Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики раннего иксодового клещевого боррелиоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Иванов, Игорь Диадорович

• Иванов, Игорь Диадорович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванов, Игорь Диадорович

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клещевой боррелиоз

1.1.1. Эпидемиология клещевого боррелиоза

1.1.2. Патогенез и клиника клещевого боррелиоза

1.2. Молекулярно-биологические характеристики спирохет В. 15 burgdorferi sensu lato

1.3. Антигены В. burgdorferi sensu lato

1.3.1. Семейство Osp

1.3.1.1. OspA и OspB

1.3.1.2. OspC

1.3.1.3. OspD

1.3.1.4. OspE и OspF

1.3.2. Другие антигены, кодируемые плазмидными ДНК

1.3.2.1 Декоринсвязывающие белки

1.3.2.2 Высоковариабельные антигены

1.3.3. Антигены, кодируемые хромосомной ДНК.

1.3.3.1. Флагеллярные белки

1.3.3.2. Р83 или Р

1.3.3.3. Р

1.3.3.4. Семейство Вмр

1.3.3.5. Р

1.4. Антигены В. burgdorferi s.l., используемые для диагностики и 47 вакцинопрофилактики

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы, реагенты и прочие материалы

2.2. Методы работы с ДНК

2.2.1. Выделение ДНК из кишечника клещей с использованием 52 протеиназы К

2.2.2. Получение суммарного препарата ДНК из клещей с 53 использованием гуанидина-изотиоцианата

2.2.3. Выделение ДНК из кожных покровов уха мелких 53 млекопитающих

2.2.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli методом 54 щелочного лизиса

2.2.5. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний E.coli

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК с использованием ионообменной 55 хроматографии

2.2.7. Электрофорез ДНК в гелях агарозы

2.2.8. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле

2.2.9. Выделение ДНК из гелей электроэлюцией в ячейках фирмы

ISCO"

2.2.10. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на мелкодисперсном диоксиде кремния

2.2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.11. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т

2.2.12. Амплификация ДНК в системе ПЦР

2.2.13. Секвенирование ДНК

2.3. Методы работы с бактериями

2.3.1. Используемые среды и общие приемы

2.3.2. Амплификация низкокопийных плазмид при помощи хлорамфеникола

2.3.3. Трансформация клеток E.coli 62 2.3.4 Подготовка бактериальных клеток к длительному хранению

2.4. Методы работы с белками

2.4.1. Выделение рекомбинантных белков

2.4.2. Анализ белков

2.4.3. Иммуноферментный анализ

2.4.4. Окраска иммуноблотов

2.4.4.1. Окраска альфа-нафтолом

2.4.4.2. Анализ нитроцеллюлозных стрипов с помощью ECL

2.4.4.3. Проявление иммуноблотов со вторыми антителами, 73 мечеными золотом

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение зараженности клещей, собранных на территории 74 Сибири

3.2. Конструирование рекомбинантных штаммов E.coli, 82 продуцирующих антигены, специфичные для циркулирующих в Сибири представителей В. burgdorferi s. 1.

3.2.1. Конструирование рекомбинантного штамма E.coli, 84 продуцирующего фрагмент флагеллярного белка B.garinii NT

3.2.2. Конструирование рекомбинантного штамма E.coli, 94 продуцирующего антиген OspC B.garinii NT

3.3. Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики 104 начальных стадий клещевого боррелиоза у человека

3.3.1. Определение оптимальной концентрации антигена и конъюгата

3.3.2. Определение антител к Borrelia burgdorferi s.l. в сыворотках крови людей

3.3.3. Разработка стрипового варианта иммунохимической тестситемы

3.4. Оптимизация наработки и выделения рекомбинантных 110 антигенов

3.4.1 Выбор оптимального количества антибиотика (ампициллина)

3.4.2. Оптимизация по количеству индуктора (налидиксовой 113 кислоты)

3.4.3. Выбор оптимального возраста культуры для проведения 113 индукции

3.4.4. Кинетика накопления рекомбинантного белка после 116 индукции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики раннего иксодового клещевого боррелиоза»

Развитие на протяжении 20 столетия химиии и биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, медицины и санитарно-эпидемиологического контроля обеспечили огромные успехи в борьбе со многими опасными инфекциями. Благодоря открытию и широкому использованию антибитиков большинство бактериальных инфекций стало легкоизлечимо. Разработка и внедрение вакцин достаточно надежно защищает человеческую популяцию от целого ряда опасных вирусных заболеваний (бешенство, оспа, полиомелит и др.). Эффективный контроль за численостью грызунов, разрушение среды обитания членистоногих-переносчиков, мониторинг чистоты питьевой воды и продуктов питания, предотвращают вспышки заболеваний, способных вызывать эпидемии и пандемии (чума, холера, малярия, дизентерии и тифы). Однако за последние десятилетия открыт целый ряд новых, порой довольно опасных заболеваний. Одним из них является клещевой боррелиоз (Лайм-боррелиоз, болезнь Лайма).

Клещевой боррелиоз (КБ) является природно-очаговым, трансмиссивным острым инфекционным заболеванием, как правило переходящим в хроническую стадию. Главным природным резервуаром возбудителя КБ являются мелкие грызуны, населяющие антропогенные ландшафты (в первую очередь лесопарки и пастбища). Перенос инфекционного агента КБ — спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.I.), осуществляется клещами рода Ixodes.

Клещевые боррелиозы распространены практически по всему умеренному поясу Северного полушария. Ежегодно, только в России и государствах Северной Америки, боррелиозом заболевает свыше 20000 человек. Клещевой боррелиоз довольно легко поддается терапии антибиотиками на ранних стадиях заболевания, при переходе в хроническую стадию, лечение становится значительно более сложным и длительным, поэтому основной проблемой является своевременная диагностика этого могут зависеть как от штаммовой принадлежности возбудителя, так и от индивидуальных свойств больного. Использование ДНК-диагностики в случае болезни Лайма затруднительно, поскольку в крови и лимфе концентрация возбудителя слишком низка для гарантированного анализа. Основным методом, позволяющим в настоящее время быстро и надежно диагностировать Лайм-боррелиоз, является иммунно-ферментный анализ.

Существует два подхода в создании иммуноферментных тест-систем для выявления специфических антител к возбудителю КБ в крови пациентов. Первый подход основан на использовании в качестве антигена суммарного гидролизата культур боррелий или, чаще, фракций гидролизата, из которых удалена часть антигенов, являщихся малоспецифичными. Второй подход основан на получении рекомбинантных специфичных антигенов возбудителя КБ, нарабатываемых в клетках E.coli, B.subtilis и др. При необходимости добавляя/заменяя рекомбинантные антигены можно легко формировать новые варианты тест-систем с подходящими свойствами.

Для диагностики Лайм-боррелиозов в настоящее время используют тест-системы преимущественно первого типа. Ввиду низкой технологичности таких тест-систем (боррелии довольно медленно растут и требуют весьмо дорогой питательной среды) и невысокой специфичности (антигенный перекрест с возбудителями других инфекций, в первую очередь спирохетозных), в последнее время основной упор делается на создание тест-систем второго типа.

Актуальность работы.

К моменту начала настоящей работы в России отсутствовали иммуноферментные тест-системы, основанные на рекомбинантных антигенах. Зарубежные же тест-ситемы характеризовались низкой специфичностью и чувствительностью в отношении выявления заболеваний клещевым боррелиозом в России. Это обусловлено крайне высокой антигенной вариабельностью возбудителя и, как следствие этого, антигенными отличиями между российскими и западно-европейскими изолятами боррелий. Таким образом, разработка эффективных средств диагностики КБ является важной задачей здравоохранения нашей страны.

Цель работы - разработка способов иммуноферментного выявления антител к Borrelia burgdorferi si. в сыворотках больных иксодовым клещевым боррелиозом.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить зараженность клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Сибири, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l.

2. Выбрать антигены Borrelia burgdorferi s.l., пригодные для выявления ранних стадий клещевого боррелиоза и разработать стратегию получения их рекомбинантных форм.

3. Определить первичные структуры кодирующих областей генов выбранных иммунодоминантных белков сибирских изолятов боррелий и сравнить их с известными.

4. Клонировать гены выбранных иммунодоминантных белков в клетках E.coli в составе экспрессирующего вектора.

5. Исследовать иммунореактивность полученных рекомбинантных антигенов в экспериментах с сыворотками больных клещевым боррелиозом.

6. Оптимизировать процесс получения рекомбинантных антигенов.

7. Определить пригодность рекомбинантных антигенов для серодиагностики клещевого боррелиоза методами твёрдофазного ИФА. Научная новизна работы:

1. Исследована зараженность клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Алтая и Новосибирской и Томской областей, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. в период с 1999 по 2001 г.г. и определена геновидовая принадлежность боррелий.

2. Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов ospC и flaB десяти сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и методами компьютерного анализа выявлены потенциальные антигенные детерминанты соответствующих белков.

3. На основе сравнения первичных структур генов ospC установлены филогенетические связи между различными штаммами Borrelia burgdorferi s.l., включая и сибирские изоляты боррелий.

4. Исследована иммунореактивность рекомбинантных антигенов OspC и фрагмента FlaB в экспериментах с сыворотками больных Лайм-боррелиозом.

Практическая значимость работы:

1. Разработана технология получения рекомбинантных белков Borrelia burgdorferi s.l. в клетках E.coli с использованием экспрессирующего вектора pREB9-6H.

2. Разработана оригинальная форма для твердофазной иммуноферментной тест-системы.

3. Предложены способы твердовазного иммуноферментного выявления антител к Borrelia burgdorferi si. в сыворотках больных клещевым боррелиозом

Положения выносимые на защиту:

1. Клещи Ixodes persulcatus на территории Сибири заражены спирохетами только двух геновидов Borrelia burgdorferi s.l.: В. garinii и В. afzelii.

2. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi S.I., цйркулирующие на территории Сибири, по-видимому, составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее.

3. Рекомбинантные белки OspC и внутренний фрагмент FlaB Borrelia garinii NT29 пригодны для определения раннего клещевого боррелиоза в Сибири.

4. Плазмидный вектор pREB9-H6 является надежной и эффективной системой для экспрессии токсичных для E.coli белков.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Иванов, Игорь Диадорович

Выводы

1. Определена зараженность клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Сибири, спирохетами Borrelia burgdorferi si в период с 1999 по 2001 г.г., составившая от 8% до 38% в зависимости от региона и года.

2. В популяции исследованных клещей Сибири выявлены только два геновида боррелий — Borrelia garinii (группы NT29 и 20047т) и Borrelia afzelii с явным преобладанием первого (85%).

3. На основе анализа первичных структур кодирующей части генов ospC и flaB исследованных изолятов боррелий, выявлена значительная вариабельность антигена OspC и консервативность FlaB.

4. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi s.l., циркулирующие на территории Сибири, по-видимому, составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее.

5. Получены штаммы E.coli - продуценты OspC и FlaB В.garinii NT29.

6. Оптимальными условиями для наработки рекомбинантных белков (в том числе токсичных) с использованием экспрессирующего вектора pREB9-H6, достигающей 12-18% от суммарного клеточного белка E.coli, являются следующие: количество индуктора (налидиксовой кислоты) - 40-60 мг/мл, количество селективного антибиотика (ампицилина) — 50 мг/мл, возраст культуры - 2.0 о.е., время индукции — 5 часов.

7. Сконструированы два прототипа иммуноферментных тест-систем, для выявления начальных стадий заболевания клещевым боррелиозом.

Заключение

Диагностические подходы, применяемые для установления инфекционных заболеваний, можно разделить на пять групп:

1. Ситуативная диагностика (т.е. пациент оказался в ситуации, когда заражение заведомо неминуемо или риск заражения сильно возрастает). Данный подход применим в случаях когда человек имел явно инфективный контакт с носителем (или переносчиком), либо оказался в очаге высоковирулентного агента (например, катастрофические нарушения стерильности в лабораториях с особо опасными инфекциями). В этих случаях, к счастью довольно редких, можно с очень высокой вероятностью ставить соответствующий диагноз, вскоре после заражения, без каких-либо дополнительных тестов. Часто этот подход применяют для выделения групп риска - в том случае если человек (или группа людей) находятся достаточное время в эндемичном очаге или попадает в группу риска по социальным либо возрастно-половым критериям. Основная роль в использовании данного подхода приходится на учреждения санитарно-эпидемиологического контроля.

2. Симптоматическая диагностика. Данный подход долгое время был единственным, который применялся врачами. За многие века был накоплен богатый опыт в распознавании различных инфекционных заболеваний. В настоящее время область применения симптоматической диагностики сильно сузилась, поскольку подход имеет ряд недостатков, а именно:

- проявление симптомов происходит тогда, когда инфекционный процесс уже получил развитие, и болезнь, как правило, уже значительно сложнее поддается лечению;

- отсутствие четкой симптоматической границы между большинством инфекционных заболеваний, что может приводить к постановке неверных диагнозов или выборе неверных методов лечения;

- и, наконец, высокая субъективность, имеющая место в данном случае, подразумевающая как индивидуальные особенности пациента, так и опыт врача.

На основании одной симптоматики сейчас ставят диагнозы лишь в довольно ограниченном наборе инфекционных заболеваний, как правило, если пациенты относятся к одной из групп риска - например ветряная оспа у детей, имеющая четко выраженные симтомы.

3. Иммунологический подход. Основан на выявлении специфичных антител к инфекционному агенту. Подход удобен и в настоящее время является едва ли не самым используемым в диагностике инфекционных заболеваний. К недостаткам подхода следует отнести его неабсолютную достоверность. В редких случаях достоверность и специфичность превышают 90%. В строгом смысле, положительный результат при проведении иммуноферментного анализа, означает лишь то, что пациент в недавнем прошлом имел контакт с антигеном, имеющим детерминанты, подобные тем, какие мы пытаемся выявить, проводя анализ.

4. Подход, основанный на выделении и культивировании возбудителя. Едва ли, не самый достоверный из имеющихся к настоящему времени. Дает наиболее полную информацию о патогене. Недостатками подхода являются его, как правило, высокая стоимость, и длительность. Подход используют в основном как дополнительный, при необходимости установить такие свойства инфекционного агента, как устойчивость к лекарственным препаратам или способность выделять определенные токсины.

5. Подход, основанный на выявлении специфичных для инфекционного агента нуклеиновых кислот. Данный подход является самым молодым. Его область применения быстро расширяется. Подход характеризуется быстротой диагностики, высокой достоверностью и практически стопроцентной специфичностью. Стоимость процедур пока остается достаточно высокой, но, как правило, ниже, чем в случае культивирования. В строгом смысле, положительный результат при проведении НК-диагностики, говорит о наличии а иногда и концентрации) возбудителя в образце, не говоря о степени инфекционного процесса.

6. Можно также преложить биохимический подход, основанный на выявлении специфических для возбудителя метаболитов или изменения метаболизма в организме пациента вод воздействием патогена. Однако автору неизвестна система диагностики какого-либа инфекционного заболевания основанного на этом подходе.

Подходы 2, 3 и 6 в первую очередь позволяют делать выводы о степени патологического процесса. Подходы 4 и 5 — о концентрации возбудителя и его свойствах.

В случае БЛ, в настоящее время на территории РФ для диагностики в основном используют подход (1) - выделение групп риска в эндемичных районах (укус клещом) и (2) - на основе проявляющейся после укуса симптоматики. Использование ИХА или реакции непрямой иммунофлюоресценции РНИФ редко из-за слабой доступности соответствующих наборов. ДНК-диагностика носит эпизодический, научно-исследовательский, характер.

Ввиду того, что различные подходы в диагностики позволяют ответить на несколько разные вопросы, уместно рассмотреть основные причины симптоматики при инфекциях и инвазиях и соотнести с задачей по диагностике клещевого боррелиоза. Причины симптоматики:

1. Прямое деструктивное воздействие возбудителя на организм либо путем секреции токсинов, либо из-за глобального поражения жизненно важных тканей, систем или органов. К этой группе относятся такие заболевания как чума, холера, СПИД, малярия.

2. Дистрофирующее воздействие, когда возбудитель эффективно конкурирует с организмом хозяина за питательные ресурсы. Большей частью такая причина симптоматики наблюдается в случаях инвазий.

3. Симптоматика обусловленная естественной активацией иммунной системы и приводящая либо к аутоиммунным реакциям (как, например, наблюдается при хронических стрептококковых инфекциях), либо к другим нарушениям, вызванным взаимодействием иммунной системы и возбудителя (например образования крупных нерастворимых комплексов вирус-антитело).

Разумеется, при любом инфекционном или инвазивном заболевании задействованы все три типа причин, и можно лишь в некоторых случаях говорить о доминировании одной из них. В случае КБ основная доля симптоматики относится к типу (3). Поэтому важно выявлять именно возросшую специфичную активность иммунной системы. ДНК-диагностика в случае КБ значительно менее эффективна. В первую очередь из-за локализации возбудителя в тканях, труднодоступных для взятия образцов. Редкие случаи, когда возбудителя можно обнаружить в крови или моче, не могут служить основой для стабильной диагностики. Кроме того, даже обнаружение боррелий в организме человека, не всегда может означать наличие инфекции, т.е. иметь место бессимптомное, зачастую кратковременное, носительство.

С учетом всего вышесказанного, идеальная система диагностики КБ,-, должна выглядеть следующим образом.

1. Выявление эндемичных очагов (эта работа в основном сделана).

2. ДНК-анализ присосавшихся клещей.

3. Наблюдение пациента после укуса — после проявления первых симптомов, характерных для КБ, иммунологическое (например, ИФА) обследование.

4. Культивирование боррелий вряд ли можно будет широко использовать непосредственно для диагностики в ближайшем обозримом будущем из-за дороговизны и длительности. Однако культивирование должно позволить выявить генетические маркеры, коррелирующие с лекарственной устойчивостью и тропностью штаммов боррелий, что позволит легко прогнозировать течение заболевания и выбирать оптимальную схему лечения, после проведения быстрых иммунологических и ДНК тестов.

Дальнейшее развитие описанной в нашей работе иммунологической тест-системы, видимо будет двигаться в двух направлениях.

Первое направление это повышение технологичности тест-системы. Изучается вопрос нанесения антигенов с использованием технологии струйных принтеров с пьезоэлектрической подачей красителя либо использованием щелевых вакуумных камер. Вероятно, вместо нитроцелюллозы будет использован другой носитель, так как нитроцелюллоза не обладает достаточной прочностью. Представляется также интересным использование окраски коллоидным золотом, как альтернативы использования пероксидазного коньюгата. Выделение рекомбинантных антигенов в настоящее время оптимизировано для количеств, не превышающих 10 мг. При возрастании потребности в антигенах потребуется дополнительная оптимизация процедур выращивания бактерий-продуцентов и выделения рекомбинантного продукта, поскольку наш многолетний опыт работы со штаммами-продуцентами, показал значительную их чувствительность к таким внешним факторам как температура, кинетика роста или режим аэрации. При использовании разных типов качалок, ферментеров, культуральных емкостей, эффективность наработки целевых продуктов менялась на 50% и более. Актуальной задачей является стандартизация используемых компонентов, в особенности получаемых извне - коньюгаты, составляющие блокировочного раствора и др. Разумеется, выполнение всех этих задач невозможно в рамках одной лишь академической системы, даже при наличии достойного финансирования.

Вторым направлением является получение новых рекомбинантных антигенов с целью увеличения чувствительности теста. Также выглядит заманчивым нанесение на одну тестовую полоску сразу нескольких вариантов одного антигена. Это позволит сразу же, после первого анализа определять штаммовую принадлежность возбудителя с высокой точностью.

Использование технологии струйных принтеров для нанесения антигенов, позволяет формировать полосы антигена шириной менее миллиметра, что дает возможность нанесения на один стрип трехсантиметровой длины, до 20 различных антигенов или их вариантов. При этом очень четко проявляются преимущества именно стрипового варианта ИХА в сравнении с вариантом, когда антигены нанесены на полистирольный планшет.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванов, Игорь Диадорович, 2003 год

1. Васильева И. С. и Наумов P. JI. Паразитарная система болезни Лайма, состояние вопроса сообщение 1. возбудители и переносчики. // Acarina. 4 (1-2), с. 53-75.

2. Горелова Н.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В., и др. Выделение Боррелий из Ixodes trianguliceps (Ixodidae) и возможное значение этого вида в эпизотиологии клещевых боррелиозов. // Паразитология. — 1996. -т. 30.-С. 13-18.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование, Москва, М., 1984.

4. Akins D.R., Caimani M.J., Yang X. et al. Molecular and evolutionary anlysis of Borrelia burgdorferi 297 circular plasmid-encoded lipoproteins with ospE-and ospF-like lider peptides. // Inf. Immun. 1999. - V, 67. - P. 1526-1532.

5. AraVind L., MakaroVa K.S., and Koonin E. V. Holiday junction resolVes and related nucleases: identification of new families, phyletic distribution and evolutionary trajectories. //Nucleic Acids Research. -2000. V. 28.- P. 34173432.

6. Barbour A.G. and Bundoc V. Flagella-les.s. borrelia. / US patent 25.07.1995. -No 5,436,000.

7. Barbour A.G., Bergstrom S. and Hans.s.on L. Osp A and В Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90. / US patent, 07.07.1998. No 5,777,095.

8. Bergstrom S., Barbour A. G. Borrelia antigen. / US patent, 18.11.1997. No 688512.

9. Bergstrom S., Bundoc V.G. and Barbour A.G. Molecular analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, ospA and ospB, of Lyme-disease spirochete Borrelia burgdorferi. // Molecular Microbilogy.- 1989. V. 4. P. 479-486.

10. Berland R., Fikrig E., Rahn D., Hardin J. and FlaVell R. Molecular characterization of the humoral response to the 41-kilodalton flagellar antigen of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent. // Infection and Immunity. —1991.-V. 59.-.P. 3531-35.

11. Brown E. L., Guo B. P., O'Neal and Hook M. Adherence of Borrelia burgdorferi. // The Journal of Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - P. 26272-26278.

12. Brunet LR, Sellitto C, Spielman A, Telford SR 3rd. Antibody response of the mouse reservoir of Borrelia burgdorferi in nature. // Infect Immun. 1995 Aug -V. 63(8)-P. 3030-6.

13. Bunkis J., Luke C. J., Bunikiene E., et al. A surface-exposed region of a noVel outer membrane protein (p66) of Borrelia spp. Is a Variable in size and sequence. //Journal of Bacteriology. 1998. - V. 180. - P. 1618-1623.

14. Burgdorfer W., Barbour A.G., Hayes S. F. et al. Lyme disease — a tick-born spirochtosis // Sciense. 1982. - V. 216. - P. 1317-1319.

15. Busch D.H., Jas.s.oy C., Brinckmann U., Girschick H. and Huppertz H.-I. Detection of Borrelia burgdorferi-specific CD8+ cytotoxic t cell in patients with Lyme arthritis. // The Journal of Immunology. 1997. - V. 157. - P. 3534-3541.

16. Caputa A.C., Bey R.F. and Murtaugh M.P. Recombinant Vaccine against Lyme disease. / US patent, 10.09.199. No 5,554,371.

17. Casjens S., Palmer N., Van Vugt R., E. et al. A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extraxromosomal DNAs in infection of the Lyme spirochete Borrelia burgdorferi. II Molecular Microbiology. — 2000. V. 35.-P. 490-516.

18. Casjens S.E. volution of the linear DNA replicons of the Borrelia spirochetes. //Current Opinion in Microbiology. -1999. P. 529-534.

19. Chaconas G., Stewart P., Tilly K. et al. Telomer resolution in the Lyme disease spirochete. //The EMBO Journal. 2001. - V. 20. - P. 3229-3237.

20. Coleman J.L., Gebbia J.A., Piesman J. et al. Plasminogen is required for efficient dis.s.emination of Borrelia burgdorferi in ticks and for enhancement of spirochetemia in mice. // Cell. 1997. - V. 89. - P. 1111-1119.

21. Coleman J.L., Rogers R.C., Rosa P.A. et al. Variation in the ospB gene of Borrelia burgdorferi result in differences in monoclonal antibody reactivity and in production of escape Variants. // Inf. Immunity. 1994. - V. 62. - P. 303-307.

22. Collins C. and Peltz G. // Immunoreactive epitopes on an expres.s.ed recombinant flgellar protein of Borrelia burgdorferi. // Inf. Immun. 1991. -V. 52.-P. 514-520.

23. Dodge D.E. and White T.J. Method for diagnosis of Lyme disease. / US patent, 15.06.1999.-No 5,912,117.

24. Dunn J. J., Buchstein S. R., Butler L.-Li. // Complete nucleotide sequence of a Circular plasmid from the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. // Journal of Bacteriology. 1994. - V. 176. - P. 2706-2717.

25. Dunn M. J. Detection of proteins in polyacrylamide gels by silVer staining. // In "The protein protocols handbook" edited by Walker J. M. / 1996. Humana Pres.s., Totowa, New Jersey. - P. 229-235.

26. Dykhuizen D.E., Polin D.S., et al. Borrelia burgdorferi is clonal: implications for taxonomy and Vaccine development. // PNAS. 1993. - V. 90. - P. 1016310167.

27. Eggers C.H. and Scott S.D. Molecular evidence for a new bacteriphage of Borrelia burgdorferi.il Journal of Bacteriology. 1999. - V. 181. - P. 73087313.

28. Fang T. L., AlVarez A. L., Gu Y. et al. An immunodominant conserved region within the variable domain of vlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi. // The Journal of Immunology. -1999. -V. 163. 5566-5573.

29. Fang Т. L., Nowling J. M. and Philipp M. Т. Cryptic and exposed invariable region of vlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi s.l. II

30. M Journal of Bacteriology. -2000. V. 182. - P. 3597-3601.

31. Fikrig E., Berland R., Chen M., Williams S., et al. Serologic response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line. // PNAS. -1993. V. 90. - P. 183-187.

32. Fikrig E., Feng W., Barthold S. W. et al. Arthopod- and host-specific Borrelia burgdorferi bbk32 expres.s.sion and ihibition of spirochete transmis.s.ion. // The Journal of Immunology. 2000. - V. 164. - P. 5344-5351.

33. Fikrig E., Tao H., Barthold S.W. and FlaVell R. A. Selection of Variant Borrelia burgdorferi isolates from mice immunized with outer surface protein A or B. // Infection and Immunity. -1995. V. 63. - P. 1658-1662.

34. Fikrig E., Tao H., Kantor F. S., et al. Evasion of protective immunity by Borrelia burgdorferi by truncation of outer surface protein В. I I PNAS. 1993. - V. 90. - P. 4092-4096.

35. Flavell R.A., Fikrig E., Lam T.T., et al. OspE, OspF, and SI polypeptides in borrelia burgdorferi. / US patent, 12.08.1997. No 5,656,451.

36. Flavell R. A., Fikrig E. and Berland R. Flagellin-based polypeptides for the diagnosis ofLyme disease. / US patent. 08.04.1997. No 5,618,533.

37. Fleche F., Postic D., Girardet K. et al. Characterization of Borrelia lusitaniae sp. NoV. By 16S ribosomal DNA sequece analysis. // International Journal of systematic Bacteriology. 1997. - V. 47. - P. 921-925.

38. Fowler S.J. Protein staining and immunodetection using colloidal gold. // In "The protein protocols handbook" edited by Walker J.M. / 1996. Humana Pres.s., Totowa, New Jersey. - P.275-289.

39. Fraser C.M., Casjens S., Huang W.M. et al., Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. II Nature. 1197. - V. 390. - P 580586.

40. Fuchs H., Wallich R., Simon M.M. and Kramer M. D. The outer surface protein A of the soirochaete Borrelia burgdorferi is a plasmin(ogen) receptor.

41. IIPNAS. 1994. - V. 91. - P. 12594-12598.

42. Ge Y. Old L. G. Girons I. S. and Charon N. W. The flgK motiliy of Borrelia burgdorferi is initiated by a sigma -like promoter.// Microbiology. 1997.-V. 143.-P. 1681-1690.

43. Ge Y., li C., Corum L., et al. Structure and expres.s.ion of the flaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi. // Journal of Bacteriology. 1998. - V. 180.-P. 2418-2425.

44. Gilmore R.D., Mbow M.L. A monoclonal antibody generated by antigen inoculation via tick bite is reactive to the Borrelia burgdorferi rev protein, a member of 2.9 gene family locus. // Infection and Immunity. 1998. - V. 66. -P. 980-986.

45. Gilmore R.D. and Mbow M. L. Conformational nature of the Borrelia burgdorferi B31 outer surface protein С protective epitope. // Infec. and Immun. -1999. V. 67. - P. 5463-5469.

46. Gilmore R.D. and Piesman J. Inhibition of Borrelia burgdorferi migration from the midget to the saliVary glands following feeding ticks on ospC-immunazied mice. // Infection and Immunity. -2000. V. 68. - P. 411-414.

47. Golde W.T., Kappel K.J., Dequesne G., et al. Tick transmis.s.ion of Borrelia burgdorferi to inbred strains of mice induces an antibody response to p39 but not to outer surface protein A. // Infection and Immunity. -1994. V. 62. - P. 2625-2627.

48. Gorbacheva V.Y., Godrey H.P. Cabello FC. Analysis of bmp gene family in Borrelia burgdorferi sensy lato. II Journal of Bacteriology. 2000. - V. 182. -P. 2037-2042.

49. Gravel P. and Golaz O. Protein blotting by semidry method. // In "The protein protocols handbook" edited by Walker J. M. / 1996. New Jersey. - P. 249261.

50. Gray J.S., Schonberg A. et al. First isolation and characterization of Borrelia garinii, agent of Lyme borreliosis, from Irish ticks. // Irish J Med. science. -1996.-V. 165.-P. 24-26.

51. Guina Т., Helfet-Helliker D. et al. Sequence and phylogenic analysis of the Borrelia burgdorferi seqA gene. // Bioch. et Bioph. Act. 1998. - V. 1371. -P. 24-30.

52. Guo B. and Hook M. Decorin binding protein compositions and methods of use. / US patent, 29.12.1998. No 5,853,987.

53. Gupta S. K., Schnberg A. and Hiepe Th. Prevalence of ticks in relation to their role as vector of Borrelia burgdorferi under autochtone conditions. // Applied Parasitology. 1995. - V. 36. - P. 97-106.

54. Guttman D.S., Wang P. W., Wang I.-N. et al. Multiple infection of Ixodes scapularis ticks by Borrelia burgdorferi as revealed by singl-strand conformation polymorphism analysist. // J. Clin. Microbiology. 1996. - V. 34. - P. 652-656.

55. Hanson M.S., Cas.s.att D.R., Guo B.P. et al. Active and pas.s.ive immunity against Borrelia burgdorferi decorin binding protein A (dbpA) protects against infection. // Infection and Immunity. -1998. V. 66. - P. 2143-2153.

56. Hanson M.S., Patel N.K., Cas.s.att D.R. and Ulbrandt N.D. Evidence for vaccine synergy between Borrelia burgdorferi decorin binding protein A and the mouse model of Lyme borreliosis. // Infection and Immunity. 2000. — N.l 1. - P. 6457-6460.

57. Hauser U., Lehnert G., Lobentanzer R. and Wilske B. Interpretation criteria for «А standardized Western blots for three European species of Borrelia burgdorferisensu lato. // Journal Clinical Microbiology. 1997. - V. 35. - P. 1433-1444.

58. Hefty P.S., Jolliff S.E., Caimano M.J. et al. Regulation of ospE-related, ospF-related, and elp lipoproteins of Borrelia burgdorferi strain 297 by mammalian host-specific signals. // Infection and Immunity. -2001. V.69. - P. 3618-3627.

59. Hopp, T.P. & Woods, K.R., Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1981 V. 78 - P. 38243828

60. Jauris-Heipke S., Fuchs R., Motz M. et al. Genetic heterogenity of the genes coding for outer surface protein С (ospC) and the flagellin of Borrelia burgdorferi. //Medical Microbiologycal Immunology. 1993. - V. 182(1). - P. 37-50.

61. Jensen J. R., Du Chateau В. K., Munson E. // Inhibition of the production of anti-ospA borreliacidal antibody with T cells from hamsters vaccinated against Borrelia burgdorferi. II Infection and Immunity. 1998. - V. 66. - P. 15071512.

62. Johnson J.M. and Church G.M. Alignment and structure prediction of divergent protein families: periplasmic and outer membrane proteins of bacterial efflux pumps. // Journal of Molekular Biology. 1999. - V. 287. - P. 695-715.

63. Kaneda K., Masuzawa T. et al. Glucospingolipid-binding protein of Borrelia burgdorferi sensu lato. II Infection and Immunity. -1997. V.65. - P.3180-3185.

64. Kawabata H., Myouga F. et al. Genetic and immunological analyses of vis (vmp-like sequences of) Borrelia burgdorferi. II Microbial Pathogen. 1998. -V. 24. - P.155-166.

65. Kitten T. Barbour A. Juxtaposition of expres.s.ed variable antigen genes with a conserved telomere in bacterium Borrelia hermsii. II PNAS. 1990. - V.87. -P. 6077-6081.

66. Klempner M.S., Noring R., Epstein M.P. et al. Binding of human plasminogen and urokinase-type plasminogen activator to the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. // The journal of Infection Diseases. 1995. - V. 171. - P. 1258-1265.

67. Korenberg, Problem of Tick-born borreliasis. // Moscow, 1993

68. Kraiczy P., Hunfeld K.P., Brienter-Runddock S. et al. Comparison of two laboratory methods for the determination of serum resistence in Borrelia burgdorferi isolates. // Immunobiology. 1999-2000. - V. 201. - P. 406-419.

69. Krider H.M. and Bushmich S.L. Early detection of Borrelia infection. / US patent, 16.11.1999.-No5,985,595.

70. Kruger J.M. The Bradford method for protein quantitation. // In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J. M. / 1996. New Jersey. - P. 15-21.

71. Lam T.T., Nguyen T.P., Montgomery R.R. Outer surface protein E and F of Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme disease. // Inf. Immun. -1994. V.62. - P.290-298.

72. LeFebvre R.B. and Perng G.-C. Methods and compositions for diagnosing Lyme disease. / US patent, 02.11.1999. No 5,977,339.

73. Li H., Dunn J.J., Luft B.J Lawson C.L. Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab. // PNAS. 1997. -V.94.- P. 3584-3589.

74. Liang F.T., Philipp M.T. Analysis and antibody response to invariable region of vlseE the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi. II Inf. and Immun. 2000. - P. 6702-6706.

75. Livey I. and Dorner F. Method for the purification of PC protein from Borrelia burgdorferi./ US patent, 25.06.1996. No 5,530,103.

76. Lobet Y., Simon M., Schaible U. et al. Osp A proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines. / US patent, 24.08.1999. No 5,942,236.

77. Lottmann H., Whilske B. and Herrmann H. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato from Ixodus ricinus in Mecklenburg-Vorpommern, Germany. // Medical Microbiologycal Immunology. 1996. - V. 184(4). - P. 181-184.

78. Luft B.J., Dunn J.J., Dattwyler R.J. et al. Cros.s.-reactive antigenic domains of the flagellin protein of Borrelia burgdorferi. // Res. Microbiology. 1993. -V.144. - P. 251-257.

79. Luft B.J., Mudri S., Jiang W. et al. The 93-kilodalton protein of Borrelia burgdorferi: an immunodominant protoplasmic cylinder antigen.// Inf. and Immun. -1992. V. 60.- P.4309-4321.

80. Magnarelli L.A., Fikrig E. et al. Use recombinant antigens of Borrelia burgdorferi in serologic tests for diagnosis of Lyme borreliosis. // J.Clin. Microbiol. 1996. -V.34. - P.237-240.

81. Magoun L., Zuckert W.R., Robbins D., et al. Variable small proten (Vsp)-dependent and Vsp-independent pathways for glucosaminoglycan recognition by relapsing fever spirochaetes. // Molecular Microbiology. 2000. - V. 36. -P. 886-897.

82. Malohr Т., Skorbene M., Gruntar I. and Kotnik. The cell-medieted immune response to Borrelia afzelii, garinii and burgdorferi in C57BL/6 mice dependent on antigen specifity. // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2000. - P. 233-240.

83. Marconi R.T. and Garon C. F. Identification of a third genomic group of Borrelia burgdorferi through signature nucleotide analysis and 16S rRNA sequence determination. // Journal of General Microbiology. 1992. - V. 138. -P. 533-536.

84. MasuzaVa Т., Wilske В., Komikado Т., et al. Comparison of ospA for Borrelia burgdorferi sensu lato fron Japan, Europe and North America. // Microbiological Immunology. 1996. - V. 40. - P. 539-545.

85. Masuzawa Т., Iwaki A., Sato Y., et al. Genetic diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato isolated in Far Eastern Rus.s.ia. // Microbiol. Immunol. 1997.-V. 41.-P. 595-600.

86. Mbow L.M., Gilmore R.D. and Titus R.G. An ospC-specific monoclonal antibody pas.s.ively protect mice from tick-tansmited infection Borrelia burgdorferi B31. // Inf. and Immunity. -1999. V. 67. - P. 5470-5472.

87. Misonne M.-C., Impe G. V. and Hoet P. P. Genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi in Ixodus ricinus ticks collected in Belgium. // J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36. - P. 3352-3354.

88. Mohammed Abdul Motaleb, Corum L. et al. Borrelia burgdorferi periplasmic flagella have both skeletal and motility functions. // PNAS. 2000. -V. 97.-P. 10889-10904.

89. Neumann U. Quatitation of proteins separated by electrophoresis using coomas.s.ie briliant blue. // In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J. M. / 1996. Humana Pres.s., Totowa, New Jersey. - P. 173-179.

90. Nguyen T.P., Lam T.T., Barthold S.W. et al. Partial destruction of Borrelia burgdonferi within ticks that engorded on ospE- or ospF-immunized mice. // Infection and Immunity. 1994. - V. 62. - P. 2079-2084.

91. Norris S.J. and Barbour A.G. Virulence as.s.ociated proteins in Borrelia burgdorferi (BB). / US patent, 21.09.1993. No 5,246,844.

92. Ohnishi J., Piesman J. and de SilVa A. M. Antigenic and genetic heterogenety of Borrelia burgdorferi population transmitted by ticks. // PNAS. 2001. - V. 98.-P. 670-675.

93. Olsen В., Gylfe A. and Bergsruom S. Canary finches (Serinus canaria) as avian ifection model for Lyme borreliosis. // Microbial Pathogenesis. 1996. -V. 20.-P. 319-324.

94. Pachner A.R., Delaney E., Zhang W.F. Protection from Lyme neuroborreliosis in nonhuman primates with a multiantigenic vaccine. // Clin. Immunol. 1999.-V.91.-P.310-313.

95. Padula S.J., Sampiere A., Dias F. et al. Molecular characterization and expres.s.ion of p23 (ospC) from a north american strain of Borrelia burgdorferi. // Inf. and Immun. 1993. - V. 61, P. 5097-5105.

96. Padula S.J. Methods for diagnosing early Lyme disease. / US patent, 15.04.1997.-No 5,620,862

97. Page M. and Thorpe R. Protein blotting by electroblotting. // In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J. M / 1996. Humana Pres.s., Totowa, New Jersey. - P. 245-249.

98. Pal U., de SilVa A.M., Montgomery R.R., et al. Attachment of Borrelia burgdorferi within Ixodus scapularis mediated by outer syrface protein A. // Journal Clinical Investigation. 2000. -V. 106. - P. 561-569.

99. Pal U., Montgomery R.R., Lusitani D. // Inhibition of Borrelia burgdorferi-tick interaction in vivo by ospA antibody. // J. Immunology. -2001.- V.166.- P. 7398-7403.

100. Patarakul K., Cole M.F. and Hughes C.A. N. Complement resistance in Borrelia burgdorferi strain 297: outer membrane proteins prevent MAC formation at lysis susceptible sites. // Microbial Pathogenesis. 1999. - V. 27. -P. 25-41.

101. Pa Via C.S. Overviwe of the pathogenic spirochetes. // J. Spirochetal and Tick-Born Diseases. 1994. - V. 1.

102. Perng G.-C., LfFebvre R.B. and Johnson R.C. Further characterization of potent immunogen and the chromosomal gene encoding it in the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi. // Infection and Immunity. 1991. - V. 59. - P. 2070-2074.

103. Persing D.H., Mathiensen D. et al. Genetic stability of Borrelia burgdorferi recovered from chronically ifected immunocompetent mice. // Inf. Immun. -.1994. V.62. - P. 3521-3527.

104. Pohl-Knoppe A., Logigian E.L., Steere A.C. and Halfer D. A. Cros.s.-reactivity of Borrelia burgdorferi and mulein basic protein-specific T cells isnot observed in borrelial encephalomyelit. I I Cellular Immunology. 1999. -V.194.-P. 118-123.

105. Postic D, As.s.ous M.V., et al. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl (23S) intergenic spacer amplicons. // Int J Syst Bacteriol. 1994. - V. 44. - P. 743-752.

106. Probert W.S. and LeFebevre R. B. Protection of C3H/HeN mice from challenge with Borrelia burgdonferi through active immunization with ospA, OspB, ospC, but not ospD or the 83-kilodalton antigen. // Infection and Immunity. 1994. - V.62. - P. 1920-1926.

107. Purser J.E. and Norris S. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. // PNAS. 2000. - V. 97. - P. 13865-13870.

108. Radolf J.D., Arndt L.L., Akinis D.R. et al. Treponema pallidium and Borrelia burgdorferi lipoproteins and synthetic lipopeptides activate monocytes/macrophages. //J. Immunol. 1995. - V. 154. - P. 2866-2877.

109. Ramamoorthy R, Philipp MT. Differential expres.s.ion of Borrelia -V, burgdorferi proteins during growth in vitro.// Infect Immun. 1998 Nov. V.66(11)-5119-24.

110. Ramamoorthy R, Scholl-Meeker D. Borrelia burgdorferi proteins whose expres.s.ion is similarly affected by culture temperature and pH. // Infect Immun. 2001 Apr - V. 69(4) P. 2739-42.

111. Rasiah C., Schiltz E., Reighert J. and Vogt. A. Purification and characterization of trypsic peptide of Borrelia burgdorferi flagellin, whichreduced cros.s.-reactivity in immunoblots and ELISA. // J. General Microbiology. 1992. - V. 138. - P. 147-154.

112. Rauer S., Spohn N., Rasiah et al. Enzyme-linked immunosorbent as.s.ay using recombinant ospC and internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease.// J. Clinical Microbiology. -1998. V. 36. -P. 857-861.

113. Restrepo B.I., Kitten T. et al. Subtelomeric expres.s.ion regions of Borrelia hermsii linear plasmids are highly polymorphic.// Mol. Microbiol. -1992.-V. 22.-P. 3299-3311.

114. Robinson J.M., Pilot-Matias T.J. and Hunt J.C. Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof. / US patent, 12.10.1997. No 5643733.

115. Robinson J. M., Pilot-Matias T. J. and Hunt J. C. Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof. / US patent, 12.10.1999. No 5965702.

116. Robinson J.M., Pilot-Matias T.J. et al. Analysis of the humoral response to the flagellin protein of Borrelia burgdorferi: cloning of regions capable of differentiating Lyme disease from syphilis .// J. Clin. Microbiol. 1993. - V.31. - P.629-635.

117. Roes.s.ler D., Hauser U. and Wilske B. Heterogeneity of bmpA among european isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato and influence of interspecies variabiliy on serodiagnosis. // Journal of Clinical Microbiology. -1997.-V. 35.-P. 2752-2758.

118. Root D.D. and Wang K. Cooper iodide staining of protein on solid phases. // In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J.M. / 1996. New Jersey. P.31 -45.

119. Sadziene А.1., Johnson M., Bergstrom S. et al. A bactericidal antibody to Borrelia burgdorferi is detected against a variable region of the ospB protein.i // Infection and Immunity. 1994. - V. 62. - P. 2037-2045.

120. Sadziene A., Rosa P.A. et al. Antibody-resistant mutants of Borrelia burgdorferi-, in vitro selection and characterization. // J. Exp. Med. 1992. -V.176. - P.799-809.

121. Sartakova M., Dobrikova E. and Cabello F.C. Development of extraxromosomal cloning Vector system for use in Borrelia burgdorferi. II PNAS. 2000. - V. 97. - P. 4850-4855.

122. Sato Y., Miyamoto K., Iwaki A. et al. Prevalence of Lyme disease spirochtes in Ixodes persulcatus and wild rodents in Far Eastern Rus.s.ia. // Applied and Environmetal Microbiology. 1996. - V.62. - P. 3887-3889.

123. Schmiltz J.L., Schell D.F., Heika A. et al. Induction of Lyme athritis in LSH hamsters. // Infection and Immunity. 1988. - V. 56. - P. 2336-2342.

124. Schonberg A. and Loser C. Differention of Borrelia burgdorferi isolates from ticks and humans by different monoclonal antibodies in immunofluorescence. // Lyme borreliosis plenum pres.s., N.Y. 1994. - P. 315319.

125. Schwan T.G., Kime K.K., Schrumpf M.E. et al. Antibody response in white-footed mice (Peromyscus leucopus) experementally infected with the Lyme disease spirochete (Borrelia burgdorferi). // Infection and Immunity. -1989.- V. 57. P. 3445-3451.

126. Schwan T.G., Piesman J., Golde W.T., et al. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. // PNAS. 1995. -V. 92.- P. 2909-2913.

127. Simon M.M., Schaible U.E., Eichmann K. et al. Hybridomas producing antibodies specific for Lyme disease antigens OspA and OspB. / US patent, 05.01.1999.- No 5,856,447.

128. Simon M.M., Schaible U.E., Eichmann K. et al. Pas.s.ive vaccine against Lyme disease./US patent, 14.07.1998. No 5,780,030.

129. Smith B.J. Quantification of proteins by staining in polyacrilamide gels. // In "The protein protocols handbook" edited by Walker J.M. / 1996. New Jersey.-P. 167-173.

130. Sohaskey C.D., Arnold C., Barbour A.G. Analysis of promoters in Borrelia burgdorferi by use of transiently expres.s.ed reporter gene. // J. Bact. -1997. V.179. - P.6837-6842.

131. Stevenson В., Schwan T.G., Rosa P.A. Temperature-related differential expres.s.ion of antigens in Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. II Inf. Immun. 1995. - V.63. - P.4535-4539.

132. Stevenson В., Bockenstedt L.K. and Barthold S.W. Expres.s.ion and gene sequence of outer surface protein С of Borrelia burgdorferi reisolated from chronicaly infected mice. I I Infection and Immunity. 1994. - V. 62. - P. 3568-3571.

133. Stevenson В., Tilly K. and Rosa P. A. A family of genes located on four separate 32-kilobase circular plasmids in Borrelia burgdorferi B31. // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 3506-3516.

134. Subramanian G., Koonin E., Aravind L. Comparative genome analysis of the pathagenic spirochetes Borrelia burgdorferi and Treponema pallidium. // Inf. Immun. 2000. - V.68. - P. 1633-1648.

135. Tai K.-F., Ma Y. and Weis J. J. Normal human В lymphocytes and molecular cells respond to the mitogenic and cytockine-simulatory activities of

136. Borrelia burgdorferi and its lipoprotein ospA. // Inf. Immun. 1994. - V. 62. -P. 520-528.

137. Theisen M., Borre M., Mathiensen M.J Evolution of the Borrelia burgdorferi outer surface protein ospC. // Journal of Bacteriology. 1995. -V.177.-P. 3036-3044.

138. Ulbrandt N.D., Cas.s.at D.R., Patel N.K. et al. Conformational nature of the Borrelia burgdorferi decorin binding protein A epitopes that elicit protective antibodies. // Infection and Immunity. -2001. V. 69. - P. 47994807.

139. Walker J.M. Gradient SDS polyacrilamide gel electrophoresis of proteins. / In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J. M. / 1996. Humana Pres.s., Totowa, New Jersey. - P. 63-67.

140. Walker J.M. SDS polyacrilamide gel electrophoresis of proteins. // In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J. M. / 1996. Humana Pres.s., Totowa, New Jersey, P. 55-63.

141. Wallich R., Helmes C., Schaible U. et al. Evolution of genetic divergence among Borrelia burgdorferi isolates by use ospA, fla, hsp60 and hsp70 gene probes. // Ifection and Immunity. 1992. - V. 60. - P. 4856-4866

142. Wallich R., Moter S.E., Simon M.M., et al. The Borrelia burgdorferi flagellum-as.s.ociated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expres.s.ion, and amplification of the gene. Inf. Immunity. 1990. - V. 58. - P. 1711-1719.

143. Wallich R., Shaible U.E., Simon M. Cloning and sequencing of the gene encoding the outer surface protein A (ospA) of European Borrelia burgdorferi isolate. //Nucleic Asid Research. 1989. - V. 17. - P. 8864.

144. Wang G., Van Dam A.P. and Dankert J. Evidence for frequent ospC gene transfer between Borrelia Valaisiana sp. nov. and other Lyme disease spirochetes. // FEMS Microbiology Letter. 1999. - V. 177. - P. 289-296.

145. Wang G., Van Dam A.P., Schwartz I. and Dankert J. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. // Clinical Microbiology Reviews. 1999. - V. 12. - P. 633-653.

146. Wang I.-N., Dykhuezen D.E., et al. Genetic diversity of ospC in local population of Borrelia burgdorferi sensu stricto. H Genetics. 1999. - V. 151. - P. 15-30.

147. Waterwood J.H. and Matthews H.R. The Lowry method for protein quantitation. // In "The protein protocols handbrook" edited by Walker J.M. / 1996. Humana Pres.s., New Jersey, P. 7-11.

148. Weis R., Durnberger J. et al. Improvement of immune response against plasmid DNA encoding ospC of Borrelia by an ertargeting leader sequence. // Vaccine. 2000. - V. 18. - P. 815-824.

149. Wilske B. Busch U., Fingerle V. et al. Immunological and molecular variability of ospA and ospC . Implication for Borrelia vaccine devolopment. // Infection. 1996. - V. 24. - P. 208-212.

150. Wilske В., Preas-Mursic V., Jarius S. et al. Immunological and molecular polymorphism of ospC, an immunodominant major outer surface protein of Borrelia burgdorferi. II Infection and Immunity. 1993. - V. 61. - P. 2182-2191.

151. Yang X., Coldberg M.S., Popova T.G. et al. Interdependece of eviroumental factors influencing reciprocal patterns of gene expres.s.ion in virulent Borrelia burgdorferi. II Molecular Microbiology. 2000. - V.37 (6) -P. 1470-1479.

152. Yang X., Popova T. G., Hagman K.E. et al. Identification, characterization and expres.s.ion of the three new members of the Borrelia burgdorferi mlp(2.9) lipoprotein gene family. // Infection and Immunity. -1999.-V. 67.-P. 6008-6018.

153. Zhang J.-R., Hardham J.M., Barbour A.G. and Norris S.J. Antigenic variation in Lyme disease borreliae by promiscuous recombination of Vmp-like sequence cas.s.ettes. // Cell. 1997. - V. 89. - P. 275-285.

154. Zhou J. and Blair D. F. Residues of the cytoplasmic domain of motA es.s.ential for torque generation in the bacterial flagellar motor. // Journal Molecular Biology. 1997. - V. 273. - P. 428-439.

155. Zuckert W. and Barbour A. Stability of Borrelia burgdorferi bdr loci in vitro and in vivo. // Infection and Immunity. 2000. - V. 68. - P. 1727-1730.

156. Zumstein G., Fuchs R., Hofmann A. et al. Genetic polymorphism of the gene encoding the outer surface protein A (ospA) of Borrelia burgdorferi. II Medical Microbiological Immunology. 1992. - V. 181. - P. 57-70.