Разработка подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты с помощью тандемных систем производных олигонуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гайдамаков, Сергей Алексеевич

• Гайдамаков, Сергей Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гайдамаков, Сергей Алексеевич

Содержание

Содержание

Список сокращений

Введение

Гдава 1. Применение олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных для изучения и регуляции экспрессии генов (обзор литературы)

1.1. «Антисенс»-стратегия: воздействие на мРНК с использованием антисмысловых олигонуклеотидов и их производных

1.2. «Антиген»-стратегия: использование олигонуклеотидных производных для воздействия на регуляторные элементы или факторы транскрипции

1.3. Фотореакционноспособные олигонуклеотидные производные как инструмент для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты

1.4. Олигонуклеотидные производные, содержащие псорален

1.5. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с регуляторными районами генов

1.6. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с факторами транскрипции

1.7. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для направленного мутагенеза

1.8. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для воздействия на ДНК в составе хромосом

1.9. Олигонуклеотидные производные, содержащие интеркалирующие красители

1.10. Олигонуклеотидные производные, содержащие азиды и перфторированные азиды, использование эффекторов для повышения степени модификации

1.11. Взаимодействие олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных с нуклеиновыми кислотами - мишенями в составе тандемных комплексов

1.12. Безизлучательная передача энергии между флуорофорами, присоединенными к олигонуклеотидам

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Ферменты

2.2. Реактивы

2.3. Плазмиды, бактериофаги и штаммы микроорганизмов

2.4. Олигонуклеотиды

2.5. Субклонирование фрагментов ДНК

2.6. Выделение бактериофагов и их одноцепочечной ДНК

2.7. Выделение ДНК плазмид и RF-формы бактериофага М13 из клеток E.coli методом осветленного лизата с последующим центрифугированием в двухступенчатом градиенте хлористого цезия

2.8. Приготовление препаратов плазмидной ДНК с разной степенью суперспирализации

2.9. Метод геномного секвенирования

2.10. Получение алкилирующих производных смеси олигонуклеотидов

2.11. Алкилирование ДНК адресованными реагентами

2.12. Получение фотоактивируемых реакционноспособных производных олигонуклеотидов Ол2Я2 и ОлЗЮ

2.13. Выделение олигонуклеотидных производных методом ВЭЖХ

2.14. Синтез пиреновых производных олигонуклеотидов Ол181 и Ол281

2.15. Синтез бензантраценового производного олигонуклеотида Ол2Б2

2.16. Синтез периленового производного олигонуклеотида Ол2БЗ

2.17. Определение Smax производных олигонуклеотидов

2.18. Гашение флуоресценции бензантраценовых производных

2.19. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды

2.20. Получение фрагментов одноцепочечной ДНК

2.21. Фотомодификация нуклеиновых кислот

2.22. Электрофоретический анализ продуктов модификации, авторадиография и денситометрия

2.23. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени

2.24. Определение каталитических свойств фотосенсибилизатора

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Многокомпонентные системы алкилирующих реагентов на основе олигонуклеотидов, полученных контролируемой фрагментацией полинуклеотидов

3.2. Комплементарно-адресованная модификация дц-ДНК плазмид. Влияние степени суперспирализации на эффективность адресованной модификации

3.2.1. Направленная модификация суперспирализованной ДНК плазмиды риС19-С2 алкилирующими производными олигонуклеотидов, полученных фрагментацией полинуклеотидов

3.2.2. Сайт-специфичная модификация суперспирализованных ДНК плазмид р160, р163 алкилирующими производными синтетических олигонуклеотидов

3.3. Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов для высокоспецифичной фотомодификации нуклеиновых кислот

3.3.1. Принцип действия бинарных систем для направленной фотомодификации нуклеиновых кислот

3.3.2. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотидной матрицы М1. Пиреновое производное олигонуклеотида в качестве сенсибилизатора

3.3.3. Позиционная направленность фотомодификации

3.3.4. Использование бензантрацена в качестве сенсибилизатора

3.3.5. Температурная зависимость эффективности фотомодификации

3.3.6. Каталитические свойства бинарной системы, определение числа оборотов фотосенсибилизатора

3.3.7. Использование перилена в качестве фотосенсибилизатора

3.3.8. Сенсибилизированная фотомодификация оц-ДНК бактериофага М13Ьтг4

3.3.9. Сравнение селективности действия бинарных систем и реагентов для прямой

модификации НК

3.3.9. Применение системы бинарных реагентов для выявления и характеризации белков, специфически взаимодействующих с регуляторным районом гена СУР102

Выводы

Список использованной литературы

Примечания

Список используемых сокращений

ГТААГ полиакриламидный гель

НК нуклеиновые кислоты

РНК рибонуклеиновая кислота

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

оц- одноцепочечная

дц- двухцепочечная

Ол1 олигонуклеотид 3' ТАСАААТТОАр

Ол2 олигонуклеотид 3' АСАААТТ<ЗАСр

ОлЗ олигонуклеотид З5 рТАСТТОААХЗА

Ол4 олигонуклеотид 3' рСТСТАТТАССТА66ТТ6Т

Ол5 олигонуклеотид 3' СТСТАТТАСр

Олб олигонуклеотид 3' рСТАОСТТСТ

М1 мишень олигонуклеотид 5 ' АТСТТТААСТОАТ(ЗААСТТСТ

М2 мишень смесь фрагментов одноцепочечной ДНК бактериофага М13ВМЯ4

МЗ мишень олигонуклеотид 5 'АСААССЗАСАТААТОвАТССААСАС

М4 мишень олигонуклеотид 5' СОАСАТААТСОАТСАААСА

М5 мишень олигонуклеотид 5' СОАСАОААТССАТСАААСА

Мб мишень олигонуклеотид 5* ССАСАОААТССАТССААСА

М7 мишень олигонуклеотид 5' бСАСАТААТСКдАТААААСА

М8 мишень олигонуклеотид 5» (ЗСЗАСАТААТСЗС сенсибилизатор пиренил-1 -метиламин

82 сенсибилизатор 5-фтор-7-метилбензо [Ь] антраценил-12-уксусной кислоты 2-аминоэтиламид

83 сенсибилизатор 3-периленилметиламин

Ш реагент и-азидотетрафторбензальгидразон-Ы-пропиониламина

112 реагент и-азидотетрафторбензамид

и линкер -КН-(СН2)з-№1-

Ь5 линкер -МН-(СН2)5-МН-.

Префикс "<Р при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев дезокси- ряда для краткости написания опущен.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты с помощью тандемных систем производных олигонуклеотидов»

ВВЕДЕНИЕ

Создание методов направленного химического воздействия на нуклеиновые кислоты является важным направлением современной молекулярной биологии. Одним из перспективных подходов является использование адресованных реагентов на основе синтетических олигонуклеотидов (Belikova étal, 1967; Кнорре и др., 1977; Кнорре и др., 1991). Метод нашел широкое применение для решения большого круга задач как в системах in vitro, так и in vivo. К адресованным реагентам предъявляются различные требования в зависимости от объекта, на который воздействуют реагенты, и ожидаемых эффектов.

Для решения целого ряда молекулярно-биологических задач необходимы реагенты, направленные на определенные, но достаточно протяженные участки нуклеиновых кислот (100-300 н о ), так называемые ген-адресованные реагенты. С помощью такого подхода направленное на определенный ген воздействие может быть осуществлено даже в тех случаях, когда точное положение функционально важных участков в пределах гена неизвестно. Создание системы реагентов для эффективной модификации в пределах протяженного участка определенного гена является необходимым условием для разработки универсального метода определения наиболее функционально важных участков генов.

Адресованные реагенты успешно применяются в настоящее время для сайт-специфичной модификации одноцепочечных нуклеиновых кислот и двухспиральных ДНК по участкам, содержащим гомопурин - гомопиримидиновые последовательности. Однако, вопрос о возможности направленной модификации двухцепочечной ДНК по произвольно выбранному участку, не содержащему гомопурин-гомопиримидиновых последовательностей, остается открытым до настоящего времени. Поскольку в эукариотических клетках ДНК в основном находится в двухцепочечной форме, недоступной для действия классических олигонуклеотидных реагентов, разработка подходов для направленного воздействия на двухцепочечную ДНК является актуальной задачей.

Особый интерес представляют реагенты, обладающие повышенной селективностью модификации нуклеиновых кислот при физиологических условиях. Увеличение избирательности воздействия реагентов, исключение неспецифического воздействия на биополимеры, не являющихся мишенью, также является важной задачей при совершенствовании адресованных реагентов.

Целью данной работы является разработка новых подходов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты, а именно:

а) разработка метода для направленной химической модификации протяженных участков определенных нуклеиновых кислот. Создание системы реакционно способных производных на основе олигонуклеотидов, получаемых генноинженерными методами;

б) разработка подхода для сайт-специфичной модификации двухцепочечной ДНК плазмид по произвольным участкам, не содержащим гомопурин-гомопиримидиновых последовательностей. Исследование влияния степени суперспирализации ДНК плазмид на доступность действию комплементарноадресованных реагентов;

в) создание системы олигонуклеотидных реагентов для адресованной фотомодификации нуклеиновых кислот, обладающих повышенной селективностью, путем использования принципа тандемных систем и группировок, обладающих свойствами бинарных реагентов.

1. Применение олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных для изучения и

регуляции экспрессии генов (обзор литературы)

В настоящее время олигонуклеотиды и их реакционноспособные производные широко используются как для изучения регуляции экспрессии генов, так и для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты в составе живых клеток с целью создания инструмента для изменения экспрессии определенных генов in vivo.

Применение немодифицированных и модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричным РНК, для понижения уровня трансляции называют «антисенс»-стратегией. Изменение экспрессии генов на уровне транскрипции получило название «антиген»-стратегии (Helene, 1990).

1.1. «Антисенс»-стратегия: воздействие на мРНК с использованием антисмысловых ,

олигонуклеотидов и их производных

Применение антисмысловых олигонуклеотидов основано на их способности образовывать комплексы с доступными участками матричной РНК. Образование гетеродуплексов олигодезоксирибонуклеотид-РНК активирует РНКазу Н, которая гидролизует цепь РНК в составе таких гибридов (Cohen, 1989; Agrawal et al., 1990; Giles and Tidd, 1992).

Используя модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды, возможно активировать и другие РНКазы. В настоящее время активно разрабатывается стратегия использования антисмысловых олигонуклеотидов с ковалентно присоединенным 5'-монофосфорилированными 2'-5'-сшитьми-олигоаденилатами. Модифицированные таким образом антисмысловые олигонуклеотиды получили название «2-5А антисенсы». Как и 2'-5'-олигоаденилаты, «2-5 А антисенсы» способны активировать РНКазу L в клетках (Maitra et al., 1995; Xiao, 1996; Glasser, 1996; Cirino et al., 1997; Bhan et al., 1997; Xiao, 1997; Torrence et al., 1997; Kondo et al., 1998; Maran et al., 1998; Player et al., 1998).

Антисмысловые олигонуклеотиды и 2-5А антисенсы широко используются в разработке противовирусных препаратов.

Начало таким работам было положено в конце 70-х годов Замечником с соавторами (Zamecnik et al., 1978), показавшими, что обработка инфицированных клеток комплементарными олигонуклеотидами подавляет размножение вируса саркомы Рауса.

Пожалуй, наибольшее количество исследований с применением антисмысловых олигонуклеотидов направлено на разработку препаратов для терапии СПИДа в связи с

исключительной актуальностью создания средств лечения этого заболевания. Многочисленные эксперименты выявили способность различных антисмысловых олигонуклеотидов и их аналогов ингибировать размножение вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-I) в культуре клеток (Zamecnik et al., 1986; Matsukura et al., 1987; Goodchild et al., 1988; Agraval et al., 1988; Sarin et al., 1988; Agraval et al., 1989; Zamecnik and Agraval, 1991; Lisziewicz et al., 1992, Svinarchuk et al., 1993; Покровский и др., 1993; Lisziewicz et al., 1993).

В работе Бонора с соавторами (Bonora et al., 1998) было показано, что короткие антисмысловые олигонуклеотиды (12-меры) с присоединенным высокомолекулярным монометоксиполиэтиленгликолем линейной структуры защищают МТ-4 клетки от заражения ВИЧ в еще большей степени, чем немодифицированные олигонуклеотиды.

Получены данные о подавлении репликации респираторного синцитиального вируса (вируса RSP) в эпителиальных клетках трахеи человека с применением 2-5 А-олигонуклеотидных производных (Cirino et al., 1997).

В 1998 году появилось сообщение о создании первого противовирусного лекарственного препарата на основе антисмысловых олигонуклеотидов (Genetic Engineering News, 1998). Лекарственный препарат фомивирсен ("fomivirsen"), выпускаемый фирмой Isis Pharmaceuticals, успешно прошел клинические испытания Ш фазы. Олигонуклеотиды, входящие в состав фомивирсена, специфически взаимодействуют с мРНК генов раннего ответа цитомегаловируса человека, в результате чего происходит подавление репликации вируса (Marwick, 1998). Препарат был создан для лечения заболевания сетчатки глаза, вызываемого цитомегаловирусом, и успешно опробован на больных СПИДом (Perry and Balfour, 1999).

Фосфоротиоатные производные олигонуклеотидов, комплементарные РНК вируса герпеса (HSV - herpes simplex virus), входят в новый лекарственный препарат под названием ISIS 4015, который в настоящее время проходит испытания на токсичность (Flores-Agular et al., 1997).

Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, комплементарные последовательности миниэкзона, который присутствует во всех мРНК внутриклеточного паразита лейшмании (Leishmania amazonensis), были успешно использованы для ингибирования трансляции мРНК и подавления размножения этого простейшего в клетках (Ramazeilles et al., 1994; Compagno et al., 1999).

В последнее время антисмысловые олигонуклеотиды все чаще предлагают использовать для противораковой терапии. Наиболее популярными мишенями в таких исследованиях

являются гены - ингибиторы апоптоза (Bloem and Lockhotst; 1999; Koty et al., 1999) и онкогены (Гринева и др., 1998).

Кэмпбел с соавторами предлагают использовать олигонуклеотиды, комплементарные мРНК, кодирующей Вс1-2 белок (один из ключевых ингибиторов апоптоза), в терапии гормон-резистентного рака простаты (Campbell et al., 1998).

Антисмысловые олигонуклеотиды предлагают использовать в комбинации с традиционными противоопухолевыми агентами в терапии лейкемии (Skoroski et al., 1997). В разработке эффективного подавления пролиферации клеток, пораженных лейкемией, используют и 2-5А антисмысловые олигонуклеотиды (Maran et al., 1998).

Параллельно с использованием антисмысловых олигонуклеотидов и их модифицированных аналогов, способных образовывать с мРНК-мишенью водородные связи, активно развивается подход для создания противовирусных и противораковых препаратов на основе реакционноспособных производных олигонуклеотидов, образующих необратимые ковалентньге связи с мишенью с образованием стабилизированного дуплекса.

Первые биологические эксперименты с реакционноспособными производными олигонуклеотидов были выполнены в начале 80х годов. Первыми реакционноспособными производными олигонуклеотидов, использованными в качестве реагентов для комплементарноадресованной модификации нуклеиновых кислот в культуре клеток были алкилирующие производные, содержащие 4-(ТЧ-2-хлорэтил-М-метиламино)фенильную группу (Власов и др., 1984; Иванова и др., 1984).

С использованием алкилирующих производных олигонуклеотидов удалось продемонстрировать подавление размножения различных вирусов в инфицированных культурах клеток: ВИЧ I (Абрамова и др., 1990), вируса энцефалита (Погодина и др., 1988), вируса гриппа (Yurchenko et al., 1991; Абрамова и др., 1994).

Производные олигонуклеотидов с присоединенным акридином были успешно применены для подавления трансляции мРНК трипаносомы (Trypanosoma Ъгисег). {Verspieren et al, 1987).

Фотоактивируемые реакционноспособные производные антисмысловых олигонуклеотидов также начинают использоваться для исследования возможности их применения в антивирусной терапии. В работе Маструзо с соавторами (Mastruzzo et al., 1994) исследовали взаимодействие олигонуклеотида с присоединенным протопорфирином и метилпирропорфирином с РНК длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека. Эта часть вирусного генома является необходимой для репликации вируса (Haseltine, 1992). Было показано, что при облучении светом с длиной волны 405 нм

происходило ковалентное присоединение олигонуклеотидного производного к РНК-мишени по гуанозину в непосредственной близости от фотоактивного порфирина.

В настоящее время фотоактивируемые призводные олигонуклеотидов используют в большей степени для изучения экспрессии генов, чем для ее регуляции. Это объясняется тем, что без этапа всестороннего выяснения механизмов взаимодействий олигонуклеотидных конъюгатов с биополимерами клеток невозможно их использование в терапевтических целях.

1.2. «Антиген»-стратегия: использование олигонуклеотидных производных для воздействия на регуляторные элементы или факторы транскрипции

Регуляция активации и репрессии генов на уровне транскрипции представляет собой чрезвычайно сложную систему взаимодействий определенных участков ДНК в области гена (промоторных районов и регуляторных элементов) и белковых молекул - факторов транскрипции и РНК-полимераз (Ьеулп, 1994). Если механизм активации-репрессии транскрипции конкретного гена изучен достаточно хорошо, возможно использование реакционноспособных производных олигонуклеотидов для изменения экспрессии этого гена. Однако, на настоящем этапе исследований реакционноспособные производные олигонуклеотидов используются в основном для исследования механизмов регуляции транскрипции. Наиболее широко используемыми фотоактивируемыми реагентами в таких исследованиях являются производные псоралена.

1.3. Фотореакционноспособные олигонуклеотидные производные как инструмент для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты

Фотореакционноспособные производные олигонуклеотидов являются перспективными реагентами для модификации биополимеров, поскольку обладают существенным преимуществом по сравнению с другими химически активными реагентами: они позволяют инициировать фотореакцию под действием внешнего воздействия света в любой заданный момент времени. При возбуждении фотоактивируемых производных образуются короткоживущие высокореакционноспособные частицы, которые могут реагировать с ближайшими химическими группировками биополимеров.

В настоящее время для получения фотоактивируемых олигонуклеотидных конъюгатов используют различные хромофоры. В частности, к концевому фосфату олигонуклеотидов

присоединяют пиридазольные производные, производные флуоресцеина, родамина, акридина, метилдиазопирена, (Helene et al., 1989), этидия (Benimetskaya et al., 1989; Кошкин и др. 1993), профлавина (Praseuth et al., 1988), азидопрофлавина (Doan et al., 1987), порфирина (Doan, 1990), псоралена (Pieles and Englis, 1989; Kulka et al., 1989), элиптицина (Doan et al.,1991), ароматические азиды (Geiger et al.,1984; Добриков и др. 1992; Добриков и др 1992; Levina., et al., 1992;1993).

Показано, что такие олигонуклеотидные конъюгаты формируют двойную спираль с комплементарными участками одноцепочечных нуклеиновых кислот, а также могут образовывать тройные комплексы с двухцепочечной ДНК.

Столь широкое разнообразие фотореагентов, существующих в настоящее время, является необходимым фактическим материалом для выбора адекватного реагента как для решения конкретных задач при изучении молекулярно-биологических процессов, так и для дальнейших методических разработок в этой области.

Псораленовые производные олигонуклеотидов являются перспективными ген-направленными биологически активными веществами.

Являясь природными фотореактивными фурокумаринами (Cimino et al., 1985), они использовались как лекарственные агенты при лечении кожных болезней еще в древнем Египте (Bhan & Miller, 1990). В настоящее время эти соединения продолжают использоваться в качестве лекарственных препаратов при фотохимиотерапии псориазов, витилиго, грибковых заболеваний кожи, Т-клеточной лимфомы (Roenigk et al., 1977; Gilchrest et al., 1979;Ben-Hur, 1984; Gilchrest, 1979; Edelson et al., 1987).

Псоралены - полициклические ароматические соединения - имеют планарную структуру и способны интеркалировать между парами оснований двухцепочечных нуклеиновых кислот.

1.4. Олигонуклеотидные производные, содержащие псорален

Rb

Re

При облучении УФ-светом с длиной волны 320-400 нм, псорален способен вступать в реакции фотоприсоединения - образовывать циклобутановое кольцо с атомами С5-С6

пиримидинов (Hearst, 1981, Havre et al., 1993). При этом реакция с цитозином идет в 15 раз медленнее, чем с тимином (Shi and Hearst, 1986; Анципович и др., 1998). Под действием длинноволнового УФ-облучения 3, 4 двойные связи пиронового или 4, 5 двойные связи фуранового кольца, взаимодействуют с 5, 6 двойными связями пиримидинов (олигонуклеотидов или ДНК), формируя циклобутановый тип моноаддуктов (Hearst, 1981).

о

о

NH

aJ

Me

^ O^IST

or2

occr

ь **

RjO.

or2

Моноаддукт: "ДНК-псораленг

О

Ri; R2; R3; Rt -полинуклеотиды Бисаддукт: "ДНК-псорален-ДНК"

В ДНК псоралены предпочтительно связываются с последовательностью 5'-d(TpA) (Sage and Moustacchi, 1987, Chen and Kagan, 1994; Kittler and Lober, 1995). Эффективность фотоприсоединения псоралена к данной последовательности по крайней мере на порядок выше, чем к тимину в другом окружении. Поскольку псорален не обладает специфичностью в узнавании длинных уникальных последовательностей нуклеиновых кислот, для адресованной фотомодификации используют моноаддукт олишнуклеотида, в котором псорален присоединен к тиминовому основанию олишнуклеотида или олигонуклеозид метилфосфоната (Houten et al., 1986; Kean, 1988; Cheng et al., 1988; Lee et al., 1988; Pieles and English, 1989; Bhan and Miller, 1989; Teare et al., 1989).

Еще в 1987 году в работе Саге и Мустачи (Sage and Moustacchi, 1987) были исследованы условия образования бисаддуктов при использовании псораленсодержащего олигонуклеотида и олигонуклеотида-мишени таким образом, что псорален, интеркалируя в двойную спираль, реагировал с тимином в составе последовательности 5'-d(TpA)/3'-d(ApT).

Me

Максимальный выход ДНК-дуплекса достигался при использовании группы СН2-0-СН2СН2 в качестве спейсера для присоединения псоралена к олигонуклеотиду. Выход бисаддукта возрастал в первые 10-30 мин после начала облучения (360 нм, 60 мин, 20°С), достигая 70-80%. Количественный выход не наблюдался даже при 100-кратном избытке модифицированного олигонуклеотида по отношению к ДНК-матрице из-за частичной инактивации псоралена при облучении (Sage and Moustacchi, 1987).

Последовательности 5'-d(TpA)/3-d(ApT) содержатся в регуляторных районах многих генов. Они являются потенциальными мишенями для модифицированных псораленом олигонуклеотидов.

1.5. Взаимодействие фотоакгивируемых производных олигонуклеотидов с регуляторными

районами генов

Псораленсодержащие олигонуклеотидметилфосфонаты использовались для изучения взаимодействия РНК-полимеразы с Т7-промотором. Был синтезирован набор таких олигонуклеотидов, комплементарных участкам кодирующей и некодирующей цепей 57-звенного ДНК-дуплекса, содержащего 17-звенный Т7-промсггор РНК-полимеразы. В результате изучения эффектов, оказываемых псораленсодержащими олигонуклеотидметилфосфонатами на процесс транскрипции in vitro было показано, что псораленсодержащее производное олигонуклеотида, ковалентно связанное с кодирующим участком ДНК, эффективно подавляет транскрипцию, тогда как олигонуклеотид, связанный с некодирующим участком, имеет малый ингибирующий эффект. Полное ингибирование синтеза РНК наступало, если были модифицированы обе цепи (Lee et al., 1989).

В регуляторных областях генов эукариот довольно часто встречаются полипурин-полипиримидиновые блоки. В таких районах возможно формирование Н-формы ДНК (Mirkin et al., 1987). Один из подходов для воздействия на уровень транскрипции гена основан на формировании тройных комплексов ДНК в гомопурин-гомопиримидиновых сайтах регуляторных районов генов. В качестве примеров такого подхода можно привести следующие работы.

Псораленсодержащие олигонуклеотиды (моноаддукты) использовались для изучения взаимодействий с гомопуриновым трактом в промоторном районе гена коллагеназы (тип IV) человека. Повышенная экспрессия этого гена наблюдается в ряде патологий, в частности, при образовании метастазов. Было показано, что при физиологических рН псораленовое производное олигомера, содержащего 8-оксо-аденин, способно связываться и селективно образовывать фотосшивки с двухцепочечной ДНК-мишенью, соответствующей району промотора гена коллагеназы (Miller et al., 1996).

Олигопиримидинс фотореактивным псораленовым производным на 5-конце использовали для взаимодействия с полипурин-полипиримидиновой последовательностью из структурной области гена CYP19, кодирующего ароматазу. Ароматаза - фермент цитохром Р-450, участвующий в превращении андрогенов в эстрогены. Ген, кодирующий ароматазу, является перспективной мишенью при лечении гормон-зависимого рака груди.

Участок ДНК кодирующей области гена длиной 20 нуклеотидных пар, выбранный для направленного воздействия, представляет собой неидеальную гомопурин-гомопиримидиновую последовательность. 17 пуринов и 3 пиримидина составляют участок кодирующей цепи выбранного района:

5'- AGCAGA AAAAAGACGCAGGА-3'

Тем не менее было показано, что псораленсодержащий олигонуклеотид способен формировать аддукт с ДНК в составе триплекса при рН=7 (Bates et al., 1995).

В работе Элена с соавторами показано, что формирование тройных комплексов возможно в составе хроматина в культуре клеток. С использованием конъюгата олигонуклеотида с псораленом ингибировали транскрипцию гена, кодирующего а-субьединицу рецептора интерлейкина-2. Ингибирование происходило в результате конкуренции за связывание с промоторной областью модифицированного олигонуклеотида и фактора транскрипции (Helene et al., 1997).

1.6. Взаимодействие фотоактивируемых производных олигонуклеотидов с факторами

транскрипции

Другим, пока не используемым в системах in vivo подходом возможного воздействия на уровень транскрипции гена, является ковалентное присоединение модифицированных олигонуклеотидов к факторам транскрипции. В настоящее время такой подход используют в основном для характеризации и выделения факторов транскрипции, если регуляторные элементы этого гена уже известны. Большинство описанных в настоящее время факторов транскрипции обладают высоким сродством к дц-ДНК регуляторного элемента.

В работе Ивазе исследовались свойства бисаддукта псоралена с двумя комплементарными олишнуклеотидами, один из которых являлся олигодезоксирибонуклеотидом, а другой олигодезоксирибонуклеозид фосфоротиоатом. Показано, что такие конъюгаты представляют B-форму ДНК и являются устойчивыми к действию фосфодиэстеразы. Авторы предлагают использовать такие бисаддукты в качестве «ловушек» для факторов транскрипции (Iwase et al., 1997).

Традиционно для аффинной модификации белковых факторов в составе ДНК-белкового комплекса применяют 5-BrdUTP (5-бромдезоксиуридин 5'-трифосфат) - фотоактивный аналог нуклеозидтрифосфата (Lucibello et al., 1989; Triesman et al., 1987). 5-BrdUTP включают в состав одной из цепей двухцепочечного меченого олигонуклеотида ферментативным способом. Затем полученное фотоактивное производное олигонуклеотида инкубируют с клеточным или ядерным экстрактом. После протекания реакций связывания,

пробы облучают светом с длиной волны выше 300 нм. Это приводит к образованию высокореакционноспособных частиц, которые взаимодействуют по свободнорадикальному механизму с прилежащими функциональными группами белков. Модифицированные таким способом белки приобретают вместе с ДНК радиоактивную или другую метку. Это позволяет определять значения молекулярных весов анализируемых факторов в системе Лэммли (ЬаешшП, 1970).

В работе Свинарчука с соавторами (БутагсИик е1 а1., 1993; Лавровский и др., 1994) для оценки молекулярной массы фактора транскрипции, способного взаимодействовать с цис-элементом ГВ82 в промоторной области гена с-/о$, наряду с 5-Вг<ШТР использовали азидосодержащий аналог цитозина - БАВсЮТР (4М-[2-(р-азидотетрафторбензамид)этил1)]-дезоксицитидин-5'-трифосфат) (Богошп е1 а!., 1992).

Эксперименты по аффинной модификации показали, что дц олигонуклеотид (длиной 30 н.п.), содержащий остатки FABdC, является более эффективным в реакции фотомодификации по сравнению с дц олигонуклеотидом, содержащим остатки 5-BrdUTP.

Используя данный метод, авторы определили, что молекулярная масса фактора транскрипции, который специфически взаимодействует с FBS2 регуляторным элементом 5'-фланкирующей зоны промотора гена c-fos, составляет 59 Ша.

Получает распространение «кросслинкинг», выполненный с помощью УФ-лазера (Но et al., 1994; Moss et al., 1997; Russman et al., 1997; Russman et al., 1998; Santoro et al., 1999).

Создание новых химических реагентов на основе ДНК-дуплексов для необратимого ингибирования факторов транскрипции проходит по двум основным направлениям:

1) введение реакционноспособных группировок по межнуклеотидным фосфатам (Kuznetsova et al., 1996; Kozlov et al., 1997);

2) использование реакционноспособных аналогов нуклеозидтрифосфатов (Cahill et al.,

dPib-5'-трифосфаг

1996).

Используя дц- олигонуклеотиды, аналогичные по нуклеотидной последовательности SRE (c-fos serum responsible element), содержащие 6-тиогуанин, изучали эффективность получения конъюгата ДНК-белок под действием длинноволнового УФ-света. При этом было обнаружено, что продукт реакции присоединения является химически нестабильным (Cahill et al., 1996).

Дальнейшее развитие в исследовании молекулярных механизмов процессов транскрипции и совершенствование методов аффинной модификации позволят применять разработанные подходы не только к изучению факторов транскрипции, но и для направленного воздействия на них in vivo.

1.7. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для

направленного мутагенеза

Другой областью применения фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов является направленный мутагенез. Введение заданной мутации в двухцепочечную ДНК с помощью реакционноспособных производных олигонуклеотидов представляет интерес для генной терапии, антивирусной и противораковой терапии, для генетической инженерии, а также для изучения ДНК-репарации.

В работах Хавре с соавторами и Гаспарро с соавторами (Havre et al., 1993; Gasparro et al., 1994) продемонстрирована возможность направленного введения нуклеотидных замен в двухцепочечную ДНК генома фага А,. 1000-кратный молярный избыток триплексформирующих олигонуклеотидов с ковалентно присоединенным по 5'- концу псораленом инкубировали с ДНК фага X и облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм. Затем проводили в системе in vitro упаковку фаговых частиц и заражали клетки E.coli.

После секвенирования гена supF, в котором находился гомопурин-гомопиримидин богатый район-мишень и гена el в качестве контроля на неспецифическую модификацию, было обнаружено следующее. Мутации в гене-мишени supF встречались в 100 раз чаще, чем в гене с! Анализ мутаций в гене supF показал, что 96% всех мутаций находилось в районе выбранного гомопурин-гомопиримидиного тракта, причем 56% случаев всех мутаций в этом районе составляла трансверсия Т*А —» А*Т.

^GGAAGGGGG3' з-GCTGAAGCTTCCAAGCTTAGGAAGGGGGTGGTGGJ 5'-CGACTTCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCACCA

eos

supF

el

eos

Высокая специфичность и повторяемость мутации позволяет надеяться на перспективность использования аналогичных фотореагентов для направленного мутагенеза.

1.8. Использование фотореакционноспособных производных олигонуклеотидов для

воздействия на ДНК в составе хромосом

С использованием олигонуклеотидных производных псоралена было показано, что триплексформирующие олигонуклеотиды способны взаимодействовать с ДНК-мишенью определенного гена не только в составе плазмидного вектора или очищенной хромосомной ДНК, но и в составе хромосом. Это было показано для Hprt гена (Majumdar et al., 1998).

Триплексформирующие олигонуклеотиды с присоединенным псораленом использовали также для картирования нуклеосом да vivo (Wellinger & Sogo, 1998).

1.9. Олигонукдеотидные производные, содержащие интеркалирующие красители

Бромистый этидий, благодаря своей способности образовывать прочные нековалентные комплексы с нуклеиновыми кислотами, широко применяется в качестве модельного соединения для изучения взаимодействия нуклеиновых кислот и интеркалирующих красителей и для изучения вторичной структуры нуклеиновых кислот. Кроме того, при облучении его светом большой интенсивности этидий способен модифицировать нуклеиновые кислоты.

Впервые олигонуклеотидное производное, содержащее ковалентно присоединенный к межнуклеотидному фосфату ¡1(ТрТ) остаток этидия, описано в работе (Ье18^ег, е! а!., 1981). Позднее этидиевые красители, ковалентно присоединенные к концевому фосфату олигонуклеотидного адреса, использовали для фотомодификации олигонуклеотидных мишеней. При интенсивном световом облучении происходила специфическая модификация мишени (Ветгг^кауа е! а1.,1989). В 1993 году Кошкиным А. А. с соавторами был разработан метод синтеза этидиевых и азидоэтидиевых красителей, содержащих свободную алифатическую аминогруппу остатка 3-аминопропионовой кислоты, что существенно упростило методику присоединения остатка этидия к концевому фосфату олигонуклеотидов (Кошкин и др., 1993).

СН2СН3

а(ССААСА)—О-Р-О—МНСН2СКН^ЗУ-Ч1

Полученные производные использовались для адресованной фотомодификации природных одноцепочечных и двухцепочечных ДНК-матриц. В зависимости от нуклеотидного состава матрицы и условий облучения, общее повреждение мишени варьировало от 10% до 70% для этидиевых красителей и 30-80% для азидоэтидиевых, причем до 15-20% из общего количества матрицы подвергалось прямому расщеплению. Кроме того, детально исследовалось влияние присоединения красителя на сродство олигонуклеотидного производного к матрице, кооперативные свойства таких производных в случае тандемного расположения реагентов. Показано, что ковалентно присоединенный

остаток этидия существенно увеличивает стабильность комплементарных дуплексов. Этидиевый остаток является значительно более сильным стабилизатором, чем акридиниевый или феназиниевый. Присутствие этидиевой группы увеличивает кооперативный эффект тандемных реагентов в дуплексе, а также увеличивает стабильность комплекса при образовании тройных комплексов с двухспиральной ДНК. Показано, что этидиевые и азидоэтидиевые реагенты могут использоваться в качестве фотореагентов для сайт-специфичной модификации одно и двухцепочечной ДНК. Введение азидогруппы в этидиевое ядро существенно повышает фоточувствительность красителя. Это приводит к значительному повышению выхода продуктов фотомодификации нуклеиновой кислоты-мишени (Koshkin et al 1994).

Особенностью конъюгатов олигонуклеотидов и флуорофоров является то, что в отличие от самого флуорофора они являются сиквенс-специфичными. Производные акридина, такие как 2-метокси-6-хлоро-9-амино акридин, являются неспецифичными интеркалирующими агентами. При добавлении в раствор тимусной ДНК флуоресценция свободных акридиновых производных гасится благодаря тому, что акридиновые хромофоры интеркалируют между GC- парами оснований. При добавлении тимусной ДНК к конъюгатам акридиновых производных и олигонуклеотидов такого гашения не происходит из-за наличия отрицательного заряда у олигонуклеотидного производного. Отрицательный заряд олигонуклеотида препятствует неспецифической интеркаляции акридина в отрицательно заряженную ДНК. При специфичном комплексообразовании с комплементарной последовательностью остаток акридина интеркалирует в ДНК-мишень, при этом стабильность комплекса олигонуклеотидного производного и ДНК-мишени увеличивается (San, 1989). Таким образом, коньюгаты олигонуклеотидов и интеркаляторов являются бифункциональными молекулами: с одной стороны, интеркаляция хромофора дает дополнительный выигрыш в энергии при образовании комплекса, а с другой стороны, олигонуклеотидная часть обеспечивает сиквенс-специфичность взаимодействия хромофора и ДНК-мишени.

Флуоресцентное производное акридина (2-метокси-6-хлоро-9-амино акридин) было присоединено к 5'фосфату различных олигонуклеотидов (Asseline, 1984).

Была исследована способность полученных производных образовывать комплексы с комплементарными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами мишенями и возможность формирования тройных комплексов с двухспиральными нуклеиновыми кислотами, содержащими гомопуриновые последовательности. Оказалось, что наличие акридиновой группировки, ковалентно присоединенной к олигонуклеотиду достаточно гибким линкером,

содержащем пять метальных звеньев, не препятствует образованию комплементарных и тройных комплексов. Более того, способность акридина интеркалировать между основаниями в двухспиральной ДНК или вступать в стекинг-взаимодействие с крайней парой оснований дуплекса дает дополнительный выигрыш в энергии, что приводит к увеличению стабильности комплекса.

Флуоресценция 2-метокси-6-хлоро-9-амино акридина ингибируется, когда он находится в непосредственной близости к гуанозиновому основанию, этого не происходит при контакте с любым другим основанием: аденином, тимином, урацилом или цитозином. Используя такую особенность акридина в работе (Sun, 1987) определяли ориентацию комплексов с а-аномерными олигонуклеотидами. В частности, 9-звенный а-аномерный олигонуклеотид с присоединенной на 5'-конце акридиновой группой при помощи пентаметиленового линкера использовали для связывания с одним из двух комплементарных 3-аномерных олигонуклеотидов, имеющих гуанозиновые остатки на противоположных концах. Гашение флуоресценции акридинового производного наблюдалось лишь в том случае, когда акридиновая группа оказывалась в непосредственной близости с остатком гуанозина. Это дало возможность сделать заключение о том, что а-аномерный олигонуклеотид связывается с комплементарной мишенью в параллельной ориентации. Такая же стратегия использовалась в другой системе, где мишенью являлась двухспиральная ДНК, содержащая гомопурин-гомопиримидиновые последовательности. Было показано, что акридин содержащие гомопиримидиновые олигонуклеотидные производные связываются с ДНК-мишенью, образуя тройной комплекс. Тройной комплекс с акридинсодержащим производным являлся более стабильным, чем тройной комплекс с немодифицированным олигонуклеотидом, за счет того, что акридин интеркалирует в двойную спираль на границе триплекса.

Гашение флуоресценции акридина вблизи остатка гуанозина использовалось при определении ориентации триплексов, образуемых а-аномерными олигонуклеотидами. Акридиновый остаток был присоединен к 5'-концевому фосфату гомопиримидинового олигонуклеотида, состоящего из 11 звеньев, который мог формировать комплекс с 11 парами гомопурин-гомопиримидиновой последовательности двухцепочечного фрагмента ДНК длинной 32 пары оснований в ориентации, параллельной гомопуриновому участку:

5' TCCTAGCAAAGGAGGAGAGAAGAAAAAATGA AGGATCGTTTCCTCCTCTCTTCTTTTTTACT 3' Асг-ТТТССТССТСТ 3'

Такой олигонуклеотид не связывался ни с одной из одноцепочечных мишеней, но в присутствии двухцепочечной матрицы образовывал комплекс с ней. Это было доказано по изменению оптической плотности смеси олигонуклеотидов, ориентацию же комплекса определяли по изменению флуоресценции акридина. В кислой среде олигонуклеотид, несущий акридиновый остаток, может образовывать тройной комплекс с мишенью. При этом наблюдается сильное гашение флуоресценции, характерное для случая интеркаляции акридинового остатка между ОС-парами. Кривая изменения гашения флуоресценции в зависимости от температуры совпадает с изменением поглощения при комплексообразовании. Результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что акридин интеркалирует между <ЗС-парами строго на границе триплекса, а олигонуклеотидное производное связывается с ДНК-мишенью в ориентации, параллельной относительно пурин содержащей цепи.

Элиптицин также является интеркалирующим агентом. При облучении ультрафиолетовым светом с длиной волны 300 нм остаток элигггицина модифицирует гетероциклические основания нуклеиновых кислот (МаийЫ е1 а11991; Е1соск е1 а1., 1996). Синтезированы и использованы для адресованной модификации нуклеиновых кислот олигонуклеотидные конъюгаты элиптицина.

Показано, что элиптицин, присоединенный к олигопиримидиновому адресу, при облучении светом с длинной волны 300 нм сайт-специфично реагирует с нуклеиновой кислотой-мишенью как в составе дуплекса, так и в составе тройного комплекса с гомопурин-гомопиримидиновыми участками мишени (Шап е1 а1., 1991). Использовали производные олигонуклеотидов с присоединенным по концевому фосфату остатком элиптицина:

Модификация приводит к ковалентному присоединению олигонуклеотидного производного к мишени, а также к расщеплению ДНК-мишени в непосредственной близости от остатка элиптицина в составе дуплекса или триплекса. Преобладают продукты сшивки (более 80 % от общего количества продуктов фотореакции). Оба процесса: и образование сшивок, и расщепление мишени - уменьшается с увеличением температуры.

и

сн3 н

Это подтверждает тот факт, что реакция проходит именно в составе комплекса олигонуклеотидного производного и ДНК-мишени. Работа проводилась на различных системах, в частности на системе:

19 19 28

5' Т6А6ТСА6ТААААААААТСАСТСССАА 3' мишень е11± ТТТТТТТТ 5'

Особенность этой системы заключается в том, что в зависимости от условий проведения реакции возможно одновременное образование как дуплекса, так и триплекса с ДНК-мишенью:

19 19 28

5' ТСАбТСАСТААААААААТСАСТСССАА 3' еШ-ТТТТТТТТ 5' 5'ТТТТТТТТ-е11±

Продукты фотоиндуцируемой модификации ДНК-мишени подтверждают образование триплекса. Зафиксировано расщепление по основаниям мишени 08, Т9, А10, А11, а также по основаниям А16, А17, Т18, 019 (Боап е* а1., 1991).

На примере другой системы была продемонстрирована более высокая специфичность модификации в составе тройного комплекса

5 ' ТСС ТАССАААССЗАСЗСАСэАТ СААХзААААААТ СА

АССАТССТТТССТССТСТАСТТСТТТТТТАСТ 5' ТТТССТССТСТ-е111 3'

В этом случае наблюдается присоединение олигонуклеотидного производного к ДНК-мишени и расщепление мишени. В первую очередь модификации подвергаются пуриновые основания обеих цепей ДНК-мишени в непосредственной близости от остатка элиптицина в образовавшемся комплексе, а именно 020 в цепи, содержащей гомопуриновую последовательность, и А14 в цепи, содержащей гомопиримидиновую последовательность (нумерация нуклеотидов начинается с 5'-концевого нуклеотидного остатка).

При облучении светом с длиной волны 315 нм 95% олигонуклеотидного конъюгата необратимо фотолизуются в течение 20 мин. Поэтому для достижения высоких степеней

модификации ДНК-мишени (около 80%) необходимо добавлять свежие порции олигонуклеотидного производного по меньшей мере три раза.

При проведении фотомодификации в составе тройного комплекса при уменьшении рН среды возрастает стабильность тройного комплекса ДНК-мишень*реагент. Параллельно с этим наблюдается увеличение выхода продуктов фотореакции ДНК-мишени с элиптициновым производным олигонуклеотида. Показано, что в случае одноцепочечной ДНК-мишени среди продуктов фотореакции преобладают продукты сшивки с мишенью, в случае двуспиральной мишени наблюдается увеличение доли разрывов ДНК-мишени в общем количестве продуктов фотореакции (Perrouault et al., 1990).

1.10. Олигонуклеотидные производные, содержащие азиды и перфторированные азиды К началу девяностых годов наиболее эффективными из описанных в литературе фотореагентов, использовавшихся для получения олигонуклеотидных конъюгатов были производные псоралена (Pieles, 1989; Nakamura,1989) или этидия (Benimetskaya, et al 1989). Используя их, удавалось достичь степени модификации мишени до 80%. Однако, вследствие низкого квантового выхода модификации для этих реагентов требуется длительное время и высокая мощность облучения.

В девяностом году было предложено использовать в качестве фотореагентов ароматические азиды (Добриков и др., 1990), которые обладают высоким квантовым выходом фотомодификации (ср=0.3-0.4 в отличие от псоралена ф= и этидия ф<10*8).

Были синтезированы олигонуклеотидные конъюгаты с различными фотоактивными группами, в частности: w-азидотетрофторбензамидной, 5-азидо-2-нитробензамидной, п-азидобензамидной группами (Добриков и др., 1990).

F

F

no2

О

С—РОз-dR

II

F F

На примере модификации пентадекануклеотида было показано, что полученные коньюгаты способны образовывать стабильные комплексы и осуществлять сайт-специфическую фотомодификацию ДНК-мишени при облучении УФ светом в диапазоне 303-365 нм. (Добриков и др., 1992). Фотомодификация ДНК-мишени приводит к образованию фотосшивок с реагентом. При щелочной обработке часть молекул ДНК-мишени расщепляется по модифицированному основанию, что позволяет определить сайт, по которому прошла модификация. Оказалось также, что помимо ковалентного присоединения фотореагента, при фотомодификации происходит скрытая модификация ДНК-мишени (т.е. модификация, не приводящая к ковалентному связыванию олишнуклеотидного реагента с мишенью, но проявляющаяся после пиперидиновой обработки модифицированной ДНК-мишени). Было показано значительное преимущество перфторированного арилазида по сравнению с 5-азидо-2-нитробензамидной и п-азидобензамидной группами. При использовании и-азидотетрофторбензамидных производных олигонуклеотидов достигнута степень модификации ДНК-мишени 65-70%.

Определена позиционная направленность фотомодификация проходит преимущественно по остатку гуанозина, находящемуся в непосредственной близости к фотоактивируемой группировке. Детально исследовались образующиеся продукты на примере фотомодификации ДНК мишеней различающихся нуклеотидным составом в непосредственной близости от фотоактивируемой группировки. ДНК-мишени были подобраны таким образом, что после образования комплекса напротив азидной группировки в разных комплексах оказывались различные нуклеозиды: А,в,С,Т. Было показано, что щелочелабильной модификации производным и-азидотетрафторбензоила подвергается предпочтительно остаток гуанина, а производным 2-нитро-5-азидобензоила остаток цитозина (Добриков и др., 1992). С точки зрения предпочтительности модификации нуклеозиды располагаются в следующем порядке: 0>С=Т=А для производного п-азидотетрафторбензоила и С>Т>0»А для производного 2-нитро-5-азидобензоила. Нитроарилазидный реагент отдает заметное предпочтение пиримидиновым основаниям; при этом происходит в основном скрытая модификация мишени.

Полученные данные хорошо согласуются с данными работы (РгазеиШ, 1987), где показано, что я-азидофенацильные производные олигонуклеотидов, для которых так же, как для производных 2-нитро-5-азидобензоила, характерно образование триплетного нитрена, модифицируют ДНК-мишень по пиримидиновым основаниям, вероятнее всего, по двойной связи С5-С6. При этом практически всегда при фотомодификации нуклеиновых кислот образуются не расщепляющиеся пиперидином продукты (Эоап е1 а1., 1987).

Во всех случаях после пиперидиновой обработки остается значительное количество продуктов сшивки, не подвергающихся расщеплению. Для фотореагента ю-азидотетра-фторбензоила выход щелочестабильных продуктов мал (4-5%) и практически не зависит от строения мишени. Для фотореагента 2-нитро-5-азидобензоила выход таких продуктов заметно выше (достигает 20%).

Кроме того, при пиперидиновой обработке аддуктов, образовавшихся после фотомодификации, происходит частичная регенерация исходной мишени, то есть, среди продуктов присутствуют такие, которые под воздействием пиперидина разрушаются с разрывом связи мишень-реагент и, таким образом, регенерируют исходную матрицу. Доля их составляет около 20% (Добриков и др., 1992).

Для выявления скрытой модификации пиперидиновой обработке подвергали продукты фотомодификации, соответствующие по электорофоретической подвижности исходной ДНК-матрице. Оказалось, что она составляет 30-40% от всего количества и происходит преимущественно по остаткам цитозина и тимина. При отсутствии пиримидиновых оснований вблизи места связывания реагента скрытая модификация не имеет выраженного характера.

Таким образом, совокупная модификация ДНК-мишени ароматическими перфторариазидами включает в себя несколько типов повреждений: ковалентное присоединение адреса к мишени, дающее щелочелабильные и щелочестабильные продукты; скрытую модификацию, не приводящую к ковалентному присоединению, но проявляющуюся после щелочной обработки. Щелочелабильные продукты ковалентного присоединения, в свою очередь, делятся на две группы: к первой относятся продукты сшивки, которые под действием пиперидина разрушаются с разрывом сахарофосфатного остова в тех местах, где повреждены гетероциклические основания; ко второй относятся продукты, регенерирующие исходную матрицу под действием пиперидина.

Перфторарилазидные производные олигонуклеотидов были успешно использованы для осуществления фотомодификации в тройном комплексе (Ьеуша е1 а1., 1992; Левина и др., 1994).

Для модификации нуклеиновых кислот использовались так же и фотоактивные аналоги нуклеотидов. В частности, в работе (Богошп е1 а1., 1994) дезоксицитозинтрифосфат с присоединенной перфторарилазидной группировкой использовали как субстрат для обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека. Предлагаемые аналоги опознавались вирусной ревертазой и присоединялись к праймеру в процессе элонгации в присутствии ДНК-матрицы . При облучении такого комплекса происходила сшивка ДНК-

матрицы и обратной транскриптазы. Метод предлагался для исследования взаимодействия белок-нуклеиновая кислота внутри активного центра фермента.

1.11. Взаимодействие олигонуклеотидов и их реакционноспособных производных с нуклеиновыми кислотами- мишенями в составе тандемных комплексов

Особый интерес представляют реагенты, обладающие повышенной избирательностью модификации при физиологических условиях, позволяющие преодолеть непроизводительное расходование реагента вне комплекса с ДНК-мишенями. Селективность олигонуклеотидных реагентов определяется способностью образовывать только совершенные комплексы с мишенью, дискриминируя последовательности, отличающиеся от сайта связывания хотя бы одним нуклеотидом. Сайт-специфичность взаимодействия олигонуклеотидных конъюгатов с мишенью непосредственно связана с протяженностью адресного олигонуклеотида. Вероятность случайного совпадения нуклеотидных последовательностей двух участков нуклеиновых кислот протяженностью п-нуклеотидов обратно пропорциональна 4П, поэтому для достижения максимальной специфичности при модификации нуклеиновых кислот необходимо увеличивать длину участка опознаваемого адресованными реагентами до 15-20 нуклеотидов. Особенно это важно при направленной модификации нуклеиновых кислот эукариотических клеток, геном которых составляет Ю9-Ю10 пар нуклеотидов. Для уменьшения вероятности случайного совпадения нуклеотидной последовательности мишени с последовательностью нуклеотидов других участков генома следует использовать реагенты, опознающие участок мишени протяженностью не менее 15 нуклеотидных звеньев. Однако использование адресных олигонуклеотидов протяженностью более 10-12 звеньев ограничивается тем, что при физиологических условиях такие олигонуклеотиды уже способны образовывать стабильные комплексы с участками, имеющими частичную гомологию с последовательностью мишени. Это свойство нуклеиновых кислот существенно снижает селективность олигонуклеотидных реагентов.

Перспективным вариантом решения проблемы увеличения специфичности и селективности адресованных реагентов являются тандемные системы, предложенные группой сотрудников НИБХ СО РАН под руководством Зарытовой В.Ф. Тандемные системы включают в себя реакционноспособное производное короткого олигонуклеотида и олигонуклеотиды-эффекторы. При использовании таких систем олигонуклеотидные эффекторы повышают эффективность и специфичность модификации нуклеиновых кислот благодаря возникновению кооперативного взаимодействия между адресованным реагентом

и эффекторами внутри сайта связывания полного тандема (Зарытова и др., 1988; КШуаут е1 а1., 1988; Зарытова и др., 1992; ЬокЬоу е! а1., 1992).

Свойства тандемной системы олигонуклеотидов, состоящей из двух октануклеотидов-эффекторов и тетрануклеотида с присоединенным алкилирующим амином в качестве реакционноспособной группировки были подробно изучены в работе Пышного с соавторами (РувЬпу! е1 а1., 1995; Пышный и др., 1997; Пышный, 1998). Было показано, что при модификации 20-звенной ДНК-мишени алкилирующий реагент (ДС1) на основе тетрануклеотида в присутствии двух дифеназиниевых октануклеотидных эффекторов высокоселективно модифицирует мишень, дискриминируя все возможные однонуклеотидные несоответствия в сайте связывания тетрануклеотидного реагента (Пышный, 1998).

М: ССТАСТТССТССАССГСССТр

(И) рЫ4: (ИС1) рСА(ЗС

Е1: рвСАТСААС

1РЪп РЬпЬ'

Е2: рТССАССЗСА

ХР2ш Ph.nL'

М- мишень

Е1, Е2 -эффекторы

К=ЯС1 - реагент- алкилирующий амин РЬп - феназиний

РЬпЬ'- = -ОСН2СН2КН -Р1н1 РЬпЬ- = Р1т-КНСН2СН2СН2КН

На этой же тандемной системе олигонуклеотидов была изучена модификация мишени фотореакционноспособными производными тетрануклеотида - п-

азидотетрафторбензильным производным тетрануклеотида ((R) pCAGC) и его эстроновым эфиром ((R) pCAGC (Est) > (Табатадзе и др., 1997).

XI

R= N3-<1 Ъ—CONHCH2CH2NH Реагенте

у-^ п-азидотетрафторбензоильной

р F группой

В этой работе авторами была продемонстрирована высокая эффективность

фотомодификации ДНК-мишени 5'-п-азидотетрафторбензоильным реагентом на основе

тетрануклеотида и его З'-фосфоэстронового эфира в присутствии двух фланкирующих

эффекторов - производных олигонуклеотидов, содержащих на концевых фосфатах N-(2-

гидроксиэтил)феназиниевые группировки или остатки холестерина и N-(2-

гидроксиэтил)феназиния).

Максимальная степень модификации мишени (65%) достигалась при использовании

реагента (R)pN4 и пары фланкирующих эффекторов (Phn)El и (Phn)E2(Phn):

М: CGTAGTTCGTCGAGGTCCGTp

(R) pN4: (R) pCAGC

(R)pN4: (R) pCAGC (Est)

El: pGCATCAAG

L'Phn

E2: pTCCAGGCA

L'Phn PhnL

М- мишень El, E2 - эффекторы L,L' - линкеры Phn- феназиний

В приведенных выше работах было показано, что и алкилирование, и фотомодификация ДНК-мишени являются высокоэффективными за счет использования тандемов коротких олигонуклеотидов-эффекторов даже при физиологической температуре. При этом в отсутствие эффекторов модификация ДНК мишени реакционноспособными производными тетрануклеотида не наблюдалась.

Остатки стероидов в олигонуклеотиды вводили для повышения способности компонентов системы тандемных комплексов проникать через клеточную мембрану при использовании разработанной системы для воздействия на ДНК внутри клетки. Было

показано, что реакционноспособный производный тетрануклеотид (реагент), содержащий на 3'-конце остаток эстрона и на 5'-конце остаток либо алкилирующего амина, либо антибиотика блеомицина А, либо фотоактивного и-азидотетрафторбензоильного производного в присутствии 5'-холестерил-3'-феназиний-содержащих октануклеотидов (эффекторов) способен эффективно и сайтспецифично взаимодействовать с 20-звенным участком ДНК-мишени в системе in vitro при 37°С (Pyshni et al., 1995; Пышный и др., 1995; Табатадзе и др., 1997). Это позволило использовать разработанный подход для воздействия на участок (+)-цепи ДНК ВИЧ-1 на биологических моделях - моноцитарных и лимфоцитарных линиях клеток, зараженных ВИЧ-1 (Плясунова и др., 1998). Участок ДНК-мишени (нуклеотиды 7516-7535) был выбран на основе результатов более ранних работ по подавлению размножения ВИЧ-1 (Покровский и др., 1993): pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA.

Была установлена способность тандема 5'-холестерил-3'-феназиний-содержащих октануклеотидов (эффекторов) с тетрануклеотидом-реагентом, несущим на 5'-конце остаток алкилирующего амина (RC1), а на 3'-конце остаток эстрона, значительно снижать репродукцию вируса как при острой, так и при хронической инфекции (Плясунова и др., 1998):

(Chs)pGCATCAAGp(Phn) (RCl)pCAGCp(Est) (Chn)pTCCAGGCA(Phn) Phn-феназиний

Est=

CH3

—О

СН3

СН3

Chs=

-О

Приведенный выше тандем олигонуклеотидов в концентрации 10 мкМ уменьшал на 73% содержание вирусспецифического белка р24 в зараженной ВИЧ лимфоцитарной клеточной линии МТ-4 через 5 суток воздействия, в то время как традиционный анти-ВИЧ-препарат - азидотимидин снижал накопление р24 в культуральной среде за этот же период времени не более, чем на 27,5%. Авторы надеются на возможность клинического использования тандемов коротких олигонуклеотидов для лечения вирусных инфекций (Плясунова и др., 1998).

1.12. Безизлучательная передача энергии между флуорофорами. присоединенными к

олигонуклеотидам

Большое внимание в настоящее время уделяется двухкомпонентным системам олигонуклеотидных производных, состоящих, как правило, из донора энергии и акцептора, взаимодействие между которыми возможно только при физическом сближении функциональных группировок на расстоянии меньше определенного - заданного физическими свойствами компонентов (при сближении на расстояние меньше, чем Ферстеровский радиус). Каждый из элементов системы, находясь в растворе, не взаимодействует со вторым компонентом системы, но при сближении донора и акцептора энергии на расстояние, достаточное для взаимодействия, система приобретает новые свойства, которые позволяют следить за изменениями, происходящими в системе, либо приводят к необратимым изменениям компонентов системы.

Так, например, происходит в случаях, когда два различных флуорофора присоединены к двум различным олигонуклеотидам, участки связывания которых с ДНК-мишенью находятся в непосредственной близости. При образовании комплекса одновременно с двумя олигонуклеотидными производными, несущими донор и акцептор, между ними возможна безизлучательная передача энергии. Это происходит при сближении флуорофоров на растояние меньше, чем Ферстеровский радиус.

В качестве иллюстрации можно привести эксперименты, проводимые Мергни с соавторами (Мег§пуе1 а1.,1992). Для получения флуоресцентных конъюгатов использовали два 11-звенных олигонуклеотида, образующие комплементарный комплекс с 30-звенной одноцепочечной ДНК-мишенью. Участки связывания олигонуклеотидов с мишенью находятся на расстоянии в пять нуклеотидных остатков.

З'-ТТ

5'-ТТТААААААААААТТСАТАСА6СА66ААА

О-ТСТССТССТТТ-5

О

,МН(СН2)з—8

СП

При одновременном связывании обоих флуоресцентных конъюгатов олигонуклеотидов со своей матрицей хромофоры оказываются сближенными настолько, что может происходить передача энергии от кумарина, присоединенного к З'-концевому фосфату одного из олигонуклеотидов, на этидиевый остаток, присоединенный к 5'-концевому фосфату другого олигонуклеотида. Безизлучательная передача энергии обнаруживается в этих опытах по уменьшению эмиссии флуоресценции кумарина при добавлении этидий-содержащего олигонуклеотида к комплексу ДНК-мишень»кумариновое производное олигонуклеотида. В отсутствие комплементарной матрицы передачи энергии между хромофорами не наблюдается.

Для передачи энергии возбуждения требуется, чтобы хромофоры были сближены на расстояние меньшее, чем Ферстеровский радиус, поэтому как только один из олигонуклеотидов диссоциирует из комплекса, эффективность передачи энергии падает до нуля. Это наблюдается при повышении температуры. Если этидий присоединять к З'-концевому фосфату вместо 5'-концевого фосфата того же олигонуклеотида, то при образовани комплементарного комплекса передача энергии между хромофорами существенно уменьшается, поскольку расстояние между ними достаточно велико для эффективной передачи энергии.

В тех случаях, когда возможно количественно оценить эффективность передачи энергии между хромофорами, полученные данные можно использовать для определения фактического расстояния между этими группировками. Такое свойство олигонуклеотидов с

присоединенными хромофорами можно использовать при исследовании вторичной и третичной структуры биополимеров (Мег§пу й а1., 1991).

Процесс передачи энергии между флуоресцентными олигонуклеотидными конъюгатами удалось зафиксировать и на двухспиральной ДНК-матрице. Был синтезирован дуплекс, содержащий две гомопурин- гомопиримидиновые последовательности, разделенные тремя парами оснований. Акридин, ковалентно присоединенный к 11-звенному гомопиримидиновому олигонуклеотиду, использовался как донор энергии возбуждения, а остаток этидия, присоединенный к 13-звенному гомопиримидиновому олигонуклеотиду -как акцептор.

О

гч-^

(СН2)2СОМН^(У)—(()

-ын,

ш I .

РО 2

5, -СТТТТТССТТСТС-ТТ6ААААА6вАА<ЗА6ТАТААА(3<ЗА(3(ЗА0АТТ- 3' ААСТТТТТССТТСТСАТАТТТССТССТСТАА-5'

(5-ТТТССТССТСТАА-З'

I

о=р—сг

ш ^ ^

осн,

Процесс передачи энергии подтверждался уменьшением эмиссии донора при увеличении концентрации акцептора и сопутствующей сенсибиллизированной эмиссией акцептора. Анализ спектра излучения подтверждал это заключение (Мег§пу et а!., 1991). Эффективность передачи энергии снижается вместе с термической диссоциацией этидий содержащего олигонуклеотидного конъюгата.

При введении точечной мутации в ДНК-мишень (замена в-С пары на Т-А пару) в центре гомопурин-гомопиримидиновой последовательности, являющейся матрицей для этидийсодержащего олигонуклеотидного конъюгата, эффективность передачи энергии между хромофорами, присоединенными к олигонуклеотидам, существенно снижалась, ее

можно было зафиксировать лишь при температуре ниже 10°С, а при температуре 20°С градусов передача энергии между флуорофорами практически равна нулю, в то время как для матрицы дикого типа передача энергии при этой температуре максимальна.

Таким образом, способность донора и акцептора к безизлучательной передаче энергии при сближении на расстояние меньше, чем Ферстеровский радиус можно использовать в диагностических целях, например, для выявления точечных мутаций в ДНК матрицах. В случае, когда нуклеиновая кислота-мишень содержит хотя бы одно несоответствие в любом из участков связывания олигонуклеотидных производных, эффективность комплексообразования падает, при этом комплекс с участием олигонуклеотида, несущего донор или акцептор, не может образоваться и взаимодействия между флуорофорами не происходит и как следствие отсутствует передача энергии.

Приведенные в литературном обзоре данные свидетельствуют о том, что фотореакционноспособные производные олигонуклеотидов являются перспективными агентами для воздействия на нуклеиновые кислоты с целью изменения уровня экспрессии генов.

Интенсивное изучение механизмов действия уже известных реагентов и разработанные к настоящему времени олигонуклеотидные системы эффективного воздействия на нуклеиновые кислоты являются основой для создания новых систем олигонуклеотидных производных, обладающих высокой эффективностью и селективностью при модификации нуклеиновых кислот. Результаты разработки и характеризации таких систем изложены в последующих главах.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гайдамаков, Сергей Алексеевич

Выводы

1. Предложен метод направленной модификации протяженных участков нуклеиновых кислот смесью реакционноспособных производных тандемных олигонуклеотидов, полученных ограниченной химической фрагментацией полинуклеотидов. Проведена направленная химическая модификация смесью алкилирующих производных олигонуклеотидов одноцепочечной ДНК бактериофага М13шр9-21 и суперспирализованной ДНК плазмиды р11С19-С2, несущих фрагмент к-ДНК 3'-концевого участка РНК вируса ЭМК.

2. Осуществлена сайт-специфичная модификации производными синтетических олигонуклеотидов суперспирализованной ДНК плазмид, несущих фрагмент гена «"-легкой цепи иммуноглобулина мыши. Показано, что доступность участков двухцепочечной ДНК для комплементарно-адресованных реагентов зависит от степени суперспирализации ДНК, облегчающей локальное расплетение участков ДНК-мишени в присутствии олигонуклеотидных производных.

3. Сконструированы бинарные системы адресованных реагентов на основе тандемных олигонуклеотидных конъюгатов, несущих остатки фотореагентов - перфторарилазидов и сенсибилизаторов - производных пирена, бензантрацена или перилена. При образовании комплементарных комплексов обоих конъюгатов с ДНК-мишенью фотореагент и сенсибилизатор сближаются и формируют фотореакционноспособный центр, который позволяет высокоэффективно проводить сенсибилизированную к видимому свету фотомодификацию ДНК-мишени.

4. Изучены основные закономерности сенсибилизированной фотомодификации нуклеиновых кислот бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов. Показано, что позиционная направленность фотомодификации, сенсибилизированной производными пирена, изменяется в зависимости от условий облучения. Вероятнее всего это происходит влседствие изменения механизма передачи энергии с пирена на фотореагент (при облучении светом в диапазоне 365-390 нм преимущественно реализуется синглет-синглетный перенос энергии, а при облучении светом в диапазоне 365-580 нм наряду с синглет-синглетным реализуется триплет-триплетный механизм переноса энергии). Установлено, что производные пирена и бензантрацена могут многократно участвовать в инициации сенсибилизированной фотомодификации, каждая молекула сенсибилизатора позволяет модифицировать до двадцати молекул нуклеиновой кислоты мишени.

5. Осуществлена избирательная сенсибилизированная фотомодификация нуклеиновых кислот. Продемонстрировано, что при физиологических условиях бинарные системы олигонуклеотидных производных обеспечивают повышенную селективность и эффективность.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гайдамаков, Сергей Алексеевич, 1999 год

Список литературы

Абрамова ТВ, Блинов ВМ, Власов ВВ, Горн ВВ, Зарытова ВФ, Иванова ЕМ, Коневец ДА, Плясунова OA, Покровский АГ, Сандахчеев ЛС. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека производными антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток. Мол. Биол. 1990. Т. 312. С. 1259-1262.

Абрамова ТВ, Власов ВВ, Иванова ЕМ, Зарытова ВФ, Фокина ТН, Фролова ЕИ, Юрченко ЛВ. Супрессия трансляции мРНК NP-белка вируса гриппа in vitro производными антисмысловых олигонуклеотидов. Мол. Биол. 1994. Т. 28. С. 307-312.

Алфимов MB, Назаров ВБ, Якушева ОБ. Связь некоторых фотографических параметров бессеребрянных материалов с фотохимическими и спектроскопическими свойствами светочувствительных веществ. Успехи научной фотографии. 1978. Т. 19. С. 229-238.

Анципович СИ, Орецкая ТС. Двуспиральные нуклеиновые кислоты с ковалентно

связанными цепями - синтез и применение в молекулярной биологии. Успехи химии. 1998. V. 67. Р. 274-293.

Власов ВВ, Годовиков АА, Зарытова ВФ, Иванова ЕМ, Кнорре ДГ. Супрессия синтеза иммуноглобулина в клетках миеломы MORS-2 J алкилирующими производными олигонуклеотидов комплементарных мРНК кодирующихлегкую цепь иммуноглобулина. Докл. Акад. Наук СССР. 1984. Т. 276. С. 1263-1265.

Воробьев ПЕ, Маркушин ЮЯ, Сергеев ДС, Зарытова ВФ. Повышение эффективности сайт-специфического расщепления ДНК-мишени блеомициновым производным тетрануклеотида с помощью олигонуклеотидов эффекторов. Биоорган. Химия. 1996. Т. 22. С. 111-116.

Гайдамакова ЕК. Активация гена цитохрома Р450вм-3 (CYP102) фенобарбиталом: выявление потенциальных регуляторных элементов. Дис. канд. биол. наук. Новосибирск. ИЦИГ СО РАН. 1997. С. 66.

Годовикова ТС, Зарытова ВФ, Халимская ЛМ Реакционноспособные фосфамиды моно-и динуклеотидов. Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 475-481.

Грачев СА, Плетнев АГ, Василенко СК, Петров НА, Чижиков BE, Чумаков КМ. Биоорг. Химия. 1983. Т. 9. С. 986-989.

Гринева НИ, Манакова ТЕ, Герасимова ЛП, Боровкова ТВ, Кругов АА, Мисюрин АВ, Сурин ВЛ, Тагиев АФ, Осокина АВ, Духовенская ЕА, Зарытова ВФ, Левина АС, Табатадзе ДР, Туркина АГ, Хорошко НД, Саркисян ГП, Булычева ТИ, Зборовский СС. Индукция гибели опухолевых клеток при действии антисмысловых

олигонуклеотидов на клетки костного мозга и периферической крови в суспензионных культурах как подход к генотерапии хронического миелолейкоза. Российский химический журнал. 1998. Т. 5. Р. 163-174.

Грязнов СМ, Горн ВВ, Зарытова ВФ, Кумарев ВП, Левина АС, Полищук АС, Потапов ВК, Потемкин ГА, Средин ЮГ, Шабарова ЗА. Автоматический синтез олигодезоксирибонуклеотидов фосфитамидным методом на установке «Виктория-4М». Изв. СО АН СССР. Сер. Хим. 1987. Вып. 1.С. 119-123.

Добриков МИ, Горн ВВ, Зарытова ВФ, Левина АС, Приходько ТА Шишкин ГВ, Табатадзе ДР, Заалишвили ММ. Комплементарно адресованная фотомодификация нуклеиновых кислот арилазидными и перфторарилазидными производными олигонуклеотидов II. исследование специфичности по отношению к нуклеозидам. Биоорган. Химия. 1992. Т. 118. С. 1190-1198

Добриков МИ, Дудко РЮ, Левина АС, Халимская ЛМ, Шишкин ГВ. Реагенты для направленной модификации биополимеров. VII Замещенные перфторароматические азиды, влияние заместителей на фотохимические свойства и эффективность фотомодификации ими нуклеиновых кислот. Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 200-207.

Добриков МИ, Дудко РЮ, Шишкин ГВ. Реагенты для направленной модификации биополимеров. VI. Замещенные оксимы и гидразон п-бензальдегида. Синтез, спектральные свойства, прямой и сенсибилизированный фотолиз. Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 191-199.

Добриков МИ, Зарытова ВФ, Комарова НИ, Левина АС, Лохов CA, Приходько ТА, Шишкин ГВ, Табатадзе ДР, Заалишвили ММ. Эффективная комплементарно адресованная фотомодификация нуклеиновых кислот производными олигонуклеотидов, содержащих ароматическую азидогруппу. Биоорган. Химия. 1992. Т. 18. С. 540-549.

Добриков МИ, Шишкин ГВ. п-Азидотетрафторбензальдегид -высокоэфективный

гетеробифунщиональный реагент для фотоиммобилизации ферментов. Изв. СО АН СССР. Сер. хим. наук. 1990. Вып. 6. С. 50-58.

Зарытова ВФ, Кутявин ИВ, Левина АС, Мамаев СВ, Подыминогин МА. N-(2-оксиэтил)феназиниевые производные олигонуклеотидов -эфекторы комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот. Докл. Акад. Наук. 1988. Т. 302. С. 102-105.

Зарытова ВФ, Кутявин ИВ, Мамаев СВ, Подыминогин МА. Сайт направленная химическая рестрикция одноцепочечного фрагмента ДНК алкилирующим

производным тетрануклеотида йфАрОрСрА) в присутствии тетрануклеотидных эффекторов. Биоорган, химия. 1992. Т. 18. С. 895-900.

Зарытова ВФ, Кутявин ИВ, Мамаев СВ, Подыминогин МА. Эффективная и селективная модификация одноцепочечного фрагмента ДНК алтлирующими производными коротких олигодезоксинуклеотидов в присутствии эффекторов реакции N-(2-гидроксиэтил) феназиниевых производных олигодезоксирибонуклеотидов. Биоорган, химия. 1990. Т. 16. С. 1653-1660.

Иванова ЕМ, и др., Селективная модификация полиА фрагментов мРНК из теток асцитной карциномы Кребс-2 с помощью алкилирующих производных нонатимидилуридина. Мол. Биол. 1984. Т. 18. С. 613-639.

Кнорре ДГ, Зарытова ВФ, Бадашкеева АГ, Федорова ОС. Реакционноспособные

производные олигонуклеотидов как ген-направленные вещества. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М. ВИНИТИ. 1991. Т. 37. С. 1-182.

Кочетков НК, Будовский ЭИ, Свердлов ЕД, Симукова НА, Турчинский МФ, Шибаев ВН. Органическая химия нуклеиновых кислот. Химия. М. 1970. С. 310-400.

Кошкин АА, Иванова ТИ, Булычев НВ, Добриков МИ, Лебедев АВ. Фотоактивные этидиевые и азидоэтидиевые красители. Синтез, свойства и ковалентное присоединение к олигодезоксинуклеотидам. Биоорган. Химия. 1993. Т. 19. С. 570581.

Лавровский Я.В., Свинарчук Ф.П., Ефремов Я.Р., Масгюгин В.Е., Власов В.В. Связывание ядерных белков с районами промотора гена с-/о,ч -465/-435 коррелирует с клеточной пролиферацией. Мол.биол. 1994. Т. 28. С. 580-585.

Левина АС, Табатадзе ДР, Зарытова ВФ, Добриков МИ, Горн ВВ, Лохов СГ.

Комплементарно-адресованная фотомодификация ДНК-мишеней арилазидными и перфторарилазидными производными олигонуклеотидов IV. Фотомодификация и (к- ДНК-Фрагментов. Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 30-39.

Левина АС, Табатадзе ДР, Зарытова ВФ, Добриков МИ, Горн ВН, Халимская ЛМ. Комплементарно-адресованная фотомодификация нуклеиновых кислот арилазидными и перфторарилазидными производными олигонуклеотидов III. Олигонуклеотидные реагенты с фотоактивной группой на конце или внутри цепи; тандемы реагентов. Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 21-29.

Лохов СГ, Кошкин АА, Кутявин ИВ, Митякин МП, Подыминогин МА, Лебедев АВ. Влияние интеркалирующих красителей этидия и феназиния ковалентно присоединенных к 5'- или 3 -концу пентануклеотида с1(р(}АААО) на термодинамику

комплементарного и кооперативного взаимодействия. Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 196-203.

Мазин АВ, Кузнеделов КД, Краев АС, Холодилов НГ, Блинов АГ, Кузьминов АВ,

Головин СЯ, Наякшин АМ, Соловьев ВВ, Ямщиков ВФ, Кокоза ВА, Иванов СВ, Потапов ВА Санарбаев МК, Дианов ГЛ, Протопопов МО, Калачиков СМ, Богачев СС, Чикаев НА. Клонирование и секвенирование в М13. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Н-ск. Изд-во Наука. 1990. С. 116-135.

Маниатис Т, Фрич ЕФ, Сэмбрук Й. Молекулярное клонирование. М. Мир. 1984. С. 479.

Мельников МЯ, Смирнов В А. Фотохимия органических радикалов. М. изд-во МГУ. 1994. С. 90-128.

Мишенина ГФ, Самуков ВВ, Шубина ТН. Биоорган.химия. 1979. Т. 4. С. 1281-1283.

Плясунова О А, Мамаева О А, Пышный ДВ, Пышная ИА, Иванова ЕМ, Воробьев ПЕ,

Зарытова ВФ, Покровский АГ. Тандем бифункциональных производных коротких олигонуклеотидов - ингибитор репродукции вирусе иммунодефицита человека в культуре клеток. Мол. Биол. 1998. Т. 32. С. 1085-1090.

Погодина ВВ, Фролова ЕИ, Абрамова ТВ, Власов ВВ, Иванова ЕМ. Производные

олигонуклеотидов комплементарных вирусной РНК ингибируют репликацию вируса энцефалита в культуре клеток. Докл. Акад. Наук СССР. 1988. Т. 301. С. 1257-1260.

Покровский А.Г., Плясунова О. А., Блинов В.М., Власов В В., Свинарчук Ф.П., Абрамова Т В., Горн В В., Коневец Д А. Ингибированиерепродукции вируса иммунодефицита человека смысловыми и антисмысловыми олигодезоксинуклеотидами. Мол. биол. 1993. Т. 27. С. 1039-1043.

Пышный ДВ, Подыминогин МА, Пышная ИА, Лохов СГ, Иванова ЕМ, Зарытова ВФ. Взаимодействие производных коротких олиглнуклеотидов с нуклеиновыми кислотами II. Тандем коротких олигонуклеотидов - высокочувствительная система к однобуквенной замене в ДНК-мишени. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 561-568.

Пышный ДВ, Пышная ИА, Лохов СГ, Иванова ЕМ, Зарытова ВФ. Взаимодействие

производных коротких олиглнуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. I. Влияния различных типов эффекторов на алкилирование ДНК-мишеней. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 561-568.

Пышный ДВ, Пышная ИА, Лохов СГ, Иванова ЕМ, Зарытова ВФ. Взаимодействие

производных коротких олиглнуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. IV. Высокая селективность модификации ДНК алкилирующим реагентом тетрануклеотида

или его эстронового эфира в присутствии эффекторов.. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. С. 835-902.

Пышный ДВ. Новый подход к повышению селективности взаимодействия

олигонуклеотидов и их производных с нуклеиновыми кислотами. Дис. канд. хим. наук. Новосибирск. НИБХ СО РАН, 1998. Соколов MB. Измерение оптического излучения. Прикладная биофотометрия. М. Наука. 1982. С. 79-116.

Табатадзе ДР, Третьякова ЛВ, Левина АС, Пышный ДВ, Иванова ЕМ, Зарытова ВФ. Взаимодействие производных коротких олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами. III. Фотомодификация ДНК-мишеней при использовании тандемов производных коротких олигонуклеотидов. 1997. Т. 23. С. 642-647. Физер Д Физер М Реагенты для органического синтеза. Пер. с англ. М. Мир. 1970. С. 1296.

Шахбазян ПС, Бронштейн ИБ, Кафиани КА. Биохимия. 1984. Т. 49. С. 1281-1290. Agrawal S, Goodchild J, Civeira MP, Thornton AH, Sarin PS, Zamecnik PC

Oligodeoxynucleoside phosphoramidates andphosphorothioates as inhibitors of human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 1504. Agrawal S, Ikeuchi T, Sun D, Sarin PS, Konopka A Maizel J, Zamecnik PC Inhibition of human immunodeficiency virus in early infected and chronically infected cells by antisense oligodeoxynucleotides and their phosphorothioate analogues. Proc Natl Acad Sci USA.

1989. V. 86. P. 7790-7794.

Agrawal S, Mayrand SH, Zamecnik PC, Pederson T. Site-specific excision from RNA by KNase Hand mixed-phosphate-backbone oligodeoxynucleotides. Proc Natl Acad Sci USA.

1990. V. 87. P. 1401-1405.

Asseline U, Delarue M, Lancelot G, Toulme F, Thuong NT, Montenay-Garestier T, Helene C. Nucleic acid binding molecules with high affinity and base sequence specificity: Intercalating agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984. V.81. P.3297-3301. Azad RF, Brown-Driver V, Buckheit RW Jr, Anderson KP. Antiviral activity of a

phosphorothioate oligonucleotide complementary to human cytomegalovirus RNA when used in combination with antiviral nucleoside analogs. Antiviral. Res. 1995. V. 28. P. 101-111.

Bair KW, Tuttle RL, Knick VC, Cory M, McKee DD. (l-Pyrenylmethyl)amino alcohols, a new class of antitumor DNA intercalators. Discovery and initial amine side chain structure-activity studies. J. Med. Chem. 1990. V. 9. P. 2385-2393.

Barre FX., Giovannangeli C, Helene C, Harel-Bellan. Covalent crosslinks introduced via a triplehelix-forming oligonucleotide coupled to psoralen areinefficiently repaired. Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 743-749. Bates PJ, Macaulay VM, McLean MJ, Jenkins TC, Reszka AP, Laughton CA, Neidle S. Characteristics of triplex-directed photoadduct formation by psoralen-linked oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4283-4289. Belikova AM, Zarytova VF, Grineva N1. Synthesis of ribomtcleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chlorethylamine and nitrogen mustard residues. Tetrahedron Lett. 1967. No 37. P. 3557-3562. Ben-Hur E. The photochemistry andphotobiology of furocoumarins (Psoralens). Adv. Radiat.

Biol. 1984. V. 11. P. 132-171. Benimetskaya LZ, Bulychev NV, Kozionov AL, Koshkin AA, Lebedev AV, Novozhilov SYu, Stokman MI. Site-specific laser modification (cleavage) of oligodeoxynucleotides. Biopolymers. 1989. V. 28. P. 1129-1147. Bhan P and Miller PS. Photo-Cross-Linking of Psoralen-Derivatized Oligonucleoside

Methylphosphonates to Single-StrandedDNA.. Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. P. 82-88. Bhan P, Bhan A, Hong M, Hartwell JG, Saunders JM, Hoke GD. 2',5'-linked oligo-3'-deoxyribonucleoside phosphorothioate chimeras: thermal stability and antisense inhibition of gene expression.. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P.:3310-3317. Bloem A, Lockhorst H. Bcl-2 antisense therapy in multiple myeloma. Pathol. Biol. 1999. V. 47. P.216-220.

Bonn D. Prospects for antisense therapy are looking brighter. Lancet. 1996. V. 347(9004). P. 820.

Bonora GM, Tocco G, Zaramella S, Veronese FM, Pliasunova 0, Pokrovsky A, Ivanova E,

Zarytova V. Antisense activity of an anti-BW oligonucleotide conjugated to linear and branched high molecular weight polyethylene glycols. Farmaco. 1998. V. 53. P. 634-637. Cahill MA, Nordheim A, Xu YZ. Crosslinking of SRF to the c-fos SRE CArG box guanines using photo-active thioguanine oligodeoxynucleotides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 229. P. 170-175. Camien MN, Warner RC. Denaturation of covalently closed circular DNA. Kinetics, comparison of several DNAs, mechanism and ionic effects. J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 60266033.

Campbell MJ, Dawson M, Koeffler HP. Growth inhibition of DU-145 prostate cancer cells by a Bcl-2 antisense oligonucleotide is enhanced by N-(2-hydroxyphenyl)all-trans retinamide. Br. J. Cancer. 1998. V. 77. P. 739-744.

Cantor CR, Tinoco I. Absorption and optical rotatory dispertion of seven trinucleotide diphosphates. J. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 65-77.

Cazenave C, Loreau N, Thuong NT, Toulme JJ, Helene C. Enzymatic amplification of translation inhibition of rabit b-globin mRNA mediated by anti-messenger oligodeoxynucleotides covalently linked to intercalating agents. Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 4717-4736.

Chen X, Kagan J. Crosslinking and cleavage of pBR322 DNA photosensitized by 7-methylpyrido(3,4-c)psoralen. J.Photochem. Photobiol. 1994. V. 23. P. 27-33.

Cheng A, Houten BV, Gamper HB, Sancar A, Hearst JE. Use of psoralen-modified

oligonucleotides to trap three-stranded RecA-DNA complexes by ABC endonuclease. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 15110-15117.

Church GM, Gilbert W. Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 1991-1995.

Cimino GD, Gamper HB, Isaacs ST, and Hearst JE. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annu. Rev. Biochem. 1985. V. 54. P. 1151-1193.

Cirino NM, Li G, Xiao W, Torrence PF, Silverman RH. TargetingRNA decay with 2',5'

oligoadenylate-antisense in respiratory syncytial virus-infected cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 1937-1942.

Cohen JS Oligonucleotides as antisense inhibitors of gene expression. -London Mac Millan press. 1989. Ch.2. P. 25-51.

Compagno D, Lampe JN, Bourget C, Kutyavin IV, Yurchenko L, Lukhtanov EA, Gorn W,

Gamper HB Jr, Toulme JJ Antisense oligonucleotides containing modified bases inhibit in vitro translation ofLeishmania amazonensis mRNAs by invading the mini-exon hairpin. J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 8191-8198.

Doan TL, Perronault L, Praseuth D, Habhoub N, Decout JL, Thoung NT, Lhomme J, Helene C. Sequence-specific recognition, photocrosslinking and cleavage of the DNA double helix by an oligo-[alpha]-thymidylate covalently linked to an azidoproflavine derivative. Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 7749-7760.

Doan TL, Perrouault L, Asseline U, Thuong NT, Rivalle C, Bisagni E, Helene C. Recognition and photo-induced cleavage and cross-linking of nucleic acids by oligonucleotides covalently linked to ellipticine. Antisense research and development. 1991. V. 1. P. 43-54.

Doan TL, Praseuth D, Perrouault L, Chassignol M, Thuong NT, Helene C. Sequence-targeted photochemical modifications of nucleic acids by complementary oligonucleotides covalently linked to porphyrins. Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. P. 108-113.

Doronin SV, Dobrikov MI, and Lavrik Ol. Photoaffinity labeling of DNA polymerase a DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog. FEBS Letters. 1992. V. 313. P. 31-33.

Doronin SV, Dobrikov MI, Buckle M, Roux P, Buc H, Lavrik 01. Affinity modification of

human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs. FEBS Letters. 1994. V. 354. P. 200-202.

Duval-Valentin G, Takasugi M, Helene C, Sage E. Triple helix-directed psoralen crosslinks are recognizedby Uvr(A)BC excinuclease. J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 815-825.

Edelson R, Berger C, Gasparro F, Jegasothy B, Heald P, Wintroub B, Vonderhield E, Knobler E, Wolff K, Plewig K, McKiernan G, Christiansen I, Oseter RNM, Honigsmann H, Wilford H, Kokoshka E, Rehle T, Perez M, Stingl G, Laroche L. Treatment of cutaneous T-cell limfoma by extracorporealphotochemotherapy: preliminary results. N. Engl. J. Med. 1987. V. 316. P. 297-303.

Elcock AH, Rodger A, Richards WG. Theoretical studies of the intercalation of 9-hydroxyellipticine in DNA. Biopolymers. 1996. V. 3. P. 309-326.

Falkner FG, Lachau HG. Nature. 1984. V.310. P. 73-74.

Flores-Aguilar M, Besen G, Vuong C, Tatebayashi M, Munguia D, Gangan P, Wiley CA,

Freeman WR. Evaluation of retinal toxicity and efficacy ofcmti-cytomegalovirus and anti-herpes simplex virus antiviral phosphorothioate oligonucleotides ISIS 2922 and ISIS 4015. J. Infect. Dis. 1997. V. 175. P. 1308-1316.

Gaidamakova EK, Karginov VA, Kovalenko SP. Protein-binding DNA regions inside and in the vicinity of the cytochrome P450bm-3 gene from Bacillus megaterium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 198. P. 862-868.

Gamper HBJr, Kutyavin IV, Rhinehart RL, Lokhov SG, Reed MW, Meyer RB. Modulation of Cm/T, G/A, and G/T triplex stability byconjugate groups in the presence and absence of KCl Biochemistry. 1997. V. 36. P. 14816-14826.

Gasparro FP, Havre PA, Olack GA, Gunther EJ, Glazer PM. Site-specific forgetting of psoralen photoadducts with a triple helix-forming oligonucleotide: characterization of psoralen monoadduct and crosslink formation. Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 2845-2852.

Geacintov NE, Zhao R,. Kuzmin VA, Kim SK, and Pecora LJ. Mechanisms of quenching of the fluorescence of a benzo[a]pyrene tetraol metabolite model compound by 2'-deoxynucleosides. Photochem. and Photobiol. 1993. V. 58. P. 185-194.

Geiger MW, Elliot MM, Karacostas VD, Moricone TJ, Salmon JB., Sideli VL, Onge MA.

Pyrene fluorescence lifetime as a probe for oxygen penetration of micelles. Photochem. Photobiol. 1975. V. 6. P. 273-276.

Genetic Engineering News. 1998. V. 18. P. 1, 8, 38.

Gilchrest BA. Metoxalen photochemotherapy for mycosis fungoides. Cancer Treat. Rep. 1979. V. 63. P. 663-667.

Giles R. V., Tidd D.M. Increased specificity for antisense oligonucleotide targeting to RNA clevage by RNAse H using chimeric methylphosphodiester-phosphodiester structures. Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 763-768.

Glaser V. RNase L and 2-5A to enhance antisense technology and target the destruction of mRNA. Mol. Med. Today. 1996. V. 2. P. 183.

Goodchild J, Agrawal S, Civeira MP, Sarin PS, Sun D, Zamecnik PC. Inhibition of human

immunodeficiency virus replication by antisense oligodeoxynucleotides. Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1988. V. 85. P. 5507-5511.

Haseltine WA. Molecular biology of the human immunodeficiency virus type I. FASEB J. V. 5. P. 2349-2390.

Havre PA, Gunter EJ, Gasparro FP, Glazer PM. Targeted mutagenesis of DNA using triple helix-forming oligonucleotides linked to psoralen. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V. 90. P. 7879-7883.

Hearst JE. Psoralen photochemistry. Annu. Rev. Biophus. Bioeng. 1981. V.10. P .69-86.

Helene C, Doan TL, Thuong NT. Sequence-targeted photochemical reactions in single-stranded nucleic acids by oligonucleotide-photosensitizer conjugates. In: Photochemical probes in Biochemistry. Ed. Nelson PE. 1989. P. 219-229.

Helene C, Giovannangeli C, Guieysse-Ppeugeot AL, Praseuth D. Sequence-specific control of gene expression by antigene and clamp oligonucleotides. CIBA found Symp. 1997. V. 209. P. 94-102.

Helene C, and Toulme JJ. Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1049. P. 99-125.

Helene C, Giovannangeli C, Guieysse-Peugeot AL, Praseuth D. Sequence-specific control of gene expression byantigene and clamp oligonucleotides. Ciba Found Symp. 1997. V. 209. P. 94-102.

Helene C, Thoung NT, Saison-Behmoars T, Francois J-C. Sequence-specific artificial endonucleases. Tibtech. 1989. V. 7. P. 310-315.

Helene C, Toulme JJ. Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. Biochem. Biophys. Acta. 1990. V. 1049. P. 99-125.

Helene C. Control of gene expression by triple-helix forming oligonucleotides: the antigene strategy. In: Mechanism of Action of Current Synthetic Oligonicleitides, CRC Press, 1993. P. 370-385.

Heiene C. Specific gene regulation by oligonucleotides covalently linked to intercalating agents. DNA-ligand interactions. Edited by W. Guschlbauer and Saenger (Plenum Publishing Corporation). 1987. P. 127-140.

Ho DT, Sauve DM, Roberge M. Detection and isolation of DNA-bindingproteins using singlepulse ultraviolet laser crosslinking.. Anal. Biochem. 1994. V. 218. P. 248-54.

Houten B V, Gamber H, Hearst JE, Sancar A. Construction ofDNA substrates modified with

psoralen at a unique site and study of the action mechanism ofabc exonuclease on these uniformly modified substrates. J. Biol. Chem. 1986. V. 200. P. 135-140.

Iwase R, Namba M, Yamaoka T, Murakami A. Gene regulation by decoy approach (I): synthesis andproperties of photo-crosslinked oligonucleotides. Nucleic Acids Symp. Ser. 1997. V. 37. P. 203-204.

Kean JM, Murakami A, Blake KR, Cushman CD, Miller PS. Photochemical cross-linking of psoralen-derivatized oligonucleozide methylphosphonates to rabbit globin messenger UNA.. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 9113-9121.

Keller W. Determination of the number of superhelical turns in simian virus 40 DNA by gel electrophoresis. ProcNatl Acad Sci U S A. 1975. V. 72. P. 4876-80.

Khandjian EW. UV crosslinking of RNA to nylon membrane enhances hybridization signals. Mol. Biol. Rep. 1986. V. 11. P. 107-115.

Kittler L, Lober G. Sequence specificity of DNA-psoralen photoproduct formation in supercoiled plasmidDNA (pUC19). J. Photochem. Photobiol. 1995. V. 27. P. 161-166.

Knorre DG, Vlassov W, Zarytova VF, Lebedev AV, Fedorova OS. Design and Targeted Reactions of Oligonucleotide Derivatives. Boca Raton: CRC Press. 1994. P. 366.

Kondo S, Kondo Y, Li G, Silverman RH, Cowell JK. Targeted therapy of human malignant

glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene. 1998. V.16. P.:3323-3330.

Korshun VA, Pestov NB, Birikh KR, Berlin YuA. Reagent for introducing pyrene residues in oligonucleotides. Bioconj. Chem. 1992. V. 3. P. 559-562.

Koshkin AA, Kropachev KYu, Mamaev SV, Bulychev NV, Lokhov SG, Vlassov W, Lebedev AV. Ethidium and azidoethidium oligonucleotide derivatives: synthesis, complementary complex formation and sequence-specific photomodification of the single-stranded and double-stranded target oligo-andpolynucleotides. Journal of molecular recognition. 1994. V. 7. P. 177-188.

Koty PP, Zhang H, Levitt ML. Antisense bcl-2 treatment increases programmed cell death in non-small cell lung cancer cell lines. Lung Cancer. 1999. V. 23. P. 115-127.

Kozlov IA, Kubareva EA, Ivanovskaya MG, Shabarova ZA Design of new reagents on the base of DNA duplexes for irreversible inhibition of transcription factor NF-kappa B. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 279-89.

Kulka M, Smith CC., Aurelian L, Fishelevich R, Meade K, Miller P, Tso PO. Site specific of the inhibitory effects of oligo(nucleoside methylphosphonate)s complementary to the acceptor splice junction of herpes simplex virus type Immediate early mRNA 4. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 6868-6872.

Kuppermann BD. Therapeutic options for resistant cytomegalovirus retinitis. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 1997. V. 14 Suppl 1:S13-21.

Kutyavin IV, Podyminogin MA Bazhina YuN, Fedorova OS, Knorre DG, Levina AS, Mamayev S V, Zarytova VF. N-(2-hydroxyethyl)phenazinium derivatives of oligonucleotides as effectors of the sequence-specific modification of nucleic acids with reactive oligonucleotide derivatives. FEBS Lett. 1988. V. 238. P. 35-38.

Kuznetsova SA Clusel C, Ugarte E, Elias I, Vasseur M, Blumenfeld M, Shabarova ZA.

Crosslinking of double-stranded oligonucleotides containing O-methyl-substituted pyrophosphate groups to the HNF1 transcription factor in nuclear cell extract. Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 4783-4790.

Lacroix L, Lacoste J, Reddoch JF, Mergny JL, Levy D, Seidman MM, Matteucci MD, Glazer PM. Triplexformation by oligonucleotides containing5-(l-propynyl)-2'-deoxyuridine: decreased magnesiumdependence and improved intracellular gene targeting. Biochemistry. 1999. V. 38. P. 1893-901.

Laemmli UK, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press. N. Y - L. 1983. P. 262344.

Lee BL, Murakami A, Blace KR, Lin S-B, Miller PS. Interaction of Psoralen-Derivatized OligodeoxyribonucleosideMethylphosphonates with Single-Stranded DNA. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3197-3203.

Leeds JM, Henry SP, Bistner S, Scherrill S, Williams K, Levin AA. Pharmacokinetics of an

antisense oligonucleotide injected intravitreally in monkeys. Drug Metab. Dispos. 1998. V. 26. P. 670-675.

Leeds JM, Henry SP, Truong L, Zutshi A, Levin AA, Kombrust D. Pharmacokinetics of a

potential human cytomegalovirus therapeutic, a phosphorothioate oligonucleotide, after intravitreal injection in the rabbit. Drug Metab Dispos 1997. V. 25. P. 921-926.

Levina AS, Berezovskii MV, Venjaminova AG, DobrikovM I, Repkova MN, Zarytova VF. Photomodification of RNA and DNA fragments by oligonucleotide reagents bearing arylazide groups. Biochimie. 1993. V. 75. P. 25-27.

Levina AS, Tabatadze DR, Dobrikov MI, Shishkin GV, Khalimskaya LM, Zarytova VP. Site-specific photomodification of single-stranded DNA targets by arylazide and perfluoroarylazide derivatives of oligonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996. V. 6. P. 119-126

Levina AS, Tabatadze DR, Dobrikov MI, Shishkin GV, Zarytova VF. Sequence-specific photomodification of double-and single-stranded DNA, by oligonuceotide reagents bearingperfluoroarilazide group via triple-helix formation. Antisense Oligonucleotides and Ribonucleases. Arcachon. France. 1992.

Levina AS, Tabatadze DR, Dobrikov MI, Shishkin GV, Zarytova VP. Sequence-specific photomodification of single-stranded and double-stranded DNA fragments by oligonucleotide perfluoroarylazide derivative. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996. V. 6. P. 127-132.

Lisziewicz J, Sun D, Klotman M, Agrawal S, Zamecnik P, Gallo R Specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by antisense oligonucleotides: cm in vitro model for treatment. Proc.Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V. 89. P. 11209-11213.

Lisziewicz J, Sun D, Metelev V, Zamecnik P, Gallo RC, Agrawal S. Long-term treatment of human immunodeficiency virus-infected cells with antisense oligonucleotide phosphorothioates. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V. 90. P. 3860-3864.

Lokhov SG, Podyminogin MA, Sergeev DS, Silnikov VN, Kutyavin IV, Shishkin GV, Zarytova VP. Synthesis and high stability of complementary complexes of N-(2-hydroxyethyl)phenazinium derivatives of oligonucleotides. Bioconjug. Chem. 1992. V. 3. P. 414-419.

Lucibello FC, Lowag C, Neuberg M., Müller R. Trans repression of the mouse c-fos promoter: a novel mechanism offos-mediated trans-regulation. Cell. 1989. V. 59. P. 999-1007.

Maitra RK, Li G, Xiao W, Dong B, Torrence PF, Silverman RH Catalytic cleavage of an RNA target by 2-5A antisense and RNase L. J. Biol. Chem. 1995. V. 270, P. 15071-15075.

Majumdar A, Khorlin A, Dyatkina N, Lin FL, Powell J, Liu J, Fei Z, Khripine Y, Watanabe KA, George J, Glazer PM, Seidman MM. Targeted gene knockout mediated by triple helixforming oligonucleotides. - Nat. Genet. 1998. V. 2. P. 212-214.

Mann JS, Shibata Y, Meehan T. Molecular amplifiers: synthesis andfunctionalization of a

poly(aminopropyl)dextran bearing a uniquely reactive terminus for univalent attachment to biomolecules. Bioconj. Chem. 1992. V. 3. P. 554-558.

Maran A, Waller CF, Paranjape JM, Li G, Xiao W, Zhang K, Kalaycio ME, Maitra RK, Lichtin AE, Brugger W, Torrence PF, Silverman RH. 2',5'-Oligoadenylate-antisense chimeras cause RNase L to selectively degrade bcr/abl mRNA in chronic myelogenous leukemia cells. Blood. V. 92. P. 4336-4343.

Marwick C. First "antisense" drug will treat CMVretinitis. JAMA. 1998. V. 280. P. 871.

Mastruzzo L, Woisard A, Ma DD, Rizarelli E, Favre A, Le Doan T. Targeted photochemical

modification of HIV-derived oligonucleotides by antisense oligodeoxynucleotides linked to porphyrins. Photochem. Photobiol., 1994. V.60. P. 316-322.

Matsukura M., Shinosuka K, Zon G., Mitsuya H., Reitz., Cohen J.S., Broder. Phosphorotioate analogs of oligodeoxynucleotides: inhibitors of replication and cytopathic effects of human immunodeficiency v/ras.-Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V. 84. P. 7706-7710.

Mauffret O, Rene B, Convert O, Monnot M, Lescot E, Fermandjian S. Drug-DNA interactions: spectroscopic andfootprinting studies of site and sequence specificity of elliptinium. Biopolymers. 1991. V. 11. P. 1325-1341.

Maxam AM, Gilbert M. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Meth. Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

Mergny JL, Montenay-Garestier T, Rougee M, Lebedev AV, Chassignol M, Thuong NT, Helene C. Fluorescence energy transfer between dimethyldiazaperopyrenium dication and ethidium intercalated in poly d(A-T). Photochem. Photobiol. 1991. V. 4. P. 555-558.

Mergny JL, Sun JS, Montenay-Garistier T, Helene C. Fluorescent-oligodeoxy nucleotide

conjugates as probes of nucleic acid sequences and structures. J. Cell Pharmacol. 1992. V. 3.P. 80-85.

Messing J. New Ml 3 vectors for cloning. Methods in Enzymology. Ed. Wu R., Grossman L., Moldave K. N.Y.: Acad. Press. 1983. V.101. P.20-78.

Miller PS, Bi G, Kipp SA, Fok V, DeLong RK. Triplex formation by psoralen-conjugated

oligodeoxyribonucleotide containing the base analog 8-oxo-adenine. Bioconjugate Chem. 1996. V. 24. P. 730-736.

Mirkin SM, Lyamichev VI, Drushlyak KN, Dobrynin VN, Filippov SA, Frank-Kamenetskii MD. DNA H-form requires a homopurine-homopyrimidine mirror repeat. Nature. 1987. V.330, P. 495-497.

Moss T, Dimitrov SI, Houde D UV-laser crosslinking of proteins to DNA. Methods. 1997. V. 11. P. 225-34.

Mulamba GB, Hu A Azad RF, Anderson KP, Coen DM Human cytomegalovirus mutant with sequence-dependent resistance to the phosphorothioate oligonucleotide fomivirsen (ISIS 2922). Antimicrob. Agents Chemother. 1998. V. 42. P. :971-973.

Ortel B, Honigsmann H. Vitilligo treatment in therapeutic photomedicine, in Honigsmann H and StinglG. (eds.) Current Problems in Dermatology. Basel Kaegel. 1986. V. 15. P. 265.

Pathak MA, Fitzpatrick TB. The evolution of photochemotherapy with psoralens and UVA (PUVA). J. Photochem. Photobiol. 1992. V. 14. P. 3-22.

Perelroyzen M P, Volovodskii AV. Theoretical analysis of'addressed' chemical modification of DNA. Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 4693-4699.

Perroaut L, Asseline U, Christian Rivalle, Thuong NT, Bisagni E, Giovannangeli C, Le Doan T, Helene C. Sequence specific artificialphotoinduced endonucleases based on triple helix forming oligonucletides. Leters to Nature. 1990. V. 344. P. 358-360.

Perry CM, Balfour JA Fomivirsen. Drugs. 1999. V. 57. P. 375-80.

Piascik P. Fomiversen sodium approved to treat CMV retinitis. J. Am. Pharm. Assoc. 1999. V. 39. P.84-5

Pieles U, English U. Psoralen covalently linked to oligideoxyribomicleotides: synthesis, sequence specific recognition of DNA and photo-cross-linking to pyrimidine residues of DNA. Nucleic Acids Research. 1989. V. 17. P. 285-299.

Player MR, Maitra RK, Silverman RH, Torrence PF Targeting RNase L to human

immunodeficiency virus RNA with 2-5A-antisense. Antivir. Chem. Chemother 1998. V. 9. P. 225-231.

Praseuth D, Chassignol M, Takasugi M, Le Doan T, Thuong NT, Helene C. Double helices with parallel strands are formed by nuclease-resistant oligo-falphaj-deoxynucleotides and oligo-falphaj-deoxynucleotides covalently linked to an intercalating agent with complementary oligo-fbetaj-deoxynucleotides. J. Mol. Biol. 1987. V. 196. P. 939-942.

Praseuth D, Le Doan T, Chassignol M, Decount JL, Habhoub N, Lhomme J, Thuong NT, Helene C. Sequence-targeted photosensitized reactions in nucleic acids by oligo-a-deoxynucleotides and oligo-fi-deoxynucleotides covalently linked to proflavin. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3031-3038.

Pyshnyi DV, Pyshnaya I, Lokhov S, Ivanova E, Zarytova V. Minicmtisense oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides. 1997. V. 14. P. 1065-1068.

Pyshnyi DV, Pyshnaya I, Lokhov S, Podyminogin, Ivanova E, Zarytova V. A new approach to enchancing the efficiency and specificity of interaction in duplexes by the use of tandem structure. Pure Appl. Chem. 1996. V. 16. P. 1565-1570.

Pyshnyi DV, Pyshnaya I, Sergeev D, Vorobjev P, Lokhov S, Ivanova E, Zarytova V. A new

approach to potentiate site-specific hybridization: a set of hydrophobic heterofunctional shot oligodeoxyribonucleotides. Nucleosides Nucleotides. 1995. V. 14. P. 1065-1068.

Raha M, Lacroix L, Glazer PM. Mutagenesis mediated by triple helix-formingoligonucleotides conjugated to psoralen: effects of linker arm length and sequence context. Photochem Photobiol. 1998. V. 3. P. 289-294.

Ramazeilles C, Mishra RK, Moreau S, Pascolo E, Toulme JJ Antisense phosphorothioate

oligonucleotides: selective killing of the intracellular parasite Leishmania amazonensis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 7859-7863.

RoenigkHH, Martin JS. Photochemotherapyforpsoreasis. Arch. Dermatol. 1977. V. 113. P. 1667-1675.

Ruetinger RT, Wen L-P, Fulco AJ. Coding nucleotide, 5 '-regulatory and deduced amino acid sequences of P450bm-3, a single peptide cytochrome P450: NADFH-P450) reductase from Bacillus megaterium. J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 10987-10995.

Russmann C, Stollhof J, Weiss C, Beigang R, Beato M Two wavelength femtosecond laser inducedDNA-protein crosslinking. Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3967-3970.

Russmann C, Truss M, Fix A, Naumer C, Herrmann T, Schmitt J, Stollhof J, Beigang R, Beato M. Crosslinking of progesterone receptor to DNA using tuneable nanosecond, picosecond andfemtosecond UV laser pulses. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 24782484.

Santoro R, Wolfl S, Saluz HP UV-Laser inducedprotein/DNA crosslinking reveals sequence variations of DNA elements bound by c-Jun in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 256. P. 68-74.

Sage E, Moustacchi E. Sequence context effects on 8-methoxypsoralen photobinding to defined DNA fragments. Biochemistry. 1987. V. 26. P. 3307-3314.

Salganik RI, Dianov GL, Ovchinnikova LP, Voronina EN, Kokoza EB, Mazin AV. Gene-directed mutagenesis in bacteriophage T7 provided by polyalkylating RNAs complementary to selected DNA sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 27962800.

San JS, Francois JS, Montenay-Garestier T, Saison-Behmoaras T, Roig V, Chassignol M,

Thoung NT, Helene C. Sequence-specific intercalating agents. Intercalation at specific sequences on duplex DNA via major-groove recognition by oligonucleotide intercalator conjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 9198-9202.

Sarin PS, Agrawal S, Civeira MP, Goodchild J, Ikeuchi T, Zamecnik PC Inhibition of acquired immunodeficiency syndrome virus by oligodeoxynucleoside methylphosphonates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 7448-7451.

Saundararajan N, Platz MS. Synthesis and binding of new polyfluorinated aryl azides to alpha-chymotrypsin. New reagents for photoqjfinity labeling. Bioconjug. Chem. 1993. V. 4. P. 256-261.

Schmitt IM, Chimenti S, Gasparro FP. Psoralen-protein photochemistry - aforgotten field. Journal of Photochemistry and Photobiology.1995. V. 27. P. 101-107.

Schnapp KA, Poe R, Leyva E, Soundararajan N, Platz MS. A laser flash photolysis study ofdi-, tri- and tetrafluorinated phenylnitrenes; implications for photoafftnity labeling. Bioconjug. Chem. 1993. V. 2. P. 178-183.

Shi Y. and Hearst JE. Thermostability of double-stranded deoxyribonucleic acids: effects of covalent additions of a psoralen. Biochemistry. 1986. V.25. P. 5895.

Skorski T, Nieborowska-Skorska M, Wlodarski P, Perrotti D, Hoser G, Kawiak J, Majewski M, Christensen L, Iozzo RV, Calabretta B. Treatment of Philadelphia leukemia in severe combined immunodeficient mice by combination of cyclophosphamide and bcr/abl antisense oligodeoxyrmcleotides. J. Natl. Cancer Inst. 1997. 89. P. 124-133.

Stephenson ML, Zamecnik PC Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribomicleotide.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 285-288.

Stix G Shutting down a gene. Antisense drug wins approval. Sci. Am. 1998. V. 279. P. 46, 50

Sun JS, Asseline U, Rouzaud D, Montenay-Garestier T, Thuong NT, Helen C. Oligo-alpha-

deoxynucleotides covalently linked to an intercalating agent. Double helices with parallel strands are formed with complementary oligo-beta-deoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 6149-6158.

Svinarchuk F, Mastyugin V, Gorn V, Dobrikov M, Doronin S Determination of the molecular mass of the transcription factor interacting with FBS2 in c-fos promoter. Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2535-2536.

Teale FWJ, Constable D. Isolation and spectral characterization of phycobiliproteins. Biochem. J. 1970. V. 2. P. 161-169.

Teare J, Wollenzien P. Specificity of site directed psoralen addition to RNA. Nucleic Acids Research. 1989. V. 17. P. 3359-3373.

Torrence PF, Xiao W, Li G, Cramer H, Player MR, Silverman RH. Recruiting the 2-5A system for antisense therapeutics. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 203-206.

Toulme J J, Helene C. Antimessenger oligodeoxyribonucleotides: an alternative to antisense RNA for artificial regulation of gene expression. A review. Gene. 1988. V. 72. P. 51-58.

Triesman RH. Identification and purification ofpolypeptide that binds to the c-fos serum response element. TheEMBO J. 1987. V.6. P. 2711-2717.

Verspieren P, Coraelissen AW, Thuong NT, Helene C, Toulme JJ An acridine-linked

oligodeoxynucleotide targeted to the common 5' end of trypanosome mRNAs kills cultured parasites. Gene. 1987. V. 61. P. 307-315.

Vlassov W. Oligonucleotides: superspecific ligands for targeting nucleic acids and proteins and development of molecular devices. In The Lock-and Key Principle. JP. Behr, ed. (John Wiley&Song Ltd). 1994. P. 89-147.

Wayne RP. Principles and applications of photochemistry. Oxford-N.Y.-Tokyo. Oxford University Press. 1988. P. 119-148.

Wellinger RE, Sogo JM. In vivo mapping of nucleosomes usingpsoralen-DNAcrosslinking and primer extension. Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1544-1555.

Wilkinson F. Triplet quantum yields and singlet-triplet intersystem crossing. Organic Molecular Photophysics. 1975. V. 2. P. 95-158.

Xiao W, Li G, Maitra RK, Maran A, Silverman RH, Torrence PF. Correlation of selective

modifications to a 2',5'-oligoadenylate-3',5'-deoxyribonucleotide antisense chimera with affinity for the target nucleic acid and with ability to activate RNase L. J. Med. Chem. 1997. V. 40. P. 1195-1200.

Xiao W, Player MR, Li G, Zhang W, Lesiak K, Torrence PF. Synthesis and characterization of composite nucleic acids containing 2\ 5'-oligoriboadenylate linked to antisense DNA. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996. V. 6. P. 247-258.

Yurchenko LV, Abramova TV, Ivanova EM, Nevinsky GA, Nomokonova NY, Fokina TN,

Vlassov W. Suppression of influenza virus biopolymers functions and reproduction of the virus by oligodeoxynucleotide derivatives. Nucleic Acids Symp Ser. 1991. V. 24. P. 301

Zamecnik PC, Agrawal S Oligodeoxynucleotide hybridization inhibition of HIV and influenza virus. Nucleic Acids Symp. Ser. 1991. V. 24. P. 127-131.

Zamecnik PC, Stephenson ML. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell

transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 280-284.

Zerial A, Thuong NT, Helene C. Selective inhibition of the cytopathic effect of type A influenza viruses by oligodeoxynucleotides covalently linked to an intercalating agent. Nucleic Acids Res. 1987. V. 15 P. 9909-9919.

Благодарности

Автор благодарен д.х.н чл. корр. РАН Власову В. В. и к.х.н. Добрикову М. И. за общее руководство работой. Автор искренне признателен соавторам данной работы: Кошкину A.A., Гайнутдинову Т.И., Гайдамаковой Е.К., Шишкину Г.В, Лукянчук Н.П.

Автор благодарит Приходько Т.А. за наработку N-окси-сукцинимидного эфира и-азидотетрафторбензойной кислоты, Лактионова П.П. за предоставленный препарат 5-фтор-7-метилбензо [Ь] антраценил-12-уксусной кислоты 2-аминоэтиламида, Тенетову Е.Д. за предоставленный препарат периленил-3-метиламина, Абрамову Т.В., Иванову Е.М., Максакову Г.А., Цветкова И.В. за синтез олигонуклеотидов.