в прогнозировании биологического действия НМ и НЧ, поэтому единой методики и критериев оценки генетической безопасности этих веществ не существует до сих пор, а исследования носят, в основном, феноменологический характер. Тем не менее, показаны генотоксические эффекты воздействия НЧ ТЮ2 на культуру фибробластов [23], НЧ А1203 и ТЮ2 на эпителиальные клетки [24, 25], НЧ Fe304, Ti02, А1 на клетки печени крыс [26]. Выявлены цитотоксические эффекты действия НЧ Fe2C>3 на клетки нейронов [27], НЧ amorphous silica на макрофаги [28], НЧ гидроксидов ряда металлов на эпителиальные клетки языка [29] и т.д.
1.2 Современные методы анализа генотоксичности НМ и НЧ
В РФ согласно методическим рекомендациям [1], и методическим указаниям МУ 1.2.2520-09 [2] для оценки влияния НЧ и продукции, полученной с использованием НМ, на генотоксичность и мутагенность рекомендуется использовать следующие тесты:
- оценка частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей линии С57В1/6 (метафазный метод);
- тест Эймса Salmonella/микросомы;
- микроядерный тест на полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей линии С57В1/6;
- Comet-тест (DNA-comet assay).
Метод оценки частоты хромосомных аберраций [7, 8, 9] принят МАГАТЭ в 1986 г. в качестве официального метода биологической дозиметрии. Однако для обнаружения клеток с хромосомными аберрациями требуются специально обученные и опытные лаборанты, что делает процедуру дорогостоящей и долгой [30]. Кроме того, метод не позволяет обнаружить
изменения пролиферации, большинство вариантов асимметрии деления и апоптоз - изменения, весьма характерные для нестабильности генома. Тест Эймса - один из самых распространенных на сегодня методов выявления мутагенной активности, основанный на индукции генных мутаций у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium [31]. Эксперименты осложнены необходимостью соблюдать регламент работы с бактериальными культурами, использовать штаммы с проверенными генотипами, строго соблюдать правила их музейного хранения. Исследования проводят высококвалифицированные специалисты после специального обучения. Comet-тест - относительно новый метод, который позволяет оценивать ДНК-разрывы на уровне отдельных клеток [13, 14, 15]. Недостатками метода ДНК-комет являются [32]:
- высокая стоимость программного обеспечения и реактивов для флуоресценции;
- высокая стоимость используемых методов специальной заморозки, либо необходимость анализировать препараты немедленно после взятия и всегда выдерживать одно и то же время от момента взятия крови до момента лизиса клеток в камере;
- необходимость подготовки препаратов, в ходе которой также возможно повреждение ДНК.
Кроме того, все перечисленные методы определяют только повреждения ДНК, при этом асимметрию распределения генетического материала в процессе деления клетки, являющеюся одной из наиболее серьезных предпосылок для опухолевой трансформации клеток [16, 17, 18], ни в одном из перечисленных методов оценить невозможно. Определяется такая асимметрия только методом полногеномной FISH-окраски (fluorescence in situ hybridization [19, 33]), в котором невозможно определить весь хромосомный набор без использования специальных маркеров и сложной дорогостоящей техники.
1.3 Оценка асимметрии распределения ДНК между дочерними клетками методами морфометрии ядер
Мы предположили, что асимметрию распределения генетического материала можно определить при сравнении площадей ядер в двуядерных клетках, которые регулярно образуются при блоке цитотомии. Эту гипотезу подтвердили данные статьи [34], в которой выявлены статистически значимые различия между площадями гипо- и гиперплоидных ядер. Кроме того, на информативность размеров ядер при оценке функционального состояния клеток указывают данные о связи размеров клеточного ядра с изменениями, являющимися маркерами канцерогенного или мутагенного воздействия [18, 35]: нарушениями в структуре ядра и целостности ДНК, в количестве генетического материала и его компактизации. Так, размеры, форма, структура хроматина и количество ДНК, характерные для клеток злокачественной опухоли, отличаются от наблюдаемых в ядрах нормальных клеток [17, 18]. Кроме того, в гистологически нормальных клетках, расположенных на периферии злокачественной опухоли были также выявлены [16] нарушения локализации и структуры хроматина. Важным фактором при использовании методов анализа, основанных на измерении размеров клеток и их ядер, является их относительная простота. Исследователю не требуется анализировать особенности строения клетки и её ядра, выявлять хромосомные аберрации или другие особые цитогенетические маркеры токсических эффектов. Достаточно получить четкое изображение клетки, на котором измеряемые структуры хорошо видны, и выполнить необходимые измерения на компьютере с помощью программного обеспечения, которое обычно входит в комплект поставки микроскопа.
1.4 Применение методов морфометрии клеток и их ядер в современных биологических исследованиях
В современных исследованиях методы морфометрии клеточных ядер достаточно широко применяются при анализе клеток злокачественных опухолей. В таблице 1 представлен обзор ряда подобных исследований.
Таблица 1 - Обзор ряда исследований, использующих морфометрию ядер для
анализа клеток злокачественных опухолей
Клеточная линия Морфометрические параметры Результат Источник
незрелые лимфоидные клетки тимуса в норме (контроль)/опухолевые клетки лимфоидной тимомы Диаметр, площадь, периметр, коэффициент формы ядра + (Диаметр, площадь, периметр ядра); комм.: диаметры, площади и периметр ядер лимфоидных клеток тимуса в норме достоверно меньше опухолевых клеток лимфоидной тимомы. Статистических различий по коэффициенту формы не выявлено. [36]
клетки желудочной аденокарциномы - операбельные больные/ клетки желудочной аденокарциномы -неоперабельные больные Площадь, периметр, минимальный диаметр, максимальный диаметр, коэффициент формы ядра - (р=0,05) комм.: статистически значимых различий не выявлено, однако значения всех измеренных параметров, полученные для группы неоперабельных больных, превышали аналогичные для группы операбельных [18]
клетки проточной карциномы ш з^и/клетки инвазивной проточной карциномы/ клетки, измененные кистозно-фиброзной мастопатией (контроль) Площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр, отношение осей, плотность, коэффициент формы ядра проточная карцинома in situ: + (площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр в норме меньше чем при патологии р<0.0001) инвазивная проточная карцинома: + (площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр; в норме меньше чем при патологии, р<0.0001; отношение осей, плотность ядра, коэффициент формы; р<0.01) [37]
Клеточная линия Морфометрические параметры Результат Источник
клетки гипернефроидной опухоли почки Площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр, коэффициент формы ядра + (площадь, периметр, максимальный диаметр;р=0.003; минимальный диаметр р=0.008) комм.: данные параметры с указанными уровнями значимости являются маркерами развития болезни и выживаемости (результаты одновариантного анализа); также выявлен ряд корреляционных связей между морфометрическими параметрами и гистопатологическими данными [38]
клетки спонтанного кожного эпидермоидного рака 1, 2 и 3 стадий Площадь, периметр, средний диаметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр ядра + (Площадь, периметр, средний диаметр, р<0.05) комм.: обнаружены статистически значимые различия между указанными морфометрическими параметрами для различных стадий опухоли - наблюдается увеличение значений от 1й стадии к Зй; сделан вывод о пригодности морфометрии для дифференцировки стадии опухоли в качестве дополнительного метода. [22]
ВЕА8-2В (нормальные клетки)/ N01-11522 (опухолевые кетки) 39 параметров, описывающих размер, состояние оболочки, и строение клеточного ядра + (р<0.0001, кроме параметров удлинения оболочки {р~0.6536) и ряда параметров структуры Маркова (р=0.0033-0.4574)) комм.: размеры клеточных ядер нормальных клеток (площадь, периметр, размер оболочки, минимальный и максимальный диаметр) значимо меньше размеров ядер опухолевых клеток [16]
Обобщая все данные, цитированные в этом фрагменте обзора, можно
заключить, что:
1. Площадь, периметр, диаметр вписанной и описанной окружности для ядер опухолевых клеток статистически значимо отличаются от аналогичных параметров нормальных клеток.
2. С прогрессированием опухоли изменяется площадь и периметр ядер.
3. Большинство авторов отмечают эффективность морфометрического анализа при исследованиях и дифференциации опухолевых клеток.
1.5 Метод микроядерного теста с цитохалазином В как референсный метод для морфометрического анализа
Двуядерные клетки стандартно образуются при культивировании лимфоцитов крови человека и животных в микроядерном тесте в условиях цитокинетического блока с цитохалазином В (ЦХВ) [10, 11, 12]. Поэтому метод микроядерного теста с расширенным протоколом исследования [39, 40] было решено использовать в качестве референсного в данной работе. Принцип метода заключается в способности ЦХВ блокировать расхождение дочерних ядер в делящейся клетке. При этом нарушается только цитокинез, но не предшествующие стадии деления, и клетка становится двуядерной, сохраняя потенциал к дальнейшему делению (Рис. 1, Рис. 2). Микроядерный тест с ЦХВ позволяет выявлять те же типы генетических повреждений, что и оценка хромосомных аберраций, но обладает достоинствами как метафазного, так и ана-телофазного анализов, от которых его выгодно отличает возможность накапливать клетки, содержащие генетические повреждения [39]. Классический микроядерный тест in vitro основан на оценке изменения количества МЯ в двуядерных клетках по сравнению с контролем. МЯ - это небольшие ДНК-содержащие тельца, существующие в клетке отдельно от основного ядра (ядер) или связанные с ними хроматиновым мостом. Их возникновение связывают, как правило, с такими типами повреждения генома [39, 20, 41] как ацентрические фрагменты хромосом или целые хромосомы, отставшие в ана-телофазе митоза от веретена деления и не вошедшие в дочерние ядра. Кроме того, МЯ могут образовываться в фазе синтеза ДНК из ядерных почек, а также, видимо, во всех тех случаях, когда клетка избавляется от избытка ДНК (избыточная амплификация, реверсия культур клеток опухоли путем экскреции онкогенов). Таким образом, МЯ — это свидетельство количественных изменений ДНК в живой клетке [39, 20,41].
єо
Є1, Э, Є2
Клеточная гибель /* Апоптоз Некроз
л
о о
" Й
\ifcT
{ЧУ
Блокирование расхождения дочерних клеток
Норма
ІіР
\
Г» У
ш яишш
І7, Л
ЕДЬ
Поврежденный геном
Вк
)
да
1
мя
I
Ускоренная пролиферация
ЩШ:
нпм
Рис. 1 - Принципиальная схема пролиферации клеток в культуре с цитокинетическим блоком
Рис. 2 - Одно- и двуядерные клетки
1.6 Обзор исследований генотоксичности наноматериалов, проведенных на культуре крови человека в микроядерном тесте с ЦХВ
Данный фрагмент обзора составлен с использованием материалов работы [42]. Автор рассматривает только те исследования, текст которых полностью доступен. Статьи и публикации с конференций не учитывались. Результаты анализа публикаций показали, что:
1. Микроядерный тест с цитокинетическим блоком пригоден для оценки генотоксических эффектов НЧ;
2. Длительные сроки экспозиции (более 24 ч) более информативны, т.к. позволяют учесть поглощение НЧ клетками. Авторы [43] рекомендуют, чтобы во время воздействия НМ клетки прошли хотя бы один митоз, по крайней мере, для тех НМ, которые не могут преодолеть ядерной мембраны.
3. Стандартные цитогенетические маркеры (индексы пролиферации и репликации, уровень апоптоза, пролиферативный пул, доля двуядерных клеток и уровни микроядер в двуядерных клетках) используются большинством современных исследователей для оценки генотоксичности НМ и НЧ в микроядерном тесте.
Таблица 2 - Обзор исследований, использующих микроядерный тест in vitro для оценки генотоксичности НМ
Тип НЧ Размер НЧ Клеточная линия _ * Протокол воздействия Цитогенетические маркеры Результат Источник
А1203 28 ± 19 нм СНО-К1 24 ч; 0-10 мкг/мл Поглощение нейтрального красного, МТТ1 + (0.5 мкг/мл) [44]
Кобальт 80 нм (20-500 нм) ВАЬВ/ЗТЗ 24 ч; 1,5, 10 мкмоль Эффективность образования колоний + (1 мкмоль) [45]
Кобальт 246 нм Лимфоциты периферической крови человека 48 ч; 10,20, 40, 60, 80 мкмоль Индекс пролиферации + (40 мкмоль) [46]
СоСг 29.5 ±6.3 нм Фибробласты кожи человека 24 ч; 5, 50, 500 мкм3/клетку МТТ, ЛДГ Малые МЯ + (50 мкм3/клетку), большие МЯ + (5 мкм3/клетку) [47]
Ультра-малые суперпарамагнитные НЧ оксида железа, покрытые декстраном нет данных МСЬ-5 24 ч; 1, 10, 100 мкг/мл нет данных + (10 мкг/мл) [48]
Аморфный БЮ2 16 нм, 60 нм А549 40 ч; 10, 20, 40, 60 мкг/мл Индекс пролиферации - [43]
Аморфный БЮ2 104 нм А549 40 ч; 40, 60, 100,200, 300 мкг/мл Индекс пролиферации - [43]
Кристаллический БЮг 7.21 нм \VIL-2NS 6,24, 48 ч; 30, 60, 120 мкг/мл МТТ, анализ роста популяции,апоптоз, индекс пролиферации + (30 мкг/мл, 24 ч) + (60 мкг/мл, 6 и 48 Ч) [49]
Аё 6-20 нм 11251,1М11-90 60 ч; 100,200 мкг Уровень АТФ2, митохондриальная активность, апоптоз + (100 мкг/мл) [50]
ТЮ2 6.57 нм \VIL2-NS 6,24, 48 ч; 0, 26, 65, 130 мкг/мл МТТ, анализ роста популяции, апоптоз, индекс пролиферации + (26 мкг/мл; 48 ч) + (65 мкг/мл; 6, 24 и 48 ч) [51]
1 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
2 аденозинтрифосфат
Тип НЧ Размер НЧ Клеточная линия Протокол воздействия Цитогенетические маркеры Результат Источник
тю2 15 нм (2-30 нм) NIH-3T3 11 недель, 10 мкг/мл МТТ, исключение трипанового синего, апоптоз + (10 мкг/мл, 3 недели) [52]
тю2 <20 нм SHE фибробласты 12,24,48, 66, 72 ч; 0.5, 1, 5, 10 мкг/см2 Нет данных + (24 ч, 1 мкг/см2) [23]
Ті02 20 ± 7 нм CHO-Kl 24 ч; 0-10 мкг/мл Поглощение нейтрального красного, МТТ + (0.5 мкг/мл) [44]
ТЮ2 анатаз 10 нм, 200 нм, >200 нм BEAS-2B 24 ч; 10 мкг/мл МТТ, % двуядерных клеток [53]
ТЮ2 рутил 200 нм BEAS-2B 24 ч; 10 мкг/мл МТТ, % двуядерных клеток - [53]
Ті02 (75% рутил/25% анатаз) 24.4 ± 0.5 нм RTG-2 48 ч; 10-50 мкг/мл Индекс репликации - [54]
Ті02 (70-85% анатаз/30-15% рутил) 30 нм Лимфоциты 48 ч; 20,50, 100 мкг/мл Исключение трипанового синего + (50 мкг/мл) [55]
ТЮ2 (80% анатаз/20% рутил) 25 нм L-02 24 ч; 0.01,0.1, 1 мкг/мл Уровень АТФ, апоптоз - [56]
1.7 Заключение по главе 1
1. Все НЧ и НМ должны проходить проверку на наличие генотоксической активности, что требует построения иерархической системы скрининга соответствующих эффектов.
2. Единой методики и критериев оценки генетической безопасности НМ и НЧ на данный момент не существует.
3. Рекомендуемые в РФ и ЕС методы оценки генетической безопасности НМ и НЧ требуют высокой квалификации исследователя, дорогостоящих реагентов, значительных временных затрат и не позволяют выявить асимметрию распределения генетического материала при деления клетки - одну из наиболее серьезных предпосылок для опухолевой трансформации клеток.
4. Информативность микроядерного теста с ЦХВ при оценке генотоксических эффектов НЧ была неоднократно доказана в независимых исследованиях. Этот тест позволяет накапливать клетки, содержащие генетические повреждения, что выгодно отличает его от других методов цитогенетического анализа, обладает достоинствами как метафазного, так и ана-телофазного анализа и может выполняться в стандартных лабораторных условиях. Методика выполнения теста подразумевает образование полиядерных клеток, и при проведении расширенного варианта цитогенетического анализа позволяет оценивать анеуплоидию по частоте клеток с нечетным числом ядер.
5. Потенциально асимметрию распределения генетического материала можно выявить при сравнении площадей ядер в двуядерных клетках. Кроме того, морфометрические параметры клеточных ядер, связанные с их размером и формой, могут быть использованы в качестве биомаркеров канцерогенного риска. Морфометрические методы обычно не требуют высокой квалификации исследователя и пригодны для автоматизации.
6. Морфометрический анализ на материале цитогенетических препаратов, подготовленных к анализу в микроядерном тесте с цитохалазином В, может быть информативен и перспективен для скрининга эффектов нестабильности генома, индуцированных действием НМ и НЧ, в том числе - для оценки асимметрии распределения генетического материала.
Похожие диссертационные работы по специальности «Гигиена», 14.02.01 шифр ВАК
Цитогенетика лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) в условиях интродукции и антропогенного стресса2008 год, кандидат биологических наук Мазурова, Ирина Эдуардовна
Хромосомные аберрации, микроядра и апоптоз в лимфоцитах при радиационных воздействиях и других патологических состояниях2010 год, доктор биологических наук Колюбаева, Светлана Николаевна
Оценка генетической безопасности питьевых вод, полученных неконтактной электрохимической активацией2015 год, кандидат наук Зацепина, Ольга Валерьевна
Особенности цитогенетического и молекулярно-генетического статуса детей и подростков, проживающих на радиоактивно загрязненных территориях Беларуси2006 год, кандидат биологических наук Лебедева, Татьяна Викторовна
Экспериментальная оценка цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на клетки щитовидной железы2011 год, кандидат медицинских наук Алтаева, Александра Андреевна
Заключение диссертации по теме «Гигиена», Мошков, Николай Евгеньевич
5.2 Выводы
1. Создан новый подход в биологической морфометрии, базирующийся на сравнительном анализе площадей ядер двуядерных клеток, образовавшихся в культуре крови человека в результате деления единого материнского ядра в условиях блока цитокинеза. Разработан математический аппарат и экспериментально-методическая база для морфометрического анализа ядер в двуядерных клетках. Показано, что форма изображений ядер в двуядерных клетках с точностью не менее 9% (р=0.90) может быть аппроксимирована эллипсом. Установлено, что площадь этого эллипсоида связана с его объемом соотношением У~8 3/2.
2. Разработан морфометрический метод количественного анализа степени симметрии распределения генетического материала между дочерними ядрами на препаратах цельной крови человека, подготовленных для анализа в микроядерном тесте с цитокинетическим блоком. Разработаны правила интерпретации морфометрических данных и обоснован минимальный комплекс морфометрических параметров, включающий соотношение и сумму площадей ядер в двуядерных клетках.
3. Обоснованы критерии и алгоритм использования морфометрического анализа ядер в двуядерных клетках с целью скрининга эффектов нестабильности генома для последующего углубленного изучения биологической активности исследуемых веществ. Критериями выбора таких веществ являются статистически значимые различия с контролем и дозозависимые изменения арифметических средних отношения и суммы площадей ядер в двуядерных клетках. Для надежного заключения требуется анализ эффектов 5-6 доз изучаемого фактора.
4. Установлено, что стандартный мутаген МННГ, а также нано- и микрочастицы диоксида титана, нановолокна и ультрадисперсия гидроксида алюминия, частицы магнетита, покрытого силикатом, и микрочастицы латекса для фагоцитоза индуцируют в культивируемых лимфоцитах крови человека эффекты нестабильности генома. Различия генотоксических эффектов между нано- и микроформой веществ проявляются, преимущественно, в клетках, прошедших в культуре второй митоз. Различия в эффектах нестабильности генома при действии нано- и микроформ одних и тех же веществ на клетки разных доноров связаны с индивидуальными различиями в пролиферативной активности клеток в культуре.
5. Показано, что изменения уровней нестабильности генома в культуре лимфоцитов крови человека сопровождаются соответствующими изменениями суммы и отношения площадей ядер в двуядерных клетках: в зависимости от дозы сумма площадей ядер устойчиво и высоко достоверно коррелирует с пролиферативной и митотической активностью клеток, а изменение отношения площадей ядер - с частотами клеток с повреждениями, прошедших за время культивирования более одного митотического цикла.
Глава 5. Заключение и выводы 5.1 Заключение
Обобщая результаты, следует заключить, что разработанные морфометрические индексы являются информативными, подходящими для оценки генотоксической активности НМ и НЧ и могут быть рекомендованы для их предварительного генетико-токсикологического скрининга. Изучение корреляционных взаимосвязей между цитогенетическими и морфометрическими индексами показывает, что существует принципиальная возможность прогнозирования эффекта анеуплоидии на основании данных о симметрии ядер двуядерных лимфоцитов. Кроме того, на основании данных об изменении размеров ядер может быть дан прогноз пролиферативной активности. Однако характер и знак корреляционных связей зависит как от состояния донора, так и от типа вещества, и данный феномен требует дополнительныхисследований. Потому дать однозначную интерпретацию морфометрическим индексам с точки зрения прогноза цитогенетических показателей на текущий момент не представляется возможным. Тем не менее, можно говорить о возможности качественного прогноза.
По результатам исследования разработан и апробирован экспериментальный метод, пригодный для оперативного выявления генотоксической активности веществ, в том числе - НМ и НЧ, в основе которого лежат количественные критерии. Метод не требует высокой квалификации исследователя и пригоден для автоматизации. Получен патент РФ №2467329 «Способ экспресс-оценки степени потенциальной генотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплодии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях цитокинетического блока», Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Приоритет изобретения:
03 марта 2011г., Зарегистрировано в Гос.реестре (публикация) 20 ноября 2012г. Срок действия - до 03 марта 2031г.
Проведено параллельное изучение генотоксической активности НМ и НЧ (магнетит, покрытый силикатом (Fe304/Si02), диоксид титана, нановолокнаи ультрадисперсная форма гидроксида алюминия) разработанным методом и методом микроядерного теста с расширенным протоколом. В результате выявлено, что: 1) все изученные вещества проявляли генотоксическую активность, но степень и характер проявления были различны для разных веществ и доноров; 2) для всех веществ характерно проявление генотоксической активности на минимальных дозах воздействия; 3) результаты цитогенетического и морфометрического анализа качественно совпадают и между ними существуют сильные повторяющиеся статистически значимые корреляционные взаимосвязи.
Полученные результаты позволили создать следующий алгоритм метода морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, согласованный с международными подходами в системах OECD и GLP:
1. Постановка культур, подготовка цитогенетических препаратов (1 контроль и 5 концентраций для каждого исследуемого вещества);
2. Фотографирование по 100 двуядерных лимфоцитов с отдельно лежащими ядрами без видимых повреждений для контроля и каждой концентрации вещества;
3. Измерение площадей ядер (Sli, S2i) каждого лимфоцита в ADOBE Photoshop (оконтуривание ядер и автоматический подсчет количества пикселей внутри контуров)
4. Расчет отношения (Sli/S2i) и суммы площадей большего (1) и меньшего (2) ядра ([SS]i = Sli+S2i) для каждого лимфоцита, формирование выборок для контроля и каждой из доз
5. Расчет морфометрических индексов для полученных выборок (арифметическое среднее S1/S2, S1+S2)
6. Статистическое сравнение выборок Sli/S2i и [£S]i, полученных для контроля и каждой из исследуемых доз (метод Краскела-Уоллеса). Анализ зависимости симметрии и размеров ядер от дозы вещества. 7. При обнаружении дозовых зависимостей и/или статистически значимых различий с контролем изучаемое вещество следует направить на углубленное изучение нестабильности генома. Анализ данных, полученных в процессе работы, позволил нам построить сравнительную таблицу, характеризующую достоинства и недостатки примененных в ходе исследования методов (Таблица 56).
Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мошков, Николай Евгеньевич, 2013 год
Список литературы
1. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Оценка безопасности наноматериалов: Методические рекомендации. - Москва : ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007
2. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания МУ 1.2.2520-09. - Москва : [б.н.], 05 июнь 2009
3. Luther Wolfgang Industrial applications of nanomaterial - chances and risk. Technology analysis. - Dusseldorf: Future Technologies Division of VDI Technologiezentrum GmbH, August 2004.
4. The Royal Society & The Royal Academy of Engineering Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties [Report]. - Cardiff: Nanoscience and nanotechnologies, 2004.
5. Tran C. L., Donaldson K., Stones V. [et al.] A scoping study to identify hazard data needs for addressing the risks presented by nanoparticles and nanotubes [Report]. - Edinburgh : Institute of Occupational Medicine, 2005.
6. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials. [Report]. - [s.l.]: OECD Environment, Health and Safety Publications. Series of Safety of Manufactured Nanomaterials no. 15, 2009.
7. Agence Internationale de l'Energie Atomique Biological dosimetry: chromosome aberration analysis for dose assessment [Journal] / Technical report series. - 1984. - p. 260.
8. Doloy M. Т., Malarbet J. L., Guedeney G. [et al.] Use of unstable chromosome aberration for biological dosimetry after the first post irradiation mitosis [Journal] / Radiat. Res. 125. - 1991. - pp. 141-151.
9. Ludwikow G., Xiao Yun, Hoebe R. A. [et al.] Induction of chromosome aberrations in unirradiated chromatin after partial irradiation of a cell nucleus [Journal] / International Journal of Radiation Biology, 1362-3095, Volume 78, Issue 4. - 2002. - pp. 239 - 247.
10. Fenech M. and Morley A. A. Measurement of micronuclei in human lymphocytes [Journal]. - 1985. - Vol. 148. - pp. 29-36.
11. Yager J. W., Sorsa M. and Selvin S. Micronuclei in Cytokinesis-Blocked Lymphocytes As an Index of Occupational Exposure to Alkylating Cytostatic Drugs [Journal] / IARC Scientific Publications. - Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1988. - 89. - pp. 213-216.
12. Pascoe S. A. and Stemp G. A modified method and staining technique for the in vitro micronucleus test in human lymphocytes using cytochalasin В [Journal] / Mutation Research. - 1990. - Vol. 234. - pp. 253-255.
13. Singh N. P., McCoy M. Т., Tice R. R. [и др.] A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells [Журнал] / Experimental Cell Research. - 1988 - 175. - стр. 184-191.
14. McKelvey-Martin V. J., Green M. H., Schmezer P. [и др.] The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): a European review [Журнал]. - July 1993 - 1 : T. 288. - стр. 47-63.
15. Fairbairn D. W., Olive P. L. и O'Neill K. L. The comet assay: a comprehensive review [Журнал] / Mutation Research. - February 1995 - 1 : T. 339. - стр. 37-59.
16. Wolfe Pamela, Murphy James, McGinley John [et al.] Using Nuclear Morphometry to Discriminate the Tumorigenic Potential of Cells: A Comparison of Statistical Methods [Journal] / Cancer Epidemiology Biomarkers. - June 2004. - 13 : Vol. 6. - pp. 976-988.
17. Zink D., Fischer A. H. and Nickerson J. A. Nuclear structure in cancer cells [Journal] / Nature reviews. - September 2004. - Vol. 4. - pp. 677-687.
18. He Yin-Cheng, Peng Wei, Qiao Jian-Guo [et al.] Relationship between nuclear morphometry, DNA content and resectability of pancreatic cancer [Journal] / World Journal of Gastroenterology. - 2003. - 9 : Vol. 8. - pp. 1863-1865.
19. Yurov Y. В., Vorsanova S. G., Iourov I. Y. [и др.] Unexplained autism is frequently associated with low-level mosaic aneuploidy [Журнал] / Journal of Medical Genetics. - [б.м.] : British Medical Association, 2007 - 8 : T. 44. - стр. 521-525.
20. Fenech M. The in vitro micronuclei test technique [Journal] / Mut. Res., vol. 455.-2000.-pp. 81-95.
21. Korchev Yuri E., Gorelik Julia, Lab Max J. [et al.] Cell Volume Measurement Using Scanning Ion Conductance Microscopy [Article] / Biophysical Journal. - January 2000. - Vol. 78. - pp. 451-457.
22. Simeonov Radostin Nuclear morphometry in relation to tumor grade in canine spontaneous cutaneous squamous cell carcinomas [Журнал] / Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. - 2009 - 33 : T. 5. - стр. 439-442.
23. Rahman Qamar, Dopp Elke, Pemsel Heidemarie [et al.] Evidence That Ultrafine Titanium Dioxide Induces Micronuclei and Apoptosis in Syrian Hamster Embryo Fibroblasts [Journal] / Environmental Health Perspectives, volume 110, number 8, August. - 2002. - pp. 797-800.
24. Barillet S, Simon-Deckers A, Herlin-Boime N [et al.] Toxicological consequences of ТЮ2, SiC nanoparticles and multi-walled carbon nanotubes exposure in several mammalian cell types: an in vitro study [Journal] / Journal of Nanoparticle Research, 12(1): January. - 2010. - pp. 61-73.
25. Weisheng Lina, Staytona Isaac, Huangb Yue-wern [et al.] Cytotoxicity and cell membrane depolarization induced by aluminum oxide nanoparticles in human lung epithelial cells A549 [Journal] / Toxicological & Environmental Chemistry, Vol. 90, Nos. 5-6, September-December. - 2008. - pp. 983-996.
26. Hussain S. M., Hess K. L., Gearhart J. M. [et al.] In vitro toxicity of nanoparticles in BRL ЗА rat liver cells [Journal] / Toxicology in vitro, 19(7), Oct. -2005.-pp. 975-983.
27. Pisanic I. I., Thomas R., Blackwell Jennifer, D. [et al.] Nanotoxicity of iron oxide nanoparticle internalization in growing neurons [Journal] / Biomaterials 28. -2007.-pp. 2572-2581.
28. Waters K.M., Masiello L.M., Zangar R.C. [et al.] Macrophage responses to silica nanoparticles are highly conserved across particle sizes [Journal] / Toxicol Sciences, 107(2), February. - 2009. - pp. 553-569.
29. Choi S.J., Oh J.M. and Choy J.H. Toxicological effects of inorganic nanoparticles on human lung cancer A549 cells [Journal] / Journal of inorganic biochemistry, Mar; 103(3). - 2009. - pp. 463-471.
30. Пикалова JI. В. Применение цитогенетических методов исследования хромосом в радиологии [Журнал] / Молекулярная биология. - июнь 2007 - Т. 9.
31. Ames Bruce N., Lee Frank D. and Durston E. William An Improved Bacterial Test System for the Detection and Classification of Mutagens and Carcinogens [Journal] / PNAS. - 1973. - 3 : Vol. 70. - pp. 782-786.
32. Comet assay interest group [Online]. - 2011. - http://cometassay.com.
33. Santos S. J., Singh N. P. и Natarajan A. T. Fluorescence in situ hybridization with comets [Журнал] / Experimental cells research. - 1997 - 232. - стр. 407-411.
34. Agerholm I. E., Hnida C., Cruger D. G. [и др.] Nuclei size in relation to nuclear status and aneuploidy rate for 13 chromosomes in donated four cells embryos [Журнал] / Assist Reprod Genet. - March 2008 - (2-3): T. 25. - стр. 95102.
35. Adams Niall M. и Freemont Paul S. Advances in Nuclear Architecture [Книга]. - [б.м.]: Springer Science+Business Media B.V., 2011.
36. Болгова JI. С., Алексеенко О. И. и Туганова Т. Н. Цитологические и морфометрические особенности лимфоидных клеток вилочковой железы в норме и при лимфоидной тимоме [Журнал] / Онкология. - 2002 - 4 : Т. 4. - стр. 252-255.
37. Radwan Mamdouh М., Amer Kawther A., Mokhtar Nadia M. [et al.]
Nuclear Morphometry in Ductal Breast Carcinoma with Correlation to Cell
Proliferative Activity and Prognosis [Journal] / Journal of the Egyptian National Cancer Institute. - September 2003. - 3 : Vol. 15. - pp. 169-182.
38. Ozer E., Yorukoglu K., Sagol O. [et al.] Prognostic significance of nuclear morphometry in renal cell carcinoma [Journal] / BJU International. - 2002. - 90. -pp. 22-25.
39. Ингель Ф. И. Перспективы использования микроядрного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока [Журнал] / Экологическая генетика. - 2006 - 3 : Т. IV. - стр. 7-19.
40. Ингель Ф. И. Перспективы использования микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока. Часть 2. Факторы среды и индивидуальные особенности в системе нестабильности генома человека. Дополнительные возможности теста. [Журнал] / Экологическая генетика IV(4). - 2006 - стр. 38-53.
41. Fenech М., Chang W.P. and Kirsch-Volders М. HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures [Journal] / Mut. Res., vol. 534, №1. -2003.-pp. 65-75.
42. Gonzalez L., Sanderson B.J. S. and Kirsch-Volders M. Adaptations of the in vitro MN assay for the genotoxicity assessment of nanomaterials [Journal] / Mutagenesis. -2011. - 1 : Vol. 26. - pp. 185-191.
43. Gonzalez L., Thomassen L. and Plas G. Exploring the aneugenic and clastogenic potential in the nanosize range: A549 human lung carcinoma cells and amorphous monodisperse silica nanoparticles as models. [Journal] / Nanotoxicology. - 2010. - 4. - pp. 382-395.
44. Di Virgilio A. L., Reigosa M., Arnal P. M. [et al.] Comparative study of the cytotoxic and genotoxic effects of titanium oxide and aluminium oxide nanoparticles in Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells [Journal] / Journal of hazardous materials. - 2010. - 177. - pp. 711-718.
45. Ponti J., Sabbioni E., Munaro B. [et al.] Genotoxicity and morphological transformation induced by cobalt nanoparticles and cobalt chloride: an in vitro study in Balb/3T3 mouse fibroblasts. [Journal] / Mutagenesis. - 2009. - 24. - pp. 439-445.
46. Colognato R., Bonelli A., Ponti J. [et al.] Comparative genotoxicity of cobalt nanoparticles and ions on human peripheral leukocytes in vitro. [Journal] / Mutagenesis. - 2008. - 23. - pp. 377-382.
47. Papageorgiou I., Brown C., Schins R. [et al.] The effect of nano- and micron-sized particles of cobalt-chromium alloy on human fibroblasts in vitro. [Journal] / Biomaterials. - 2007. - 28. - pp. 2946-2958.
48. Doak S. H., Griffiths S. M., Manshian B. [et al.] Confounding experimental considerations in nanogenotoxicology. [Journal] / Mutagenesis. - 2009. - 24. - pp. 285-293.
49. Wang J. J., Sanderson B. J. and Wang H. Cytotoxicity and genotoxicity of ultrafine crystalline Si02 particulate in cultured human lymphoblastoid cells [Journal] / Environmental and molecular mutagenesis. - 2007. - 48. - pp. 151-157.
50. AshaRani P. V., Low Kah Mun G., Handle M. P. [et al.] Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells [Journal] / ACS Nano. - 2009. -3.-pp. 279-290.
51. Wang J. J., Sanderson B. J. and Wang H. Cyto- and genotoxicity of ultrafine Ti02 particles in cultured human lymphoblastoid cells [Journal] / Mutation Research. - 2007. - 628. - pp. 99-106.
52. Huang S., Chueh P. J., Lin Y. W. [et al.] Disturbed mitotic progression and genome segregation are involved in cell transformation mediated by nano-Ti02 long-term exposure. [Journal] / Toxicology and applied pharmacology. - 2009. -241.-pp. 182-194.
53. Gurr J. R., Wang A. S., Chen C. H. [et al.] Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. [Journal] / Toxicology. - 2005. - 213. - pp. 66-73.
54. Vevers W. F. and Jha A. N. Genotoxic and cytotoxic potential of titanium dioxide (ТЮ2) nanoparticles on fish cells in vitro. [Journal] / Ecotoxicology. -2008.- 17.-pp. 410-420.
55. Kang S. J., Ют В. M., Lee Y. J. [и др.] Titanium dioxide nanoparticles trigger p53-mediated damage response in peripheral blood lymphocytes. [Журнал] / Environmental and molecular mutagenesis. - 2008 - 49. - стр. 399-405.
56. Shi Y., Zhang J. H., Jiang M. [et al.] Synergistic genotoxicity caused by low concentration of titanium dioxide nanoparticles and p, p'-DDT in human hepatocytes. [Journal] / Environmental and molecular mutagenesis. - 2010. - 51. -pp. 192-204.
57. Роскин Г. И. и Левинсон JI. Б. Микроскопическая техника [Книга] / ред. Роскин Г. И. - Москва : Советская наука, 1957. - третье издание.
58. Whitehead R. A., Chagnon S., Groman Е. V. [et al.] [Patent] : 4554088. -U.S., 1985.
59. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. [Книга]. - Москва : МедиаСфера, 2002.
60. Орлов А. И. Прикладная статистика [Книга]. - Москва : "Экзамен", 2004.
61. Aillon К. L., Xie Y., El-Gendy N. [et al.] Effects of nanomaterial physicochemical properties on in vivo toxicity [Journal] / Advanced Drug Delivery Reviews. - 2009. - 6 : Vol. 61. - pp. 457-466.
62. Buzea C., Pacheco 1.1. и Robbie K. Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity [Журнал] / Biointerphases. - 2007 - 4 : T. 2.
63. Howard V. Statement of Evidence: Particulate Emissions and Health (An Bord Plenala, on Proposed Ringaskiddy Waste-to-Energy Facility). [Отчет]. - 2009, Retrieved 2011-04-26.
64. De Stefano D., Carnuccio R. и Maiuri M.C. Nanomaterials Toxicity and Cell Death Modalities [Журнал] / Journal of Drug Delivery. - 2012 - T. 2012.
65. Li N., Sioutas C., Cho А. [и др.] Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage [Журнал] / Environ Health Perspect. -2003 -T. 111. - стр. 455-460.
66. Cui Y., Gong X., Duan Y. [и др.] Hepatocyte apoptosis and its molecular mechanisms in mice caused by titanium dioxide nanoparticles [Журнал] / J Hazard Mater. - 15 Nov 2010 - 1-3 : T. 183. - стр. 874-880.
67. Mahmoudi M., Saeedi-Eslami S. N., Shokrgozar M. A. [et al.] Cell "vision": complementary factor of protein corona in nanotoxicology [Journal] / Nanoscale. -Sep 7, 2012. - 17 : Vol. 4. - pp. 5461-5468.
68. Sharma M. Understanding the mechanism of toxicity of carbon nanoparticles in humans in the new millennium: A systemic review [Журнал] / Indian J Occup Environ Med.. - Jan 2010 - 1 : T. 14. - стр. 3-5.
69. . Pollution particles lead to higher heart attack risk [Online]. - Feb 9, 2010. -http://www.bloomberg.com/apps/news study.
70. Hoet P. H., Bruske-Hohlfeld I. and Salata О. V. Nanoparticles-known and unknown health risks [Journal] / J Nanobiotechnol.. - 2004. - 2 : Vol. 12.
71. Красовский Г. H., Рахманин Ю. А. и Егорова Н. А. Экстраполяция токсикологических данных с животных на человека [Книга]. - Москва: Медицина, 2009. - стр. 208.
72. Жолдакова 3. И. и Харчевникова Н. В. Механизмы процессов биоактивации чужеродных химических веществ под действием ферментных систем организма [Журнал] / Вестник Российской академии медицинских наук. - 2002 - 8. - стр. 44-49.
73. Жолдакова 3. И. и Харчевникова Н. В. Прогноз опасности веществ в рамках зависимостей структура-активность с учетом биотрансформации [Журнал] / Гигиена и санитария. - 2000 - 1. - стр. 26-29.
74. Abbott Chalew Т. Е. и Schwab К. J. Toxicity of commercially available engineered nanoparticles to Caco-2 and SW480 human intestinal epithelial cells [Журнал] / Cell Biol Toxicol. - 2013
75. Liu С. Y., Tsai Т. H., Huang Y. С. [et al.] Differential immunomodulating effects of pegylated liposomal doxorubicin nanoparticles on human macrophages [Journal] / JNanosci Nanotechnol. - 2012. - 10 : Vol. 12. - pp. 7739-7746.
76. Kirsch-Volders M., Decordier I., Elhajouji А. [и др.] In vitro genotoxicity testing using the micronucleus assay in cell lines, human lymphocytes and 3D human skin models [Журнал] / Mutagenesis. - 2011 - 1 : T. 26. - стр. 177-184.
77. ECVAM. (2006) Statement by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the Scientific Validity of the In vitro Micronucleus Test as an Alternative to the In vitro Chromosome Aberration Assay for Genotoxicity Testing. ESAC 25th meeting [В Интернете]. - 16-17 November 2006 - 28 September 2010 - http://ecvam.jrc.it/index.htm.
78. ESAC. (2006) ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review. Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test. Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. ECVAM, Ispra, Italy [В Интернете]. - 1617 November 2006 - 28 September 2010 - http://ecvam.jrc.it/index.htm . 79.0ECD (draft). In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test (MNvit). OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 487. OECD, Paris. [В Интернете]. - 28 September 2010 - http://www.oecd.org/env/testguidelines.
80. МУ 1.2.2743-10. «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в водных объектах» Методические указания. Утверждены руководителем Роспотребнадзора, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.ОНИЩЕНКО. - 17 октября 2011
81.MP 1.2.2639-10.1.2. «Использование методов количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии». Методические рекомендации Утверждены руководителем Роспотребнадзора, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.ОНИЩЕНКО. - 24 мая 2010
82.МР 1.2.0018-11. 1.2. «Порядок отбора проб и методы определения содержания наночастиц в составе продукции бытовой химии, дезинфекционных и парфюмерно-косметических средств». Методические рекомендации. Утверждены Г.Г. Онищенко. - 2 марта 2011
83. MP 1.2. 2640-10 «Методы отбора проб, выявления и определения содержания наночастиц и наноматериалов в составе сельскохозяйственной, пищевой продукции и упаковочных материалов». Методические рекомендации. Утверждены Г.Г. Онищенко. - 2 марта 2011
84.МР 1.2.0016-10 «Методика классифицирования нанотехнологий и продукции наноиндустрии по степени их потенциальной опасности» Методические рекомендации. Утверждены Г.Г.Онищенко и введены в действие с 27.12.2010.
85.МУ 1.2. 2635-10. «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» Методические указания, Москва 2010 Утверждены Г.Г.Онищенко 2 марта 2011 года.
86.МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов». Методические указания. Утверждены Г.Г.Онищенко 5 июня
2009 года.
87.МУ 1.2.2634-10. 1.2. «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза». Методические указания. Утверждены Г.Г.Онищенко 24 мая 2010 года.
88.МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo", Утверждены Г.Г.Онищенко 29 декабря 2009 года.
89.МР 1.2.0042-11 «Контроль наноматериалов, применяемых в сельском хозяйстве методические рекомендации Утверждены Г.Г.Онищенко 17 октября 2011 года.
90.МР. 1.2.2522-09. «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека». Методические рекомендации. Утверждены Г.Г.Онищенко 2 июля 2009 года.
91.МУ 1.2.2637-10. «Порядок и методы проведения контроля миграции наночастиц из упаковочных материалов». Утверждены Г.Г.Онищенко 24 мая
2010 года.
92.МР 1.2.0054-11. «Порядок и методы оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на токсическое действие химических веществ» Методические рекомендации, Москва 2011. Утверждены Г.Г.Онищенко 29 декабря 2012 года.
93. Курляндский Б. А. О нанотехнологии и связанных с нею токсикологических проблемах [Журнал] / Токсикологический вестник. -2007 - 6. - стр. 2-3.
94. Slamenova D., Gabelova А. и Ruzekova L. Detection of MNNG-induced DNA lesions in mammalian cells; validation of comet assay against DNA unwinding technique, alkaline elution of DNA and chromosomal aberrations [Журнал] / Mutation research. - 1 May 1997 - 3 : T. 383. - стр. 243-252.
95. Манских В. H. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза [Журнал] / Бюллетень сибирской медицины. - 2004 - 1.
96. Тронов В. А., Крамаренко И. И., Смирнова Т. Д. [и др.] Сравнение гено-и цитотоксического эффектов метилнитрозомочевины на линиях клеток, профицитных и дефицитных по коррекционной репарации ДНК (MMR) [Журнал] / Цитология. - 2006 - 1 : Т. 48.
97. Spitkovsky D. М., Veiko N. N., Ermakov А. V. [et at.] Structural and functional change induced by exposure to X-ray adaptive doses in human lymphocytes both normal and defective by DNA double strand break reparation. [Book Section] / The effects of low dose radiation / book auth. Burlakova E. and Naidich V.. - Utrecht-Boston : [s.n.], 2004.
98. Korkina L. G., Durnev A. D., Suslova Т. B. [et al.] Oxygen Radical -Mediated Mutagenic Effect of Asbestos on Human Lymphocytes: Suppression by Oxygen Radical Scavengers [Journal] / Mutation Research. - 1992. - 265. - pp. 245253.
99. Хамидулина X. X. и Давыдова Ю. О. Международные подходы к оценке токсичности и опасности наночастиц и наноматериалов [Журнал] / Токсилогический вестник. - 2011 - http://www^ohv.ru/security/20120210/.
100. Рахманин Ю. А. и Сычева JI. П. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях [Книга]. - Москва : Гениус, 2007.
101. Moshkov N.E., Ingel F.I., Ahaltseva L.V. [et al.] Evaluation of safety of nanoparticles and water with modified structure in cytogenetic studies [Journal] / Conference of International Society for Environmental Epidemiology (ISEE 2009), "Environmental, Food and Global Health", Electronic abstract book. - Dublin: [s.n.], august 25-29, 2009. - p. 147.
102. Moshkov Nikolay E Micronuclei test and morphometry of cellular nuclei upon relative evaluation of cytogenetic activity of aluminum hydroxide nanofibers [Journal] / EEMS conference. - 2010.
103. Ингель Ф. И., Юрченко В. В. и Гуськов А. С. Показатели пролиферативной активности и их связь с генетическими повреждениями лимфоцитов крови при культивировании в условиях цитокинетического блока [Статья] / Вестник РАМН. - 2006 - 4. - стр. 41-46.
104. Стехин А. А. и Яковлева Г. В. Структурированная вода. Нелинейные эффекты. [Книга]. - Москва : ЛКИ, 2008.
105. Тейлор Дж. Введение в теорию ошибок [Книга]. - Москва : "Мир", 1985.
106. Кендалл М. и Стьюарт А. Теория распределений [Книга] / ред. Колмогоров А. Н.. - Москва: "Наука", Главная редакция физико-математической литературы, 1966.
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА
КОМИССИЯ ПО КАНЦЕРОГЕННЫМ ФАКТОРАМ
115478, Москва, Каширское шоссе, 24 Тел.(499)323-50-10, 323-59-55, 324-16-64, 324-22-54. Факс (499) 323-50-10, 323-59-55
« 6 » M<Z¿£/a 20 № г.
№ A t
На № от
« »
Расширенное бюро Комиссии по канцерогенным факторам рассмотрело материалы исследования Н.Е.Мошкова, посвященного разработке системы морфометричеекого скрининга эффектов нестабильности генома на клетках крови человека, культивированных в условиях цитокинетического блока, и пришла к следующим выводам: работа представляет большой теоретический и практический интерес. Предложенный автором новый принцип и методы морфометричеекого анализа целесообразно использовать при исследовании канцерогенеза.
Предложенный автором метод использован в лаборатории природных канцерогенов Института канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН при изучении нестабильности генома, индуцированной действием асбеста, что позволило существенно расширить имеющиеся представления о механизмах канцерогенеза.
Комиссия считает целесообразным рекомендовать автору продолжить исследования в направлении автоматизации метода.
Заместитель председателя
Комиссии, д.м.н., профессор LÍA Л.Н.Пылев
L. Г
■ & if* «} <3
Г I- r' 1
^ J:.l .rl
f >%»»""Д
I, T'iL - vV, -.""¿-Г W"-*
-•у} & 'i »
4*1
Я p /s I5 jg gi's
i¡ ч ! i ! ! í> 1 1 < I ¡ ¡ '
№ 2467329
г í СПОСОБ ЖСПРЕСС-ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ
J ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
i.' ВЕЩЕСТВ И ФАКТОРОВ СРЕДЫ ПО НАЛИЧИЮ
ÍS-I АНЕУПЛОИДИИ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ
„í КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ОБРАЗОВАВШИХСЯ В РЕЗУЛЬТАТЕ
л' КУЛЬТИВИРОНАНИЯВ УСЛОВИЯХ ЦИТОКИНЕТИЧЕСКОГО
* ! БЛОКА
у i
ПатшпооЛ [а ып пь( ш) Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экологии че ювена и гигиены окружающей среды им. 4.Н. Сысина"Министерства 1дравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)
Aínop(bi) см. на обороте
Заявка X» 2011108037 Приоритет ичобретсния 03 марта 20111. Зариш грирована в Fou.upt гш шито растрс »ioópntmm Российской Ф( ириши 20ноябри2012г. Срак кйс гнпя патента исгс к к т 03 марта 2031 г.
Руководитель Ф< d<¡шьпои < и/ж бы по иитепгктца :ыти cofít wet иноши
h II Симонов
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
О
Ф см со
ь. ф
*
(Ы
Э СС
(19) Ц||<и>
(51) МПК
вот 33/49 (200601)
,(13)
С1
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
С2) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21X22) Заявка 2011108037/15, 03 03 20И
(24) Дата начала отсчета срока действия патента 03 03 2011
Приоритет(ы)
(22) Дата потачи заявки 03 03 2011
(45) Опубликовано 20112012Бюл №32
(56) Список документов цитированных я отчете о
поиске Ни 2223494 С1,10 02 2004 1Ш 2054176 С1, 10 02 1996 \УО 2005121365 А2,22 12 2005 ИНГЕЛЬ Ф.И Перспективы использования михроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинегичесхого блока // Экологическая генетика. 2006, №3, т IV, с 7-19 АВТАНДИЛОВ Г Г Медицинская морфометрия Руководство //М Медицина, (см прод)
Адрес для переписки
105425, Москва, Сиреневый б-р, 12, корп 1, кв 50, Т Г Горячкиной
(72) Авторы)
Рахмаиин Юрий Анатольевич (1Ш) Мошков Николай Евгеньевич (яи) Ингель Фаина Исааковна (1Ш) Юрцева Надежда Александровна (1Ш) Ахальцева Людмила Вячеславовна (1Ш) Кривцов Георгий Георгиевич (КЦ) Юрченко Валентина Васильевна фи)
(73) Патент ообладатель(и)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им АН Сысина" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ИЦ)
(54) СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ И ФАКТОРОВ СРЕДЫ ПО НАЛИЧИЮ АНЕУПЛОИДИИ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ОБРАЗОВАВШИХСЯ В РЕЗУЛЬТАТЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В УСЛОВИЯХ ЦИТОКИНЕТИЧЕСКОГО БЛОКА
(57) Реферат
Изобретение относится к медицине, а именно к цитогенстике и может быть испо іьзовано дтя экспресс оценки степени потенциальной геногоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуптоидин в шмфоцитах периферической крови человека образовавшихся в результате культивирования в условиях
щпокинетическою блока Дія эгою культивируют лимфоциты крови человека в условиях цитокиняического бтока в присутствии изучаемою вещества Фиксируют клетки Приготавливают и окрашивают цитогенстическис препараты Далее после окраски для каждого препарата при помощи
светового микроскопа со встроенной цифровой камерой при увеличении 10x40 проводят раистрацию изображений 100 клеток содержащих два огдетьно лежащих ядра и не имеющих видимых в тч генетических повреждений По этим изображениям вычисляю г сумму и ошошспис площадей ядер в каждой такой к ютке Па основании полученных данных вычисляются метианы верхний и нижний квартили их отношение и разность Проводят статистическое сравнение препаратов по этим параметрам В стучас обнаружения значимых различий при уровне значимости р£005 а также при обнаружении дозовой зависимости делают вывод о способности изучаемого вещества
Я
с
го
о>
и ю (0
О
Стр 1
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.