Тандемные системы бинарных олигонуклеотидных производных: исследование закономерностей сенсибилизированной фотомодификации биополимеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат биологических наук Гайнутдинов, Тимур Имильевич

• Гайнутдинов, Тимур Имильевич
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гайнутдинов, Тимур Имильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фотодинамическая терапия

1.1.1. Фотохимические основы ФДТ

1.1.1.1. Воздействие синглетного кислорода (фотодинамический эффект II типа)

1.1.1.2. Фотоокисление с участием радикальных частиц и переноса электрона 13 (фотодинамический эффект I типа)

1.1.2. Фотосенсибилизаторы, применяемые в фотодинамической терапии рака

1.1.2.1. Сенсибилизаторы первого поколения на основе порфиринов

1.1.2.2. Сенсибилизаторы второго поколения 17 Производные хлорофилла а и бактериохлорофилла а 19 Синтетические хлорины и бактериохлорины 21 Тетраазапорфирины 23 Аналоги порфиринов

1.1.3. Транспорт и распределение фотосенсибилизаторов в организме 25 1.1.3.1. Распределение фотосенсибилизаторов в организме 25 Транспорт и распределение фотосенсибилизаторов гидрофобной природы 26 Транспорт и распределение водорастворимых фотосенсибилизаторов

1.1.4. Патофизиологические процессы, вызывающие некроз клеток

1.1.4.1. Реакции, сенсибилизируемые в клетке

1.1.4.2. Острая воспалительная реакция (ранняя фаза) 31 Высвобоэюдение биологически активных ионов 31 Высвобождение биологически активных веществ

1.1.4.3. Отложенная воспалительная реакция (поздняя фаза) 34 Активация системы комплемента 34 Клеточные реакции и гистологические изменения

1.1.5. Недостатки, ограничения и пути совершенствования методов фотодинамической 36 терапии

1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами 39 олигонуклеотидных реагентов

1.2.1. Синглет-синглетный перенос энергии

1.2.2. Двухквантовое резонансное триплет-триплетное возбуждение

1.2.3. Перспективы использования фотореагентов для направленной модификации 45 нуклеиновых кислот in vivo

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Олигонуклеотиды

2.3. Методы

2.3.1. Получение фотоактивируемых реакционноспособных производных 48 ол и го нуклеотидо в

2.3.2. Синтез производных олигонуклеотидов, несущих остаток сенсибилизатора

2.3.3. Выделение олигонуклеотидных производных методом ВЭЖХ

2.3.4. Гашение флуоресценции периленильных производных

•К 2.3.5. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды

2.3.6. Фотомодификация нуклеиновых кислот.

2.3.7. Электрофоретический анализ продуктов модификации, радиоавтография и 52 денситометрия.

2.3.8. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени

2.3.9. Культивирование клеток.

2.3.10. Модификация клеточных белков фотоактивируемым производным 53 олигонуклеотида

2.3.11. Электрофоретический анализ белков.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-мишени на эффективность 55 сенсибилизированной фотомодификации

3.1.1. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишеней Ml и М

3.1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени МЗ

3.2. Влияние строения сенсибилизатора на скорость и эффективность 65 сенсибилизированной фотомодификации ДНК

3.2.1. Влияние заместителей в антраценовом остатке

3.2.1.1. Строение и спектрально-люминесцентные свойства сенсибилизаторов на основе 66 антрацена

3.2.1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени

3.3. Использование перилена в качестве сенсибилизатора

3.3.1. Спектрально-люминесцентные свойства перилена

3.3.2. Гашение флуоресценции олигонуклеотидного производного перилена в 72 двуцепочечных комплексах

3.3.3. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени

3.3.4. Механизм сенсибилизации фотореагента основан на переносе электрона

3.4. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотид-связывающих белков, 85 представленных на поверхности эукариотических клеток

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тандемные системы бинарных олигонуклеотидных производных: исследование закономерностей сенсибилизированной фотомодификации биополимеров»

Фотореакционноспособные производные олигонуклеотидов являются перспективными реагентами для направленной химической модификации определенных последовательностей нуклеиновых кислот и инструментами для исследования структуры и функции биополимеров [1,2].

Фотореакционноспособные конъюгаты олигонуклеотидов обладают рядом преимуществ по сравнению с другими реагентами на основе олигонуклеотидов - они инертны в отсутствие облучения, а процесс фотоактивации легко регулировать. Фотоактивация позволяет повысить селективность воздействия - реакция преимущественно проходит в сформированном аффинном комплексе. Фотоактивные антисмысловые олигонуклеотиды могут связываться с целевыми мРНК и, после облучения, ингибировать их трансляцию. Они способны образовывать трехтяжевые комплексы с двуцепочечной ДНК и ингибировать репликацию и транскрипцию генов in vitro и in vivo. Фотоактивируемые конъюгаты олигонуклеотидов могут взаимодействовать с белками, обладающими сродством к нуклеиновым кислотам, что позволяет применять их для исследования механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами и модулировать активность белков in vivo.

Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов позволяют осуществить фотомодификацию ДНК с повышенной эффективностью и селективностью [3-8]. Принцип подхода заключается в том, что используются два олигонуклеотида, комплементарные соседним участкам ДНК- или РНК-мишени, к одному из которых присоединен сенсибилизатор, к другому - фотореагент. При комплементарном связывании таких пар олигонуклеотидных конъюгатов с нуклеиновой кислотой сенсибилизатор и фотореагент сближаются, в результате чего формируется фотореакционноспособный центр. Облучение образовавшегося комплекса длинноволновым светом вызывает возбуждение сенсибилизатора с последующей активацией реагента за счет безизлучательного переноса энергии и фотомодификацию биополимера.

Фотомодификация нуклеиновых кислот и белков взаимодействующих с РНК и ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов может быть использована как инструмент в исследовательских, диагностических и терапевтических целях. В условиях in vivo исключительно важно, чтобы фотомодификация инициировалась видимым или ИК-светом, более глубоко проникающим в клетки и не вызывающим, в отличие от коротковолнового УФ, нежелательных побочных эффектов облучения. Поэтому применение бинарных систем олигонуклеотидных конъюгатов активизируемых длинноволновым светом особенно перспективно для приложения in vivo.

Целью данной работы являлось: а) - разработка новых, активируемых видимым светом, бинарных систем производных олигонуклеотидов для фотосенсибилизированной модификации биополимеров; б) - изучение влияния химической структуры сенсибилизатора и влияния последовательности целевой нуклеиновой кислоты на эффективность фотомодификацию ДНК-мишени; в) - использование бинарных систем конъюгатов олигонуклеотидов для исследования процессов взаимодействия нуклеиновых кислот с клеточными белками in vivo.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Гайнутдинов, Тимур Имильевич

выводы

1. Предложены и охарактеризованы новые бинарные системы фотоактивируемых олигонук-леотидных реагентов с использованием сенсибилизаторов - 3-периленметиламина и 3-аминопропионилгидразон-9-антраценаля и фотореагента N-(4-азидотетрафторбензилиден)-ГЧ'-(3-аминопропил)гидразина. Фотохимические свойства комбинаций предложенных сенсибилизаторов и фотореагента позволяют осуществить инициированную видимым светом (более 460 нм) высокоселективную сайт-специфическую фотомодификацию комплементарной ДНК-мишени и обеспечивают инертность компонентов в отсутствие целевого биополимера.

2. Показано, что в отличие от ранее использованных сенсибилизаторов, нерасходуемых в ходе реакции фотомодификации целевой нуклеиновой кислоты, сенсибилизированная 3-периленметиламином фотомодификация сопровождается инактивацией сенсибилизатора, вероятно, вследствие фотоокисления периленового остатка за счет фотоиндуцированного переноса электрона с азидогруппы реагента на электронно-возбужденный сенсибилизатор.

3. Продемонстрировано, что использование олигонуклеотидного производного 9-хлор-10-аминометилантрацена для сенсибилизации фотомодификации ДНК-мишени в сочетании с выбором целевой последовательности, содержащей в предполагаемом сайте модификации нуклеотидную последовательность (pG)4, позволяет осуществить количественную модификацию ДНК.

4. С использованием бинарной системы олигонуклеотидных конъюгатов исследовано взаимодействие поверхностных белков эукариотических клеток с экстраклеточными нуклеиновыми кислотами. В условиях in vivo продемонстрировано, что данные белки, связывающие олигонуклеотиды, участвуют и в связывании двуцепочечной ДНК

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гайнутдинов, Тимур Имильевич, 2003 год

1. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and Targeted Reactions of Oligonucleotide Derivatives. Boca Raton, Florida, CRC Press. 1994.

2. Каневский Н.Э., Кузнецова C.A. Получение реакционноспособных производных нуклеиновых кислот и их использование для исследования структуры и функций биополимеров., Успехи химии, 1998, Т. 67, С. 688-704

3. Vlassov V.V., Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gaidamakova E.K., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A. DNA and RNA Cleavers and Chemotherapy of Cancer and Viral Diseases. Dordrecht, Kluwer Acad. Publiser. NATO ASI Series. 1996, V. 479, P. 309-317.

4. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized Photomodification of Single-Stranded DNA by a Binary System of Oligonucleotide Conjugates.

5. Antisense. Nucleic. Acid Drug Dev., 1997, V. 7, P. 309-317.

6. Добриков М.И., Гайдамаков С.А., Шишкин Г.В., Власов В.В. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов. III. Двухквантовая сенсибилизация. Биоорган, химия, 1998, Т. 24, С. 831-838.

7. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей. Сор. Обр. Журнал, 1996, Т. 8, С 32-40.

8. Шинкаренко H. В., Алесковский В. Б. Химические свойства синглетного молекулярногокислорода и значение его в биологических системах. Успехи химии, 1982, Т. LI, С. 713-735.

9. Lipson R.L., Baldes E.J., Gray M.J. Hematoporphyrin Derivative for Detection and Management of Cancer. Cancer 1967, V. 12, P. 2255-2257

10. Byrne C.J., Marshallsay L.V., Ward A.D. The composition of Photophryne II. J Photochem Photobiol 8, 1990, V. 6, P. 13-27

11. Moan J., Properties for Optimal PDT Sensitizers. J. Photochem. Photobiol., B: Biology, 1990, V. 5, P. 521-524.

12. Matsuura E., Fukimbara Т., Kawahara H., Ito H. Studies on photodynamic action of chlorophyl derivatives—phototoxicity of pheophorbide-A on rats. Kitasato Arch. EjcP. Med, 1988, V. 61, P. 201-213

13. Kochubeev G.A., Frolov A.A., Sarzhevskaia M.V., Gurinovich G.P. Erythrocyte Photohemolysis Sensitized by Chlorine e6. Biofizika, 1987, V. 32, P. 652-655

14. Roberts W.G., Shiau F.Y., Nelson J.S., Smith K.M., Berns M.W. In vitro Characterization of Monoaspartyl Chlorin e6 and Diaspartyl Chlorin e6 for Photodynamic Therapy. J. Natl. Cance.r Inst., 1988, V. 80, P. 330-336

15. Kessel D. Determinants of Photosensitization by Mono-L-aspartyl Chlorin e6. Photochem. Photobiol., 1989a, V. 49, P. 447-452

16. Borland C.F., McGarvey D.J., Morgan A.R., Truscott T.G. Laser flash photolysis of purpurins: novel potential photosensitizers of interest in photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B, 1988, V. 2, P. 427-434.

17. Kessel D. Determinants of Photosensitization by Purpurin. Photochem. Photobiol., 1989b, V. 50, P. 169174

18. Morgan A.R., Rampersaud A., Garbo G.M., Keck R.W., Selman S.H. New sensitizers for photodynamic therapy: controlled synthesis of purpurins and their effect on normal tissue. J. Med Chem., 1989, V. 32, P. 904-908

19. Sahai D., Lo J.L., Hagen I.K., Bergstrom L., Chernomorsky S., Poretz R.D. Metabolically Convertible Lipophilic Derivatives of pH-Sensitive Amphipathic Photosensitizers. Photochem. Photobiol., 1993, V. 58, P. 803-808.

20. Henderson B.W., Sumlin А.В., Owczarczak B.L., Dougherty T.J. Bacteriochlorophyll-a as photosensitizer for photodynamic treatment of transplantable murine tumors. J. Photochem. Photobiol. B, 1991, V. 10, P. 303-313.

21. Schuitmaker J.J., van Best J.A., van Delft J.L., Dubbelman T.M., Oosterhuis J.A., de Wolff-Rouendaal D. Bacteriochlorin a, a new photosensitizer in photodynamic therapy. In vivo results. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1990, V. 31, P. 1444-1450.

22. Bonnett R., Photosensitizers of the Porphyrin and Phtolocyanine Series for Photodynamic Therapy, Chem. Soc. Reviews, 1995, V. 24, P. 19-33.

23. Michels S., Barbazetto I., Schmidt-Erfurth U. Choroidal changes after photodynamic therapy (PDT). A two-year follow-up study of 38 patients. Klin. Monatsbl. Augenheilkd., 2000, V. 217, P. 94-99.

24. Rousset N., Vonarx V., Eleouet S., Carre J., Bourre L., Lajat Y., Patrice T. Cellular Distribution and Phototoxicity of Benzoporphyrin Derivative and Photofrin. Res. ExP. Med. (Berl.), 2000, V. 199, P. 341357.

25. Kaplan M.J., Somers R.G., Greenberg R.H., Ackler J. Photodynamic Therapy in the Management of Metastatic Cutaneous Adenocarcinomas: Case Reports from Phase 1/2 Studies Using Tin Ethyl Etiopurpurin (SnET2). J. Surg. Oncol., 1998, V. 67, P. 121-125.

26. Rosental I., Ben-Hur E. Phthalocyanines in Photobiology. New York, VCH, 1989, P. 393-425.

27. Ochsner M. Light scattering of human skin: a comparison between zinc (Il)-phthalocyanine and photofrin II. J. Photochem. Photobiol. В., 1996, V. 32, P. 3-9.

28. Henderson B.W., Doughterty T.J. How Does Photodynamic Therapy Work? Photochem. Photobiol., 1992, V. 55, P. 145-157.

29. Firey P.A., Rodgers M.A. Photo-properties of a silicon naphthalocyanine: a potential photosensitizer for photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., 1987, V. 45, P. 535-538.

30. Aramendia P.F., Redmond R.W., Nonell S., Schuster W., Braslavsky S.E., Schaffner K., Vogel E. The photophysical properties of porphycenes: potential photodynamic therapy agents. Photochem. Photobiol., 1986, V. 44, P. 555-559.

31. Patterson M.S., Wilson B.C., Graff R. In Vivo Tests of the Concept of Photodynamic Threshold Dose in Normal Rat Liver Photositized by Aluminium Chlorsulphonated Phthalocyanine. Photochem. Photobiol., 1990, V. 51, P. 343-349.

32. Weishaupt K.R., Gomer C.J., Doughterty T.J. Identification of Singlet Oxygen as the Cytotoxic Agent in

33. Photo-Inactivation of a Murine Tumor. Cancer Researh, 1976, V. 36, P. 2326-2329.

34. Moan J., Boye E. Photodinamic Effect on DNA and Cell Survival of Human Cells Sensitized by Hematoporphyrn. Photochem. Photobiophys., 1981, V. 2, P. 301-307.

35. Foster Т.Н., Murant R.S., Bryant T.G., Knox R.S., Gibson S.L., Hilf R. Oxygen Consumption and Diffusion Effects in Photodinamic Therapy. Radial. Res., 1991, V. 126, P. 296-303.

36. Henning J.P., Fourier R.L., Hampton J.A. A Transient Mathematical Model of Oxygen Depletion During Photodinamic Therapy. Radial. Res., 1995, V. 142, P. 221-226.

37. Geiger P.G., Korytowski W., Girotti A.W. Photodynamically Generated 3|}-hydroxy-5a-cholest-6-ene-5-hydroxyperoxyde: Toxic Reactivity In Membranes And Susceptibility To Enzymatic Detoxification. Photochem. Photobiol., 1995, V. 62, P. 580-587.

38. Kulig M.J., Smith L.L. J. Org. Chem., 1973, V. 38, P. 3639-3642.

39. Gollnick K. Type II Photooxygenation Reactions in Solution. Adv. Photochem., 1968, V. 6, P. 1-122.

40. Murrel G., Francis M., Bromley L. Fibroblasts Release Superoxide Free Radicals. Biochem. Soc. Trans., 1989, V. 17, P. 483-484.

41. Straight R.C., Spikes J.D., Photosensitized Oxidation of Biomolecules. Boca Raton, CRC Press, 1985, P. 92-143.

42. Foote C.S. Photooxydation of biological model compounds. In: Oxygen and Oxy-Radicals in Chemistry and Biology. Eds: Rodgers M. and Powers E.L. New York, Academic Press, 1981, P. 425-440.

43. Scalkos D., Hampton J.A. Iminium Salt Benzochlorins as Potential Photosensitizers In Photodynamic Therapy. Med. Che. Res., 1992, V. 2, P. 276-281.

44. Selman S.H., Hampton J.A., Morgan A.R., Keck R.W., Balkany A.D., Scalkos D. Copper Benzochlorin, A Novel Photosensitizer For Photodynamic Therapy: Effects On Transplantable Urothelial Tumor. Photochem. Photobiol., 1993, V. 57, P. 681-685.

45. Hampton J.A., Skalkos D., Taylor P.M., Selman S.H. Iminium Salt of Copper Benzochlorine (CDS1), a Novell Photosensitizer for Photodynamic Therapy: Mechanism of Cell Killing. Photochem. Photobiol., 1993, V. 58, P. 100-105.

46. Egorov S., Kamalov V., Koroteev N., Krasnovsky A., Toleutaev В., Zinukov S. Rise and Decay Kinetics of Photosensitized Singlet Oxygen Luminiscence in Water. Chem. Phys. Lett., 1989, V. 163, P. 421-424.

47. Wilkinson F., Brummer J. Rate Constants for the Decay and Reactions of the Lowest Electronicaly Excited Singlet State of Molecular Oxygen in Solution. J. Phys. Chem. Ref. Data, 1981, V. 10, P. 809999.

48. Kanolsky J. Quencin of Singlet Oxygen by Human Red Cell Ghosts. Photochem. Photobiol., 1991, V. 53, P. 93-99.

49. Baker A., Kanofsky J. Quenching of Singlet Oxygen by Biomolecules from L1210 Leukemia Cells.

50. Photochem. Photobiol., 1992, V. 55, P. 523-528.66.