Сиквенс-специфическая химическая модификация двуцепочечной ДНК алкалирующими производными олигонуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Демченко, Елена Николаевна

• Демченко, Елена Николаевна
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Демченко, Елена Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ТРЕХЦЕПОЧЕЧНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1.1. Открытие тройных комплексов

1.2. Структура триплексов

1.2.1. Нуклеотидные последовательности, способные образовывать триплексы

1.2.2. Ориентация третьей цепи

1.2.3. Конформация триплексов

1.3. Межмолекулярные и внутримолекулярные триплексы

1.4. Геометрия триплексов

1.5. Специфичность образования триплексов

1.6. Стабилизация триплексов

1.6.1. Стабилизация триплексов с помощью уменьшения отталкивания

полинуклеотидных цепей

1.6.2. Влияние рН на сстабильность триплексов

1.6.3. Зависимость стабильности триплексов от длины РиРу тракта и третьей цепи

1.6.4. Влияние гидрофобных заместителей в основаниях третьей цепи на

стабильность триплексов

1.6.5. Стабилизация тройных комплексов триплекс-специфичными лигандами

1.6.6. Некоторые особенности стабилизации межмолекулярных и

внутримолекулярных триплексов

1.7 Воздействие на основные генетические процессы с помощью триплекс образующих олигонуклеотидов

ГЛАВА 2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Описание выбранной модельной системы и сё характсризация

2.2. Модификация мишени I алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов 1 и 2

2.3. Модификация мишеней II и III алкилирующими производными

пиримидиновых олигонуклеотидов 3, 4,5

2.4. Модификация дцДНК производными пуриновых олигонуклеотидов

2.5. Разработка метода количественной модификации дцДНК алкилирующим

производным пиримидинового олигонуклеотида 1

2.6. Модификация дцДНК в составе несовершенных тройных комплексов

2.7. Модификация дцДНК [32Р]-меченым алкилирующим производным

олигонуклеотида 2

2.8. Модификация дцДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов, несущими реакционноспособные группы на З'-концевом фосфате, либо на 5'- и 3'-

концевых фосфатах одновременно

2.9. Определение структуры несовершенных комплексов

2.10. Модификация дцДНК в составе тройного комплекса алкилирующими производными длинного (15-мера) и короткого (6-мера) пирмидиновых

олигонуклеотидов

2.11. Оценка скорости образования комплекса 15-мера с ДНК-мишенью в различных

условиях с помощью гель-электрофореза в неденатурирующих условиях

2.12. Изучение эффективности модификации ДНК-мишени алкилирующим

производным 15-мера в составе двух типов комплексов

2.13. Изучение зависимости степени модификации ДНК-мишени производными 6-мера и 15-мера

от рН в различных солевых условиях

ГЛАВА 3

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.2..Методьт

3.2.1. Буферные системы

3.2.2. Трансформация клеток Е. coíi

3.2.3. Выделение дцДНК

3.2.4. Введение 5'-конецевой 32Р метки в олигонуклеотидьг

3.2.5. Синтез производных олигонуклеотидов, несущих остатки

4-(Н-2-хлорэтил-Н-метиламино) бензил амина на 5-концевых фосфатах

3.2.6. Синтез феназиниевого производного одигонукдеотида - эффектора

3.2.7 Секвенирование фрагментов ДНК

3.2.8 Дот-гибрвдиизация 32Р-меченных пиримидиновых олигонуклеотидов с дцДНК 107 ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сиквенс-специфическая химическая модификация двуцепочечной ДНК алкалирующими производными олигонуклеотидов»

ВВЕДЕНИЕ

Создание методов необратимой инактивации и регуляции экспрессии определенных генов является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Наиболее перспективным подходом к решению этой задачи является направленное воздействие на конкретные генетические программы с помощью олигонуклеотидов и их производных, способных избирательно взаимодействовать с характерными для этих программ нуклеотидными последовательностями, модулируя эффективность их функционирования.

Метод регуляции экспрессии генов с помощью комплементарных матричным РНК олигонуклеотидов (антисмысловых олигонуклеотидов), впервые предложенный Н. Гриневой (ВеИкоуа а1., 1967), оказал большое влияние на пути развития современной медицинской химии (\Vickstrom, 1991). Еще более перспективным представляется создание методов направленного воздействия на определенные участки геномной ДНК, так как в этом случае возможно необратимое изменение генетических программ и достижение долговременных эффектов. Прямым подходом к решению этой проблемы является использование гомопуриновых и гомопиримидиновых олигонуклеотидов, способных образовывать комплексы с соответствующими участками двуцепочечной ДНК (дцДНК) (ЗоуГег & Ро1ашап, 1996).

Связывание олигонуклеотидов с ДНК может приводить к нарушению взаимодействия специфических регуляторных белковых молекул и ферментов с ДНК, или к изменению хода биологических процессов в результате стабилизации дуплексной структуры нуклеиновой кислоты. С помощью реакционноспособных производных гомопиримидиновых и гомопуриновых олигонуклеотидов может быть осуществлена направленная химическая модификации дцДНК и необратимая инактивация или модуляция экспрессии отдельных генов. Одним из наиболее перспективных классов реакционноспособных производных олигонуклеотидов для модификации ДНК являются конъюгаты олигонуклеотидов с

алкилирующими группировками. Возможность расщепления ДНК по алкилированным основаниям позволяет точно определять направленность и глубину модификации. Механизм алкилирования одноцепочечной ДНК производными олигонуклеотидов был детально исследован, изучены свойства продуктов модификации (Кпогге е* а1., 1989). Потенциальная пространственная доступность основных мишеней алкилирования, N7 атомов гуанозинов для реакционноспособной группы олигонуклеотидных конъюгатов, связывающихся в большой бороздке дцДНК, позволяет надеяться, что алкилирующие производные олигонуклеотидов могут быть использованы для эффективной модификации дцДНК. Возможность осуществления такой модификации дцДНК алкилирующими производными олигоцитидилатов в составе трехцепочечного комплекса бьша впервые продемонстрирована в работе (Кнорре и др., 1988).

Целью настоящей работы является изучение специфичности и эффективности алкилирования дцДНК реакционноспособными производными пиримидиновых и пуриновых олигонуклеотидов, несущих алкилирующую группу на 5- и 3'- концевых фосфатах; изучение закономерностей образования комплексов олигонуклеотидов с дцДНК в различных условиях; разработка методов повышения специфичности и эффективности модификации дцДНК-мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А DP - аденозиндифосфат

DMSO - диметштсульфоксид

DMF А - димегилформамид

DMS - диметилсульфат

EDTA - этилендиаминтеграуксусная кислота

N-Melm - N-метилимидазол

РЬзР - трифенилфосфин

(PyS)2 - дипиридилдисульфид

SDS - додецилсульфат натрия

ß-МЭ - ß-меркаптоэтанол

дцДНК - двуцепочечная ДНК

ТФО - триплексформирующие олигонуклеотиды

ТЭА - триэтиламин

е. а. - единица активности

o.e. - оптическая единица

п.о. - пара оснований

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ТРЕХЦЕПОЧЕЧНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1Л. Открытие тройных комплексов

Впервые о существовании трехцепочечных нуклеиновых кислот было сообщено в работе Feisenfeld с соавторами в 1957 году (Felsenfeld et al.,1957): с помощью спектрофотометрических методов было доказано образование комплекса, состоящего из одной цепи poly(A) и двух цепей poly(U). Дальнейшие исследования этих же авторов позволили выявить ряд особенностей трехцепочечных нуклеиновых кислот (Rich, 1958). Кинетические исследования показали, что образование тройных комплексов происходит медленнее, чем образование дуплексов. Увеличение ионной силы раствора приводит к уменьшению отталкивания между отрицательными зарядами фосфатов полинуклеотидных цепей, ускоряя процесс образования триплексов; двухвалентные катионы оказывают более сильное влияние на формирование триплексов, чем одновалентные. Было высказано предположение, что уридин, принадлежащий третьей цепи, образует две водородные связи с аденозином, находящимся в дуплексе, образованном с помощью Уотсон-Криковского взаимодействия. Продемонстрировано, что полинуклеотиды poly(I) и poly(A) также могут образовывать тройной комплекс следующего состава: poly(I)»poly(A)*poly(I).

Рентгеноструктурные исследования (Hoogsteen, 1959) показали, что водородные связи между дуплексом и третьей цепью образуются отличным от Уотсон-Криковского взаимодействия образом. Данный тип образования водородных связей получил название Хугстеновского взаимодействия.

Вскоре было сообщено о существовании комплексов с отличным от poly(A)*poly(U)*poly(U) составом. Было исследовано взаимодействие poly(C) с короткими олигонуклеотидами GG и GGG (Lipsett, 1964) и показано, что при нейтральных pH образуется стехиометрический комплекс 1G:1C, а при понижении pH ниже 6.0 в результате протонирования остатков цитозина образуется комплекс 1G:2C. Было также обнаружено, что при нейтральных pH образуется триплекс со стехиометрией 2G:1C. Взаимодействие молекул poly(C) и poIy(G) происходит в соотношении 1:1, тройной комплекс 2G.1C образуется только при существенном уменьшении степени полимеризации (Pochon, & Michel son, 1965). Было сделано предположение о том, что структурная организация длинных молекул нуклеиновых кислот не допускает образования протяженных трехцепочечных комплексов; разрывы же в дуплексе и (или) третьей цепи способствуют формированию триплексов. Эксперименты показали, что образование триплексов в системе poly(G) + poly(C) в отличии от системы poly(A) + poly(U) является более сложным и зачастую невоспроизводимым процессом (Haas & Guschlbauer, 1976). Кроме присутствия катионов, нейтрализующих отрицательные заряды фосфатов полинуклеотидных цепей, требуется наличие дополнительных стабилизирующих триплексы факторов.

Более поздние исследования показали, что в определенных условиях такой комплекс не является метастабильной структурой (Marek & Thiele, 1978). Знания о возможном составе тройных комплексов расширились после того, как была доказана возможность существования poly(dT)»poly(dA)*poly(U) триплекса (Rich, 1960).Стало известно, что в образовании тройных комплексов способны принимать участие как РНК, так и ДНК цепи. В своих исследованиях Morgan и Wells продемонстрировали образование триплексов poly [d(T-C)]e poly [d(G-A)]*poly[(U-C)], доказав этим, что тройные комплексы могут образовывать не только гомополимерные цепи, но и гомопуриновые и гомопиримидиновые полимеры смешанной последовательности (Morgan & Wells, 1968).

Таким образом, некоторые особенности образования тройных комплексов были исследованы достаточно давно. Однако, значительный интерес к структурам триплексов появился только в середине 80-х годов, когда были сделаны два независимых открытия. Во-первых, было обнаружено, что в суперспирализованных плазмидах гомопурин-гомопиримидиновые тракты принимают необычную форму, включающую в себя в качестве важнейшего структурного элемента триплексные структуры (Lyamichev et al., 1986; Mirkin et al., 1987). Во-вторых, несколько различных исследовательских групп продемонстрировали, что гетерогенные гомопиримидиновые и некоторые гомопурин-богатые олигонуклеотиды могут образовывать стабильные сиквенс-специфические комплексы с соответствующими гомопурин-гомопиримидиновыми участками дцДНК ( Le Doan et al., 1987; Moser &Dervan, 1987). Бьшо показано, что эти структуры являются тройными комплексами, а не D-петлями, в которых олигонуклеотид замещает одну из цепей дуплекса. Эти открытия вызвали значительный рост интереса к исследованиям в области строения и биологических функций трехцепочечных нуклеиновых кислот.

1.2. Структура триплексов

1.2.1. Нуклеотидные последовательности, способные образовывать триплексы

Было показано, что триплексы могут образовываться гомопурин-гомопиримидиновым дуплексом, сформированным с помощью Уотсон-Криковских водородных связей, и третьей гомопиримидиновой или шмопуриновой цепью, которая образует с пуриновой цепью дуплекса водородные связи Хугстеновского типа (Morgan & Wells, 1968; Broitman et al., 1987). Таким образом, тройные комплексы могут быть двух

типов: либо пиримидин - пурин - пиримидин содержащие (РуРиРу), либо пиримидин - пурин - пурин содержащие (PyPuPu). Тройные комплексы могут формироваться как ДНК, так и РНК цепями,

* +

Мономерными звеньями РуРиРу триплексов являются канонические триады CG С и

ТА*Т (UA*U) (Ри* - триплексобразующая пуриновая цепь) (рис. 1). Для образования

Хугстеновских водородных связей с дуплексом, третья цепь должна располагаться в

большой бороздке двойной спирали (Hoogsteen, 1963). Изоморфизм обеих канонических

триад позволяет образовывать регулярную трехцепочечную спираль. Возможность

образования таких структур ограничена частотой встречаемости протяженных шмопурин-

гомопиримидиновых трактов в последовательности ДНК. Важной особенностью РуРиРу

триплексов является то, что формирование таких структур происходит при кислых рН, так £ .

как образование CG С триады требует протонирования N3 цитозина третьей цепи (Morgan & Wells, 1968; Lee et al, 1979).

Первоначально считалось, что PyPuPu триплексы могут включать в свой состав только CGG и ТА А триады (Broitman et al., 1987; Kohwi & Kohwi-Shigematsu 1988; Beraues et al., 1990). Более поздние исследования с помощью методов ДНКазнош футпринтинга, олигонуклеотид-направленного расщепления, ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования показали, что, несмотря на нарушение оптимальных условий для спаривания оснований и конформации рибозофосфатного остова, в состав PyPuPu триплексов может быть включено некоторое количество ТА*Т триад (Beal & Dervan, 1991; Radhaktishnan et ai., 1991). Таким образом, термин PyPuPu триплекс не является исчерпывающим по отношению к химической природе третьей цепи (рис.2). Триады PyPuPu триплексов менее изоморфны, чем триады РуРиРу триплексов.

Следует заметить, что триады, содержащие в третьей цепи тимин, цитозин и гуанин, могут существовать в двух изомерных конфигурациях (обзор: Thuong & Helene, 1993). В одной из этих конфигураций (нормальное Хугстеновское взаимодействие) третье основание

Рисунок 1. Канонические триады РуРиРу триплексов, образованные с помощью Хугстеновских водородных связей. Третья пиримидиновая цепь имеет син- конформацию гликозидных связей.

Рисунок 2. Основные триады РуРиРи триплексов, образованные с помощью обращенных Хугстеновских водородных связей. Третья пуриновая цепь имеет анти- конформацию гликозидных связей.

ориентировано согласно схеме предложенной Хугстеном (Hoogsteen, 1959). В другой конфигурации (обращенное Хугстеновское взаимодействие) основания третьей цепи повернуты на 180° относительно их положения в предложенной схеме. Аденин в третьей цепи образует две водородные связи и может принимать только одну конфигурацию (обращенную Хугстеновскую). Отличием между двумя типами тройных комплексов является то, что в PyPuPu триплексах для существования стекиншвого взаимодействия между CG G, ТА А и ТА Т триадами требуется образование водородных связей по обращенно Хугстеновскому типу (Beal & Dervan, 1991).

В то время, как в РуРиРу триплексах последовательность третьей цепи полностью определяется последовательностью дуплекса, для PyPuPu триплексов ситуация не столь очевидна. Третья цепь может состоять из трех оснований G, А и Т, при этом положение гуанина соответствует положению гуанина в пуриновой цепи дуплекса, тогда как аденин или тимин могут соответствовать аденину дуплекса. Недавно было показано, что для конкретных

олигонуклеотидных систем константы связывания двадцатизвенных G,T- и G, А-содержащих

¿ i 7 1

олигонуклеотидов в триплекс могут существенно отличаться: 10 М" и 2.510 М" соответственно (Alunni-Fabbroni et al., 1996).

При кислых рН может также образовываться триада CG А (рис.2), в которой протонированный аденин третьей цепи соответствует гуанину дуплекса (Malkov et al.,1993).

Менее изучены гибридные триплексы, состоящие из ДНК и РНК цепей. В принципе возможно существование восьми комбинаций РНК и ДНК цепей внутри триплекса. По недостаточно понятным причинам результаты исследований разных групп ученых об относительной стабильности гибридных РуРиРу триплексов каждого типа существенно отличаются (Roberts & Crothers, 1992; Escude et al., 1993; Han & Dervan, 1993). Это может быть объяснено различиями в последовательностях изучаемых объектов и (или) в условиях, в которых проводилось формирование триплексов. Тем не менее, все данные согласованно

указывают на то, что комплексы более стабильны, если в качестве гомопуриновой триплексобразующей цепи дуплекса выступает цепь ДНК, а не РНК.

1. 2. 2. Ориентация третьей цепи.

Одним из важнейших вопросов при изучении тройных комплексов является взаимная ориентация химически гомологичных цепей, которая теоретически может быть как параллельной; так и антипараллельной. Для РуРиРу комплексов, образованных с помощью канонических Хугстеновских водородных связей и имеющих син- конформацию гликозидных связей третьей цепи, ориентации третьей пиримидиновой цепи параллельна пуриновой цепи дуплекса. Если третья цепь имеет анти- конформацию гликозидной связи и триады образуются с помощью обращенных Хугстеновских водородных связей, то ориентация третьей пиримидиновой цепи антипараллельна относительно пуриновой цепи дуплекса. С помощью рентгеноструктурного анализа на примере poly(dT)*poly(dA)*poIy(dT) триплекса была доказана антипараллельная ориентация пиримидиновых цепей (Arnott & Seising, 1974)! Антипараллельность ориентации третьей цепи (по отношению к химически гомологичной) следует также из предложенной модели Н-формы ДНК (Lyamichev et al., 1986) и кривых плавления межмолекулярных триплексов (Manzini et al, 1990). Данные, прямо указывающие на антипараллельную ориентацию пиримидиновых цепей, получены в экспериментах с расщепляющими и фотореакционноспособными олигонуклеотидными производными (Le Doan et al., 1987; Moser. & Dervan, 1987).

Для PyPuPu комплексов анти- конформация гликозидной связи третьей цепи и образование обращенных Хугстеновских водородных связей соответствует антипараллельной ориентации третьей пуриновой цепи относительно пуриновой цепи

дуплекса. Син- конформация гликозидной связи третьей цепи и образование канонических Хугстеновских водородных связей предполагает параллельную ориентацию третьей пуриновой цепи пуриновой цепи дуплекса. Антипараллельная ориентация двух химически гомологичных цепей в РуРиРи тройных комплексах была доказана экспериментально с помощью ЯМР (ЯасШакйзЬпап е1 а1,, 1991), с помощью расщепления дцДНК триплексформирующими олигонуклеотидами (ТФО) с присоединенной Ре-ЕБТА группировкой (Веа1 & Вегуап, 1991), а также с помощью фотофутпринтинга (Ргапк-Катепе1з1ш ег а1., 1991).

1.2.3. Конформация триплексов

Первая попытка определить структуру poly(dT)poly(dA)poly(dT) триплекса, используя дифракцию рентгеновских лучей, была сделана в 1974г. (Arnott & Seising, 1974). Были определены два важнейших параметра тройной спирали; расстояние между основаниями, равное 3,26А, и угол вращения, равный 30°. Построенная на этих экспериментальных данных модель предполагала, что триплекс имеет структуру, подобную А-форме ДНК, с 12 триадами оснований на виток спирали и СЗ'-эндо фуранозными кольцами (Arnott et al., 1976).

Исследования последних лет показали, что структура дуплекса, входящего в состав многих тройных комплексов отличается от канонической А-формы ДНК. С помощью инфракрасной спектроскопии было показано, что полинуклеотидная спираль poly(dT)poly(dA)po!y(dT) имеет С2'-эндо конформацию сахара, характерную для структуры В-формы ДНК (Liquier et al., 1991; Howard et al., 1992), вместо СЗ'-эндо конформации в модели Arnott (Arnott & Seising, 1974; Arnott et al.,1976). Позднее методом спектроскопии было показано, что и другие РуРиРу триплексы также содержат структурные черты В-

формы. Например, полностью дезоксирибозная тройная спираль (где остов может принимать как А- так и В-форму), состоящая из С и G оснований, содержит оба типа Сахаров: СЗ'-эндо и С2!-эндо. Вероятно, пуриновая цепь имеет конформацию В-формы (Akhebat et al., 1992). Гомополимерные PyPuPy триплексы, которые содержат С и G основания, образованные дуплексом, содержащим только рибозу (ограниченным геометрией А-формы), либо содержащие рибозу в третьей цепи, все имеют СЗ'-эндо тип геометрии сахара, присущий А-форме (Akhebat et al., 1992).

Было показано, что для PyPuPy триплексов, содержащих А, Т и U основания, конформация Сахаров имеет более сложный вид (Liquier et al., 1991). Для триплексов poly (rU)poly(rA)poly(rU) и poly(dT)poly(rA)poly(rU) была установлена СЗ'-эндо конформация рибозы. Для триплексов poly(rU)poly(rA)poly(dT), poly(rU)poly(dA)poly(dT) и poly(dT)poly(rA)poly(dT) были обнаружены оба типа конформаций: СЗ'-эндо и С2'-эндо. Подобные структурные исследования, проведенные для гомополимерных PyPuPu-триплексов, показали, что poly(dC) цепь имеет остатки сахара С2-эндо типа, poly(dG) цепь имеет остатки сахара СЗ'-эндо типа в дуплексе; третья же цепь имеет конформацию сахара либо СЗ'-эндо типа в poly(rG), либо С2'-эндо в poly(dG) (Ouali et al., 1993).

Данные рентгеноструктурного анализа относят олигонуклеотидные триплексы к структурам с В- формой спирали и конформация сахара определена как С2'-эндо. PyPuPy триплексы с гомогенной последовательностью имеют 12 триад на виток и расстояние равное 3,20А между остатками оснований (Liu et al., 1994).

Молекулярное моделирование, начиная с модели А-формы Arnott, показало, что равновесная структура значительно отличается от А-формы, особенно по конформации сахара и ориентации фосфатных групп в пуриновой цепи (Laughton & Neidle, 1992). Другое отличие - это большая, чем предсказывалось теоретической моделью, ширина большой бороздки (Laughton & Neidle, 1992). С помощью молекулярного моделирования показано, что структура комплекса poly(dT)poly(rA)poly(dT) соответствует скорее В-форме, чем А-

форме (Sekharadu et al., 1993). В равновесной структуре конформация сахара, ширина большой бороздки, угол наклона оснований относительно оси спирали подобны характеристикам В-формы, тогда как смещение оснований вдоль оси спирали и угол вращения имеют сходство с А-формой ДНК. Аналогичные данные, касающиеся PyPuPu комплексов, свидетельствуют о том, что цепи принимают конформацию подобную конформации цепей в РуРиРу триплексах: А-подобную конформацию для пуриновой цепи дуплекса и В-подобную конформацию для других цепей (Laughton & Neidle, 1992b). Изучение связывания дистамицина, специфично связывающегося с В-формой ДНК, позволило сделать вывод о том, что малая бороздка в poly(dT)poly(dA)poly(dT) триплексе имеет структуру типичную для В-формы (Howard et al., 1992).

Данные футпринтинга показали, что дуплекс в составе триплекса имеет некоторые черты относящиеся к А-форме (Lyamichev et al., 1990; Soyfer et al., 1992). Защита от фотомодификации для пиримидинов в триплексе имеет сходство с уменьшением степени (выхода) фотомодификации для А-формы ДНК. (Backer & Wang, 1989). К тому же, связывание третьей цепи уменьшает подвижность оснований внутри триплекса, делая расположение пиримидинов неблагоприятным для димеризации вследствие облучения. Таким образом, триплекс отличается от канонической структуры ДНК понижением мобильности входящих в его состав оснований (Lyamichev et al., 1990).

Было обнаружено, что неожиданно высокая стабильность триплексов при взаимодействии коротких пуриновых олигонуклеотидов с SIV7HIV-2 генами обусловлена структурой ДНК-мишени: для образования высокостабильных триплексов, у которых Тт триплекса на 4-8°С выше, чем у соответствующего дуплекса, должны присутствовать участки ДНК, имеющие А-подобную структуру (Svinarchuk et al., 1995).

Исследования большого количества триплексобразующих последовательностей с помощью ЯМР показали, что большинство Сахаров в РуРиРу триплексах имеют С2'-эндо конформацию и структуру близкую к раскрученной В-форме (Radhakrishnan et al., 1991b;

Macaya et al., 1992). Так же были обнаружены отчетливые отличия в величинах угла наклона оснований относительно оси спирали и смещении оснований вдоль оси спирали для сочетаний GG, GT и TG в третьей цепи (Radhaktishnan & Patel, 1993). Таким образом, гетерогенность конформаций существует не только между различными цепями в триплексе, но также вдоль одной цепи.

С помощью химического пробинга продемонстрировано изменение в дуплексной структуре на границе между B-формой дуплекса и триплексом, образованным олигонуклеотидом (Hartman et al., 1992). Изменение конформации цепей не распространяется далеко за триплексную структуру. Это заключение было подтверждено группой исследователей, которые не нашли распространения измененной триплексом дуплексной структуры дальше, чем на одну пару оснований соседней последовательности (Colocci et al., 1993). То, что граница дуплекс:триплекс четко локализована, доказывает и то, что конформационные изменения не мешают связыванию белка с участком ДНК, находящимся в непосредственной близости с триплексом (Hanvey et al., 1990).

1.3. Межмолекулярные и внутримолекулярные триплексы

Тройные комплексы могут формироваться либо внутри одной полимерной молекулы (внутримолекулярные триплексы), либо быть сформированными различными полинуклеотидами (межмолекулярные триплексы).

Типичный межмолекулярный триплекс образуется, когда полимерная или олигомерная третья цепь соответствующей последовательности связывается с двуцепочечным PyPu-трактом в ДНК или РНК с помощью Хугстеновских водородных связей. В зависимости от пиримидиновой или пуриновой природы олигонуклеотида могут образовываться два типа межмолекулярных триплексов РуРиРу и PyPuPu.

Внутримолекулярные триплексы могут формироваться в составе молекул дцДНК, содержащих РуРи-тракты с зеркальной симметрией (ЬуагшсЬеу е! а1., 1986; Мнкт е! а1., 1987). Данные по расщеплению нуклеазой 81 и 2В- электрофореза в суперспирализованных плазмидах, содержащих такие тракты, демонстрируют наличие в их составе необычных структур (ЬуатюЬеу е! а!., 1986). Дальнейший анализ показал, что нарушение зеркальной симметрии даже на одно основание значительно дестабилизирует такие структуры (Ми~кт е1 а!., 1987). Основываясь на этих данных, Франк-Каменецкий предложил модель образования внутримолекулярных триплексов, в которые вовлечены РуРи тракты (Ьуапис1аеу е! а1., 1986) (рис.3). Половина зеркального РуРи траста расплетается, одна из цепей изгибается относительно точки симметрии и взаимодействует с другой половиной дцРуРи тракта, образуя Хугстеновские водородные связи (ЬуагшсЬеу & а1., 1986). Вторая цепь расплетенного участка остается неспаренной. Эта модель дала первое рациональное объяснение чувствительности РуРи-тракта к расщеплению Б1 нуклеазой при кислых рН. Поскольку как пиримидиновая, так и пуриновая цепи могут участвовать в образовании тройного комплекса, то могут существовать как РуРиРу так и РуРиРи внутримолекулярные триплексы (рис. 3). В первом случае Ру цепь расплетенного участка образует Хугстеновские водородные связи, оставляя Ри цепь неспаренной; во втором случае водородные связи с дуплексом образует Ри цепь. Обычно пиримидиновая цепь содержит как тимин, так и цитозин. В случае цитозина, стабильная триада с двумя Хугстеновскими водородными связями может образовываться, если N3 цитозина протонирован, что становится возможным в слабокислой среде (рН~4-5). Внутримолекулярные РуРиРу триплексы были открыты раньше, чем РуРиРи и названы "Н-формой", так как являются протонированными структурами (ЬуаписЬеу е! а1., 1986).

Гипотеза о структуре внутримолекулярных триплексов в суперспирализованных дцДНК была принята на основе стереохимических данных. Позднее она была подтверждена множеством экспериментальных данных по химическому пробингу, которые определили

5'-с-с-с-с-с-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т • • • ••• ••••• •• * * *•••••

3• -с-с-с-с-с-с-а-с-а-с-а-с-а-с-а-с-а-с-а-с-а с ооооооооооо оооооо о \/

т»а а

i 1 \g-g-g-a-g-a-g-a-g-a-g-a--g-a-g-a ^

т*а

I I Об

! I

3' 5 ' Н-форма днк

5'~с-с-с-с-с-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-тч

«в* * • * ••• ( • • • •• »»•••• с.

3' -G-G-G~G-G-G-A-G-A~G-A~G-A~G-A-G-A-G~A~-G-A Т

\ \

000000000000000 000.6 с

1 /

а*т-с-с-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т-с-т '

I I

А»т

I I

6*С

I I

5*3' Н*-форма ДНК

Рисунок 3. Схематическое изображение внутримолекулярных РуРиРу и РуРиРи триплексов.

(•) Уотсон-Криковские водородные связи (о ) Хугстеновские водородные связи

функциональное состояние индивидуальных оснований в составе внутримолекулярных триплексов (Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1988; Htun & Dahlberg, 1988).

Внутримолекулярные PyPuPu триплексы, формирующиеся в суперспирализованных дцДНК, не требуют протонирования, но для их образования обязательно присутствие поливалентных катионов. Для того, чтобы отличать их от "Н-формы", они были названы "Н -формой" (Bernues et al., 1990) (рис. 3). Как и для межмолекулярных PyPuPu триплексов, в третьей цепи Н*-формы ДНК аденин может быть замещен на тимин (Dayn et al., 1992); при кислых рН гуанин может быть замещен на аденин (Malkov et al., 1993а). Таким образом, последовательность дцДНК, принимающая Н*-форму, может не быть строгим зеркальным повтором и даже быть не полностью гомопурин-гомопиримидиновой (Mirkin & Frank-Kamenetskii, 1994).

Описан также гибрид H и Н*-формы ДНК, названный узелковой (nodule) ДНК (Kohwi-Shigematsu & Kohwi, 1991; Panyutin & Wells, 1992). Узелковая ДНК является аналогом межмолекулярных триплексов с альтернативными цепями (рис.4А).

Обсуждается и другая Н-подобная структура, образованная двумя далеко расположенными друг от друга гомопурин-гомопиримидиновыми трактами (Hampel et al., 1994). Было показано, что линейная дцДНК, содержащая оба тракта, при рН 4,0 в присутствии спермидина имеет очень маленькую электрофоретическую подвижность в агарозном геле, что было объяснено образованием так называемой связанной (tethered) петли. Обнаружено, что добавление избытка оцДНК, гомологичной гомопиримидиновому тракту, препятствует образованию петли, в то время как гомопуриновая цепь ДНК не оказывает такого эффекта. Таким образом, в этой структуре гомопиримидиновая цепь одного тракта образует триплекс с отдаленным гомопурин-гомопиримидиновым участком, в то время как комплементарная ей гомопуриновая цепь остается одноцепочечной (рис. 4Б).

А.

шииитшт

ItlllVI lllllllllll

ШШ1Ш111ПП1

lllllll III IIIIII II

Рисунок 4. Схематическое изображение (А) узелковой (nodule) ДНК (гибрид Н- и Н'-форм) и {Б) формы ДНК, содержащей связанную (tethered) петлю. Пуриновые цепи ' ■ Пиримидиновые цепи

111ЛI Уотсон-Криковские водородные связи IIIIII Хугстеновские водородные связи

1.4. Геометрия триплексов

Очевидно, что существует множество вариантов геометрического построения триплексов. Триплексы, строение которых было подтверждено экспериментально, подробно описаны в обзоре (Frank-Kamenetskii & Mirkin, 1995) (рис.5).

Канонический межмолекулярный триплекс состоит либо из трех независимых олигонуклеотидных цепей (Morgan & Wells 1968; Lee et al., 1979) (рис.5 A, F), либо из протяженного ДНК-дуплекса, несущего гомопурин-гомопиримидиновую вставку, и соответствующего олигонуклеотида (Le Doan et al., 1987; Moser & Dervan, 1987; Lyamichev et al., 1988). В обоих случаях процесс образования триплексов концентрационно зависим.

Одноцепочечная ДНК также может образовывать триплекс, цепи которого соединены двумя петлями (рис.5 В, G). Подчиняясь требованиям к последовательности и полярности цепей, оцДНК должна иметь совершенно определенную последовательность: содержать зеркальные повторы (гомопиримидиновые для РуРиРу триплексов и гомопуриновые для PyPuPu триплексов), фланкированные последовательностью комплементарной одной из половин этого повтора (Sklenar & Feigon 1990). Такие молекулы ДНК формируют триплексы гораздо быстрее, чем это происходит при образовании межмолекулярного триплекса, так как все триплексобразующие сегменты находятся внутри одной молекулы (Sklenar & Feigon 1990; Haner & Dervan, 1990; Radhaktishnan et al., 1991a).

Существует также семейство триплексов, образующихся из шпилечной структуры и оцДНК. Возможны два типа организации таких структур (Giovannangeli et al., 1991; Roberts & Crothers, 1991). (а). Каноническая шпилька, сформированная двумя самокомплементарными сегментами ДНК, вовлекается в образование Хугстеновских водородных связей с третьей цепью (рис.5 С, Н) и (б), "шпилька", содержащая гомопуриновый (для PyPuPu триплексов) или гомопиримидиновый (для РуРиРу триплексов) зеркальный повтор, вовлекается как в Уотсон-Криковское так и в Хугстеновское

РуРи'Ру

РуРи'Ри

В

В

^1)11111111)11

шшшишшГ

шиииичнпо

иишнииниГ

I 9

пишнпшшО шпншшннГ

пимшмпи!

шниммшш

ипиимнпш

лишними ii

о

г

н

шшшшшш

ИНИИИПИШ

ПМЖПШШПГ)

С шиищщщи

шшпшипп

11111111111111111

2

' д

11111111

пиши

ннншшип

ниннппнш

я

шшпишш

к

Комплексы с участием альтернативных цепей

111111111II

шмпнп

МИШИН

МИШИН

Рисунок 5. Возможные варианты геометрической организации триплексов.

Пкрнмидиновые цепи

^ Пуриновые цепи.

шиш 1Ш1111

Уотсон-Криковские водородные связи Хугстеновские водородные связи

Направление стрелок соответствует ориентации цепей.

взаимодействие с гомопиримидиновой или гомопуриновой оцДНК (рис. 5 D, I). В работах (Kool, 1991; Prakash & Kool, 1992) описана особая модификация этой схемы: вместо шпильки для образования триплексов был использован короткий кольцевой олигонуклеотид (рис.5 Е, J). Такие триплексобразующие олигонуклеотиды могут быть особенно полезны для воздействия на ДНК in vivo, так как кольцевые олигонуклеотиды не расщепляются экзонуклеазами.

В структурах на рис.5 не указаны 5'- и 3'- концы полинуклеотидиых цепей. Фактически, все эти структуры могут существовать как две химические изоформы, отличающиеся полярностью цепей. Сравнительная стабильность двух этих изоформ изучена плохо. Современные данные, присутствующие в работах (Booher et al., 1994; Wang et al., 1994), показывают, что их свободные энергии могут отличаться на 1,5-2,0 ккал/моль и зависят от последовательности петли.

Ранее мы рассматривали тройные комплексы, в состав которых входят дуплексы, состоящие только из полностью гомопуриновых и гомопиримидиновых цепей. Однако, требованиям, касающимся нуклеотидного состава и полярности цепей в составе ДНК-мишени, удовлетворяют также чередующиеся кластеры гомопуринов и гомопиримидинов (Home & Dervan, 1990; Beal & Dervan, 1992b; Jayasena & Johnston, 1992a; Jayasena & Johnston, 1992b) (рис.5 К, L, M). Третья цепь, состоящая из находящихся рядом гомопуриновых и гомопиримидиновых блоков, образует Хугстеновские водородные связи с пуринами разных цепей дуплекса-мишени, переходя с одной цепи на другую для сохранения нужной полярности. Существование этих структур, названных триплексами с чередующимися цепями, было экспериментально продемонстрировано как для внутримолекулярных (Jayasena & Johnston, 1992а) (рис.5 М), так и для межмолекулярных триплексов (Beal & Dervan, 1992b; Jayasena & Johnston, 1992b) (рис.5 К, L). Специфической чертой таких триплексов является то, что два участка разного состава третьей цепи удовлетворяют требованиям образования триплекса с одной двуцепочечной мишенью (рис.5 К, L). В

результате этих исследований существенно увеличивается количество потенциальных триплексобразующих мишеней в природных ДНК: в их число также входят последовательности, состоящие из пуриновых и пиримидиновых кластеров. Но нужно заметить, что не каждая такая произвольно взятая последовательность является удобной мишенью, так как образование комплексов с чередующимися цепями энергетически менее выгодно, чем образование триплекса с одним гомопурин-гомопиримидиновым блоком дцДНК. По предварительной оценке минимальная длина кластеров в триплексах с чередующимися цепями находится между 4 и 8 п.о. (Jayasena & Johnston, 1993). Для немногочисленных изученных мишеней эффективность образования триплексов изображенных на рис. 5 К и L значительно отличается. Перекручивание третьей цепи в направлении 3'-Рип-Руп-5' предпочтительнее, чем в направлении 3'-Pyn-Pun-5' (Jayasena & Johnston, 1993).

1.5. Специфичность образования триплексов

Для воздействия на нативную дцДНК необходимо иметь данные о специфичности узнавания двуцепочечных последовательностей третьей цепью. При этом нужно учитывать, что природа дцДНК-мишеней ограничена гомопурин-гомопиримидиновыми последовательностями, или последовательностями, состоящими из расположенных рядом олигопурин-олигопиримидиновых кластеров. Это значительное ограничение для биологического и терапевтического применения ТФО вызвало интенсивные поиски оснований нуклеиновых кислот, которые могли бы быть встроены в третью цепь триплекса и не препятствовать образованию комплексов в случае наличия пиримидиновых оснований в гомопуриновой цепи дуплекса.

Большинство данных, касающихся необычных триад, были получены для РуРиРу триплексов. Один из подходов в исследовании - анализ влияния таких триад на формирование Н-формы ДНК с помощью двумерного гель-электрофореза (Belotserkovskii et al., 1990). Стабильность необычных триад изучалась также с помощью определения эффективности направленного расщепления дуплекса реакционноспособными производными олигонуклеотидов (Griffin & Dervan, 1989), путем анализа кривых плавления триплексов (Mergny et al., 1991; Sun et al., 1991) и методом ЯМР (Macaya et al., 1991). Эти исследования показали, что хотя единичная замена может и не стать критической при образовании триплекса, любая из замен является неблагоприятной.

Данные по оценке относительной стабильности индивидуальных неканонических триад у различных групп исследователей существенно отличаются. Так, например, при изучении межмолекулярных триплексов триплет AT* G был признан наиболее благоприятным (Griffin & Dervan, 1989, Mergny et al., 1991), тогда как при формировании Н-формы ДНК такой триплет имеет деструктурирующее влияние (Belotserkovskii et al., 1990). Это противоречие может быть объяснено тем, что объектами исследований являлись разные триплексобразующие структуры, и гетерогенность стекинговых взаимодействий внутри тройной спирали могла сильно влиять на стабильность комплексов. Это предположение было подтверждено исследованиями AT*G триад с помощью ЯМР (Radhaktishnan. & .Patel, 1994; Wang et al., 1992). Показано, что гуанин этого триплета из-за стерического препятствия, созданного метальной группой тимина, находится вне плоскости АТ-пары мишени. Вероятно, определяющим условием стабильности AT G триплета является благоприятное стекинговое взаимодействие между гуанином и тимином, фланкирующим его с 5'-конца. Это также объясняет различие данных, полученных для межмолекулярных и внутримолекулярных триплексов. В первом случае гуанин фланкируется тимином с 5-конца (Griffin Sc Dervan, 1989), в то время как во втором случае он фланкируется цитозином (Belotserkovskii et al., 1990). Таким образом, для внутримолекулярного триплекса отсутствует

благоприятное стекинговое взаимодействие, и АТС триада нестабильна. Группой авторов было показано, что замена ТА*Т триады с 5'-конца гуанина на СО*С триаду уменьшает стабильность АТ*0 триплета ег а!., 1992). Эти факты свидетельствуют о важности

влияния ближайших соседних оснований на стабильность триад.

Несмотря на сложности, возникающие при изучении ошибочных триад, были предложены некоторые эмпирические правила для образования тройных комплексов с несовершенными гомопурин-гомопиримидиновыми последовательностями (Уооп е1 а!., 1992). Если шмопуриновая цепь прерывается тимином или цитозином, то в третьей цепи должен находиться гуанин или тимин, соответственно. Однако, как было сообщено, такое расширение кода узнавания третьей цепи явилось слишком поспешным (ГоввеНа е1 а1., 1993). Триада (ЗС*Т, являясь достаточно стабильной, оказалась значительно слабее, чем каноническая ТА*Т триада. Таким образом, ТФО, содержащий тимин напротив цитозина в пуриновой цепи мишени, должен связываться с такой ДНК-мишенью значительно хуже, чем с мишенями, содержащими в соответствующем положении аденин. В случае АТЧ} специфичность образования триады высока, но сродство О к ТА паре умеренно.

Недавно была изучена стабильность триплексов с протяженными заменами: 2-4 пиримидина в пуриновой триплексобразующей цепи 15-звеного триплекса (Оошеге 8с Бох, 1997). Стабильность триплетов уменьшалась следующим образом: (АТ*в)2 > (АТ*С)2 > (АТ*Т)2 > (АТ* А)2 и (<ЗС* Т)2 > (СС*С)2 > (ОС'в)2 = (СЗС* А)2. Удалось зарегистрировать комплексы, содержащие (АТ* в)3, (ОС*'Т)3 и (вС С)З замены. Триплексов, содержащих 4 замены, зарегистрировать не удалось.

Строгость требований к составу гомопурин-гомопиримидиновой мишени может быть преодолена и с помощью другого подхода - введения в третью цепь нуклеиновой кислоты синтетических оснований. Несколько исследований показали, что искусственные основания, такие как 2'~диоксинебуралин, 2-диоксиформицин А и другие могут образовывать очень

стабильные триады с цитозином и тимином, входящими в гомопуриновую цепь (Sun et al., 1991; Stilz & Dervan, 1993).

Количество данных по замене триад в PyPuPu триплексах весьма ограничено. В экспериментах по аффинному расщеплению было показано, что все 13 неканонических триплетов (все комбинации кроме CG*G, ТА*А и ТА*Т) неблагоприятны для образования триплексов (Beal & Dervan, 1992а). Исключение составляет только CG A триада, которая, благодаря протонированию аденина, может образовываться при кислых рН (Malkov et al., 1993а).

1.6. Стабилизация триплексов

Изучение межмолекулярных триплексов привело к пониманию, что триплекс образующие олигонуклеотиды могут быть универсальными лигандами, осуществляющими сиквенс-специфическое узнавание дцДНК. Для реализации возможного биологического применения ТФО важнейшим параметром является стабильность тройных комплексов. Как было отмечено ранее, PyPuPy-триплексы образуются при кислых рН; для образования PyPuPu триплексов не требуется протонирования, но необходимо присутствие миллимолярных концентраций поливалентных катионов. В физиологических условиях, то есть в нейтральной среде и в отсутствие высоких концентраций поливалентных катионов, стабильность триплексов снижена. Было проведено большое количество исследований, направленных на изучение стабильности триплексов в различных условиях и разработку методов ее увеличения.

1.6.1. Стабилизация триплексов с помощью уменьшения отталкивания полинуклеотидных

цепей

Экранирование отрицательных зарядов фосфатных групп полинуклеотидных цепей облегчает их сближение и, следовательно, должно способствовать образованию триплексов. Для стабилизации триплексов могут быть использованы как неорганические, так и органические катионы. Показано, что в определенных условиях в системе polyA + 2 polyU при низких концентрациях моновалентных катионов существуют только двуцепочечные структуры. Для того, чтобы преодолеть отталкивание фосфатных групп третьей цепи, требуются очень высокие (до IM) концентрации моновалентных катионов Na", К+ или Li (Feisenfeld et al, 1957; Rich, 1960). Эта тенденция наблюдается для всех тройных комплексов с непротонированными основаниями (комплексы, содержащие триады ТА*Т, UA*U и т.д.). Однако в случае протонированной цитозин-содержащей третьей цепи повышение концентрации моновалентных катионов стабилизирует триплексы в меньшей степени по сравнению с комплексами, содержащими только непротонированные основания (Wilson et al., 1994).

В случае гуанин-богатых последовательностей присутствие в растворе катионов Na+ и КГ способствует образованию четырехцепочечных структур и, следовательно, приводит к смещению равновесия в сторону таких комплексов. В результате этого, формирование триплексов гуанин-богатыми последовательностями, особенно в случае олигонуклеотидных систем, может быть затруднено. Этих трудностей можно избежать, используя ионы лития (Johnson et al., 1992).

Уже в первых экспериментах на полинуклеотидных комплексах было обнаружено, что для стабилизации триплексов эффективны значительно меньшие концентрации (1-10 тМ) бивалентных катионов (Mg2+, Са2+, Mn2+, Zn2+) (Felsenfeld et al., 1957) по сравнению с одновалентными. Большое число исследований было посвящено изучению влияния на

образование триплексов катионов бивалентных металлов (Cooney et al., 1988; Collier & Wells, 1990; Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1988). В результате исследований были определены некоторые специфические черты, характерные для внутримолекулярных и межмолекулярных триплексов. Стабильные межмолекулярные d(C)nd(G)„d(G)n триплексы образуются как в присутствии Mg2+n Са2', так и в присутствии катионов переходных металлов (Cd2+, Со2+, Mn2+, Zn2+ и Ni2+), но не Ва2+ и Hg2+ (Soyfer et al., 1992; Malkov et al., 1993b). Гетерогенные последовательности (A, G, T, С - содержащие) образуют триплексы в присутствии одного из катионов переходных металлов (Mn2+, Zn2+, Cd2+, Со2+ и Ni2+), причем это является обязательным условием для образования и (или) стабилизации внутримолекулярных PyPuPu триплексов (Malkov et al., 1993b). Катионы Mg2+, Ca2+, Ba2+ и Hg2+ в этом случае неэффективны (Soyfer et al., 1992).

Несколькими группами исследователей было описано образование PyPuPu триплексов (Н*-формы ДНК) в присутствии катионов Mg2+ на фрагментах (dC)n(dG)n в составе суперспирализованных плазмид (Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1988; Soyfer et al., 1992; Kang & Wells, 1992). В присутствии катионов Zn2+ при 25°C участки (dC)n(dG)„ не образовывали Н*-формы ДНК (Bernues et al., 1990), однако Н*-форма ДНК была обнаружена после повышения температуры до 37°С и увеличения времени инкубации до 1,5 часов (Kang & Wells, 1992). В последней работе авторы наблюдали образование Н*~формы ДНК в присутствии катионов Мп2+. Последовательность d(GA)22d(CT)22 образует Н*-форму ДНК только в присутствии катионов Zn2+, Cd2+ и Mn2+ (Bernues et al., 1990). При концентрации 5mM эффективность действия катионов уменьшалась в ряду; Zn2+ >Cd2+ >Мп2+, в присутствии же катионов Са2+, Mg2+, Со2" , Ni2+, Cu2+ и Hg2+ образования триплексов не наблюдалось. При повышении температуры инкубации подобная структура в составе плазмиды образует Н*-форму ДНК в присутствии Mg2+, Са2 и Со3+ (Panyutin & Weils, 1992).

Из анализа полученной информации можно сделать несколько предварительных выводов: влияние на образование триплексов катионов бивалентных металлов не может быть

объяснено простым электростатическим взаимодействием; бивалентные катионы имеют специфические места связывания с основаниями ДНК; в зависимости от состава ДНК связанные катионы могут стабилизировать либо двуцепочечную, либо трехцепочечную формы.

Хорошо известно, что двуцепочечные и трехцепочечные нуклеиновые кислоты стабилизируются полиаминами и что величина эффекта зависит от структуры полиамина (Glaser &Gabbay, 1968; Thomas & Thomas, 1993) и от расстояния между зарядами в цепях полиамина (Thomas & Thomas, 1993). Стабилизирующий эффект обеспечивается, вероятно, как и в случае с катионами металлов, благодаря понижению высокой плотности отрицательных зарядов в триплексе в результате связывания нуклеиновых кислот с положительно заряженными полиаминами. Метод стабилизации триплексов полиаминами был использован во многих работах. Показано, что в присутствии спермина и спермидина межмолекулярные и внутримолекулярные РуРиРу триплексы могут образовываться даже при физиологических pH (Moser & Dervan 1987; Hampeî et al., 1991; Hampel et al., 1993). При концентрации 10'3M спермин, который несет четыре положительных заряда, способствует формированию PyPuPy (Moser & Dervan, 1987; Hanvey et al., 1991; Lyamichev et al., 1991; Soyfer et al, 1992) и PyPuPu (Beal & Dervan, 1991; Soyfer et al., 1992) триплексов и увеличивает скорость их образования. Эффективность действия полиаминов зависит от величины их заряда: спермидин, несущий три положительных заряда, действует так же, как спермин, но в более высоких концентрациях (Hampel et al., 1991; Thomas & Thomas, 1993). В случае PyPuPy триплексов, содержащих тимины и метилцитозины в третьей цепи (что делает возможным существование триплексов при нейтральных pH), полиамины важны только для ассоциации олигомера с дуплексом - уменьшение концентрации спермина после образования триплекса не ведет к уменьшению количества детектируемого триплекса (Hampel et al., 1991). Присутствие полиаминов в миллимолярных концентрациях в ядрах эукариотических

клеток позволяет надеяться на возможность существования прочных триплексов in vivo (Tabor & Tabor, 1984).

Представляется важным охарактеризовать образование тройных комплексов в присутствии различных катионов. Если в растворе одновременно присутствуют моновалентные и поливалентные катионы, то повышение концентрации моновалентных катионов может фактически дестабилизировать триплексы, предформированные с помощью других стабилизаторов (Lipsett, 1964; Lee et al., 1984; Latimer et al., 1989; Mäher et al., 1990; Lyamichev et al., 1991; Singleton. &.Dervan, 1993; Gamper et. al., 1997). Соответствующие данные получены для PyPuPy триплексов. При изучении триплексов методами плавления, защиты от расщепления нуклеазами и футпринтиншм было продемонстрировано, что увеличение концентрации Na+ в интервале 50 mM -IM дестабилизирует PyPuPy триплексы, содержащие протонированные цитозины (Lipsett, 1964; Lee et al.,1984; Latimer et al., 1989; Mäher et al., 1990; Lyamichev et al., 1991; Soyfer et al., 1992). Более детальные исследования показали, что увеличение концентрации моновалентных катионов при постоянной концентрации бивалентных катионов ведет к заметной дестабилизации триплексов. Скорость ассоциации уменьшается незначительно, но скорость диссоциации увеличивается существенно (Mäher et al., 1990; Singleton &Dervan 1993). Такая же тенденция сохраняется для триплексов и в присутствии моновалентного К и тетравалентного спермина, хотя величина дестабилизации в данном случае не столь велика ( Singleton & Dervan, 1993).

А ,

Увеличение концентрации бивалентного Mg также уменьшает триплекс-стабилизирующий эффект спермина ( Singleton & Dervan, 1993). Напротив, повышение концентрации поливалентных катионов при постоянной концентрации одновалентных увеличивает стабильность триплексов. Было показано, что добавление Mg2+ отменяет дестабилизирующее влияние высоких концентраций Na+ на цитозин-содержащие триплексы (Mäher et al., 1990; Lyamichev et al., 1991; Soyfer et al., 1992; Singleton & Dervan 1993 ). Однако эта тенденция зависит от структуры поливалентных катионов. Например, дивалентные полиамины, в

которых два положительных заряда пространственно разнесены, более эффективны для стабилизации триплексов, чем ионы Mg2" (Thomas & Thomas ,1993).

1.6.2. Влияние рН на стабильность триплексов

Как уже упоминалось ранее, PyJPuPy триплексы, содержащие CGC триады, образуются при кислых рН, так как требуют протонирования N3 цитозинов третьей цепи. Этот процесс необходим, как для межмолекулярных триплексов (Lipsett, 1964; Morgan &Wells, 1968; Lee et al., 1979; Lyamichev et al., 1988), так и для Н-формы ДНК (Htun & .Dahlberg, 1988; Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1988). Показано также, что и некоторые PyPuPu триплексы образуются только при кислых рН; в этом случае последовательность третьей цепи такова, что возможно образование CG*A+ триад (рис.2). Протонирование цитозинов и аденинов третьей цепи делает возможным образование двух Хугстеновских водородных связей с основаниями пуриновой цепи дуплекса-мишени (Malkov et al., 1993а).

Теоретическая модель рН зависимых структурных переходов предполагает, что время жизни протонированного триплекса (tt) является очень существенной функцией рН (Frank-Kamenetskii, 1992): Tt=to'10'NpH/r, где г - число пар оснований на один протонированный сайт, N - длина тракта в парах оснований, и то является среднегеометрической величиной времени жизни непротонированной триады. Это выражение верно в интервале рН между рК* протонированного сайта в составе одноцепочечной и рКа протонированного сайта в составе трехцепочечной структур. Такая рН зависимость очень сильна: если третья цепь содержит 10 цитозинов, время жизни изменяется в 10 раз при изменении рН на 0,1 единицы.

рКа для цитидина (рКа=4.3) и для аденозина (рКа=3 .8) относительно низки. Однако в строго организованных полинуклеотидных структурах эти величины значительно выше. Например, две индивидуальные poly(dC) цепи образуют дуплекс poly(dC)poly(dC) и рКа

этого перехода составляет 7.3-7.5 (lnman, 1964; Gray et al., 1988). Подобный переход для самоассоциирующихся структур poly[d(TC)] характеризуется рКа около 6.2 (Gray et al.,

1988). Значение кажущейся величины pK* для цитидина в триплексной структуре составляет около 5.5 (Xodo et al., 1991; Singleton & Dervan, 1992). Для аденозин-содержащих триплексов подробных данных нет, но известно, что самоассоциирующиеся структуры аденозин-содержащих полимеров образуются с кажущимся рКа около 6 (Steiner & Beers, 1959; Antao et al, 1988).

Несмотря на существенное повышение pK* для пар нуклеотидов по сравнению со свободными нуклеотидами, кинетический барьер для формирования триплексов не меняется. Протонированные триплексы легко образуются при слабо кислых условиях (Lipsett, 1964; Morgan &Wells, 1968; Lee et al., 1979; Lyamichev et al., 1985; Soyfer et al., 1992; Malkov et al, 1993a). Присутствие полиаминов может помочь преодолеть этот барьер in vivo и сохранить триплексы при физиологических условиях.

Необходимость протонирования цитозина может быть преодолена несколькими химическими способами. Введение 5-метилцитозинов вместо цитозинов в ТФО повышает стабильность РуРиРу триплексов при физиологических рН (Lee et al., 1984; Maher et al.,

1989). Более детальные исследования показали, что этот эффект относительно мал (возможность повышения рН при метилировании цитозинов составляет только 0,5 единицы рН (А рКа=0,5) (Plum et al., 1990). Другим решением этой проблемы является замещение цитозинов в третьей цепи на искусственные основания, не требующие протонирования для образования Хугстеновских водородных связей. Действительно, замена цитозинов на метил-8-оксо-2-дезоксиаденозины (Krawczyk et al., 1992), псевдоизоцитидины (Ono et al., 1991), 7,8 дигидро-8-оксоаденины (Jetter & Hobbs , 1993) или З-метил-5-амино-1 Н-пиразоло-[4.3-d] пиримидин-7-ones (Koh & Dervan, 1992) позволяет формировать триплексы pH-независимым образом.

1.6.3. Зависимость стабильности триплексов от длины PuPy тракта и третьей цепи

Обычно увеличение длины PuPy трактов облегчает образование триплексов. Длина PuPy трактов, необходимая для образования Н или Н*-формы ДНК, составляет около 20 пар оснований. В этом случае образование триплекса происходит при среднем отрицательном значении плотности суперспирализации (-о ~ 0.05) и рН 5.0 (Lyamichev et al., 1985; Htun & Dahlberg, 1989) или в присутствии миллимолярных концентраций ионов Zn при нейтральном рН (Soyfer et al., 1992; Martinez-Balbas & Azorin, 1993). Теоретически было подсчитано, что нижний предел PuPy участка дцДНК, который может участвовать в образовании Н-формы ДНК, составляет 15 пар оснований (Lyamichev et al., 1989). Увеличение длины PuPy тракта ведет к уменьшению отрицательной плотности суперспирализации, требуемой для индуцирования образования триплекса (Htun & Dahlberg, 1989; Collier & Wells, 1990; Soyfer et al., 1992). Длинный PuPy тракт d(GA)37'ct(CT)37 образует внутримолекулярный триплекс при нейтральных рН и среднем уровне отрицательной суперспирализации (Collier & Wells, 1990). На относительно коротких d(A)nd(T)n участках образования Н*- формы ДНК не происходит, это становится возможным только при п-69 (Fox, 1990). Сравнительный анализ триплексобразующих способностей PuPy трактов, имеющих длину несколько десятков нуклеотидов, показал, что возможны многочисленные варианты образования Н или Н* форм ДНК при различных рН и концентрациях ионов (Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1988). Существует множество конформеров, в которых половина каждой из Ру или Ри цепей может участвовать в комплексообразовании, а также двойной триплексной структуры (рис. 4А), в которой одноцепочечный участок Н-формы ДНК образует Н*-форму с другим PuPy трактом (Kohwi-Shigematsu & Kohwi, 1991; Panyutin

& Wells, 1992; Beitran et al., 1993; Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1993; Martinez-Balbas & Azorrn, 1993).

Зависимость возможности формирования межмолекулярных триплексов от длины РуРи трактов была изучена с помощью олигонуклеотидных моделей. Показано, что при использовании полимерной матрицы пуриновый блок может состоять из набора отдельных нуклеотидов (нуклеозидов), образуя Уотсон-Криковские водородные связи с пиримидиновым полимером (Hattori et al., 1975). Стекинговые взаимодействия дополнительно стабилизируют такие агрегаты, служащие второй, комплементарной цепью. Полученный «дуплекс» может служить матрицей для образования триплекса. Тройная спираль может быть сформирована либо мономерными пуриновыми звеньями, либо полимерной пиримидиновой цепью. Такие комплексы легко диссоциируют и требуют присутствия большого избытка мономерных компонентов. Исследования, в которых было изучено образование триплексов, сформированных из полинуклеотидных и олигонуклеотидных компонентов различной длины, продемонстрировали увеличение стабильности триплексов при увеличении длины олишмеров (Lipsett et al., 1960; Cassani & Bollum, 1969). При сохранении упомянутой основной тенденции эти работы содержали различающиеся экспериментальные данные: (а) линейная зависимость температуры плавления триплекса Тш от величины обратно пропорциональной длине олигонуклеотида 1/п (Lipsett et al., 1960) и (б) линейная зависимость 1/Т от 1/n (Cassani & Bollum, 1969). В более поздних работах по аналогии с обычными двуцепочечными олигомерными комплексами для описания образования триплекса из мишени-дуплекса и олигонуклеотида была использована вторая зависимость (Cantor & Schimmel, 1980). Изучение образования триплексов в модельной системе d(A)gd(T)8+d(T)n показало, что минимальная длина третьей олигомерной цепи, которая может связываться с дуплексом, составляет 5 нуклеотидов (Sugimoto et al., 1991). В дополнение к требованию образования достаточного числа Хугстеновских водородных связей и стекинговых взаимодействий, стабильность триплексов зависит от

необходимости приведения в соответствие конформаций дуплекса и третьей цепи, так как в противном случае структурные несоответствия, накапливаясь на протяжении нескольких витков спирали, могут значительно дестабилизировать CG G и ТА*А триплексы (Pochon & Michelson, 1965; Broitman et al., 1987). Например, poly(G) в отличие от олиго(О), не образует PyPuPu триплекс с poly(C) в 0.15М NaCl (Pochon & Michelson, 1965). Триплекс может быть образован после щелочной обработки poly(G), уменьшающей степень полимеризации в среднем до 15 нуклеотидов. Образование poly(U)poly(A)poly(A) в присутствии 5mM Mg2+ ограничено длиной poly(A) цепей от 28 до 150 оснований (Broitman et al., 1987). В обоих случаях возможным объяснением ограничения длины пуриновой цепи служит геометрия CG*G и UA*A триад и (или) то, что при закручивании каждого последующего остатка третьей цепи вокруг мишени-дуплекса, остов третьей цепи претерпевает все возрастающую деформацию. Деформация накапливается до того момента, когда связывание третьей цепи становиться энергетически невыгодным (Pochon & Michelson, 1965; Broitman et al., 1987). К сожалению, в этих исследованиях не было сделано попыток использовать более сильные стабилизаторы триплексов, например, дивалентные катионы для CG*G триплексов и катионы переходных металлов для ТА*А триплексов. В более поздней работе введение в инкубационную смесь 5mM Mg2+ позволило образовать полинуклеотидный CG*G триплекс между poly(dG)poly(dC) со средней длиной 300 пар оснований и полимерной третьей цепью длиной несколько сотен нуклеотидов (Letai et al., 1988). Таким образом, по-видимому, связывание поливалентных катионов с третьей пуриновой цепью триплекса может частично облегчить формирование длинных триплексных структур.

Обычно длина третьей олигонуклеотидной цепи составляет не менее 9-10 нуклеотидов (Le Doan et al., 1987; Moser & Dervan, 1987). Стабильность более коротких триплексов, очевидно, недостаточна, чтобы они существовали при физиологических условиях и температуре. Возможность образования триплексов с участием альтернативных цепей (рис.5 К, L, М) позволила использовать в качестве мишеней короткие, расположенные

последовательно, чередующиеся кластеры гомопуриновых и гомопиримидиновых участков ДНК (Home & Dervan, 1990; Beal & .Dervan, 1992b; Jayasena & Johnston, 1992b, 1993).

1.6.4. Влияние гидрофобных заместителей в основаниях третьей цепи на стабильность

триплексов

Было показано, что тройные комплексы poly(A) с поли-5-метилуридилатом (полириботимидилатом) и 5-метоксиуридилатом более термостабильны, чем комплексы poiy(A) с полиуридилатом (Massoulie et al., 1966; Hillen & Gassen, 1979). В более поздних исследованиях было продемонстрировано, что два гидрофобных аналога уридина -риботимидин и 5-( 1 -пропинил)-2'-уридин, также стабилизируют триплекс, причем более выраженный эффект наблюдался для более гидрофобного заместителя (Froehler & Ricca, 1992). Использование 5-метилированных цитозинов в третьей цепи позволяет формировать тройные комплексы с двуцепочечными мишенями при нейтральных pH (Lee et al., 1984; Xodo et al., 1991). При исследовании связывания двенадцатизвенного дуплекса с высокой степенью симметрии с олигонуклеотидом, содержащем 5-метилцитозины было обнаружено, что сначала происходит замена пиримидиновой цепи дуплекса на модифицированный олигонуклеотид с последующим связыванием второй молекулы модифицированного олигонуклеотида в триплекс. Таким образом, было продемонстрировано, что наличие 5тС обеспечивает стабилизирующий эффект при образовании как тройных, так и двойных спиралей (Xodo et al., 1994а).

Физико-химическими методами было показано, что в третьей цепи вместо 5-метилированного цитозина может находиться К7-гликозилированиый гуанин (Koshlap et al., 1997).

Аналоги пуриновых оснований, несущие заместители в позициях, не вовлеченных в образование водородных связей, теоретически тоже должны стабилизировать триплексы. Были исследованы такие аналоги, как 8-метил-аденин (Limn et al., 1983) и 2-амино-8-метил-аденин (Howard et al., 1985; Kanaya et al., 1987). Однако, оказалось, что они не способны образовывать тройные комплексы, так как объемный заместитель при С8 благоприятствует син-конформации основания, которая несовместима с дуплексной и триплексной структурами (Limn et al., 1983; Kanaya et al., 1987).

1.6.5. Стабилизация тройных комплексов триплекс-специфичными лигандами

Другим направлением исследований явился поиск триплекс-специфичных лигандов, способных стабилизировать трехцепочечные структуры. Один из таких лигандов, производное бензо[е]пиридоиндол (ВеРТ), описан в работах (Mergny et al., 1992; Pilch et al., 1993). Показано, что BePI предпочтительнее интеркалирует в тройную, чем в двойную спираль, значительно стабилизируя триплексы (Pilch et al., 1993). Также было изучено взаимодействие фенантролиновых красителей с триплексом poly(dT) poly(dA)-poly(dT) и дуплексом poly(dA)-poly(dT). Показано, что этидий бромид и пропидий иодид одинаковым образом взаимодействуют как с дуплексом, так и с триплексом, стабилизируя обе структуры. Введение в эти органические молекулы катионных заместителей не вносит существенных, изменений в характер взаимодействия. Гомодимеры зтидия (бис-интеркаляторы) стабилизируют дуплекс, не влияя на термодинамическую стабильность триплекса (Tuite & Norden, 1995). Обнаружено, что ароматический диамидин DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол), который образует флюоресцирующие комплексы с двуцепочечными нуклеиновыми кислотами, интеркалируя в малую бороздку дуплекса, способен индуцировать

образование ДНКРНКДНК-триплексов, не образующихся в отсутствие DAPI (Xu et al., 1997). С помощью молекулярного моделирования было предсказано, что 2,6-замещенные амидоантрахиноны могут избирательно связываться с трехцепочечной ДНК и стабилизировать ее. Методом ферментативного футпринтинга были оценены эффекты связывания ряда изомеров 1,4- и 2,6- серий с двуцепочечной и трехцепочечной ДНК. Показано, что изомеры 1,4- серии предпочтительно связывают и стабилизируют двуцепочечную ДНК, тогда как 2,6- замещенные амидоантрахиноны значительно эффективнее взаимодействуют с триплексами, стабилизируя их (Fox et al., 1995).

Недавно было изучено взаимодействие 21-звенного А-богатого гомопуринового участка, входящего в состав человеческой DQP1*Q302 аллели, с Сга/Т, G/A и G/T содержащими олигонуклеотидами, несущими различные химические группировки на концевых фосфатах (Gamper et. al., 1997). Присоединение гексанольной и холестерольной групп к G/A содержащим олигонуклеотидам приводило к понижению стабильности триплексов в 1,6 и 13 раз соответственно, тогда как наличие аминогексильной или интеркалирующей группы (акридин, псорален) в составе олишнуклеотидов увеличивает стабильность триплексов в 1,3 и 13 раз. Аналогичный, но менее выраженный эффект наблюдался при введении соответствующих групп в Сш/Т и G/T содержащие олигонуклеотиды. Добавление КС1 в инкубационную смесь приводило к существенному понижению стабильности триплексов (в 1900 раз) для G/A содержащих олишнуклеотидов. Показано, что этот эффект может нивелироваться присоединением к олигонуклеотиду интеркалирующей группы (30-350 кратное повышение стабильности), либо добавлением специфического интеркалятора коралайна (1000-кратное увеличение стабильности).

1.6.6. Некоторые особенности стабилизации межмолекулярных и внутримолекулярных

триплексов

Межмолекулярные триплексы могут быть дополнительно стабилизированы, в том случае, если третья цепь представляет собой конъюгат олигонуклеотида с интеркалятором. Это было впервые продемонстрировано на примере гомопиримидинового олигонуклеотида с химически присоединенным производным акридина (Le Doan et al., 1987). Позже влияние интеркалирующих группировок на стабильность триплексов было продемонстрировано для других олигонуклеотидов и интеркаляторов (оксазолопиридокарбазол, 6,9-диамино, 3-метоксн акридин) (Sun et al., 1991b, Mouscadet et al., 1994, Orson et al., 1994). Стабилизация происходит благодаря интеркаляции лиганда в ДНК на границе дуплекс-триплекс: Наиболее стабильный комплекс образуется, когда ишеркалятор присоединен к 5'-концу ТФО.

Перспективными для направленного воздействия кажутся коныогаты олигонуклеотидов с псораленом, так как при облучении триплексов, образованных такими коньюгатами, свегом, близким к УФ-облучению может происходить сшивка олигонуклеотида с мишенью (Takasugi et al., 1991).

Внутримолекулярные триплексы могут быть стабилизированы с помощью нескольких приемов. Наиболее очевидный из которых - это повышение отрицательной плотности суперспирализации, так как образование Н-формы ДНК позволяет устранить вращательное напряжение. Был описан менее очевидный путь стабилизации Н-ДНК, названный кинетической ловушкой (Belotserkovskii et al., 1992). Продемонстрировано, что одигонуклеотиды, комплементарные одноцепочечному гомопуриновому участку Н-формы ДНК, стабилизируют эту форму при нейтральных рН, тогда как, в отсутствие этих олигонуклеотидов Н-форма быстро возвращается к В-конформации.

Следует отметить, что ТФО в качестве биологически активных веществ должны отвечать следующему требованию: они должны достаточно прочно связываться с собственной мишенью и не связываться с другими последовательностями. Можно ожидать, что если ТФО будет обладать очень высоким сродством к своей мишени, то он будет связываться так же с сайтами с неполной комплементарностью. Таким образом, повышение стабильности триплексов неизбежно повлечет за собой уменьшение селективности ТФО. Это должно проявляться особенно сильно при неспецифичной стабилизации триплексов с помощью интеркалирующих групп, присоединенных к ТФО. Неслучайно эффектная демонстрация сиквенс-селективного разрезания геномной ДНК достигалась в условиях экстремально слабого связывания ТФО с мишенями (Strobel & Dervati, 1990; Strobel & Dervan, 1991; Strobel et al., 1991). Хотя до настоящего времени не было проведено систематического экспериментального изучения сиквенс-селективности модифицированных ТФО, очевидно, что они должны иметь более низкую селективность, чем немодифицированные ТФО.

1. 7. Воздействие на основные генетические процессы с помощью триплекс образующих олигонуклеотидов

Высокая специфичность узнавания дцДНК ТФО является основой "антигенной" стратегии, направленной на подавление экспрессии нежелательных генов (Helene, 1991). Основная идея этой стратегии состоит в том, что связывание ТФО с определенным геном-мишенью должно препятствовать его нормальному функционированию. Большинство исследований, в которых были сделаны попытки регулировать экспрессию генов на уровне транскрипции, были стимулированы данными о существовании функционально важных гомопурин-гомопиримидиновых участков в регуляторных участках многих эукариотических

генов. Такие участки являются удобными мишенями для ТФО, так как связывание олигонуклеотида может препятствовать взаимодействию с ними регуляторных белков.

Первые результаты были получены на примере человеческого гена с-шус. Было продемонстрировано, что связывание пурин- богатого ТФО с несовершенной гомопурин-гомопиримидиновой последовательностью, находящейся за 125 п. о. перед промоторным участком PI, блокирует транскрипцию гена in vitro (Cooney et al., 1988). Сайт взаимодействия ТФО с дцДНК-мишенью важен для транскрипции гена с-тус, так как служит местом связывания белков, активирующих транскрипцию (Davis et al., 1989; Postel et al., 1989). Два гена, кодирующих белки, связывающиеся с данной мишенью, были клонированы и секвенированы (Kolluri et al., 1992; Postel et al., 1993). Аналогичные результаты получены и для промотора металлотионинового гена (Mäher et al., 1989; Mäher et al., 1992). В этом случае был использован гомопиримидиновый олигонуклеотид, препятствующий связыванию активатора транскрипции Spl и значительно снижающий активность промотора в бесклеточной системе транскрипции. Показано также, что ТФО препятствуют связыванию SP1 с промоторами человеческих генов дегидрофолатреедуктазы (Gee et al., 1992) и Ha-ras (Mayfield et al., 1994). Продемонстрировано, что конъюгаты триплексобразующих олигонуклеотидов и интеркаляторов действуют как репрессоры транскрипции гена рецептора а интерлейкина 2 in vitro, препятствуя связыванию активатора транскрипции NFkB (Grigoriev et al., 1992). В описанных работах ТФО эффективно блокируют доступ транскрипционных факторов к участкам их связывания.

ТФО могут ингибировать также и инициацию транскрипции, осуществляемую РНК-полимеразой. Ген Ыа плазмиды pBR322 содержит гомопурин-гомопиримидиновую последовательность (13 п.о.) перед точкой инициации транскрипции. Гомопиримидиновый 13-мер, формирующий межмолекулярный триплекс с этой мишенью, препятствует инициации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой E.coli in vitro (Duval-Valentin

et al., 1992). Другие исследователи получили такие же данные для Т7 РНК-полимеразы (Mäher, 1992).

Транскрипция, осуществляемая эукариотической РНК-полимеразой II in vitro, протекает с участием позднего аденовирусного промотора. Гомопиримидиновый ТФО образует межмолекулярный триплекс с транскрибируемой ДНК, содержащей гомопурин-гомопиримидиновый тракт (15 п. о.), и ингибирует синтез значительной части транскриптов (Young et al., 1991). Таким образом, ТФО, выступающие в роли искусственных регуляторов транскрипции, могут блокировать различные ее стадии: образование промоторного комплекса, инициацию и элонгацию.

Появляются сообщения, демонстрирующие, что ТФО могут действовать как репрессоры транскрипции и в культурах клеток. Наиболее убедительные результаты получены для промотора рецептора а ингерлейкина 2 (Grigoriev et al., 1992; Grigoriev et al., 1993). Как упоминалось выше, были использованы гомопиримидиновые ТФО, связывающиеся с дцДНК-мишенью и препятствующие связыванию активатора транскрипции NFkB. Также были синтезированы конъюгаты этих олигонуклеотидов с акридином и псораленом. Плазмида, несущая репортерный ген под контролем промотора IL-2Ra, была трансфецирована совместно с ТФО в культуру ткани. Продемонстрировано, что ТФО блокируют активность промотора. Особенно сильный эффект наблюдался на клетках, трансфецированных коньюгатом олигонуклеотида с псораленом после их облучения УФ-светом. С помощью химического футпринтинга для данного случая было прямо продемонстрировано образование межмолекулярного триплекса in vivo. Аналогичный подход с применением котрансфекции был использован для воздействия in vivo на IRE (Roy, 1993).

На культуре клеток было достигнуто частичное ингибирование транскрипции человеческих генов с-тус и IL-2Ra с помощью пурин-богатых ТФО, З'-концы которых были защищены аминогруппами (Orson et al., 1991; Postel et al., 1991). Подобный эффект

наблюдался при ингибировании транскрипции вируса человеческого иммунодефицита (HIV) в культуре клеток (McShan et al., 1992). ТФО с присоединенным холестерином были использованы для ингибирования прогестерон-чувствительного гена (Ing et al., 1993). Хотя эффект ингибирования составил не более 50%, эта величина достаточно значима для того, чтобы утверждать, что короткие олигонуклеотиды успешно распознают конкретную мишень в составе полного генома и препятствуют ее участию в процессе транскрипции. Однако, следует заметить, что ни в одном из этих случаев не было показано, что именно образование триплексов вызывает наблюдаемый эффект.

ТФО использовались также для ингибирования репликации ДНК. Образование межмолекулярных или Н-подобных триплексов в составе одноцепочечной ДНК in vitro ингибирует различные ДНК-полимеразы (Samadashwily et al., 1993; Samadashwily & Mirkin, 1994), Поскольку условия синтеза ДНК in vitro благоприятны для образования PyPuPu триплексов, пурин-богатые ТФО эффективно иншбируют даже такие ферменты, как Т7 ДНК-полимераза и термофильные Taq nVent полимеразы. Для того, чтобы с большей эффективностью осуществлять ингибирование, комплексы олигонуклеотидов (пиримидин-богатых ТФО) могут быть дополнительно стабилизированы за счет присоединения к ДНК-мишени (Giovannangeü et al., 1993). ТФО также блокируют синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы на двуцепочечной ДНК в качестве матрицы (Hacia et al., 1994; Krasilnikov et al., 1997). Белки, связывающие одноцепочечную ДНК (SSB белки), помогают ДНК-полимеразам частично преодолеть триплексный барьер, но эффективность действия SSB белков полностью зависит от состава триплексов (Samadashwily & Mirkin, 1994). Хотя эти наблюдения делают ТФО возможными кандидатами для подавления репликации ДНК in vivo, на эту тему почти нет экспериментальных данных. Известны только единичные данные, касающиеся использования конъюгата октатимидилата с акридином: конъюгат предположительно связывается с последовательностью d(A)g ДНК вируса SV40, находящейся рядом с участком связывания Т-антигена. In vivo ТФО частично ингибирует

репликацию ДНК SV40, возможно, путем влияния на связывание или изменение активности Т-антигена (Birg et al., 1990).

Имеет смысл коротко остановиться на некоторых трудностях, возникающих при использовании триплексобразующих олигонуклеотидов, особенно наиболее перспективных из них - пуриновых, для направленного воздействия на экспрессию генов, а также на способах их преодоления.

Одной из задач при использовании ТФО является создание синтетических производных олигонуклеотидов, обладающих повышенной устойчивостью к действию нуклеаз. Было показано, что фосфотиоатные производные пиримидиновых олигонуклеотидов, устойчивые к действию некоторых нуклеаз и представляющие интерес в качестве потенциальных агентов для регуляции экспрессии генов, способны узнавать соответствующие полипурин-полипиримидиновые двуцепочечные участки ДНК и образовывать стабильные триплексы. Стабильность таких комплексов ниже, чем при использовании немодифицированных; Тт уменьшается в среднем на 2°С при введении очередной фосфотиоатной связи (Xodo et al., 1994b).

Нуклеиновые кислоты, содержащие polyG тракты, способны как к образованию триплексов с d(GC) трактами, так и к самоассоциации с образованием четырехцепочечных структур при физиологических условиях. Показано, что присутствие моновалентных катионов, особенно К+, индуцирует образование квадруплексов, тогда как добавление Мп2+, Со2 , Ni2+ позволяет сдвинуть равновесие преимущественно в сторону триплекса (Blume et al., 1997).

Для лучшего понимания, какие параметры влияют на структуру G-богатых олигонуклеотидов, была проверена способность ряда таких олигонуклеотидов к самоассоциации (Cheng & Van Dyke, 1997). Были сделаны следующие наблюдения: 1) олигонуклеотиды, содержащие 4 кластера по 3 и более гуанозинов, очень быстро самоассоциируют внутримолекулярно, но не межмолекулярно 2) межмолекулярная

димеризация является предпочтительной формой взаимодействия, если олигонуклеотиды содержат только два гуанозиновых кластера, 3) Т-богатые вставки вызывают мультимеризацию олигонуклеотидов и образование высокоорганизованных структур.

При попытках ингибировать транскрипцию урх-гена с помощью пуриновых олигонуклеотидов не было получено позитивных результатов (ЗутагсЬик ег а1., 1996). Для предотвращения агрегации пуриновых олигонуклеотидов и сдвига равновесия в сторону образования триплексов в этой работе было предложено использовать пуриновые олигонуклеотиды в комплексе с короткими олигонуклеотидами, комплементарными их 5-или З'-концу. Продемонстрировано, что такой подход может бьггь полезен для практического применения.

Гораздо более удачные попытки воздействия на геномную ДНК в составе интактных клеток были осуществлены другой группой исследователей <Ве1ошоу е!.а1., 1998). Для воздействия на ген рецептора ССК5 в клетках аденокарциномы НТ-29 были использованы 12-звенные А/О-содержащий олигонуклеотид и его изостерический гуаниновый аналог, несущие хлорамбуцильные алкилирующие остатки на 5-концевых фосфатах. Продемонстрировано, что алкилирование может эффективно протекать в интактных клетках, эффективность модификации может быть существенно увеличена при добавлении в культуральную среду интеркалятора коралайна, стабилизирующего триплексы.

При физиологических условиях константы связывания олигонуклеотидов с дцДНК-мишенями невысоки, что способствует высокой специфичности их связывания; использование длинных ТФО ограничивает число потенциальных мишеней, так как длинные гомопурин-гомопиримидиновые тракты в геноме достаточно редки. В связи с этим наиболее важной проблемой при использовании ТФО для регуляции экспрессии генов является сложность сочетания эффективности связывания с его высокой селективностью.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Демченко, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. На примере фрагментов гена человеческого у-интерферона исследована направленность и эффективность модификации дцДНК алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, образующими трехцепочечные комплексы с полипурин -полипиримидиновыми трактами. Продемонстрирована высокая специфичность реакции алкилирования. Показано, что алкилирующая группа, присоединенная к З'-концевому фосфату триплексобразующего олигонуклеотида, реагирует с гуанозинами, находящимися в обеих цепях дцДНК, в то время как 5-концевая алкилирующая группа реагирует только с гуанозинами пуриновой цепи. Бифункциональные реагенты, несущие реакционноспособные группы на 3'- и 5'-концах олигонуклеотида, могут алкилировать одновременно обе цепи ДНК, приводя к ковалентной сшивке двух цепей, что открывает возможности для расщепления определенного выбранного участка ДНК по обеим цепям. Продемонстрировано, что эффективность реакции алкилирования зависит от расположения реакционноспособного центра мишени относительно алкилирующей группы, а также от длины линкера, связывающего олигонуклеотид и реакционноспособную группу.

2. Изучена специфичность образования комплексов пуриновых олигонуклеотидов с полипурин-полипиримидиновыми участками дцДНК. С помощью реакционноспособных производных пуриновых олигонуклеотидов впервые показано, что их связывание происходит в антипараллельной по отношению к пуриновой цепи дуплекса ориентации.

3. Разработан метод количественной модификации дцДНК алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, заключающийся в последовательных обработках ДНК реагентом в возрастающих концентрациях без удаления предыдущей порции гидролизованного реагента.

4. Доказано, что в присутствии ионов магния при кислых рН пиримидиновые олигонуклеотиды и их реакционноспособные производные могут образовывать комплексы с участками дцДНК-мишени, содержащими последовательности с неполной комплементарностью. Показано, что 1). При наличии в пуриновой цепи ДНК одиночных остатков Т или С, олигонуклеотид в этом месте должен содержать несколько выпетливающихся оснований, предпочтительно тимидин. 2). Гуанозин в пиримидиновом I олигонуклеотиде, введенный напротив тимидина в пуриновой цепи ДНК, не участвует в образовании тройного комплекса. 3). Модификация может протекать эффективно даже в составе слабых комплексов, не регистрируемых в данных условиях. 4). Реакция модификации дцДНК проходит с большей эффективностью в составе структур, в которых 5'-концевая область олигонуклеотида образует совершенный комплекс с ДНК-мишенью, в то время как 3'-концевая область с алкилирующей группой вследствие неполной комплементарности имеет большую конформационную свободу.

5. Обнаружено, что при низких рН в присутствии ионов магния пиримидиновые олигонуклеотиды образуют с дцДНК два типа тройных комплексов, причем алкилирование протекает с высокой эффективностью только в составе одного из них (канонического Хугстеновского).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Демченко, Елена Николаевна, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Akhebat A., Dagneaux C., Liquier J. & Taillandier E. (1992) Triple helical polynucleotide strutures: an FTIR study of the C'GC triplet. J. Biomol. Struct. Dyn. 10, 577-588.

2. Alunni-Fabbroni M., Pirulli D., Manzini G. & Xodo L.E. (1996) (A,G)-oligonucleotides form extraordinary stable triple helices with a critical R Y sequence of the murine c-Ki-ras promoter and inhibit transcription in transfected NIH ЗТЭ cells. Biochemistry 35, 16361-16369.

3. Antao V.P., Gray D.M. & Ratliff R.L. (1988) CD of six conformational rearrangements of poly[d(A-G)'d(C-T)] induced by low pH. Nucleic Acids Res. 16, 719-738.

4. Arnott S. & Seising E. (1974) Structures for the polynucleotide complexes poly(dA) poly(dT) and poly(dT)poIy(dA)po!y(dT). J. Mol. Biol. 88, 509-521.

5. Arnott S.> Bond P.J., Seising E. & C.Smith PJ. (1976) Models of triple-stranded polynucleotides with optimized stereochemistry. Nucleic Acids Res. 3, 2459-2470.

6. Backer M.M. & Wang Z.. (1989) B->A transitions within a 5S ribosomal RNA gene are highly sequence-specific. J.Biol. Chem. 264,4163-4167.

7. Beal P.A. & Dervan P.B. (1991) Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide directed triple-helix formation. Science 251,1360-1363.

8. Beal P.A. & Dervan P.B. (1992a) The influence of single base triplet changes on the stability of a Pur Pur-Pyr triple helix determined by affinity cleaving. Nucleic Acids Res. 20, 27732776.

9. Beal P.A. & Dervan P.B. (1992b) Recognition of double helical DNA by alternate strand triple helix formation. J. Am. Chem. Soc. 114, 4976-4982.

10. Belikova A.M., Zarytova V.F. & Grineva N.I., (1967) Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. Tetrahedron Lett., 37, 3557-3562.

11. Belotserkovskii B.P., Krasilnikova M.M., Veselkov AG. & Frank-Kamenetskii M.D.

(1992) Kinetic trapping ofH-DNAby oligonucleotide binding. Nucleic Acids Res. 20,1903-1908.

12. Belotserkovskii B.P., Veselkov A G., Fillppov S.A., Dobrynin V.N.. M.Mirkin S. & Frank-Kamenetskii M.D. (1990) Formation of intramolecular triplex in homopurine- homopyrimidine mirror repeats with point substitutions. Nucleic Acids Res. 18, 6621-6624.

13. Belousov E.S., Afonina I.A., Kutyavin I.V., Gall A.A., Reed M.W., Gamper H.B., Wydro R.M. & Meyer R.B. (1998) Triplex targeting of a native gene in permeabilized intact cells: covalent modification of the chemokine receptor CCR5. Nucleic Acids Res. 26,1324-1328.

14. Beitran R., Martinez-Balbas A., Bernues J., Bowater R. & Azorin F. (1993) Characterization of the zinc-induced structural transition at a d(GA'CT)22 sequence. J. Mol. Biol. 230, 966-978.

15. Bemues J., Beitran R., Casasnovas J.M. & Azorin F. (1990) DNA-sequence and metal-ion specificity of the formation of *H-DNA. Nucleic Acids Res. 18, 4067-4073.

16. Birg F., Praseuth D., Zerial A., Asseline U., Le Doan T.& Helene C. (1990) Inhibition of simian virus 40 DNA replication in CV-1 cells by an oligodeoxynucleotide covalently linked to an intercalating agent. Nucleic Acids Res. 18, 2901-2908.

17. Blume S.W., Guarcello V., Zacharias W. & Miller D.M. (1997) Divalent transition metal counteract potassium-induced quadruplex assembly of oligo(dG) sequences. Nucleic Acids Res. 25, 617-625.

18. Booher M.A., Wang S. & Kool E.T. (1994) Base pairing and steric interactions between pyrimidine strand bridging loops and the purine strand in DNA pyrimidine.purine.pyrimidine triplexes. Biochemistry 33, 4645-4651.

19. Borisova O.F., Shchyolkina A.K., Timofeev E.N., Tsybenko S.Yu., Mirzabekov A.D. & Florentiev V.L. (1995) Stabilization of parallel (recombinant) triplex with propidium iodide. J. Biomol. Struct. Dyn. 13, 15-27.

20. Broitman S.L., Im D.D. & Fresco J.R. (1987) Formation of the triple-stranded polynucleotide helix, poly(AAU). Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 5120-5124.

21. Cantor C R. & Schimmel P.R. (1980) Biophysical Chemistry. Part III: The Behavior of

Biological Macromolecules. Freeman, New York.

22. Cassani G.R. & Bollum F.J. (1969) 01igodeoxythymidilate:polydeoxyadenylate and oligodeoxyadenylate:polydeoxythyrnidilate interactions. Biochemistry 8, 3928-3936.

23. Cheng A. J.& Van Dyke M.W. (1997) Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on intramolecular and intermolecular G-quartet formation. Gene 197, 253-260.

24. Collier D.A. & Wells R.D. (1990) Effect of length, supercoiling and pH on intramolecular triplex formation. Multiple conformers at Pur-Pyr mirror repeats. J. Biol. Chem. 265, 10652- 10658.

25. Colocci N., Distefano M.D. & Dervan P.B. (1993) Cooperative oligonucleotide-directed triple helix formation at adjacent DNA sites. J. Am. Chem. Soc. 115, 4468-4473.

26. Cooney M., Czernuszewicz G., Postel E.H., Flint S.J. & M.E.Hogan (1988) Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vivo. Science 241, 456459.

27. Davis T.L., Firulli A.B. & Kinniburgh A.J. (1989) Ribonucleoprotein and protein factors bind to an H-DNA-fbrming c-myc DNA element: possible regulators of the c-myc gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 9682-9686.

28. Dayn A., Samadashwily G.M. & Mirkin S.M. (1992) Intramolecular DNA triplexes: unusual sequence requirements and influence on DNA polymerization. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89,11406-11410.

29. Duval-Valentin G„ Thuong N.T. & Helene C. (1992) Specific inhibition of transcription by triple helix-forming oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 504-508.

30. Escude C, Francois J.C., Sun J.S., Ott G., Sprinzl M., Garestier T. & Helene C. (1993) Stability of triple helices containing RNA and DNA strands: experimental and molecular modeling studies. Nucleic Acids Res. 21, 5547-5553.

31. Felsenfeld G., Davies D.R. & Rich A. (1957) Formation of a three-stranded polynucleotide molecule. J. Am. Chem. Soc. 79,2023-2024.

32. Fossella J.A., Kim Y.J., Shih H., Richards E.G. & Fresco J.R. (1993) Relative specificities

in binding of Watson-Crick base pairs by third strand residues in a DNA pyrimidine triplex motif. Nucleic Acids Res. 21, 4511-4515.

33. Fox K.R. (1990) Long (dA)n.(dT)n tracts can form intramolecular triplexes under superhelical stress. Nucleic Acids Res. 18, 5387-5391.

34. Fox K.R., Polucci P., Jenkins T.C. & Neidle S. (1995) A molecular anchor for stabilizing triple-helical DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 7887-7891.

35. Francois J.C., Saison-Behmoaras T. & Helene C. (1988) Sequence-specific recognition of the major groove of DNA by oligodeoxynucleotides via triple helix formation. Footprinting studies. Nucleic Acids Res. 16, 11431-11440.

36. Frank-Kamenetskii M. (1992) Protonated DNA structures. Methods Enzymol. 211, 180-191.

37. Frank-Kamenetskii M.D. & Mirkin S.M. (1995) Triplex DNA structures. Annu. Rev. Biochem. 64, 65-95.

38. Frank-Kamenetskii M.D., Malkov V.A., Voloshin O.N. & Soyfer V.N. (1991) Stabilization of PyPuPu triplexes with bivalent cations. Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 24, 159-162.

39. Froehler B.C. & Ricca D J. (1992) Triple-helix formation by oligonucleotides containing the carbocyclic analogs of thymidine and 5-methyl-2'-deoxycytidine. J. Am. Chem. Soc. 114, 83208322.

40. Gamper H.B., Jr, Kutyavin I.V., Rhinehart R.L., Lokhov S.G., Reed M.W. & Meyer R.B. (1997) Modulation of Cm/T, G/A, and G/T triplex stability by conjugate groups in the presence and absence of KCl. Biochemistry 36, 14816-14826.

41. Gee J.E., Blume S., Snyder R.C., Ray R. & Miller D.M. (1992) Triplex formation prevents Spl binding to the dihydrofolate reductase promoter. J. Biol. Chem. 267, 11163-11167.

42. Giovannangeli C., Montenay-Garestier T., Rougee M., Chassignol M., Thuong N.T. & Helene C. (1991) Single-stranded DNA as a target for triple-helix formation. J. Am. Chem. Soc. 113, 7775- 7777.

43. Giovannangeli C., Thuong N.T. & Helene C. (1993) Oligonucleotide clamps arrest DNA

synthesis on a single-stranded DNA target. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10013-10017.

44. Glaser R. & Gabbay E.J. (1968) Topography of nucleic acid helices in solutions. III. Interactions of spermine and spermidine derivatives with polyadenylic-polyuridylic and polyinosinic-polycytidylic acid helices. Biopolymers 6,243-254.

45. Gowers D.M. & Fox K.R. (1997) DNA triple helix formation at oligopurine sites containing multiple contiguous pyrimidines. Nucleic Acids Res. 25, 3787-3794.

46. Gray D.M., Ratliff R.L., Antao V.P. & Gray C.W. (1988) CD spectroscopy of acid induced structures of polydeoxyribonucleotides: importance of C-C+ base pairs. In (.Sarma R.H. & Sarma M.H., Eds.) Structure & Expression. Vol. 2: DNA and Its Drug Complexes. Adenine Press, New York, 147-166.

47. Griffin L.C. & Dervan P.B. (1989) Recognition of thymine-adenine base pairs by guanine in a pyrimidine triple helix motif. Science 245, 967-971.

48. Grigoriev M., Praseuth D., Guyesse A.L., Robin P., Thuong N.T., Helene C. & Harrel-Bellan A. (1993a) Inhibition of gene expression by triple helix-directed DNA cross-linking at specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3501-3505.

49. Grigoriev ML, Praseuth D., Robin P., Hemar A., Saison-Behmoaras T., Dautry-Varsat A., Thuong N.T., Helene C. & Harrel-Bellan A. (1992) A triple helix-forming oligonucleotide-intercalator conjugate acts as a transcriptional repressor via inhibition of NF kB binding to interleukin-2 receptor a-regulatory sequence. J. Biol. Chem. 267, 3389-3395.

50. Haas B.L. & Guschlbauer W. (1976) Protonated polynucleotide structures. 18. Interaction of oligocytidylates with poly(G). Nucleic Acids Res. 3, 205-218.

51. Hacia J.G., Dervan P.B. & Wold B.J. (1994) Inhibition of Klenow fragment DNA polymerase on double-helical templates by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Biochemistry 33, 6192-6200.

52. Hampel K.J., Ashley C. & Lee J.S. (1994) Kilobase-range communication between polypurine.polypyrimidine tracts in linear plasmids mediated by triplex formation: a braided knot

between two linear duplexes. Biochemistry 33, 5674-5681.

53. Hampel K.J., Burkholder G.D. & Lee J.S. (1993) Plasmid dimerization mediated by triplex formation between polypyrimidine-polypurine repeats. Biochemistry 32, 1072-1077.

54. Hampel K.J., Crosson P. & Lee J.S. (1991) Polyamines favor DNA triplex formation at neutral pH. Biochemistry 30, 4455-4459.

55. Han H. & Dervan P.B. (1993) Sequence-specific recognition of double helical RNA and RNA-DNA by triple helix formation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 3806-3810.

56. Haner R. & Dervan P.B. (1990) Single-strand DNA triplex formation. Biochemistry 29, 9761-9765.

57. Hanvey J.C., Shimizu M. & Wells R.D. (1990) Site-specific inhibition of EcoRI restriction/modification enzymes by a DNA triple helix. Nucleic Acids Res. 18, 157-161.

58. Hanvey J.C., Williams E.M. & Besterman J.M. (1991) DNA triple-helix formation at physiologic pH and temperature. Antisense Res. Dev. 1, 307-317.

59. Hartman D.A., Kuo S.R., Broker T.R., Chow L.T. & Wells R.D. (1992) Intermolecular triplex formation distorts the DNA duplex in the regulatory region of human papillomavirus type-11. J. Biol. Chem. 267, 5488-5494.

60. Hattori M., Frazier J. & Miles H.T. (1975) Poly(8-aminoguanylic acid): formation of ordered self-structures and interaction with poly(cytidylic acid). Biochemistry 18, 5033-5045.

61. Helene C. (1991) The antigene strategy: control of gene expression by triplex-helix-forming oligonucleotides. Anticancer Drug Des. 6, 569-584.

62. Hillen W. & Gassen H.G. (1979) Physical and coding properties of poly(5-methoxyuridylic) acid. Biochim. Biophys. Acta 562, 207-213.

63. Hoogsteen K. (1959) The structure of crystals containing a hydrogen-bonded complex of 1 -methylthymine and 9-methyladenine. Acta Crystallogr. 12, 822-823.

64. Hoogsteen K. (1963) The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine. Acta Crystallogr. 16,907-916.

65. Home D.A. & Dervan P.B. (1990) Recognition of mixed-sequence duplex DNA by alternate-strand triple-helix formation. .J. Am. Chem. Soc. 112, 2435-2437.

66. Howard F.B., Limn W. & Miles H.T. (1985) Poly(2-amino-8-methyladenylic acid). Competing structural and energetic effects of substituents. Biochemistry 24, 5033-5039.

67. Howard F.B., Miles H.T., Liu K., Frazier, Raghunathan G. & Saslsekharan V. (1992) Structure of d(T)n(A)nd(T)n: the DNA triple helix has B-form geometry with C2'-endo sugar pucker. Biochemistry 31,10671-10677.

68. Htun, H. & Dahlberg J.E. (1988) Single strands, triple strands, and kinks in H-DNA. Science 241, 1791-1796.

69. Htun, H. & Dahlberg J.E. (1989) Topology and formation of triple-stranded H-DNA. Science 243, 1571-1576.

70. Ing, N.H., Beekman J.M., Kessler D.J., Murphy M., Jayaraman K., Zendegui J.G., Hogan M.E., OMalley B.W. & Tsai M.J. (1993) In vivo transcription of a progesterone- responsive gene is specifically inhibited by a triple-forming oligonucleotide. Nucleic Acids Res. 21, 2789-2796.

71. Inman, R.B. (1964) Multistranded DNA homopolymer interactions. J. Mol. Biol. 10, 137146.

72. Jayasena, S.D. & Johnston B.H. (1992a) Intramolecular triple-helix formation at (PunPy„)(PunPyn) tracts: recognition of alternate strands via PuPuPy and Py PuPy base triplets. Biochemistry 31, 320-327.

73. Jayasena, S.D. & Johnston B.H. (1992b) Oligonucleotide-directed triple helix formation at adjacent oligopurine and oligopyrimidine DNA tracts by alternate strand recognition. Nucleic Acids Res. 20, 5279-5288.

74. Jayasena, S.D. & Johnston B.H. (1993) Sequence limitations of triplex formation by alternate-strand recognition. Biochemistry 32, 2800-2807.

75. Jetter, M.C. & Hobbs F.W. (1993) 7,8-dihydro-8-oxoadenine as a replacement for cytosine in the third strand of triple helices. Triplex formation without hypochromicity. Biochemistry 32,

3249-3254,

76. Johnson, K.H., Durland R.H. & Hogan M.E. (1992) The vacuum UV CD spectra of GGC triplexes. Nucleic Acids Res. 20, 3859-3864.

77. Kanaya, E.N., Howard F.B., Frazier J. & Miles H.T. (1987) Poly(2-amino-8-methyldeoxyadenylic acid): contrasting effects in deoxy- and ribopolynucleotides of 2-amino and 8-methyl substituents. Biochemistry 26, 7159-7165.

78. Kang, S. & Wells R.D. (1992) Central non-PurPyr sequences in oligo(dGdC) tracts and metal ions influence on the formation of intramolecular DNA triplex isomers. J. Biol. Chem. 267, 20887-20891.

79. Kiessling, L.L., Griffm L.C. & Dervan P.B. (1992) Flanking sequence effects within the pyrimidine triple-helix motif characterized by affinity cleaving. Biochemistry 31, 2829-2834.

80. Knorre, D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F. & Lebedev A.V. (1989) Reactive oligonucleotide derivatives as tools for site specific modification of biopolymers. Soviet Scientific Reviews 15, 271-339.

81. Koh, J.S. & Dervan P.B. (1992) Design of a nonnatural deoxyribonucleoside for recognition of GC base pairs by oligonucleotide-directed triple helix formation. J. Am. Chem. Soc. 114, 14701478.

82. Kohwi, Y. & Kohwi-Shigematsu T. (1988) Magnesium ion-dependent triple-helix structure formed by homo-purine-homopyrimidine sequences in supercoiled plasmid DNA. Proc. Natl.Acad.Sci. USA 85, 3781-85.

83. Kohwi, Y. & Kohwi-Shigematsu T. (1993) Structural polymorphism of homopurine-homopyrimidine sequences at neutral pH. J. Mol. Biol. 231, 1090-1101.

84. Kohwi-Shigematsu, T. & Kohwi, Y. (1991) Detection of triple-helix related structures adopted by poly(dG)-poly(dC) sequences in supercoiled plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 19, 4267-4271.

85. Kolluri, R., Torrey T.A. & Kinniburgh A.J. (1992) A CT promoter element binding protein:

definition of a double-strand and a novel single-strand DNA-binding motif. Nucleic Acids Res. 20, 111-116.

86. Kool, E.T. (1991) Molecular recognition by circular oligonucleotides: increasing the selectivity of DNA binding. J. Am. Chem. Soc. 113, 6265-6266.

87. Koshlap K.M,, Schultze P., Brunar H., Dervan P.B., Feigon J. (1997) Solution structure of an intramolecular DNA triplex containing an N7-glycosylated guanine which mimics a protonated cytosine. Biochemistry 36, 2659-2668.

88. Krasilnikov A.S., Panyutin I.G., Samadashwily G.M., Cox R. & Mirkin S.M. (1997) Mechanisms of triplex-caused polimerization arrest. Nucleic Acids Res. 25, 1339-1346.

89. Krawczyk, S.H., Milligan J.F., Wadwani S., Moulds C., Froehler B. & Matteucci M.D. (1992) Oligonucleotide-mediated triple helix formation using an N3-protonated deoxycytidine analog exhibiting pH-independent binding within the physiological range. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3761-3764.

90. Kutyavin I.V., Gamper H.B., Gall A.A. & Meyer R.B., Jr. (1993) Efficient, specific interstrand cross-linking of double-stranded DNA by a chlorambucil-modified, triplex-forming oligonucleotide. J. Am. Chem. Soc. 115, 9303-9304.

91. Lampe J.N., Kutyavin I.V., Rhinehart R., Reed M.W., Meyer R.B. & Gamper H.B., Jr (1997) Factors influencing the extent and selectivity of alkylation within triplexes by reactive G/A motif oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 25, 4123-4131.

92. Latimer, L.J.P., Hampel K. & Lee J.S. (1989) Synthetic repeating sequence DNAs containing phosphorothioates: nuclease sensitivity and triplex formation. Nucleic Acids Res. 17, 1549-1561.

93. Laughton, C.A. & Neidle S. (1992) Prediction of the structure of the Y+.R-.R(+)-type DNA triple helix by molecular modelling. Nucleic Acids Res. 20, 6535-6541.

94. Laughton, C.A. & Neidle S. (1992a) Molecular dynamics simulation of the DNA triplex d(TC)5 d(GA)5 d(C+T)5. J. Mol. Biol. 223, 519-529.

95. Le Doan, T., Perrouault L., Praseuth D., Habhoub N., Decoult J.L., Thuong N.T., Lhomme J. & Helene C. (1987) Sequence-specific recognition, photocrosslinking and cleavage of the DNA double-helix by an oligo-[a]-thymidilate covalently linked to an azidoproflavine derivative. Nucleic Acids Res. 15, 7749-7760.

96. Lee, J.S., Johnson D.A. & Morgan A.R. (1979) Complexes formed by (pyrimidine)n(purine)„ DNAs on lowering the pH are three-stranded. Nucleic Acids Res. 6, 30733091.

97. Lee, J.S., Woodsworth ML., Latimer L.J. & Morgan A.R. (1984) Poly(pyrimidine)-poly(purine) synthetic DNAs containing 5-methylcytosine form stable triplexes at neutral pH. Nucleic Acids Res. 12, 6603-6614.

98. Letai, A.G., Palladino M.A., From £., Rizzo V. &.Fresco J.R (1988) Specificity in formation of triple-stranded nucleic acid helical complexes: studies with agarose-linked polyribonucleotide affinity columns. Biochemistry 27, 9108-9112.

99. Limn, W., Uesugi S„ Ikehara M. & Miles H.T. (1983) Poly(8-methyladenylic acid): a single- stranded regular structure with alternating syn-anti conformations. Biochemistry 22, 42174222.

100. Lipsett, M.N. (1964) Complex formation between polycytidylic acid and guanine oligonucleotides. J. Biol. Chem. 239,1256-1260.

101. Lipsett, M.N., Heppel L.A. & Bradley D.F. (1960) Complex formation between adenine oligonucleondes and polyuridylic acid. Biochim. Biophys. Acta 41, 175-177.

102. Liquier, J., Coffinier P., Firon M. & Taillandier E. (1991) Triple helical polynucleotide structures: sugar conformations determined by FTIR spectroscopy. J. Biomol. Struct. Dyn. 9, 437435.

103. Liu, K., Miles H.T., Parris K.D. & Sasisekharan V. (1994) Fibre-type X-ray diffraction patterns from single crystals of triple helical DNA. Nature Struct. Biol. 1, 11-12.

104. Lyamichev, V.I., Frank-Kamenetskii M.D. & Soyfer V.N. (1990) Protection against UV-

induced pyrimidine dimerization in DNA by triplex formation. Nature 344, 568-570.

105. Lyamichev, V.I., Mirkin S.M. & Frank-Kamenetskii M.D. (1985) A pH-dependent structural transition in the homopurine-homopyrimidine tract in superhelical DNA. J. Biomol. Struct. Dyn. 3, 327-338.

106. Lyamichev, V.I., Mirkin S.M. & Frank-Kamenetskii (M.D. 1986) Structures of homopurine-homopyrimidine tract in superhelical DNA. J. Biomol. Struct. Dyn. 3, 667-669.

107. Lyamichev, V.I., Mirkin S.M., Danilevskaya O.N., Voloshin O.N., Balatskaya S.V., Dobrynin V.N., Filippov S.A. & Frank-Kalmenetskii M.D. (1989) An unusual DNA structure detected in a telomeric sequence under superhelical stress and at low pH. Nature 339, 634- 636.

108. Lyamichev, V.I., Mirkin S.M., Frank-Kamenetskii M.D. Cantor & C.R. (1988) A stable complex between homopyrimidine oligomers and homologous regions of duplex DNAs. Nucleic Acids Res. 16, 2165-2178.

109. Lyamichev, V.I., Voloshin O.N., Frank-Kamenetskii M.D. & Soyfer V.N. (1991) Photofootprinting of DNA triplexes. Nucleic Acids Res. 19, 1633-1638.

110. Macaya, R , Gilbert D.E., Malek S., Sinsheimer J.S. & Feigon J. (1991) Structure and stability ofX G C mismatches in the third strand of intramolecular triplexes. Science 254, 270-274.

111. Macaya, R., Schultze P., & Feigon J. (1992a) Sugar conformations in intramolecular DNA triplexes determined by coupling constants obtained by automated simulation of P.COSY cross peaks. J. Am. Chem. Soc. 114, 781-783.

112. Macaya, R., Wang E., Schultze P., Sklenar V. & Feigon J. (1992b) Proton nuclear magnetic resonance assignments and structural characterization of an intramolecular DNA triplex. J. Mol. Biol. 225, 755-773.

113. Maher L.J.III, Wold B. & Dervan P.B. (1991) Oligonucleotide-directed DNA triple-helix formation: an approach to artificial repressors? Antisense Res. Dev. 1,277-281.

114. Maher, L.J., in (1992) Inhibition of T7 RNA polymerase initiation by triple-helical DNA complexes: a model for artificial gene repression. Biochemistry 31, 7587-7594.

115. Mäher, L.J., IE, Dervan P.B. & Wold B. (1990) Kinetic analysis of oligodeoxy-ribonucleotide-directed triple-helix formation on DNA. Biochemistry 29, 8820-8826.

116. Mäher, L.J., ID, Dervan P.B. & Wold B. (1992) Analysis of promoter-specific represssion by triple-helical DNA complexes in a eukaryotic cell-free transcription system. Biochemistry 31, 70-81.

117. Mäher, L.J., in, Wold B. &.Dervan P.B (1989) Inhibition of DNA binding proteins by oligonucleotide-directed triple helix formation. Science 245, 725-730.

118. Malkov, V.A., Voloshin O.N., Rostapshov V.M., Jansen I., Soyfer V.N. & Frank-Kamenetskii M.D. (1993a) Protonated pyrimidine-purine-purine triplex. Nucleic Acids Res. 21, 105-111.

119. Malkov, V.A., Voloshin O.N., Soyfer V.N. & Frank-Kamenetskii M.D. (1993b) Cation and sequence effects on stability of intermolecular pyrimidine-purine-purine triplex. Nucleic Acids Res. 21, 585-591.

120. Manzini, G., Xodo L.E. & Gasparotto D. (1990) Triple helix formation by oligopurine-oligopyrimidine DNA fragments - electrophoretic and thermodynamic behaviour. J. Mol. Biol. 213, 833-843.

121. Marek, C. & Thiele D. (1978) Poly(dG) poly(dC) at neutral and alkaline pH: the formation of triple stranded poly(dG) poly(dG) poly(dC). Nucleic Acids Res. 5,1017-1028.

122. Martinez-Balbas, A. & Azorin F. (1993) The effect of zinc on the secondary structure of d(GA TC)n DNA sequences of different length: a model for the formation *H-DNA. Nucleic Acids Res. 21, 2557-2562.

123. Massoulie, J., Michelson A.M. & Pochon F. (1966) Polynucleotide analogues. VI. Physical studies on 5-substituted pyrimidine polynucleotides. Biochim. Biophys. Acta 114, 16-26.

124. Mayfield C., Ebbinghaus S„ Gee J., Jones D„ Rodu B., Squibb M. & Miller D. (1994) Triplex formation by the human Ha-ras promoter inhibits Spl binding and in vitro transcription. J. Biol. Chem. 269, 18232-18238.

125. McShan, W.M., Rossen R.D., Laughter A.H., Trial J., Kessler D.J., Zendegui J.G., Hogan M.E. & Orson F.M. (1992) Inhibition of transcription of HtV-1 in infected human cells by oligodeoxynucleotides designed to form DNA triple helices. J. Biol. Chem. 267, 5712-5721.

126. Mergny, J.L., Duval-Valentin G.,.Nguyen C.H, Perrouault L., Faucon B., Rougee M., Montenay-Garestier T,, Bisagni E. & Helene C. (1992) Triple-helix specific ligands. Science 256, 1681-1684.

127. Mergny, J.L., Sun J.S., Rougee M., Montenay-Garestier T., Barcelo F., Chomilier J. & Helene C. (1991) Sequence specificity in triple-helix formation: experimental and theoretical studies of the effect of mismatches on triplex stability. Biochemistry 30, 9791 -9798.

128. Mirkin, S.M. & Frank-Kamenetskii M.D. (1994) H-DNA and related structures. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 541-576.

129. Mirkin, S.M., Lyamichev V.l., Drushlyak K.N., Dobrynin V.M. & Frank-Kamenetskii M.D. (1987) DNA H form requires a homopurine-homopyrimidine mirror repeat. Nature 330, 495-497.

130. Morgan, A.R. & Wells R.D. (1968) Specificity of the tree-stranded complex formation between double-stranded DNA and single-stranded RNA containing repeating nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 37, 63-80.

131. Moser, H. & Dervan P.B. (1987) Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triplex helix formation. Science 238, 645-650.

132. Mouscadet, J.-F., Ketterle C , Goulaouic H., Carteau S., Subra F., Le Bret M. & Auclair C. (1994) Triple helix formation with short oligonucleotide-intercalator conjugates matching the HIV-l U3 LTR end sequence. Biochemistry 33,4187-4196.

133. Mündt, A.A., Crouch G.J .& Eaton B.E. (1997) Bimolecular DNA triplexes: duplex extensions show implications for H-form DNA stability. Biochemistry 36, 13004-13009.

134. Ono, A., Ts'o P.O.P. & Kan L.-S. (1991) Triplex formation of oligonucleotides containing 2-O-methyl-pseudoisocytidine in substitution for 2-deoxycytidine. J. Am. Chem. Soc. 113, 40324033.

135. Orson, F.M., Kinsey B.M. & McShan W.M. (1994) Linkage structures strongly influence the binding cooperativity of DNA intercalators conjugated to triplex forming oligonucleotides. Nucleic Acid Res. 22, 479-484.

136. Orson, F.M., Thomas D.W., McShan W.M., Kessler DJ. & Hogan M.E. (1991) Oligonucleotide inhibition of EL2Ra mRNA transcription by promoter region collinear triplex formation in lymphocytes. Nucleic Acids Res. 19, 3435-3441.

137. Ouali, M., Letellier R., Sun J.S., Ahkebat A., Adnet F., Liquier J. & Taillandier E. (1993) Determination of G*GC triple-helix structure by molecular modeling and vibrational spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 115, 4264-4270.

138. Panyutin, I.G. & Wells R.D. (1992) Nodule DNA in the (GA)37(CT)37 insert in superheiical plasmids. J. Biol. Chem. 267, 5495-5501.

139. Pilch, D.S., Waring M.J., Sun J.S., Rougee M., Nguyen C.H., Bisagni E., Garestier T. & Helene C. (1993) Characterization of a triple helix-specific ligand. BePI {3-methoxy-7H-8- methyl-ll-[(3'-amino)propylamino]-benzo[e]pyrido[4,3-b]indole} intercalates into both double-helical and triple-helical DNA. J. Mol. Biol. 232,926-946.

140. Plum, G.E., Park Y.W., Singleton S.F., Dervan P.B. & Breslauer K.J. (1990) Thermodynamic characterization of the stability and the melting behavior of a DNA triplex: a spectroscopic and calorimetric study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9436-9440.

141. Pochon, F. & Michelson A.M. (1965) Polynucleotides. VI. Interaction between polyguanylic acid and polycytidylic acid. Proc. Natl. Acad. Sci USA 53, 1425-1430.

142. Postel, E.H., Berberich S.J., Flint S.J., Ferrone C.A. (1993) Human c-myc transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a candidate supressor of tumor metastasis. Science 261,478-483.

143. Postel, E.H., Flint S.J., Kessler D.J. & Hogan M.E. (1991) Evidence that a triplex-forming oligodeoxyribonucleotide binds to the c-myc promoter in HeLa cells, thereby reducing c-myc mRNA levels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8227-8231.

144. Postel, E.H., Mango S.E. & Flint S.J. (1989) A nuclease-hypersensitive element of the human c-myc promoter interacts with a transcription initiation factor. Mol. Cell. Biol. 9, 5123-5133.

145. Prakash, G. & Kool E.T. (1992) Structural effects in the recognition of DNA by circular oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 114, 3523-3527.

146. Radhakrishnan, I. & Patel D.J. (1993) Solution structure of an intramolecular purine purine pyrimidine DNA triplex. J. Am. Chem. Soc. 115,1615-1617.

147. Radhakrishnan, I. & Patel D.J. (1994) Solution structure of a pyrimidine purine pyrimidine DNA triplex containing T. AT, C+ GC and GTA triples. Structure 2,17-32.

148. Radhakrishnan, I., de los Santos C. & Patel D.J. (1991a) Nuclear magnetic resonance structural studies of intramolecular purine purine pyrimidine DNA triplexes in solution - base triple pairing alignments and strand direction. J. Mol. Biol. 221, 1403-1418.

149. Radhakrishnan, I., Gao X., de los Santos C., Live D. & Patel D.J. (1991b) NMR amino proton and nitrogen markers of GTA base triple formation. Biochemistry 30, 9022-9030.

150. Rich, A. (1958) Formation of two- and three-stranded helical molecules by polyinosinic acid and polyadenylic acid. Nature 181, 521-525.

151. Rich, A. (1960) A hybrid helix containing both deoxyribose and ribose polynucleotides and its relation to the transfer of information between the nucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 46, 1044-1053.

152. Roberts, R.W. & Crothers D.M. (1991) Specificity and stringency in DNA triplex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9397-9401.

153. Roberts, R.W. & Crothers D.M. (1992) Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA and DNA backbone composition. Science 258,1463-1466.

154. Roy, C. (1993) Inhibition of gene transcription by purine rich triplex forming oligodeoxyribonucleotides. Nucleic Acids Res. 21, 2845-2852.

155. Samadashwily G.M. & Mirkin S.M. (1994) Trapping DNA polymerases using triplex-forming oligodeoxyribonucleotides. Gene 149, 127-136.

156. Samadashwily, G.M., Dayn A. & Mirkin S.M. (1993) Suicidal nucleotide sequences for DNA polymerization. EMBO J. 12, 4975-4983,

157. Sarver N. (1986) Sustained high-level production of recombinant human gamma interferon using a bovin papillomavirus vector. European patent 0 198 386.

158. Sekharudu, C.Y., Yathindra N.& Sundaralingam M. (1993) Molecular dynamics investigations of DNA triple helical models: unique features of the Watson-Crick duplex. J. Biomol. Struct. Dyn. 11,225-244.

159. Singleton, S.F. & Dervan P.B. (1992a) Thermodynamics of oligodeoxyribonucleotide-directed triple-helix formation: an analysis using quantitative affinity cleavage titration. J. Am. Chem. Soc. 114, 6957-6965.

160. Singleton, S.F. & Dervan P.B. (1992b) Influence of pH on the equilibrium association constants for oligo-deoxyribonucleotide-directed triple helix formation at single DNA sites. Biochemistry 31, 10995-11003.

161. Singleton, S.F. & Dervan P.B. (1993) Equilibrium association constants for oligonucleotide-direeted triple helix formation at single DNA sites: linkage to cation valence and concentration. Biochemistry 32, 13171-13179,

162. Sklenar, V. & Feigon J. (1990) Formation of a stable triplex from a single DNA strand. Nature 345, 836-838.

163. Soyfer, V.N. & Potaman V.N. (1996) Triple Helical Nucleic Acids. Springer Verlag.

164. Soyfer, V.N., Voloshln O.N., Malkov V.A.& Frank-Kamenetskii M.D. (1992) Photofootprinting of inter- and intramolecular DNA triplexes. In (R.H.Sarma & M.H.Sarma eds.) Structure and Function, Vol. 1: Nucleic Acids, Adenine Press, New York, 29-41.

165. Steiner,R.F.& Beers R.F. (1959) Polynucleotides. VI. The influence of various factors upon the structural transition of polyriboadenylic acid at acid pH. Biochim. Biophys. Acta 32, 166-176.

166. Stilz, H.U. & Dervan P.B. (1993) Specific recognition of CG base pairs by 2-

deoxynebularine within the purine purine pyrimidine triple-helix motif. Biochemistry 32, 21772185.

167. Strobel, S.A. & Dervan P.B. (1990) Site-specific cleavage of a yeast chromosome by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science 249, 73-75.

168. Strobel, S.A. & Dervan P.B. (1991) Single-site enzymatic cleavage of yeast genomic DNA mediated by triple helix formation. Nature 350,172-174.

169. Strobel, S.A., Doucette-Stamm L.A., Riba L., Housman D.E.& Dervan P.B. (1991) Site-specific cleavage of human chromosome 4 mediated by triple helix formation. Science 254, 16391642.

170. Sugimoto, N, Shintani Y. & Sasaki M. (1991) Effect of the third-strand length on the formation of DNA triple helix. Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 25, 183-184.

171. Sun J.S., Mergny J.L., Lavery R., Montenay-Garestier T., Helene C. (1991a) Triple helix structures: sequence dependence, flexibility and mismatch effects. J. Biomol. Struct. Dyn. 9, 411424.

172. Sun, J.-S., Giovannangeli C., Francois J.C., Kurfurst R., Montenay-Garestier T., Asseline U., Saison-Behmoaras T., Thuong N.T. & Helene C. (1991b) Triple-helix formation by a-oligodeoxynucleotides and a-oligodeoxynucleotide-intercalator conjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,6023-6027.

173. Svinarchuk F., Cherny D., Debin A., Delain E., Malvy C. (1996) A new approach to overcome potassium-mediated inhibition of triplex formation. Nucleic Acids Res. 24, 3858-3865.

174. Svinarchuk F., Monnot M., Merle A., Malvy C., Fermandjian S. (1995) The high stability of the triple helices formed between short purine oligonucleotides and SI\7HIV-2 vpx genes is determined by the targeted DNA structure. Nucleic. Acids. Res. 23, 3831-3836.

175. Tabor, C.W. & Tabor, H. (1984) Polyamines. Annu. Rev. Biochem. 53, 749-790.

176. Takasugi, M., Guendouz A., Chassignol M., Decout J.L., Lhomme J., Thuong N.T. & Helene C. (1991) Sequence-specific photo-induced cross-linking of the two strands of double-

helical DNA by a psoralen covalently linked to a triple helix-forming oligonucleotide. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 5602-5606.

177. Thomas, T. & Thomas T.J. (1993) Selectivity of polyamines in triplex DNA stabilization. Biochemistry 32, 14068-14074.

178. Thomas, T.J., Kulkami G.D., Greenfield N.J., Shirahata A, Thomas T (1996) Structural specificity effects of trivalent polyamine analogues on the stabilization and conformational plasticity of triplex DNA. Biochem J 319( Pt 2), 591-599.

179. Thuong, N.T. & Helene C. (1993) Sequence-specific recognition and modification of double-helical DNA by oligonucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 666-690.

180. Tuite E. & Norden B. (1995) Intercalative interactions of ethidium dyes with triplex structures. Bioorg. Med. Chem. 3, 701-711.

181. Vlassov, V.V., Gaidamakov S.A., Zarytova V.F., Knorre D.G., Levina A.S., Nikonova A.A., Podust L.M. & Fedorova O.S. (1988) Sequence-specific chemical modification of double-stranded DNA with alkylating oligodeoxyribonucleotide derivatives. Gene 72, 313-322.

182. Wang, E., Malek S.& Feigon J. (1992) Structure of a G T A triplet in an intramolecular DNA triplex. Biochemistry 31, 4838-4846.

183. Wang, S., Booher M.A. & Kool E.T. (1994) Stabilities of nucleotide loops bridging the pyrimidine strands in DNA pyrimidine-purine-pyrimidine triplexes: special stability of the CTTTG loop. Biochemistry 33, 4639-4644.

184. Wickstrom, E. (1991) Prospects for antisense nucleic acid therapy of cancer and AIDS. Wiley-Liss, New York, NY.

185. Wilson, W.D., Hopkins H.P., Mizan S., Hamilton D.D. & Zon G. (1994) Thermodynamics of DNA triplex formation in oligomers with and without cytosine bases: influence of buffer species, pH, and sequence. J. Am. Chem. Soc. 116, 3607-3608.

186. Xodo L„ Alunni-Fabbroni M., Manzini G., Quadrifoglio F. (1994b) Fyrimidine phosphorothioate oligonucleotides form triple-stranded helices and promote transcription inhibition. Nucleic Acids Res. 22, 3322-3330.

187. Xodo, L.E., Alunni-Fabbroni M., Manzini G. (1994a) Effect of 5-methylcytosine on the structure and stability of DNA. Formation of triple-stranded concatenamers by overlapping oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dyn, 11, 703-720.

188. Xodo, L.E., Manzini G., Quadrifoglio F., van der Marel G. & van Boom J. (1991) Effect of 5-methylcytosine on the stability of triple-stranded DNA - a thermodynamic study. Nucleic Acids Res. 19, 5625-5631.

189. Xu Z., Pilch D.S., Srinivasan A.R., Olson W.K., Geacinton N.E. & Breeslauer K.J. (1997) Modulation of nucleic acid structure by ligand binding: induction of a DNA.RNA.DNA hybrid triplex by DAPI intercalation. Bioorg. Med. Chem. 5, 1137-1147.

190. Yoon, K., Hobbs C.A., Koch J., Sardaro M., Kutny R. & Weis A.L. (1992) Elucidation of the sequence-specific third strand recognition of four Watson-Crick base pairs in a pyrimidine triple-helix motif: T AT, C GC, TCG, and GTA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3840- 3844.

191. Young, S.L., Krawczyk S.H., Matteucci M.D. & Toole J.J. (1991) Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10023-10026.

192. Зарытова, В.Ф., Иванова E.M., Кутявин Й.В. (1982) Синтез олигодезоксирибонуклеотидов GGCCTGTTTGGC и Т(рТ)ы триэфирным методом с использованием 5'-п-хлорфениловых эфиров соответствующих олигонуклеотидных блоков. Биоорган, химия, 8,224-230.

193. Кнорре Д.Г., Зарытова В.Ф., Подуст JI.M., Федорова О С. (1988) Комплементарно адресованная модификация двуцепочечкой ДНК в составе трехцепочечного комплекса. Докл. АН СССР, 300, 1006-1009.