Хромосомные аберрации, микроядра и апоптоз в лимфоцитах при радиационных воздействиях и других патологических состояниях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.01, доктор биологических наук Колюбаева, Светлана Николаевна

• Колюбаева, Светлана Николаевна
• доктор биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации доктор биологических наук Колюбаева, Светлана Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПОВРЕЖДЕНИЯХ В ГЕНОМЕ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ (обзор литературы)

1.1. Современные методы определения поврежденности генома лимфоцитов

1.1.1. Трансформированный лимфоцит - модель для изучения основных законов клеточного активирования

1.1.2. Повреждения, выявляемые с помощью метода сестринских хроматидных обменов

1.1.3. Метод дифференциально окрашенных хромосом

1.1.4. Флуоресцентная in situ гибридизация

1.2. Исследования повреждений в геноме лимфоцитов с помощью микроядер

1.2.1. Совершенствование метода

1.2.2. Исследование радиационных воздействий с помощью микроядерного анализа

1.2.3. Чувствительность микроядерного теста

1.3. Соотношение диагностической значимости для определения повреждений в геноме лимфоцитов при облучении с помощью анализа микроядер и хромосомных аберраций 34.

1.4. Соотношение между микроядрами и апоптозом

1.4.1. Апоптоз

1.4.2. Клеточный цикл и гибель клетки

1.4.3. Клеточный цикл и апоптоз в дифференцированных клетках

1.4.4. Индукция клеточной гибели, вызванная радиацией

1.4.5. Гены-супрессоры роста опухоли и ответ на радиацию

1.4.6. Апоптотический механизм формирования микроядер

1.5. Нестабильность генома и рак

1.6. Исследование повреждений генома при злокачественных лимфомах

1.6.1. Рекуррентные хромосомные повреждения

1.6.2. Активация генов при лимфомагенезе

1.6.3. Цитогенетические методы в дифференциальной диагностике различных видов лимфом

1.6.4. Прогностическая значимость цитогенетических повреждений при лимфомах

1.6.5. Эволюция опухолевых клонов при гемобластозах

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ И КЛИНИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЙ

2.1. Характеристика доноров и обследованных пациентов

2.2. Характеристика использованных животных

2.3. Методы культивирования лимфоцитов периферической крови и получения препаратов для цитогенетического анализа

2.3.1. Построение дозовой зависимости индукции МЯ в облученных in vitro ФГА-стимулированных лимфоцитах периферической крови доноров без использования цитокалазина В

2.3.2. Сопоставление числа клеток с МЯ и ХА на параллельных культурах донорской крови при облучении in vitro

2.3.3. Построение дозовой зависимости индуцированных облучением МЯ в ФГА-стимулированных лимфоцитах периферической крови с использованием цитокалазина В (двуядерных)

2.3.4. Построение дозовой зависимости числа хромосомных аберраций в облученных in vitro лимфоцитах периферической крови доноров

2.3.5. Построение дозовых зависимостей для индукции клеток с аномальными ядрами в лимфоцитах периферической крови

2.4. Получение препаратов для анализа апоптотических клеток из крови крыс

2.5. Определение уровня микроядер и хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у доноров и пациентов с патологией щитовидной железы

2.6. Приготовление препаратов для электронной микроскопии

2.7. Метод флуорресцентной in situ гибридизации

2.8. Приготовление препаратов для анализа хромосомных аберраций и микроядер у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС и у их детей, а также у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, участников ликвидации химического оружия, пациентов со злокачественными лимфомами

2.9. Идентификация цитогенетических повреждений

2.10. Методы статистической обработки

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование действия облучения на индукцию микроядер и хромосомных аберраций в ФГА-стимулированных лимфоцитах периферической крови

3.1.1. Исследование действия облучения на индукцию микроядер в культуре лимфоцитов без цитокалазина В

3.1.2. Исследование действия облучения на индукцию микроядер в культуре лимфоцитов с использованием цитокалазина В

3.1.3. Исследование влияния облучения на индукцию хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови

3.2. Исследование действия радиации на индукцию апоптотических клеток крови человека in vitro и крови крыс in vivo

3.3. Исследование повреждений в геноме лимфоцитов человека и обезьян методом флуоресцентной in situ гибридизации после облучения in vitro и in vivo

3.4. Исследование повреждений в геноме лимфоцитов у участников ликвидации аварии на ЧАЭС

3.5. Исследование хромосомных повреждений у детей, рожденных у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС

3.6. Влияние облучения на уровень хромосомных аберраций и микроядер у больных с нарушением тиреоидного гомеостата

3.7. Исследования повреждений в геноме лимфоцитов у больных с хроническим вирусным гепатитом С

3.8. Исследование повреждений в геноме лимфоцитов лиц, участвующих в ликвидации химического оружия

3.9. Исследование цитогенетических повреждений в периферической крови и костном мозге больных с различными формами неходжкинских лимфом

3.9.1. Цитогенетические исследования при неходжкинских лимфомах

3.9.2. Цитогенетические исследования при хроническом лимф оцитарном лейкозе

3.9.3. Эволюция опухолевых клонов при лимфопролиферативных заболеваниях

ГЛАВА 4. СООТНОШЕНИЕ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ, МИКРОЯДЕР И АПОПТОЗА В ФГА-СТИМУЛИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТАХ (заключение) 177 ВЫВОДЫ 201 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 203 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФ- ацентрические фрагменты ДС - дицентрики МЯ - микроядра ХА - хромосомные аберрации FISH - флуоресцентная in situ гибридизация ПКХ - преждевременная конденсация хромосом

ГЖХ-К - преждевременная конденсация хромосом с использованием дифферециальной окраски

ЛПЭ - линейная потеря энергии ионизирующего излучения

ОБЭ - относительная биологическая эффективность различных видов ионизирующего излучения

СХО - сестринские хроматидные обмены

ИГ- иммуноглобулины

ЩЖ - щитовидная железа

УЛПА - участники ликвидации последствий аварии

ЛПК - лимфоциты периферической крови

XMJ1 - хронический миелоидный лейкоз

XJIJI - хронический лимфоцитарный лейкоз

НХ - неходжкинские лимфомы

ФЛ - фолликулярные лимфомы

ЛБ - лимфома Беркитта

АКЛ - анапластическая крупноклеточная лимфома ЛКМЗ - лимфома из клеток мантийной зоны ДКЛ - диффузные крупноклеточные лимфомы ЛЛ - лимфобластная лимфома

МАЛТ — B-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны

ММ - множественная миелома

ХВГ-В — хронический вирусный гепатит В

ХВГ-С - хронический вирусный гепатит С del - делеция хромосомы t - транслокация хромосом р- короткое плечо хромосомы р+ - дополнительный хромосомный материал в коротком плече q - длинное плечо хромосомы q+ - дополнительный хромосомный материал в длинном плече шаг - маркерная хромосома ira - ломкий (фрагильный) участок хромосомы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Хромосомные аберрации, микроядра и апоптоз в лимфоцитах при радиационных воздействиях и других патологических состояниях»

Актуальность работы. Лимфоциты периферической крови циркулируют во всех тканях организма, являясь носителями многих физиологических функций. Облучение, химические вещества экзогенной и эндогенной природы, вирусы воздействуют на геном, вызывая повреждения. В ответ клетки вовлекают три процесса: задержку клеточного цикла, репарацию ДНК и гибель [Imyanitov et al., 2005]. Для того чтобы правильно оценить действие повреждающих агентов, и в частности, облучения, используют цитогенетические методы, благодаря довольно точным и повторяющимся результатам [Amundson et al., 2001, Mettler and Voelz, 2002, Sevan'kaev et al., 2005, Leonard et al., 2005, Levy et al., 2007]. Однако широко используемый в целях радиационной диагностики метод определения числа дицентрических хромосом имеет ряд недостатков [Edwards et al., 2005, Lamadrid et al., 2007]. При облучении в малых дозах он информативен только при анализе большого числа метафаз [Voisin, 2001, 2004]. В отдаленные сроки часть дицентрических хромосом элиминируется, снижая тем самым реальную дозу облучения [Рубинович и соавт., 2006, Wang et al.,2007]. Кроме того, после облучения, вирусных инфекций, а также с возрастом происходит уменьшение размера теломер, что увеличивает число теломерных ассоциаций и приводит к числу ложноположительных случаев [Stewenius et al., 2005, Sguara et al., 2006, Castella et al., 2007, M'Kacher et al., 2007]. Флуоресцентная in situ гибридизация - один из наиболее точных методов для обнаружения облученности организма. Он лишен ряда недостатков предыдущих методов, так как позволяет регистрировать стабильные аберрации, которые сохраняются в течение длительного периода [Sorokine-Durm et al., 2000, Camaparoto et al., 2003]. Кроме того, метод может быть использован для выявления микротранслокаций [Bauchinger et al., 2001, Tucker, 2001, Pouget et al., 2004, Durante et al., 2004, Edwards et al., 2005, Szeles et al., 2006]. Как правило, для определения факта облученности используют библиотеку генов нескольких хромосом с последующим пересчетом выявленных повреждений на весь геном [Lucas et al., 1993]. Однако такой пересчет не всегда бывает адекватным, так как хромосомы имеют разную радиочувствительность за счет длины теломер, экспрессии генов, наличия общих ломких сайтов и т. д. [Martin-Subero et al., 2002, Narath et al., 2005, Lamadrid et al., 2007]. Все эти проблемы можно решить при использовании мультиколорного FISH [Braselman et al., 2005]. Однако высокая стоимость метода и большая трудоемкость не могут способствовать широкому внедрению метода в практику [Pouzoulet et al., 2007].''

В последние годы благодаря своей простоте достаточно широкое распространение, наряду с методом анализа хромосомных аберраций (ХА), получил метод анализа микроядер (МЯ) [Fenech, 1997, 2000, 2006, Miller et al., 2007]. В течение ряда лет дискутируется вопрос об эквивалентности этих двух методов для биологической дозиметрии [Bhat and Rao, 2003, Edwards et al., 2004, Fenech, 2006, Hatayoglu and Orta, 2007]. Оба показателя имеют в определенном диапазоне доз линейную или линейно-квадратичную зависимость. При этом спонтанный уровень микроядер выше, и по своей чувствительности к радиации этот метод несколько уступает методу анализа ХА. Возможно, причина кроется в механизме формирования МЯ [Tanaka et al., 2000, Norppa and Falck, 2003, Thomas et al., 2003, Fenech, 2007].

Известно, что структура и количество хромосом должны оставаться постоянными в течение жизни, поэтому многие изменения, возникшие в результате повреждающих воздействий, элиминируются из организма. Некоторые остаются в течение многих лет, формируя состояние генетической нестабильности [Paz-y-Mino et al., 2001, Kawamura et al., 2004, Rossner et al., 2005]. Изменения в геноме лимфоцитов могут происходить при физиологическом старении [Blasco, 2005, Gerdes et al., 2005, Zijno et al., 2007], и старении, вызванном воздействием различных агентов, в том числе и радиацией [Krishnaja and Sharma, 2006, Любимова и Воробцова, 2007, Suzuki et al., 2007]. Наличие генетических перестроек в геноме опухолей является хорошо доказанным фактом. В настоящее время установлено, что 90% всех опухолей человека имеют цитогеиетические повреждения. Однако до сих пор не ясно, являются ли эти повреждения причиной или следствием формирования опухоли. Имеются данные о том, что неправильное расположение генетической информации может привести к серьезным нарушениям в состоянии здоровья человека, даже если ни один из участков хромосом не утерян [Tefferi et al., 2005, Kreskova et al., 2007].

Цель: в клинико-экспериментальных исследованиях оценить повреждения генома лимфоцитов при развитии патологических состояний, вызванных воздействием радиации в сравнении с другими повреждающими факторами.

Основные задачи исследования:

1. Изучить частоту хромосомных аберраций (ХА) и микроядер (МЯ) в лимфоцитах периферической крови после облучения in vitro.

2. Выявить зависимость индукции апоптотических лимфоцитов при облучении проб крови человека in vitro и лабораторных животных in vivo.

3. Выявить дозовую зависимость стабильных ХА у человека и обезьян методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

4. Исследовать влияние облучения на уровень ХА и МЯ у больных с нарушением тиреоидного гомеостаза.

5. Провести сравнительный анализ ХА и МЯ у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС

6. Исследовать цитогеиетические изменения у детей, рожденных у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС

7. Определить характер повреждений генома лимфоцитов у больных с хроническим гепатитом С.

8. Установить особенности формирования хромосомных повреждений у лиц, участвующих в ликвидации химического оружия.

9. Изучить распределение ХА в лимфоцитах периферической крови больных с различными формами лимфом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Исследование генома лимфоцитов периферической крови при различных патологических состояниях, вызванных действием радиации, вирусов, химических веществ, при условии нарушения тиреоидного гомеостаза, при лимфомах выявляет развитие сходных изменений цитогенетического статуса лимфоцитов, проявляющихся в формировании ХА и МЯ. Характер и выраженность цитогенетических проявлений экстремальных воздействий на лимфоциты определяются видом действующего фактора, его дозой, временем воздействия, а также степенью нарушения гомеостаза организма.

2. Сравнение дозовых зависимостей радиационно-индуцированных ХА и МЯ, аппроксимирующихся линейно-квадратичными уравнениями, выявляет их различия по линейной и квадратичной компонентам. Количество повреждений в хромосомах не зависит от длины хромосомы. Образование МЯ нельзя однозначно ассоциировать с ацентрическими фрагментами.

3. Лимфоциты периферической крови (ЛПК) аккумулируют полученные в результате действия облучения и других вредных факторов повреждения в виде стабильных ХА и сохраняют их в течение ряда лет. Если такие повреждения образуют клон, они становятся потенциальным источником образования гемобластозов и могут быть выявлены с помощью цитогенетических методов.

Научная новизна. При сравнительном исследовании двух цитогенетических методов на большой группе участников ликвидации в разные сроки после аварии на ЧАЭС, в том числе в течение первого месяца после воздействия, впервые установлено, что: а) микроядерный тест с использованием цитокалазина В позволяет оценивать поглощенную дозу облучения с погрешностью, эквивалентной определению ее по уровню ХА, начиная с дозы 0,1 Гр; б) наличие двуядерных лимфоцитов с двумя и более МЯ позволяет регистрировать дозу облучения, начиная с дозы 0,25 Гр; в) отсутствие корреляции между дозовой зависимостью числа МЯ и частоты ХА не позволяет отождествлять МЯ с ацентрическими фрагментами; г) МЯ, образованные в процессе митоза и в процессе апоптоза, не отличаются по морфологическим критериям, выявленным на световом и электронно-микроскопическом уровне исследования.

При сравнительном исследовании кривой доза-эффект, полученной методом FISH для ЛПК обезьян и человека, установлено, что для корректного определения дозы облучения необходимо использовать не менее трех ДНК-зондов для целых хромосом. Гибридизация хромосом 1, 4 и 13 человека с хромосомами 1, 4 и 16 обезьян позволяет использовать их для определения дозы облучения in vivo.

Установлено, что радиация вызывает зависимое от дозы увеличение суммарного числа МЯ и ХА, при этом число дицентрических хромосом более чем в два раза ниже числа МЯ при соответствующих дозах облучения. Полученные результаты позволяют расширить представления о механизме формирования МЯ. Длительный прием трийодтироксина приводит к достоверному увеличению числа ХА. Показано, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С появляются маркерные хромосомы и клональные разрывы.

Практическая значимость работы заключается в получении новых фактов о закономерностях процесса апоптотической гибели лимфоидных клеток в нормальных физиологических условиях и при лучевом воздействии, на основе которых разработан метод быстрой диагностики лучевых повреждений. Предложенный метод анализа апоптотических (или аномальных) ядер имеет ряд преимуществ перед анализом частоты МЯ, так как экономит время за счет отсутствия культивирования и может быть применен при аварийных ситуациях для сортировки больших групп людей на облученных и необлученных. Впервые использованы ЛПК с целью диагностики цитогенетических повреждений при лимфомах и доказана их диагностическая значимость для клинических исследований.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзной конференции "Радиобиологические последствия аварии на ЧАЭС" (Минск, 1991), 2-м радиобиологическом съезде (Киев, 1993), (25-th Annual Meeting of EEMS (Стокгольм, 1995), New Activities of WHO Collaborating (Монпелье, 1996), интернациональной конференции по радиационной биологии "Повреждения ДНК, репарация и канцерогенез" (Индия, 1998), Всесоюзной конференции "Морфологические, иммунологические и молекулярно-биологические аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний" (Адлер, 1999), международной конференции по цитогенетике опухолей (Париж, 2001), Российско-голландской научной конференции "Диагностика и лечение лимфом" (СПб., 2002), международной конференции "Гемобластозы: диагностика и лечение" (СПб., 2003), научной конференции "Биологическая защита" (СПб., 2006), международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в экспериментах на обезьянах" (Адлер, 2007), 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (СПб., 2008),

Диссертация апробирована на совместном совещании кафедр военной токсикологии и медицинской защиты, военно-полевой терапии, клинической биохимии, НИО отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Научно-исследовательского испытательного центра (медико-биологической защиты) ГНИИИ военной медицины МО РФ 29 января 2008 г. (протокол № 10).

Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебную, научную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники Военно-медицинской академии и ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий». На основании полученных данных выпущены методические рекомендации "Использование микроядерного теста для индикации пострадиационных эффектов у человека" (М: Минздрав, 1993), "Диагностическая значимость цитогенетических повреждений при лимфомах" (СПб.: ВМедА, 2000), "Диагностическая значимость цитогенетических показателей при миелопролиферативных заболеваниях" (СПб.: ВМедА, 2000), сделаны 3 рационализаторских предложения, получено авторское свидетельство на изобретение № 310946.

Связь с темами НИР. Исследование выполнено в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии, зарегистрированных в ЦСИФ МО РФ (per. № 4.99.194, per. № VMA 0.3.12.08.05.07/0195, per. № VMA03.12.03.0810/0159)

Личный вклад автора. Автором лично выполнены цитогенетические исследования для построения дозовых кривых для МЯ и ХА, для стабильных ХА, выявленных методом FISH, и цитогенетические исследования больных со злокачественными лимфомами, статистическая обработка, обобщение результатов исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, из них 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 7 разделов собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 501 источника (в том числе 49 источников на русском языке и 452 источника на иностранных языках). Работа включает 22 таблицы и 27 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Колюбаева, Светлана Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Воздействие радиации in vitro приводит к увеличению суммарного числа микроядер и хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, динамика образования которых имеет сходную зависимость от дозы облучения. Отсутствие клеток, содержащих более 3-х микроядер в контроле, и формирование их при облучении, уже начиная с дозы 0,5 Гр, позволяет использовать этот показатель для определения радиационных повреждений.

2. Анализ клеток с аномальными (апоптотическими) ядрами дает возможность выявлять повреждения при больших дозах радиационного воздействия через 6-8 ч после облучения организма, т.е. времени, соответствующему пику интерфазной гибели клеток.

3. Микроядра имеют различные механизмы происхождения, однако наибольшая часть их формируется во время митоза и апоптоза. Соотношение вклада этих двух механизмов в формирование микроядер зависит от величины повреждающего воздействия на клетки.

4. Число повреждений на хромосому не зависит от ее длины, поэтому метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) должен применяться для биодозиметрии с использованием ДНК-зондов не менее чем для трех хромосом.

5. Выявлена прямая зависимость между радиационно-специфичными повреждениями, обнаруженными в лимфоцитах родителей -участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, и маркерными хромосомами у детей, специфичными для гемобластозов.

6. Облучение в дозе 1 Гр при условии нарушения тиреоидного гомеостаза в 1,5 раза увеличивает число микроядер по сравнению с контролем, при этом суммарное число хромосомных аберраций не изменяется.

7. При оценке степени облучения необходимо учитывать мутагенные свойства вируса гепатита С, которые проявляются в формировании парных разрывов в сайтах 1я31-32, 9я21-22, 2ц32-34, 7я22, и появлении маркерных хромосом.

8. Особенностью формирования хромосомных повреждений в лимфоцитах периферической крови у лиц, длительно контактировавших с фосфорорганическими отравляющими веществами, является образование ломких сайтов и парных фрагментов, при этом изученные вещества не обладают канцерогенным эффектом.

9. Спектр распределения хромосомных аберраций в периферической крови при лимфомах соответствует таковому в клетках лимфатических узлов. Особенностью фолликулярных лимфом у больных в Северо-Западном регионе России является отсутствие транслокации (14; 18), наиболее специфичной для этой группы заболеваний в США и странах западной Европы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для корректной оценки радиационных поражений лаборатории, занимающиеся биологической дозиметрией, должны иметь собственную калибровочную кривую для всех методов, используемых в этой лаборатории.

2. В случае потенциальной опасности сверхнормативного облучения людей необходимо использовать микроядерный тест для всех лиц, которые находились в зоне аварии. Оценка дозы по этому критерию должна определяться только с учетом данных тщательно собранного анамнеза, так как различные предшествующие воздействия - вирусы, химические вещества, а также радиация, могут изменять истинную дозу облучения.

3. Лица, у которых выявлен уровень МЯ, соответствующий дозе более 1 Гр по калибровочной кривой, должны быть обследованы вторично для определения числа дицентриков, желательно с использованием метода дифференциальной окраски хромосом во избежание артефактов. При радиационном воздействии в высоких дозах и необходимости немедленного обследования людей для оценки поглощенной дозы можно использовать показатель аномальных клеток в лимфоцитах периферической крови.

4. В тех случаях, когда необходимо подтвердить или выявить факт облученности организма в отдаленные сроки после воздействия, необходимо использовать метод FISH, при использовании не менее трех ДНК-зондов.

5. Лица с выявленными в результате радиационного воздействия стабильными рекуррентными хромосомными повреждениями в лимфоцитах, которые можно рассматривать как онкомаркерные, должны быть отнесены к группе канцерогенного риска и регулярно проходить диспансерное обследование.

6. При обследовании пациентов с эндо- и экстранодальными лимфомами для цитогенетических исследований следует использовать лимфоциты периферической крови, стимулированные Т- и B-клеточными митогенами.

7. Цитогенетический метод исследования лимфоцитов периферической крови может быть использован для многократных исследований пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями с целью дифференциального диагноза, прогноза лечения и определения минимальной остаточной болезни.