Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР для определения однонуклеотидных замен в геноме Mycobacterium tuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Игнатова, Анна Николаевна

• Игнатова, Анна Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Игнатова, Анна Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К АНТИБИОТИКАМ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 История распространения туберкулеза.

1.2 Подходы к лечению туберкулеза.

1.3 Противотуберкулезные антибиотики.

1.4 Развитие устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам.

1.5 Механизмы устойчивости к отдельным противотуберкулезным препаратам.

Рифампицин.

Изониазид.

Стрептомицин.

Пиразинамид.

Этамбутол.

Фторхинолоны.

Канамицин, амикацин, виомицин, капреомицин.

1.6 Методы диагностики лекарственной устойчивости.

Микробиологические методы.

Молекулярно-биологические методы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР для определения однонуклеотидных замен в геноме Mycobacterium tuberculosis»

Туберкулез - одно их наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека. Эта болезнь является одним из старейших врагов человечества. Примерно треть населения Земли инфицирована туберкулезом, и каждый год эта болезнь уносит 2 миллиона жизней. Несмотря на существование эффективной терапии, заболеваемость туберкулезом во всем мире продолжает расти, причем особенностью современной эпидемии является распространение лекарственно-устойчивых форм болезни.

Для проведения успешного лечения особое внимание должно уделяться определению спектра и уровней чувствительности микобактериальных культур. Поскольку М. tuberculosis медленно растущая бактерия, стандартные микробиологические тесты для определения устойчивости могут занимать от нескольких недель до двух месяцев. В этой связи особое значение приобретает разработка быстрых и высокоэффективных методов определения лекарственной чувствительности клинических изолятов М. tuberculosis. Молекулярно-генетические методы определения устойчивости обладают важным преимуществом, так как позволяют сократить время необходимое для получения результатов до нескольких дней или даже часов.

Таким образом, разработка эффективного метода детекции однонуклеотидных замен в геноме М. tuberculosis является одной из актуальных проблем современной молекулярной диагностики, филогенетики и эпидемиологии.

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К АНТИБИОТИКАМ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Игнатова, Анна Николаевна

выводы

1. Разработан метод аллель-специфичной истощающей ПЦР, позволяющий повысить аллельную дискриминацию за счет дополнительной амплификации консервативного участка генома.

2. На основе метода разработаны тест-системы для определения точечных мутаций в генах rpoB, katG, embB и gyrA, приводящих к устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам.

3. Показана возможность применения аллель-специфичной истощающей ПЦР для анализа гетерорезистентных культур М. tuberculosis. Метод позволяет детектировать 5 и менее % примеси устойчивых к рифампицину и изониазиду бактерий.

4. При исследовании 116 клинических изолятов М. tuberculosis с помощью разработанных тест-систем для идентификации мутаций в генах гроВ и katG, устойчивость к рифампицину и изониазиду была корректно определена в 95% и 100% случаев, соответственно.

5. Разработан экспресс-метод идентификации основных филогенетических групп бактерий туберкулезного комплекса. Была показана возможность выявления смешаных культур, состоящих из нескольких изолятов М. tuberculosis.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор глубоко признателен своим научным руководителям, Светлане Алексеевне Дубилей и Игорю Георгиевичу Шемякину, под чьим непосредственным руководством выполнялась настоящая работа, а также заведующему лабораторией член-корреспонденту РАН Александру Габибовичу Габибову. Автор также благодарен всем сотрудникам Лаборатории биокатализа, принимавшим живейшее участие в судьбе данной работы. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова за полученные знания, а также за высокую требовательность и постоянное внимание.

Заключение

Таким образом, нами был разработан метод аллель-специфичной истощающей ПЦР, позволяющий повысить аллельную дискриминацию за счет одновременной амплификации аллель-специфичного продукта и не связанного с анализируемой последовательностью участка генома. Разработанный метод был применен для детекции мутаций, приводящих к устойчивости М. tuberculosis к рифампицину, изониазиду, этамбутолу и фторхинолонам. Амплификация вспомогательного продукта (фрагмента гена mtp40 или мобильного элемента IS6110) в АСИ ПЦР позволяет одновременно определять видовую принадлежность исследуемого образца, а также является контролем качества ДНК-матрицы, используемой для ПЦР. Кроме быстрой детекции устойчивости к антибиотикам, описанные методы предоставляют эпидемиологически важную информацию о том, какие именно мутации приводят к резистентности, и могут быть применены как важное дополнение к стандартным микробиологическим тестам. Динамический диапазон метода АСИ ПЦР позволяет идентифицировать смешанные образцы, в которых представлены два или более аллельных варианта. Таким образом, метод АСИ ПЦР может иметь важное практическое применение для выявления лабораторных контаминаций, изучения случаев множественной инфекции и анализа гетерорезистентных культур М. tuberculosis.

ГЛАВА III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Материалы.

В работе было использовано следующее оборудование: центрифуги Eppendorf 5415D (Eppendorf, Германия), Sigma 301К и Sigma 2К15 (Sigma, Германия); УФ-трансиллюминатор 2011 Macrovue (LKB, Швеция); система для документирования и анализа результатов электрофореза (UVP, США); спектрофотометр DU-70 (Beckman, США); рН-метр CyberScan 1100 (Eutech Instruments/Oakton Instruments); термостат суховоздушный ТС 1/20 СПУ (Россия); термостат Thermolyne 17600 (Barnstead, США); приборы для горизонтального электрофореза Wide Mini-Sub Cell GT, Sub Cell 192 (BioRad, США); прибор для вертикального электрофореза BioRad Sequi-Gen Sequencing Cell (BioRad, США); прибор для переноса Vacuum Blotter model 785 (BioRad, США); прибор для фиксации ДНК на нитроцеллюлозном фильтре с помощью ультрафиолетового света UVC 500 UV Crosslinker, Hoefer; источник питания 2197 Power supply (LKB, США); ПЦР-амплификатор РТС-200 Peltier Thermal Cycler, (MJ Research, США), гибридизационный инкубатор Hybridization oven/shaker (Amersham Pharmacia, Великобритания); автоматические пипетки (Gilson, Франция); весы Sartorius laboratory (Sartorius, Германия); настольный инкубаторный шейкер Innova 4000 (New Brunswick Scientific, США); прибор для перемешивания растворов с подогревом MR 3001 (Heidolph, Германия); ламинарный шкаф Flow laboratories BSB 4А (Gelaire, Italy), система для ПЦР в реальном времени ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США).

В работе использовали следующие расходные материалы; пластиковые наконечники и пластиковые пробирки для ПЦР на 0.2 и 0.5 мл (Treff Lab, Швейцария); пластиковые микроцентрифужные пробирки на 1.5 и 2.0 мл - эппендорфы (Eppendorf, Германия); одноразовые центрифужные пробирки на 15 мл и 50 мл Corning (США); одноразовые чашки Петри Завода Медицинских Полимеров (Россия); рентгеновская пленка AGFA (Бельгия), пленка для детекции хемилюминесценции Hyperfilm (Amersham Biosciences, Великобритания); нейлоновая мембрана Hybond N+ (Amersham, США); нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм и 0.45 мкм (Millipore, США); набор реактивов для определения последовательности ДНК CycleReader (Fermentas, Литва); набор реактивов для мечения и детекции нуклеиновых кислот ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System (Amersham Biosciences, Великобритания); ДНК-маркеры длин 1 т.п.о. (1 kb DNA Ladder) и 100+1500 п.о. (100 bp DNA Ladder) (SibEnzyme, Россия).

В работе использовали следующие реактивы: трис-гидроксиметиламинометан (трис), тетраборат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), этиловый спирт, изопропиловый спирт, уксусная кислота, однократно перегнанный фенол, хлороформ, бромистый этидий, акриламид, №,№-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевину (sequence grade); агар, триптон, дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания); Repel-silane, Bind-silane (LKB, Швеция); агароза LE Molecular Biology Grade (Promega, США); бромфеноловый синий (Bio-Rad, США); ксиленцианол (Bio-Rad, США); дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Roche Diagnostics, Германия); остальные реактивы отечественного производства марки "осч" (особо чистые); плазмиды: pGEM5Z; штаммы Е. coli: DH5a - supE44, delta lacU169 (phi 80 lacZ delta M15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl (Gibco, Великобритания), эндонуклеаза рестрикции PvuII и буфер G для рестрикции (Fermentas, Литва). Растворы.

TBE IPX: 0.89 M трис, 0.89 M борная кислота, 20 мМ ЭДТА, pH 8.0 ТАЕ 50Х: 2 M трис, 0.05 M ЭДТА

Буфер для нанесения образцов ДНК на агарозный гель - 0.1 % бромфеноловый синий, 0.1 % ксиленцианол, 30 % глицерин.

Буфер для Тад-полимеразы - 2 мМ MgS04,25 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.85.

Буфер SSC (20х) - 3 M NaCl, 0.3 M цитрат натрия

Депуринизирующий раствор - 0.25 M HCl

Денатурирующий раствор - 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH

Нейтрализующий раствор - 0.5 M Трис-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.1

Отмывочные растворы для гибридизации: 1) - 0.5х SSC, 0.4 % SDS; 2) -2х SSC

Микробиологические среды. LB: 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl LB-агар: LB, 18 г/л агара

2xYT: 16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl

SOB: 20 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0.5 г/л NaCl, 250 мМ KCl,

10 мМ MgCl2

SOC: SOB, 50 мМ глюкоза

Препараты, меченные радиоактивными изотопами; [а-33Р]АТР, (>5000 Ки/ммоль) - ГНЦ РФ ФЭИ, Обнинск, Россия.

Образцы ДНК.

Образцы геномной ДНК клинических изолятов М. tuberculosis штамма H37Rv были выделены в лаборатории молекулярно-биологических исследований ГНЦ ПМ (Оболенск, Россия).

Методы

Аллель-специфичная ПЦР

АСИ ПЦР и АС ПЦР проводили используя в качестве матрицы примерно 10 нг геномной ДНК, объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Реакционная смесь включала 40 мкМ каждого из дНТФ, 2 единицы Taq-полимеразы (Fermentas, Литва), 2 мМ MgS04, 25 мМ KCl, and 2% DMSO, в 10 мМ Трис-HCl, pH 8.85. ПЦР проводили в амплификаторе DNA Engine РТС-200 (MJ Research, Inc., USA).

Детекция мутаций в генах гроВ и katG.

Каждая реакция содержала пару праймеров для аллель-специфичного ампликона (фрагмента гена гроВ или katG) и пару праймеров для вспомогательного ампликона (фрагмента mtp40 или IS6110). Использовали следующие количества праймеров: 5 пМоль аллель-специфичных праймеров, по 10 пМоль праймеров для вспомогательного ампликона (mtpFor и mtpRev или ISFor и ISRev). Режим амплификации - начальная денатурация 96°С 7 мин, затем 30-50 циклов 95°С 40 сек, 62°С 20 сек, 72°С 1 мин. Результаты ПЦР анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле. Последовательности праймеров представлены в Табл. 8.

Для определения превичной структуры участков генов гроВ использовали следущие праймеры: rSfor (GTCGGCGAGCTGATCCAAAAC), rSrev (GGTACGGCGTTTCGATGAACC), katG • kSfor (CTCCGCTGGAGCAGATGGGC), kSrev (TCTTCCAGGGTGCGAATGACCT).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Игнатова, Анна Николаевна, 2007 год

1. Neriich, A.G., Haas, C.J., Zink, A., Szeimies, U. and Hagedorn, H.G. (1997) Molecular evidence for tuberculosis in an ancient Egyptian mummy. Lancet, 350,1404.

2. Salo, W.L., Aufderheide, A.C., Buikstra, J. and Holcomb, T.A. (1994) Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA in a pre-Columbian Peruvian mummy. Proc Natl Acad Sei US A, 91,2091-4.

3. Zink, A., Haas, C.J., Reischl, U., Szeimies, U. and Neriich, A.G. (2001) Molecular analysis of skeletal tuberculosis in an ancient Egyptian population. J Med Microbiol, 50,35566.

4. Smith, I. (2003) Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. Clin Microbiol Rev, 16,463-96.

5. Raviglione, M.C., Snider, D.E., Jr. and Kochi, A. (1995) Global epidemiology of tuberculosis. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA, 273,220-6.

6. Yerokhin, V.V., Punga, V.V. and Rybka, L.N. (2001) Tuberculosis in Russia and the problem of multiple drug resistance. Ann N YAcad Sei, 953,133-7.

7. Liu, J., Barry, C.E., 3rd, Besra, G.S. and Nikaido, H. (1996) Mycolic acid structure determines the fluidity of the mycobacterial cell wall. J Biol Chem, 271,29545-51.

8. Brennan, P.J. and Nikaido, H. (1995) The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem, 64,29-63.

9. Engelhardt, H., Heinz, C. and Niederweis, M. (2002) A tetrameric porin limits the cell wall permeability of Mycobacterium smegmatis. J Biol Chem, 277,37567-72.

10. Stephan, J., Mailaender, C., Etienne, G., Daffe, M. and Niederweis, M. (2004) Multidrug resistance of a porin deletion mutant of Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 48,4163-70.

11. Elliott, A.M., Berning, S.E., Iseman, M.D. and Peloquin, C.A. (1995) Failure of drug penetration and acquisition of drug resistance in chronic tuberculous empyema. Tuber Lung Dis, 76,463-7.

12. Gillespie, S.H. (2002) Evolution of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: clinical and molecular perspective. Antimicrob Agents Chemother, 46,267-74.

13. Ramaswamy, S. and Musser, J.M. (1998) Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuber Lung Dis, 79,3-29.

14. Heep, M., Rieger, U., Beck, D. and Lehn, N. (2000) Mutations in the beginning of the rpoB gene can induce resistance to rifamycins in both Helicobacter pylori and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 44,1075-7.

15. Hirano, K., Abe, C. and Takahashi, M. (1999) Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated mostly in Asian countries and their rapid detection by line probe assay. J Clin Microbiol, 37,2663-6.

16. Yuen, L.K., Leslie, D. and Coloe, P.J. (1999) Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia. J Clin Microbiol, 37, 3844-50.

17. Valim, A.R., Rossetti, M.L., Ribeiro, M.O. and Zaha, A. (2000) Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil. J Clin Microbiol, 38, 3119-22.

18. Matsiota-Bernard, P., Vrioni, G. and Marinis, E. (1998) Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Greece. J Clin Microbiol, 36,20-3.

19. Mani, C., Selvakumar, N., Narayanan, S. and Narayanan, P.R. (2001) Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India. J Clin Microbiol, 39,2987-90.

20. Pozzi, G., Meloni, M., Iona, E., Orru, G., Thoresen, O.F., Ricci, M.L., Oggioni, M.R., Fattorini, L. and Orefici, G. (1999) rpoB mutations in multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy. J Clin Microbiol, 37,1197-9.

21. Cavusoglu, C., Hilmioglu, S., Guneri, S. and Bilgic, A. (2002) Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing and line probe assay. J Clin Microbiol, 40,4435-8.

22. Yue, J., Shi, W., Xie, J., Li, Y., Zeng, E. and Wang, H. (2003) Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from China. J Clin Microbiol, 41,2209-12.

23. Hwang, H.Y., Chang, C.Y., Chang, L.L., Chang, S.F., Chang, Y.H. and Chen, Y.J. (2003) Characterization of nfampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Taiwan. J Med Microbiol, 52, 239-45.

24. Takayama, K., Wang, L. and David, H.L. (1972) Effect of isoniazid on the in vivo mycolic acid synthesis, cell growth, and viability of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2,29-35.

25. Zhang, Y., Heym, B., Allen, B„ Young, D. and Cole, S. (1992) The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature, 358,591-3.

26. Heym, B., Zhang, Y., Poulet, S., Young, D. and Cole, S.T. (1993) Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the isoniazid susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol, 175,4255-9.

27. Zhang, Y., Garbe, T. and Young, D. (1993) Transformation with katG restores isoniazid-sensitivity in Mycobacterium tuberculosis isolates resistant to a range of drug concentrations. Mol Microbiol, 8,521-4.

28. Yu, S., Girotto, S., Lee, C. and Magliozzo, R.S. (2003) Reduced affinity for Isoniazid in the S315T mutant of Mycobacterium tuberculosis KatG is a key factor in antibiotic resistance. J Biol Chem, 278,14769-75.

29. Kapetanaki, S.M., Chouchane, S., Yu, S., Zhao, X., Magliozzo, R.S. and Schelvis, J.P. (2005) Mycobacterium tuberculosis KatG(S315T) catalase-peroxidase retains all active site properties for proper catalytic function. Biochemistry, 44,243-52.

30. Banerjee, A., Dubnau, E., Quemard, A., Balasubramanian, V., Um, K.S., Wilson, T., Collins, D., de Lisle, G. and Jacobs, W.R., Jr. (1994) inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis. Science, 263,227-30.

31. Rouse, D.A., Li, Z., Bai, G.H. and Morris, S.L. (1995) Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 39,2472-7.

32. Dessen, A., Quemard, A., Blanchard, J.S., Jacobs, W.R., Jr. and Sacchettini, J.C. (1995) Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacterium tuberculosis. Science, 267,1638-41.

33. Quemard, A., Sacchettini, J.C., Dessen, A., Vilcheze, C., Bittman, R., Jacobs, W.R., Jr. and Blanchard, J.S. (1995) Enzymatic characterization of the target for isoniazid in Mycobacterium tuberculosis. Biochemistry, 34, 8235-41.

34. Rozwarski, D.A., Grant, G.A., Barton, D.H., Jacobs, W.R., Jr. and Sacchettini, J.C. (1998) Modification of the NADH of the isoniazid target (InhA) from Mycobacterium tuberculosis. Science, 279, 98-102.

35. Rawat, R., Whitty, A. and Tonge, P.J. (2003) The isoniazid-NAD adduct is a slow, tight-binding inhibitor of InhA, the Mycobacterium tuberculosis enoyl reductase: adduct affinity and drug resistance. Proc Natl Acad Sei U SA, 100,13881-6.

36. Telenti, A., Honore, N., Bernasconi, C., March, J., Ortega, A., Heym, B., Takiff, H.E. and Cole, S.T. (1997) Genotypic assessment of isoniazid and rifampin resistance in

37. Mycobacterium tuberculosis: a blind study at reference laboratory level. J Clin Microbiol, 35, 719-23.

38. Slayden, R.A., Lee, R.E. and Barry, C.E., 3rd (2000) Isoniazid affects multiple components of the type II fatty acid synthase system of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol, 38,514-25.

39. Mdluli, K., Slayden, R.A., Zhu, Y., Ramaswamy, S., Pan, X., Mead, D., Crane, D.D., Musser, J.M. and Barry, C.E., 3rd (1998) Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl ACP synthase by isoniazid. Science, 280,1607-10.

40. Lee, A.S., Lim, I.H., Tang, L.L., Telenti, A. and Wong, S.Y. (1999) Contribution of kasA analysis to detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in Singapore. Antimicrob Agents Chemother, 43,2087-9.

41. Kelley, C.L., Rouse, D.A. and Morris, S.L. (1997) Analysis of ahpC gene mutations in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 41,2057-8.

42. Miesel, L., Weisbrod, T.R., Marcinkeviciene, J.A., Bittman, R. and Jacobs, W.R., Jr. (1998) NADH dehydrogenase defects confer isoniazid resistance and conditional lethality in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol, 180,2459-67.

43. Lee, A.S., Teo, A.S. and Wong, S.Y. (2001) Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother, 45,2157-9.

44. Bercovier, H., Kafri, 0. and Sela, S. (1986) Mycobacteria possess a surprisingly small number of ribosomal RNA genes in relation to the size of their genome. Biochem Biophys Res Commun, 136,1136-41.

45. Tracevska, T., Jansone, I., Nodieva, A., Marga, O., Skenders, G. and Baumanis, V. (2004) Characterisation of rpsL, rrs and embB mutations associated with streptomycin and ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis. Res Microbiol, 155,830-4.

46. Ramaswamy, S.V., Dou, S.J., Rendon, A., Yang, Z., Cave, M.D. and Graviss, E.A. (2004) Genotypic analysis of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Monterrey, Mexico. J Med Microbiol, 53,107-13.

47. Meier, A., Sander, P., Schaper, K.J., Scholz, M. and Bottger, E.C. (1996) Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotypic resistance levels in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 40,2452-4.

48. Scorpio, A. and Zhang, Y. (1996) Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus. Nat Med, 2,662-7.

49. Guo, M., Sun, Z. and Zhang, Y. (2000) Mycobacterium smegmatis has two pyrazinamidase enzymes, PncA and pzaA .J Bacteriol, 182,3881-4.

50. Zhang, Y., Scorpio, A., Nikaido, H. and Sun, Z. (1999) Role of acid pH and deficient efflux of pyrazinoic acid in unique susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J Bacteriol, 181,2044-9.

51. Sun, Z. and Zhang, Y. (1999) Reduced pyrazinamidase activity and the natural resistance of Mycobacterium kansasii to the antituberculosis drug pyrazinamide. Antimicrob Agents Chemother, 43,537-42.

52. Sreevatsan, S., Pan, X., Zhang, Y., Kreiswirth, B.N. and Musser, J.M. (1997) Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of Mycobacterium tuberculosis complex organisms. Antimicrob Agents Chemother, 41,636-40.

53. Rodrigues Vde, F., Teiles, M.A., Ribeiro, M.O., Cafrune, P.I., Rossetti, M.L. and Zaha, A. (2005) Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, 49,444-6.

54. Morlock, G.P., Crawford, J.T., Butler, W.R., Brim, S.E., Sikes, D., Mazurek, G.H., Woodley, C.L. and Cooksey, R.C. (2000) Phenotypic characterization of pncA mutants of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 44,2291-5.

55. Scorpio, A., Lindholm-Levy, P., Heifets, L., Gilman, R., Siddiqi, S., Cynamon, M. and Zhang, Y. (1997) Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 41, 540-3.

56. Takayama, K., Armstrong, E.L., Kunugi, K.A. and Kilburn, J.O. (1979) Inhibition by ethambutol of mycolic acid transfer into the cell wall of Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 16,240-2.

57. Mikusova, K., Slayden, R.A., Besra, G.S. and Brennan, P.J. (1995) Biogenesis of the mycobacterial cell wall and the site of action of ethambutol. Antimicrob Agents Chemother, 39,2484-9.

58. Takayama, K. and Kilburn, J.O. (1989) Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 33,1493-9.

59. Telenti, A., Philipp, W.J., Sreevatsan, S., Bernasconi, C., Stockbauer, K.E., Wieles, B., Musser, J.M. and Jacobs, W.R., Jr. (1997) The emb operon, a gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol. Nat Med, 3,567-70.

60. Lety, M.A., Nair, S., Berche, P. and Escuyer, V. (1997) A single point mutation in the embB gene is responsible for resistance to ethambutol in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 41,2629-33.

61. Alcaide, F., Pfyffer, G.E. and Telenti, A. (1997) Role of embB in natural and acquired resistance to ethambutol in mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 41,2270-3.

62. Lee, A.S., Othman, S.N., Ho, Y.M. and Wong, S.Y. (2004) Novel mutations within the embB gene in ethambutol-susceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 48,4447-9.

63. Lee, H.Y., Myoung, H.J., Bang, H.E., Bai, G.H., Kim, S.J., Kim, J.D. and Cho, S.N. (2002) Mutations in the embB locus among Korean clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis resistant to ethambutol. Yonsei Med J, 43, 59-64.

64. Plinke, C., Rusch-Gerdes, S. and Niemann, S. (2006) Significance of mutations in embB codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother, 50,1900-2.

65. Kocagoz, T., Hackbarth, C.J., Unsal, I., Rosenberg, E.Y., Nikaido, H. and Chambers, H.F. (1996) Gyrase mutations in laboratory-selected, fluoroquinolone-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Antimicrob Agents Chemother, 40,1768-74.

66. Poole, K. (2000) Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-positive bacteria and the mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 44,2595-9.

67. Li, X.Z., Zhang, L. and Nikaido, H. (2004) Efflux pump-mediated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother, 48,2415-23.

68. Pasca, M.R., Guglierame, P., Arcesi, F., Bellinzoni, M., De Rossi, E. and Riccardi, G. (2004) Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c, an ABC fluoroquinolone efflux pump in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 48,3175-8.

69. Alangaden, G.J., Kreiswirth, B.N., Aouad, A., Khetarpal, M., Igno, F.R., Moghazeh, S.L., Manavathu, E.K. and Lerner, S.A. (1998) Mechanism of resistance to amikacin and kanamycin in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 42,1295-7.

70. Kruuner, A., Jureen, P., Levina, K., Ghebremichael, S. and Hoffner, S. (2003) Discordant resistance to kanamycin and amikacin in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 47,2971-3.

71. Taniguchi, H., Chang, B., Abe, C., Nikaido, Y., Mizuguchi, Y. and Yoshida, S.I. (1997) Molecular analysis of kanamycin and viomycin resistance in Mycobacterium smegmatis by use of the conjugation system. J Bacteriol, 179,4795-801.

72. Suzuki, Y., Katsukawa, C., Tamaru, A., Abe, C., Makino, M., Mizuguchi, Y. and Taniguchi, H. (1998) Detection of kanamycin-resistant Mycobacterium tuberculosis by identifying mutations in the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol, 36,1220-5.

73. Maus, C.E., Plikaytis, B.B. and Shinnick, T.M. (2005) Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 49, 571-7.

74. Johansen, S.K., Maus, C.E., Plikaytis, B.B. and Douthwaite, S. (2006) Capreomycin binds across the ribosomal subunit interface using tlyA-encoded 2'-0-methylations in 16S and 23S rRNAs. Mol Cell, 23,173-82.

75. Bergmann, J.S. and Woods, G.L. (1998) Evaluation of the ESP culture system II for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis isolates to four primary antituberculous drugs. J Clin Microbiol, 36,2940-3.

76. Roggenkamp, A., Hornef, M.W., Masch, A., Aigner, В., Autenrieth, I.B. and Heesemann, J. (1999) Comparison of MB/BacT and BACTEC 460 ТВ systems for recovery of mycobacteria in a routine diagnostic laboratory. J Clin Microbiol, 31,3711-2.

77. Bemer, P., Bodmer, Т., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V. and Drugeon, H. (2004) Multicenter evaluation of the MB/BACT system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 42,1030-4.

78. Heym, В., Alzari, P.M., Honore, N. and Cole, S.T. (1995) Missense mutations in the catalase-peroxidase gene, katG, are associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol, 15,235-45.

79. Nash, K.A., Gaytan, A. and Inderlied, C.B. (1997) Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by use of a rapid, simple, and specific RNA/RNA mismatch assay .J Infect Dis, 176,533-6.

80. Watterson, S.A., Wilson, S.M., Yates, M.D. and Drobniewski, F.A. (1998) Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 36,1969-73.

81. Troesch, A., Nguyen, H., Miyada, C.G., Desvarenne, S., Gingeras, T.R., Kaplan, P.M., Cros, P. and Mabilat, C. (1999) Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol, 37,49-55.

82. Torres, M.J., Criado, A., Palomares, J.C. and Aznar, J. (2000) Use of real-time PCR and fluorimetry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 38,3194-9.

83. El-Hajj, H.H., Marras, S.A., Tyagi, S., Kramer, F.R. and Alland, D. (2001) Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons. J Clin Microbiol, 39,4131-7.

84. Abate, G., Hoffner, S.E., Thomsen, V.O. and Miorner, H. (2001) Characterization of isoniazid-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis on the basis of phenotypic properties and mutations in katG. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 20,329-33.

85. Spindola de Miranda, S., Kritski, A., Filliol, I., Mabilat, C., Panteix, G. and Drouet, E. (2001) Mutations in the rpoB gene of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Brazil and France. Mem Inst Oswaldo Cruz, 96,247-50.

86. Cockerill, F.R., 3rd (1999) Genetic methods for assessing antimicrobial resistance. Antimicrob Agents Chemother, 43,199-212.

87. Gibbs, R.A., Nguyen, P.N. and Caskey, C.T. (1989) Detection of single DNA base differences by competitive oligonucleotide priming. Nucleic Acids Res, 17, 2437-48.

88. Giffard, P.M., McMahon, J.A., Gustafson, H.M., Barnard, R.T. and Voisey, J. (2001) Comparison of competitively primed and conventional allele-specific nucleic acid amplification. Anal Biochem, 292,207-15.

89. Kainz, P. (2000) The PCR plateau phase towards an understanding of its limitations. Biochim Biophys Acta, 1494,23-7.

90. Huang, M.M., Arnheim, N. and Goodman, M.F. (1992) Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for smgle nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res, 20,4567-73.

91. Waterfall, C.M., Eisenthal, R. and Cobb, B.D. (2002) Kinetic characterisation of primer mismatches in allele-specific PCR: a quantitative assessment. Biochem Biophys Res Commun, 299,715-22.

92. Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, L.E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C. and Markham, A.F. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res, 17,2503-16.

93. Mokrousov, I., Otten, T., Vyshnevskiy, B. and Narvskaya, O. (2003) Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears. Antimicrob Agents Chemother, 47,2231-5.

94. Del Portillo, P., Thomas, M.C., Martinez, E., Maranon, C., Valladares, B., Patarroyo, M.E. and Carlos Lopez, M. (1996) Multiprimer PCR system for differential identification of mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 34, 324-8.

95. Thierry, D., Brisson-Noel, A., Vincent-Levy-Frebault, V., Nguyen, S., Guesdon, J.L. and Gicquel, B. (1990) Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol, 28,2668-73.

96. Parsons, L.M., Somoskovi, A., Urbanczik, R. and Salfinger, M. (2004) Laboratory diagnostic aspects of drug resistant tuberculosis. Front Biosci, 9,2086-105.

97. Wada, T., Maeda, S., Tamaru, A., Imai, S., Hase, A. and Kobayashi, K. (2004) Dualprobe assay for rapid detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR. J Clin Microbiol, 42,5277-85.

98. Glynn, J.R., Whiteley, J., Bifani, P.J., Kremer, K. and van Soolingen, D. (2002) Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review. Emerg Infect Dis, 8, 843-9.

99. Gamier, T., Eiglmeier, K., Camus, J.C., Medina, N., Mansoor, H., Pryor, M., Duthoy, S., Grondin, S., Lacroix, C., Monsempe, C. et al. (2003) The complete genome sequence of Mycobacterium bovis. Proc Natl Acad Sei USA, 100,7877-82.

100. Kovalev, S.Y., Kamaev, E.Y., Kravchenko, M.A., Kurepina, N.E. and Skorniakov, S.N. (2005) Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping. IntJTuberc Lung Dis, 9, 746-52.

101. Shemiakin, I.G., Stepanshina, V.N., Ivanov, I., Lipin, M., Korobova, O.V. and Anisimova, V.A. (2003) Characteristics of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis using molecular biological methods. Mol Gen Mikrobiol Virusol, 32-40.

102. Yeh, R.W., Ponce de Leon, A., Agasino, C.B., Hahn, J.A., Daley, C.L., Hopewell, P.C. and Small, P.M. (1998) Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes. J Infect Dis, ill, 1107-11.

103. Niemann, S., Rusch-Gerdes, S., Richter, E., Thielen, H., Heykes-Uden, H. and Diel, R. (2000) Stability of IS6110 restriction fragment length polymorphism patterns of

104. Chaves, F., Dronda, F., Alonso-Sanz, M. and Noriega, A.R. (1999) Evidence of exogenous reinfection and mixed infection with more than one strain of Mycobacterium tuberculosis among Spanish HIV-infected inmates. Aids, 13,615-20.

105. Kruuner, A., Pehme, L., Ghebremichael, S., Koivula, T., Hoffner, S.E. and Mikelsaar, M. (2002) Use of molecular techniques to distinguish between treatment failure and exogenous reinfection with Mycobacterium tuberculosis. Clin Infect Dis, 35,146-55.

106. Soim, H., Pan, X., Amin, A., Graviss, E.A., Siddiqui, A. and Musser, J.M. (2000) Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by spoligotyping. J Clin Microbiol, 38,669-76.