Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинами: Синтез, термодинамические свойства и реакционная способность тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Черноносов, Александр Анатольевич

• Черноносов, Александр Анатольевич
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Черноносов, Александр Анатольевич

Список сокращений

Введение

1. Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами - реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот

Обзор литературы)

1.1. Механизмы образования активных форм кислорода

1.1.1. Каталитическая активация молекулы кислорода

1.1.2. Образование активных комплексов с ионами переходных металлов

1.1.3. Механизм образования синглетного кислорода 15 1.1.3.1. Фотосенсибилизаторы на основе порфирина и его аналогов

1.2. Реагенты для окислительной модификации нуклеиновых кислот на основе коньюгатов олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами

1.2.1. Производные олигонуклеотидов с группами, способными сенсибилизировать образование синглетного молекулярного кислорода

1.2.1.1. Порфирины

1.2.1.2. Хлорины

1.2.1.3. Тексафирин и сапфирин

1.2.2. Производные олигонуклеотидов с группами каталитически активными в условиях окисления нуклеиновых кислот молекулярным кислородом и пероксидом водорода

1.2.2.1. Порфирины

1.2.2.2. Корриновый комплекс кобальта(П)

1.2.2.3. Тексафирин диспрозия(Ш)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинами: Синтез, термодинамические свойства и реакционная способность»

Поиск реагентов, способных к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты, находящиеся в клетках в составе различных комплексов, является одной из важнейших задач физико-химической биологии. Среди существующих методов создания таких реагентов можно выделить подход, впервые сформулированный в 1967 году Н. И. Гриневой и получивший название "комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот" [1]. Этот подход основан на фундаментальном свойстве нуклеиновых кислот - способности образовывать двухспиральные структуры за счет Уотсон-Криковских водородных связей (комплементарные взаимодействия). Такое свойство нуклеиновых кислот позволяет создавать реагенты на основе олигонуклеотидов, комплементарных одноцепочечным участкам ДНК-или РНК-мишеней и несущих реакционноспособные группы, которые с помощью олигонуклеотидной части реагентов направляются или "адресуются" на выбранные участки мишеней. Такой подход является наиболее универсальным методом высокоизбирательного воздействия на нуклеиновые кислоты и может быть использован для подавления развития вирусных инфекций и роста опухолей.

В реакционноспособных производных олигонуклеотидов в настоящее время применяются различные химически активные группы: термически активируемые, фотоактивируемые и каталитически активные группы. Среди таких группировок представляют интерес металлированные и неметаллированные порфирины и их аналоги. В силу уникальности своей электронной структуры эти соединения обладают широким спектром полезных свойств. Неметаллированные порфирины и их комплексы с диамагнитными металлами А1, Рф обладают фотохимической активностью как за счет сенсибилизации генерации синглетного молекулярного кислорода, так и из-за возможности прямой реакции возбужденного порфирина с нуклеиновой кислотой. Комплексы порфиринов с парамагнитными ионами переходных металлов способны катализировать окислительную деструкцию ДНК и РНК с помощью О2, Н2О2 и других окислителей.

Аналогичными свойствами обладают синтетические аналоги порфиринов -фталоцианины (тетрабензотетраазапорфирины), которые химически более стабильны, чем порфирины. К тому же электронный спектр у них сдвинут в длинноволновую область, поэтому они могут возбуждаться светом с длиной волны более 600 нм, что существенно для их применения в фотодинамической терапии.

Цель настоящей работы состояла в комплексном изучении физико-химических свойств новых потенциальных ген-направленных реагентов - конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами Со(П), А1(Ш) и гп(П). Для решения поставленной задачи были разработаны методы синтеза в растворе и на твердом носителе конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами, содержащими в боковых заместителях карбоксильные группы. Методами кругового дихроизма и термической денатурации было исследовано влияние остатка фталоцианина на процессы образования дуплексов, триплексов и тетраплексов, происходящие с участием конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами. Методом термической денатурации были получены термодинамические параметры устойчивости дуплексов и триплексов. Полученные конъюгаты были испытаны как потенциальные ген-направленные реагенты для окислительной модификации модельных ДНК-мишеней как в темновых условиях, так и при облучении светом ртутной лампы или гелий-неонового лазера.

В результате проведенного исследования получены данные, свидетельствующие о способности производных олигонуклеотидов с металлокомплексами фталоцианинов вызывать эффективную и селективную окислительную модификацию нуклеиновых кислот. Такие соединения перспективны для дальнейшего практического использования в качестве препаратов для темновой и фотодинамической терапии различных заболеваний.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Черноносов, Александр Анатольевич

Выводы

1. Впервые синтезированы конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с тетра-4-карбоксиметилтиофталоцианином Ъг\(\\) и тетра-[4-карбоксипентил-сульфамоил]фталоцианином А1(Ш) как в растворе, так и на твердом носителе, а также с тетра-4-карбоксифталоцианином Со(П) на твердом носителе.

2. Методами термической денатурации и кругового дихроизма изучено влияние остатка тетра-4-карбоксифталоцианина Со(И) в составе конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов на образование различных комплексов ДНК:

• установлено, что остаток тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в составе конъюгата взаимодействует с олигонуклеотидной частью, образуя внутримолекулярный комплекс;

• показано, что конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) с олигодезоксирибонуклеотидом стабилизирует двухцепочечные и трехцепочечные комплексы ДНК;

• обнаружено, что остаток тетра-4-карбоксифталоцианина Со(И) в составе конъюгата стерически препятствует образованию четырехцепочечного комплекса ДНК, что может быть преодолено пространственным удалением остатка фталоцианина путем включения дополнительных нуклеотидов в конъюгат;

• методом термической денатурации получены термодинамические параметры взаимодействия конъюгатов тетра-4-карбокси-фталоцианина Со(И) с нуклеиновыми кислотами в составе дуплексов и триплексов.

3. Показано, что конъюгаты олигонуклеотидов с металлокомплексами фталоцианинов способны катализировать направленную окислительную модификацию ДНК как при облучении, так и в темновых условиях:

• обнаружено, что конъюгаты тетра-4-карбоксиметилтиофталоцианина Ъп{\\) и тетра-[4-карбоксипентилсульфамоил] фталоцианина А1(Ш) сенсибилизируют направленную модификацию ДНК в составе дуплексов при облучении светом ртутной лампы (Хтах = 365 нм) или светом гелий-неонового лазера (Хтах = 633 нм);

• установлено, что конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в составе дуплексов, триплексов и тетраплексов способен катализировать окисление ДНК молекулярным кислородом в присутствии сопряженных восстановителей или пероксидом водорода;

• обнаружено, что в дуплексах конъюгат тетра-4-карбоксифталоцианина Со(П) в присутствии пероксида водорода вызывает высокоэффективную направленную модификацию ДНК.

Заключение

В представленной работе впервые синтезированы конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианинами двумя методами: в растворе и на твердом носителе. Данные методы синтеза позволяют достаточно легко синтезировать конъкЗгаты с использованием доступных химических реактивов и оборудования. Хотя в случае проведения синтеза в растворе из-за особенностей строения молекулы фталоцианина не удается достигнуть высоких выходов целевого продукта, этот метод может быть использован для синтеза конъюгатов, радиоактивномеченных по 5'-концу олигонуклеотида. Такие радиоактивномеченные конъюгаты необходимы для определения места локализации конъюгатов в клетках и органах живых организмов, а также для исследования повреждения олигонуклеотидной части конъюгатов в ходе реакции модификации модельных ДНК-мишеней, что важно для определения механизма реакции и изучения кинетики процесса модификации.

Синтез на твердом носителе позволяет избежать проблему выделения конъюгатов из реакционной смеси. В этом случае избыток непрореагировавших свободных фталоцианинов выводят из реакционной смеси до удаления продуктов с твердой подложки, что чрезвычайно упрощает методику очистки. В результате, по сравнению с жидкофазным методом синтеза, выход продукта синтеза значительно возрастает.

Методами кругового дихроизма и термической денатурации на примере тетракарбоксифталоцианина Со(П) установлено, что молекула фталоцианина увеличивает стабильность различных комплексов ДНК. Обнаружено, что остаток фталоцианина взаимодействует с четырьмя-пятью нуклеотидами собственной олигонуклеотидной части конъюгата. В случае дуплексов экспериментальные данные позволяют однозначно сказать, что остаток фталоцианина увеличивает температуру плавления комплекса примерно на 6-7 °С. Стабилизация остатком фталоцианина образования триплексов установлена даже более явно, чем для дуплексов, так как образование трехцепочечного комплекса ДНК происходит только в присутствии фталоцианина. В тех же условиях, но в отсутствие фталоцианина, образование триплекса зарегистрировать не удается. В случае тетраплексов нельзя однозначно сказать о стабилизации комплекса остатком фталоцианина по следующим причинам. Во-первых, так как существует взаимодействие фталоцианина с нуклеиновой кислотой в составе конъюгата, при образовании тетраплекса приходится пространственно удалять остаток фталоцианина от участка цепи олигонуклеотидной части конъюгата, принимающей участие в образовании тетрамеров. Во-вторых, из-за кооперативной диссоциации четырехцепочечного комплекса методом термической денатурации регистрируется только один общий переход, что не позволяет оценить вклад фталоцианина в образование комплекса. Экспериментальные данные позволяют только утверждать, что фталоцианин взаимодействует с ДНК в составе тетраплекса.

Сравнение способности конъюгатов К56-К61 модифицировать модельные олигонуклеотиды в составе дуплексов показывает, что наиболее эффективными оказываются конъюгаты К58 и К61, содержащие фталоцианин Со(П). В случае конъюгата К61 максимальная степень щелочелабильной модификации, проводимой 2 в присутствии 1,0x10 М Н2О2, достигает 80 %, а степень модификации, выявляемая Fpg-бeлкoм - 40 %. Это означает, что если модификация, выявляемая Ррд-белком, полностью выявляется пиперидином, то реальная степень модификации составляет 80 %. В случае, если же какая-то часть модификации, выявляемая пиперидином, не выявляется Fpg-бeлкoм, или наоборот, какая-то часть модификации, выявляемая Рр§-белком, не выявляется пиперидином, реальный выход реакции может быть выше и достигать 100 %.

Замена Н2О2 на пару сопряженный восстановитель + 02 приводит к снижению выхода реакции модификации приблизительно до 20 - 25 %, но даже в этом случае степень модификации несколько выше, чем в случае фотоактивируемых конъюгатов.

Сопоставление степени фотомодификации конъюгатами К56, К57, К59 и К60 позволяет сделать заключение о влиянии длины аминолинкера и центрального иона металла на эффективность действия данных реагентов. Результаты экспериментов показывают, что, во-первых, выход реакции модификации в случае конъюгатов К56 и К57, содержащих аминопропанольный линкер, несколько выше, чем в случае конъюгатов К59 и К60, содержащих аминогексанольный линкер. Во-вторых, степень модификации при использовании конъюгатов К56 и К59, содержащих фталоцианин 2п(П), выше, чем в случае использования конъюгатов К56 и К57, содержащих А1(Ш). Соответственно, наиболее эффективным является конъюгат фталоцианина Zn(II) К56, содержащий аминопропанольный линкер.

Причиной низкой эффективности модификации фотоактивируемыми конъюгатами может являться способность синглетного кислорода диффундировать на значительное расстояние за время своей жизни. Время жизни синглетного кислорода и гидроксил-радикала составляет 10"6 и 10"9 секунды, соответственно. Несложно оценить средний диффузный радиус действия данных частиц по формуле Эйнштейна - Смолуховского [155]: для синглетного кислорода он составляет 45 нм, а для гидроксил-радикала - 3 нм. Видно, что гидроксил-радикал не выходит за пределы 22-х звенного олигонуклеотида TGAATGGGAAGAGGGTCAGGTT (МЗ), в котором расстояние между соседними основаниями ДНК составляет 0,34 нм [156], тогда как синглетный кислород способен диффундировать на расстояние, значительно превышающее размер олигонуклеотида-мишени. В этом случае доля активных частиц, вступивших в реакцию с ДНК вблизи их места образования, будет меньше.

В отличие от ранее предложенных порфириновых производных олигонуклеотидов, данные конъюгаты менее подвержены окислительной деструкции. Они способны модифицировать более одной молекулы мишени в расчете на молекулу конъюгата. Поэтому результаты, полученные в данной работе и показывающие способность конъюгатов, несущих фталоцианины Co(II), Zn(II) и А1(Ш), стабилизировать образование дуплексов и триплексов, а также модифицировать нуклеиновые кислоты в составе различных комплексов, имеют большое значение для дальнейшей разработки ген-направленных реагентов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Черноносов, Александр Анатольевич, 2005 год

1. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleotides and diribonucleotides phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. // Tetrahedron Lett. 1967. P. 3557-3567.

2. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. Boca Raton. Florida: CRC Press. 1994.

3. Cerutti P.A. Prooxidant states and tumor promotion. // Science. 1985. V. 227. P. 375-381.

4. Бердников B.M., Журавлёва O.C. Термодинамические характеристики радикала НОг в водном растворе. // Журнал физ. химии. 1972. Т. 46. С. 26582661.

5. Денисов Е. Т. Кинетика гомогенных химических реакций. М: Мир, 1978.

6. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas С.Е. Role of metals in oxygen radical reactions. // J. Free Rad. Biol. Med. 1985. V. 1. P. 3-25.

7. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon press, 1986.

8. Morehouse L.A., Thomas C.E., Aust S.D. Superoxide generation by NADPH-cytochrome P-450 reductase: the effect of iron chelators and the role of superoxide in microsomal lipid peroxidation. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 232. P. 366377.

9. McCord J.M., Fridovich I. The reduction of cytochrome с by milk xanthine oxidase. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 5753-5760.

10. Das D.K., George A., Liu X.K., Rao P.S. Detection of hydroxyl radical in the mitochondria of ischemic-reperfused myocardium by trapping with salicylate. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 165. P. 1004-1009.

11. Chuaqui C.A., Petkau A. Chemical reactivity and biological effects of superoxide radicals. //Radiat. Phys. Chem. 1987. V. 30. P. 365-373.

12. Follin P., Dahlgren C. Altered O2-/H2O2 production ratio by in vitro and in vivo primed human neutrophils. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 167. P. 970-976.

13. In: Enzyme nomenclature: Recommendations (1978) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry. New York: Acad. Press, 1979. P. 82.

14. Gibbs E.J., Pasternack R.F. Interaction of porphyrins and metalloporphyrins with nucleic acids. //Seminars in Hematology. 1989. V. 26. P. 77-85.

15. Winston G.W., Feierman D.E., Cederbuum A.I. The role of iron chelates in hydroxyl radical production by rat liver microsomes, NADPH-cytochrome P-450 reductase and xanthine oxidase. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 232. P. 378390.

16. Czapski G., Goldstein S. Role of metal complexes in the formation-detoxication action of active oxygen species. // Bioelectrochem. Bioenergetics. 1987. V. 18. P. 21-28.

17. Афанасьев КБ. Кислородные радикалы в биологических процессах. // Усп. химии. 1979. Т. 48. С. 977.

18. Dix Т.A., Aikens J. Mechanisms and biological relevance of lipid peroxidation initiation. // Chem. Res. Toxicol. 1993. V. 6. P. 2-18.

19. Cadet J., Teoule R. Comparative study of oxidation of nucleic acid components by hydroxyl radicals, singlet oxygen and superoxide anion radicals. // Photochem. Photobiol. 1978. V. 28. P. 629.

20. Blakely W.F., Fuciarelli A.F., Wegher B.J., Dizdaroglu M. Hydrogen peroxide-induced base damage in deoxyribonucleic acid. // Radiat. Res. 1990. V. 121. P. 338-343.

21. Link E.M. The mechanism of pH-dependent hydrogen peroxide cytotoxicity in vitro. //Arch. Biochem. Biophys. 1988. V. 265. P. 362-372.

22. Farhataziz, Ross A.B. II Nat. Stand. Ref. Data System, Nat. Bur. Stand. 1977. V. 59.

23. Richard P., Haugland Ph. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. 6th Ed. Eugene: Molecular Probes Inc, 1996.

24. Bertinchamps A.S., Huttermann J., Kohnlein W, Teoule R. Effects of ionizing radiation on DNA. Berlin: Springer-Verlag, 1978.

25. Von Sonntag C. The chemical basis of radiation biology. London: Taylor and Francis, 1987.

26. White P. W Mechanistic studies and selective catalysis with cytochrome P-450 model systems. // Bioorgan. Chem. 1990. V. 18. P. 440-456.

27. Traylor T.G., Fann W.-P., Bandyopadhyay D. A common heterolytic mechanism for reactions of iodosobenzenes, peracids, hydroperoxides, and hydrogen peroxide with iron(III) porphyrins. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 8009-8010.

28. Traylor T.G., Xu F. Mechanisms of reactions of iron(III) porphyrins with hydrogen peroxide and hydroperoxides: solvent and solvent isotope effects. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 178-186.

29. Tsuchiya S. Stable oxo-iron(IV) porphyrin 7i-radical cation related to the oxidation cycles of cytochrome P-450 and peroxidase. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991. V. 10. P. 716-717.

30. Oertling W.A., Kean R.T., Weaver R., Babcock G.T. Factors affecting the iron-oxygen vibrations of ferrous oxy and ferryl oxo heme proteins and model compounds. //Inorg. Chem. 1990. V. 29. P. 2633-2645.

31. Chen S.-M., Su Y.O. Electrochemical and spectral characterization of stable iron(IV) tetrakis-5,10,15,20-(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin in aqueous solution at room temperature. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990. V. 1. P. 491-493.

32. Koppenol W.H., Liebman J.F. The oxidizing nature of the hydroxyl radical. A comparison with the ferryl ion (FeC^. //J. Phys. Chem. 1984. V. 88. P. 99-101.

33. Ениколопян H.C., Богданова Л.Ф., Кармшова JI.B., Аскаров К.А. Катализ металлопорфиринами реакций окисления молекулярным кислородом и кислородсодержащими соединениями. //Усп. химии. 1985. Т. 54. С. 369-395.

34. Bowry T.G., Ingold K.V. A radical clock investigation of microsomal cytochrome P-450 hydroxylation of hydrocarbons. Rate of oxygen rebound. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 5699-5707.

35. Khanna R.K., Sutherlin J.S., Lindsey D. Mechanisms in a biomimetic hydroxylation of a chemical probe: 5-nitroacenaphthene. // J. Org. Chem. 1990. V. 55. P. 62336234.

36. Grieco P.A., Stuk T.L. Remote oxidation of unactivated carbon-hydrogen bonds in steroids via oxometalloporphinates. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 77997801.

37. Watanabe Y„ Takehira K, Shimizu M., Hayakawa Т., Orita H. Oxidation of aldehydes by an iron(III) porphyrin complex-m-chloroperbenzoic acid system. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1990. P. 927-929.

38. Rodgers K.R., Arafa I.M., Goff H.M. Iron porphyrin catalysed oxidation of propanal and cyclohexene by molecular oxygen. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1990. P. 1323-1324.

39. Stubbe J., Kozarich J. W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation. // Chem. Rev. 1987. V. 87. P. 1107-1136.

40. McGall G.H., Stubbe J. II In: Nucleic Acids and Molecular Biology/Eds. Eckstein F., Lilley D. M. J. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1988. V. 2. P. 85-104.

41. Pratviel G., Bernadou J., Meunier B. Evidence for high-valent iron-oxo species active in the DNA breaks mediated by iron-bleomycin. // Biochem. Pharmacol. 1989. V. 38. P. 133-140.

42. Sigman D.S. Chemical nucleases. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-9105.

43. Thederahu T.B., Kuwabara M.D., Larsen T.A., Sigman B. Nuclease activity of 1,10-phenanthroline-copper: kinetic mechanism. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 4941-4946.

44. Dizdaroglu M„ Aruoma O.I., Halliwell B. Modification of bases in DNA by copper ion-1,10-phenanthroline complexes. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 8447-8451.

45. Johnson G.R.A., Nazhat N.B. Kinetics and mechanism of the reaction of the bis(l,10-phenanthroline)copper(I) ion with hydrogen peroxide in aqueous solution. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 1990-1994.

46. Kuwabara M., Yoon C., Goyne Т., Thederahn Т., Sigman D.S. Nuclease activity of 1,10-phenanthroline-copper ion: reaction with CGCGAATTCGCG and its complexes with netropsin and EcoRI. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 7401-7408.

47. Briviba K., Klotz L.O., Sies H. Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biological systems. // Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 1259-1265.

48. Singh A. Introduction: interconversion of singlet oxygen and related species. // Photochem. Photobiol. 1978. V. 28. P. 429-433.

49. Красновский A.A. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. // Итоги науки и техники. Сер. Соврем, проблемы лазерной физики. ВИНИТИ. 1990. С. 63-135.

50. Foote C.S. II In: Porphyrin localization and treatment of tumors/Eds. Doirion D.R., Gomer C.J. New York: Alan R. Liss., 1984. P. 3-18.

51. Кузнецова H.A., Калия O.JI. Фотокаталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фотодинамической терапии. // Рос. Хим. Журнал. 1998. С. 37-49.

52. Crestini С., D'Auria М. Photodegradation of lignin: the role of singlet oxygen. // J. Photochem. Photobiol. A. 1996. V. 101. P. 69-73.

53. Seen H., Spikes J., Kopecek P. Photodynamic crosslinking of proteins. I. Model studies using histidine- and lysine-containing N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers. //J. Photochem. Photobiol. B. 1996. V. 34. P. 203-210.

54. Girotti A. W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. // Photochem. Photobiol. 1990. V. 51. P. 497-509.

55. Piette J. New trends in photobiology: Biological consequences associated with DNA oxidation mediated by singlet oxygen. // J. Photochem. Photobiol. B. 1991. V. 11. P. 241-260.

56. Baker A., Kanofsky J. Quenching of singlet oxygen by biomolecules from L1210 leukemia cells. // Photochem. Photobiol. 1992. V. 55. P. 523-528.

57. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues. // J. Photochem. Photobiol. B. 1990. V. 6. P. 3434.вЪ.Беккер Г. О. Введение в фотохимию органических соединений. JL: Химия, 1976. С. 326.

58. Dolphin D. Photomedicine and photodynamic therapy. // Canad. J. Chem. 1994. V. 72. P.1005-1013.

59. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и опыт клинического применения в России. // Рос. Хим. Журнал. 1998. С. 5-9.

60. Laurens Н. The physiological effects of radiation energy. New York: Tudor Press, 1933.

61. Eales L. И In: The porphyrins/Ed. Dolphin D. New York: Academic Press Inc., 1979. V. 7. P. 663.

62. Койфман О.И., Агеева T.A. Структурные типы порфиринов. // Усп. химии порфиринов/Ред. Голубчиков О.А. 1997. Т. 1. С. 6-26.

63. Кузьминский В.А., Соловьев КН., Цвирко М.П. Спектроскопия и квантовая химия порфиринов. // Порфирины: Спектроскопия, электрохимия, применение/Ред. Ениколопян Н.С. М.: Наука, 1987. С. 7-126.

64. Березин Б.Д., Ениколопян Н.С. Классификация. Молекулярная структура и свойства порфиринов. // Порфирины: Структура, свойства, синтез/Ред. Ениколопян Н.С. М.: Наука, 1985. С. 28.

65. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. // Bioconjug. Chem. 1990. V. 1 P. 165187.

66. Da Ros Т., Spalluto G., Boutorine A.S., Bensasson R.V., Prato M. DNA-photocleavage agents. // Curr. Pharm. Des. 2001. V. 7. P. 1781-1821.

67. Manoharan M. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. P. 103-128.

68. In: Antisense Research and Applications/Eds. Crooke S.T., Lebleu B. Boca Raton. Florida: CRC Press. 1993. 579 P.

69. Gait M.J. Peptide-mediated cellular delivery of antisense oligonucleotides and their analogues. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 844-853.

70. Da Ros T., Spalluto G., Prato M, Saison-Behmoaras T., Boutorine A., Cacciari B. Oligonucleotides and oligonucleotide conjugates: a new approach for cancer treatment. // Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 71-88.

71. Battiroli G., Ramponi R., Croce A.C. Quantitative analysis of intracellular behaviour of porphyrins. // Photochem. Photobiol. 1987. V. 28. P. 7268-7275.

72. ChenX., HuiL., Foster D.A., Drain C.M. Efficient synthesis and photodynamic activity of porphyrin-saccharide conjugates: targeting and incapacitating cancer cells. //Biochemistry. 2004. V. 43. P. 10918-10929.

73. Dukh M, Saman D, Lang K, Pouzar V, Cerny I, Drasar P, Kral V. Steroid-porphyrin conjugate for saccharide sensing in protic media. // Org. Biomol. Chem. 2003. V. 19. P.3458-3463.

74. Paillous N., Vicendo P. Mechanisms of photosensitized DNA cleavage. // J. Photochem. Photobiol. B. 1993. V. 20. P. 203-209.

75. Cadet J., Decarroz C., Wanf S.Y., Midden W.R. Mechanisms and products of photosensitized degradation of nucleic acids and related model compounds. // Isr. J. Chem. 1983. V. 23. P. 420-429.

76. Kearns D.R. Physical and chemical properties of singlet molecular oxygen. // Chem. Rev. 1971. V. 71. P. 395-427.

77. Mastruzzo L., WoisardA., Ma D.D.F., Rizzarelli E., Favre A., Le Doan T. Targeted photochemical modification of HIV-derived oligoribonucleotides by antisense oligodeoxynucleotides linked to porphyrins. // Photochem. Photobiol. 1994. V. 60. P. 316-322.

78. Li H., Fedorova O.S., Trumble W.R., Fletcher T.R., Czuchajowski L. Site-specific photomodification of DNA by porphyrin oligonucleotide conjugates synthesized via a solid phase. // Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 49-56.

79. Magda D., Wright M„ Miller R.A., Sessel J.L., Sansom P.I. Site-specific photocleavage of DNA by expanded porphyrin with irradiation above 700 nm. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 3629-3630.

80. Sessel J.L., Sansom P.I., Kral V., O'Connor D., Iverson B.L. Sapphyrin-oligonucleotide conjugates. Novel sequence-specific DNA photomodifying agentswith increased binding affinity. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 1232212330.

81. Sigman D.S., Mazumder A., Perrin D.M. Chemical nucleases. // Chem. Rev. 1993. P. 2295-2316.

82. Tullius T.D. Chemical 'snapshots' of DNA: using the hydroxyl radical to study the structure of DNA and DNA-protein complexes. // Trends Biochem. Sci. 1987. V. 12. P. 297-300.

83. Волъпин М.Е., Кнорре Д.Г., Новодарова Г.Н., Тувин М.Ю., Федорова О.С., Фролова Е.И. Хелатные комплексы кобальта как катализаторы окислительного расщепления цепей ДНК. // Доклады АН. 1988. Т. 298. С. 363366.

84. Ward В., Skorobogaty A., Dabrowiak J.C. DNA cleavage of a group of cationic metalloporphyrins. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 6875-6883.

85. Кнорре Д.Г., Фёдорова O.C., Фролова Е.И. Окислительная деградация нуклеиновых кислот. // Усп. химии. 1993. Т. 62. С. 70-91.

86. Stubbe J., Kozarich J.W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation. // Chem. Rev. 1987. V. 87. P. 1107-1136.

87. Le Doan T., Perrouault L., Hélène С., Chassignol M., Thuong N.T. Targeted cleavage of polynucleotides by complementary oligonucleotide covalently linked to iron-porphyrins. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 6736-6739.

88. Le Doan T., Perrouault L„ Chassignol M., Thuong N.T., Hélène С. Sequence-targeted chemical modifications of nucleic acids by complementary oligonucleotides linked to porphyrins. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 86438659.

89. Иванова Е.М., Мамаев C.B., Фёдорова О.С., Фролова Е.И. Комплементарно -адресованная модификация одноцепочечного фрагмента ДНК железопорфириновым производным олигонуклеотида. // Биоорган, химия. 1988. Т. 14. С. 551-554.

90. Frolova ЕЛ., Ivanovo Е.М., Zarytova V.F., Abramova T.V., Vlassov V.V. Porphyrin-linked oligonucleotides. Synthesis and sequence-specific modification of ssDNA. //FEBS Lett. 1990. V. 269. P. 101-104.

91. Frolova ЕЛ., Fedorova O.S., Knorre D.G. Kinetic study of the addressed modification by hemin derivatives of oligonucleotides. // Biochimie. 1993. V. 75. P. 5-12.

92. Casas С., Lasey С.J., Meunier В. Preparation of hybrid "DNA cleaver-oligonucleotide" molecules based on metallotris(methyl-pyridiniumyl)porphyrin motif. //Bioconjug. Chem. 1993. V. 4. P. 366-371.

93. Mestre В., Pratviel G., Meunier В. Preparation and nuclease activity of hybrid "metallotris(methylpyridinium)porphyrin oligonucleotide" molecules having a 3'-loop for protection against 3'- exonucleases. // Bioconjug. Chem. 1995. V. 6. P. 466-472.

94. Hamilton G.A., Workman R.J., Woo L. Oxidation by molecular oxygen. I. Reactions of a possible model system for mixed-function oxidases. // J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. P. 3390-3391.

95. Hamilton G.A. Oxidation by molecular oxygen. II. The oxygen atom transfer mechanism for mixed-function oxidases and the model for mixed-function oxidases.// J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. P. 3391-3392.

96. Hamilton G.A., Giacin J.R., Hellman T.M., Snook M.E., Weller J.W. Oxenoid models for enzymic hydroxylations. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1973. V. 212. P. 4-12.

97. Estabrook R.W., Hildebrandt A.G., Baron J., Netter K.J., Leibman K. A new spectral intermediate associated with cytochrome P-450 function in liver microsomes. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V. 42. P. 132-139.

98. Murugesan N., Hecht S.M. Bleomycin as oxene transferase. Catalytic oxygen transfer to olefins. // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107. P. 493-500.

99. Bigey P., Sonnichsen S.H., Meunier В., Nielsen P.E. DNA binding and cleavage by a cationic manganese porphyrin-peptide nucleic acid conjugate. // Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. P. 267-270.

100. Mestre В., Jakobs A., Pratviel G., Meunier B. Structure/Nuclease activity relationships of DNA cleavers based on cationi metalloporphyrin-oligonucleotide conjugates. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 9140-9149.

101. Magda D., Crofts S., Lin A., Miles D., Wright M., Sessel J.L. Synthesis and kinetic properties of ribozyme analogues prepared using phosphoramidite derivatives of dysprosium (III) texaphyrin. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 2293-2294.

102. Magda D., Wright M., Crofts S., Lin A., Sessel J.L. Metal complex conjugates of antisense DNA which display ribozyme-like activity. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 6947-6948.

103. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Халимская JI.M. Реакционноспособные фосфамиды моно- и динуклеотидов. // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 475481.

104. Sinha N.D., Striepeke S. II In: Oligonucleotides and analogues. A practical approach/Ed. Eckstein F. Oxford; New York; Tokyo: Oxford University Press, 1991. P. 185-210.

105. Promega protocols and aplications guide/Ed. Titus E. 2nd Ed. Madison: Promega Corporation. 1991.

106. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984. С. 402.

107. Барам Г.И., Грачев С. А. Использование перхлората лития при выделении и анализе олиго- и полинуклеотидов. // Биоорган, химия. 1985. Т. 11. С. 14201422.

108. Borer P.N. II In: Handbook of biochemistry and molecular biology: Nucleic Acids. V. I/Ed. Fasman G.D. 3rd Ed. Cleveland: CRC Press. Inc., 1975. P. 589.

109. Калверт Дж., Питтс Дж. Фотохимия. Москва: Мир, 1968.

110. Махат, A.M., Gilbert, W. Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

111. Ishchenko A.A., Bulychev N.V., Maksakova G.A., Johnson F., Nevinsky G.A. Single-stranded oligodeoxyribonucleotides are substrates of Fpg protein from Escherichia coli. IIIUBMB Life. 1999. V. 48. P. 613-618.

112. Stuzhin P.A., Khelevina O.G. Azaporphyrins: structure of the reaction centre and reactions of complex formation. // Coord. Chem. Rev. 1996. V. 147. P. 41-86.

113. Chen B.M.L., Tulinsky A. Redetermination of the structure of porphine. // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 4144- 4151.

114. Шойхет К.Г., Фёдорова O.C. Синтез металлопорфирина с изотиоцианатной группой для мечения олигонуклеотидов. // Сиб. Хим. Журнал. 1991. Вып. 4. С. 32-36.

115. Johnson W.C., Jr. Determination of the conformation of nucleic acids by electronic CD. // In: Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules/Ed. Fasman G.D. New York: Plenuim Press, 1996. P. 433-468.

116. Cantor C.R., Warshaw M.M., Shapiro H. Oligonucleotide interactions. 3. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligonucleotides. // Biopolymers. 1970. V. 9. P. 1059-1077.

117. Baase W.A., Johnson W.C., Jr. Circular dichroism and DNA secondary structure. // Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 797-814.

118. Allshire R.C., Dempster M., Hastie N.D. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed non-randomly. // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 4611-4627.

119. TchouJ., KasaiH., ShibutaniS., Chung M.-H., Laval J., Grollman A.P., Nishimura S. 8-Oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 4690-4694.

120. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., Antoshechkin I., Miller J., Grollman A.P., Johnson F. Substrate specificity of Fpg protein. Recognition and cleavage of oxidatively damaged DNA. //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 15318-15324.

121. Karakaya A., Jaruga P., Bohr V.A., Grollman A.P., Dizdaroglu M. Kinetics of excision of purine lesions from DNA by Escherichia coli Fpg protein. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 474-479.

122. Jurado J., Saparbaev M., Matray M.J., Greenberg M.M., Laval J. The ring fragmentation product of thymidine C5-hydrate when present in DNA is repaired by the Escherichia coli Fpg and Nth proteins. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 7757-7763.

123. Кнорре Д. Г., Попов С. Г., Чимитова Т. А. Кинетические особенности аффинной модификации биополимеров для реакций, протекающих с участием активных промежуточных частиц. // Доклады АН СССР. 1976. Т. 230. С. 1369-1372.

124. Кнорре Д. Г., Чимитова Т. А. Изотермы химической модификации биополимеров для аффинных реагентов, образующих активные промежуточные частицы. // Молекулярн. биология. 1978. Т. 12. С. 814-821.

125. Knorre D. G., Chimitova Т. A. Equations of the kinetic curves of affinity labelling of biopolymers with the reagents consumed in parallel reactions in solution. // FEBS Lett. 1981. V. 131. P. 249-252.

126. Немордук А. А., Безрогова E. В. Фотохимические реакции в аналитической химии. М.: Химия, 1972. С. 167.

127. Энтелис С. Г., Тигер Р.П. Кинетика реакции в жидкой фазе. Количественный учет влияния среды. М.: Химия, 1973.

128. Lehninger A. L., Nelson D. L., Сох М. М. Principles of Biochemistry. 2nd ed. Worth Publishers Inc., 1993. P. 334.1. Благодарности

129. Автор благодарен Ольге Семёновне Фёдоровой за постоянное внимание и научное руководство, Владимиру Васильевичу Ковалю за помощь и всестороннюю поддержку, академику Дмитрию Георгиевичу Кнорре за интерес к работе.

130. Автор благодарен Алие Гусейновне Веньяминовой за прочтение и правку диссертации в период её подготовки к защите.

131. Особенно автор благодарен Татьяне Вениаминовне Абрамовой и Дмитрию Владимировичу Пышному за неоценимую помощь и плодотворное сотрудничество.

132. Автор признателен всем сотрудникам Института химической биологии и фундаментальной медицины за интерес к работе, оказанную помощь и поддержку.