Изучение антигенной структуры поверхностного белка А (OspA) спирохеты Borrelia burgdorferi как основа для разработки новых иммунохимических методов диагностики болезни Лайма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Садыкбекова, Роза Куанышкалиевна

• Садыкбекова, Роза Куанышкалиевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Садыкбекова, Роза Куанышкалиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ИКСОДОВЫЕ КЛЕЩЕВЫЕ БОРРЕЛИОЗЫ (БОЛЕЗНЬ ЛАЙМА) КАК СОВОКУПНОСТЬ ТРАНСМИССИВНЫХ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ СПИРОХЕТАМИ РОДА BORRELIA.

1.1. Основные этапы становления научных знаний о природе иксодовых клещевых боррелиозов (болезнь Лайма).

1.2. Молекулярно-биологические аспекты болезни Лайма. 18 1.2.1. Молекулярная структура, иммунологические и биологические свойства поверхностного белка А

OspA) спирохеты В. burgdorferi.

1.3. Эпидемиология болезни Лайма.

1.4. Клиника болезни Лайма

1.5. Особенности иммунного ответа при болезни Лайма.

Глава 2. ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНИ ЛАЙМА.

2.1. Методы антигенной диагностики.

2.2. Методы серологической диагностики.

2.3. Чувствительность и специфичность методов серодиагностики.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение антигенной структуры поверхностного белка А (OspA) спирохеты Borrelia burgdorferi как основа для разработки новых иммунохимических методов диагностики болезни Лайма»

Актуальность проблемы. Комплекс иксодовых клещевых боррелиозов (болезнь Лайма, Лайм-боррелиоз) - совокупность инфекционных трансмиссивных природно-очаговых заболеваний различной этиологии, вызываемых спирохетами рода Borrelia и передающихся иксодовыми клещами [204]. Болезнь Лайма (БЛ) протекает с преимущественным поражением кожи, опорно-двигательного аппарата, нервной и сердечно-сосудистой систем, и часто приводит к хронизации инфекции [29]. В настоящее время БЛ является наиболее широко распространенным трансмиссивным заболеванием практически на всех континентах. По данным Центра Госсанэпиднадзора РФ (1997) заболеваемость БЛ в России ежегодно составляет 10-80 заболевших на 100 000 человек и за последние 5 лет возросла в три раза, превысив 8000 случаев. Возбудители БЛ входят в комплекс В.burgdorferi sensu lato, который в настоящее время на основании анализа ДНК разделен на 10 геновидов. Для трех геновидов установлена патогенность для человека и присущий им органотропизм: В. burgdorferi sensu stricto поражает опорно-двигательный аппарат, B.garinii вызывает неврологические проявления, B.afzelii - хронические поражения кожи. На территории России преимущественно циркулируют B.garinii и B.afzelii [29]. Наиболее протяженный ареал БЛ находится в лесной полосе бывшего СССР от Прибалтики до Южного Сахалина [17]. На территории России БЛ разносится лесными клещами Ixodes ricinus и таежными I.persulcatus. В Европейской части России 10-60% (в зависимости от места сбора) иксодовых клещей заражены возбудителями Б Л [9]. Общность переносчиков и сопряженность природных очагов для возбудителей БЛ и вируса клещевого энцефалита (КЭ) определяет возможность одновременного инфицирования людей и развития микстинфекции Б Л и КЭ [24]. По уровню заболеваемости и тяжести клинического течения иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) представляют собой одну из наиболее актуальных проблем в современной инфекционной патологии. Регистрируемая заболеваемость в разных странах и регионах в большей мере зависит от уровня диагностики инфекции. Диагностика БЛ представляет значительные трудности. Это обусловлено широким спектром клинического полиморфизма, ультранизкой концентрацией возбудителя в биологических средах организма человека (ликвор, кровь, моча), высокой антигенной и генетической вариабельностью возбудителя, трудностью ранней диагностики в связи с поздним появлением специфических IgM и IgG антител и их длительной персистенцией, возможностью одновременной циркуляции в одном очаге нескольких геновидов боррелий, в том числе в сочетании с возбудителями других инфекций, приводящее к развитию микстинфекции. Все вышеперечисленное предполагает существование различных клинических вариантов болезни [5]. За рубежом для серодиагностики Б Л используют тест-системы на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) и иммуноблота (ИБ). Зарубежные коммерческие тесты являются дорогостоящими и недоступны для многих клинических лабораторий. В России для выявления возбудителя в клещах применяется метод темнопольной микроскопии (ТПМ), а для верификации серологических результатов используется тест-система на основе непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ), выпускаемая НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

В связи с этим, очевидна актуальность разработки современных высокочувствительных, высокопроизводительных коммерчески доступных средств дифференциальной диагностики БЛ, учитывающих региональные особенности патогенеза и клиники этого заболевания. Важность разработки методов антигенной и серологической диагностики БЛ обусловлена необходимостью проведения сероэпидемиологического мониторинга природных очагов, основанного на выявлении возбудителей БЛ в биологическом материале (клещи) и специфических антител к В. burgdorferi s.l. в клиническом материале (кровь). При разработке иммунохимических тест-систем для детекции спирохеты В. burgdorferi наиболее целесообразно использование моноклональных антител (МКА) к основному поверхностному белку OspA. Это обусловливает необходимость предварительного молекулярно-биологического изучения антигенной структуры, определения эпитопной специфичности МКА, определения числа и локализации антигенных детерминант на поверхности OspA различных геновидов В. burgdorferi s.l., циркулирующих на территории России. Изучение антигенной структуры OspA может быть использовано как при разработке группоспецифических тест-систем на основе МКА к различным антигенным сайтам белка OspA, так и при создании антиборрелиозных вакцин [99, 192, 206]. Известно, что белок OspA является основным по количеству видоспецифическим, высоко вариабельным и иммуногенным белком спирохеты, входящим в состав практически всех патогенных для человека видов [210]. Он играет основную роль в иммунном ответе организма при БЛ. Среди иммунохимических методов одним из наиболее перспективных может оказаться метод лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА) с применением моноклональных антител для выявления и идентификации возбудителя (и его антигенов), и для выявления спектра Лайм-специфических антител в сыворотках крови пациентов. Он также прост в исполнении, как и традиционный ТИФА, но характеризуется более высокой чувствительностью при выявлении антигенов и антител, стабильностью реагентов при длительном хранении тест-систем, высокой производительностью за счет автоматизации большинства стадий иммуноанализа. Профессор И.Г. Харитоненков, первым применивший для диагностики БЛ метод ЛИФА и тест-системы на основе моноклональных антител к В. burgdorferi s.s., штамм 297, показал, что чувствительность ЛИФА составляет 15 пг в пробе, что в 10 раз выше по сравнению с аналогичной ТИФА тест-системой [140].

Кроме того, в ближайшем будущем, особенно в России, стратегия научных и диагностических исследований, вероятно, будет направлена на поиск новых подходов к сбору материала для массового серологического тестирования населения. Использование сухих пятен крови особенно актуально для жителей сельской местности и отдаленных районов, где бывает сложно осуществить используемую в настоящее время стандартную процедуру сбора материала - забор венозной крови в объеме 5-10 мл. Метод серодиагностики, основанный на анализе антител, элюированных из сухих пятен крови, имеет два важнейших для скрининговых эпидемиологических исследований преимущества. Во-первых, забор крови менее опасен для пациента в плане его инфицирования, а сама процедура менее болезненна. Во-вторых, сухие пятна крови могут храниться и транспортироваться более удобно, так как собранный материал можно пересылать по почте в герметично запакованных пластиковых пакетах, а высушенный на бумаге биоматериал обладает большей стабильностью при хранении по сравнению с жидкими сыворотками крови.

С учетом вышеизложенного, были сформулированы цель и задачи исследований.

Цель и задачи исследования. Цель работы - проведение эпитопного картирования белка OspA и разработка на этой основе высокочувствительных и высокоспецифичных тест-систем для индикации В. burgdorferi и серодиагностики БЛ с применением лантанидного иммунофлуоресцентного анализа и моноклональных антител.

Исходя из цели работы были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Проведение эпитопного картирования белка OspA с использованием конкурентного ЛИФА и панели моноклональных антител путем оценки степени конкуренции меченых ионами европия и немеченых моноклональных антител за места связывания на антигенных детерминантах белка OspA.

2. Исследование морфологии и особенностей взаимодействия с моноклональными антителами российского штамма Ip-21 B.afzelii методом электронной микроскопии.

3. Разработка тест-систем на основе ЛИФА для детекции антигенов возбудителей БЛ, в том числе для одновременного выявления в инфицированном иксодовом клеще антигенов возбудителей БЛ и вируса клещевого энцефалита.

4. Апробация разработанных тест-систем для выявления возбудителей БЛ и КЭ в лабораторных и полевых клещах.

5. Разработка и апробация тест-систем на основе ТИФА и ЛИФА для выявления специфических антител классов IgM и IgG к В. burgdorferi в сыворотках и в сухих пятнах крови пациентов.

Научная новизна работы.

Впервые для эпитопного картирования белка OspA В.burgdorferi применен методический подход на основе конкурентного ЛИФА и панели из 14 МКА, специфичных к OspA В.burgdorferi s.s. штамм 297. Это позволило получить новые научные данные о числе и локализации антигенных детерминант на поверхности белковой молекулы OspA различных геновидов, сгруппировать исследованные МКА в 7 групп по степени взаимодействия с различными штаммами боррелий, выявить различия в локализации антигенных детерминант на поверхности OspA изолированного и в составе нативной бактерии.

Показано, что на поверхности изолированного OspA локализованы две основные (ADI, ADII) и несколько минорных антигенных детерминант. Сайт ADI расположен в консервативной N-концевой области, сайт ADII - в вариабельной С-половине белковой молекулы. Белок OspA в составе спирохеты В. burgdorferi s.s. содержит две вышеуказанные мажорные области, частично перекрывающиеся между собой и другими минорными антигенными детерминантами. Белок OspA в составе B.afzelii содержит лишь одну антигенную детерминанту (ADI), совпадающую с основной детерминантой OspA В.burgdorferi s.s.

Изучена возможность и предложена оригинальная методика для выявления в одном клеще возбудителей БЛ и КЭ на основе метода ЛИФА.

За счет применения методов ЛИФА, впервые продемонстрирована возможность прямого выявления IgG и IgM антител к B.burgdorferi s.l. в сухих пятнах крови пациентов без предварительной экстракции биологического материала (антител) с чувствительностью, приближающейся к чувствительности анализа жидких проб.

Практическая ценность работы.

1. Разработан и апробирован на модели поверхностного белка OspA B.burgdorferi новый методический подход к эпитопному картированию белков на основе конкурентного ЛИФА и панели МКА. Преимуществом использования такого подхода является быстрота проведения анализа, низкая трудоемкость, стабильность меченых реагентов, что обусловлено минимальным повреждающим воздействием меток на основе ионов европия при мечении антител и при хранении коньюгатов.

2. Разработанный подход практически применен для эпитопного картирования поверхностного белка OspA. Это позволило охарактеризовать МКА по степени взаимодействия с различными штаммами В. burgdorferi и обосновать выбор пар МКА для построения тест-систем для индикации и идентификации американских и российских штаммов В.burgdorferi. Кроме того, определено число и локализация антигенных детерминант на поверхности OspA белка, что может быть использовано в исследованиях по разработке вакцин.

3. На основе анализа 64 вариантов построения тест-систем с использованием различных сочетаний МКА к OspA В.burgdorferi s.s. (штамм 297) и кроличьих поликлональных антител, специфичных к B.afzelii, штамм 1р-21, установлено, что для детекции американских штаммов В. burgdorferi наиболее эффективны тест-системы на основе пар МКА к различным антигенным сайтам OspA; наиболее сильная реакция наблюдалась в тест-системах, включающих МКА Е6 (к сайту ADII OspA) в качестве улавливающих и меченые хелатом европия МКА D8 (к сайту ADI) в качестве детекторных. Для выявления российских изолятов B.afzelii (штамм 1р-21) целесообразно было использовать МКА D8, A7j или СЗ (все к сайту ADI OspA) в сочетании с поликлональным кроличьим коньюгатом. Чувствительность детекции американских и российских штаммов в этих вариантах тест-систем, в том числе по данным шифрованного опыта, составила 5-10 нг/мл, что соответствовало приблизительно (2-5)* 103 боррелиям/мл.

4. На основе ЛИФА разработана методика выявления двух возбудителей: спирохеты В.burgdorferi и вируса КЭ в одном клеще, что позволило существенно снизить трудоемкость исследований при ее практическом использовании для обследования природных очагов на территории Московской области в эпидсезоны 1999-2000 гг. Установлены показатели зараженности клещей двумя возбудителями и различия зараженности клещей боррелиями в отдельных районах Московской области. Средняя зараженность боррелиями составила от 3,1 до 18%, вирусом КЭ - менее 1%, что соответствует данным других исследователей.

5. Проведена разработка и клиническая апробация серодиагностических тест-систем на основе ТИФА и ЛИФА для выявления специфических IgM и IgG антител к В. burgdorferi в сыворотках крови пациентов. При сопоставимой специфичности по сравнению с коммерческими тест-системами на основе НРИФ (53%) производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и ТИФА фирмы "Diagnostics Pasteur" (67%) разработанные тест-системы ЛИФА и ТИФА характеризовались более высокой чувствительностью при выявлении антител у пациентов с клиническим диагнозом Лайм-боррелиоза (7279%).

6. Показана принципиальная возможность использования для серодиагностики БЛ сухих пятен крови. Это позволит исключить крайне болезненную и опасную процедуру, используемую в настоящее время -забор венозной крови в объеме 5-10 мл, и облегчит сбор и транспортировку образцов из отдаленных регионов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическая модель антигенной структуры белка OspA американских и российских штаммов В. burgdorferi по данным эпитопного картирования методом конкурентного ЛИФА с использованием панели МКА.

2. Метод индикации возбудителей БЛ в лабораторных и полевых материалах.

3. Методика выявления возбудителей БЛ и КЭ в одном клеще.

4. Метод серодиагностики БЛ на основе выявления IgG и IgM антител в сыворотках и сухих пятнах крови пациентов.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Россия, г. Новосибирск, 1998), на VIII международной конференции «Lyme Borreliosis and other Emerging Tick-Borne Diseases» (Германия, г. Мюнхен, 1999). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова и на Научно-техническом совете Государственного Научного Центра ГосНИИ биологического приборостроения МЗ РФ. По материалам диссертации опубликовано 4 и принята в печать 1 работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена в одном томе на 206 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследований», 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 40 таблицами, 33 рисунками. Библиография включает 49 российских и/80 зарубежных публикаций.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Садыкбекова, Роза Куанышкалиевна

ВЫВОДЫ

1. Проведено эпитопное картирование поверхностного белка OspA Borrelia burgdorferi с помощью панели моноклональных антител и метода конкурентного лантанидного иммунофлуоресцентного анализа путем оценки степени конкуренции меченых ионами европия и немеченых антител за места связывания на антигенных детерминантах, что позволило расширить существующие научные представления об антигенной структуре белка OspA и было практически реализовано в качестве основы для разработки тест-систем для диагностики болезни Лайма.

2. Предложена модель антигенной структуры белка OspA B.burgdorferi. Показано, что американские штаммы B.burgdorferi sensu stricto содержат 2 основных (консервативный и вариабельный) антигенных сайта ADI и ADII, расположенных соответственно в N- или С-половине белковой молекулы, и несколько минорных антигенных детерминант. Выявлены различия в локализации и степени перекрывания эпитопов на поверхности белка OspA изолированного и в составе цельных боррелий. Показано, что в отличие от американских штаммов, европейские штаммы B.afzelii содержат лишь консервативный эпитоп ADI.

3. На основе моноклональных антител и метода ЛИФА разработаны группоспецифические тест-системы для выявления поверхностного белка OspA B.burgdorferi в лабораторных и полевых о материалах с чувствительностью 5-10 нг/мл или (2-5)* 10 боррелий/мл. Установлено, что для детекции американских штаммов возбудителя тест-системы должны включать пары МКА к обоим мажорным антигенным сайтам ADI и ADII, тогда как для выявления европейских изолятов B.afzelii целесообразно использование МКА к сайту ADI в сочетании с поликлональными кроличьими антителами.

4. Разработана и практически применена для обследования природных очагов на территории Московской области методика выявления в одном клеще возбудителей болезни Лайма и клещевого энцефалита. Это позволило установить показатели зараженности клещей спирохетой B.burgdorferi (от 3,1 до 18%) и вирусом клещевого энцефалита (менее 1%) и существенно снизить трудоемкость эпидемиологических исследований.

5. Предложены и клинически апробированы иммуноферментная и иммунолюминесцентная тест-системы для серодиагностики болезни Лайма путем выявления специфических IgG и IgM антител в сыворотках крови пациентов. Показано, что при сопоставимой специфичности по сравнению с коммерческими тест-системами на основе реакции непрямой иммунофлуоресценции и твердофазного иммуноферментного анализа предложенные тест-системы характеризовались более высокой чувствительностью при выявлении антител у пациентов с клиническим диагнозом Лайм-боррелиоза (72-79%), особенно при выявлении антител класса IgM, что обусловливает перспективность их использования для диагностики ранних стадий заболевания.

6. Показана принципиальная возможность выявления антител в образцах сухих пятен крови с помощью предложенных тест-систем на основе твердофазного иммуноферментного анализа и лантанидного иммунофлуоресцентного анализа с чувствительностью и специфичностью, сопоставимыми с достигаемыми при анализе сывороточных образцов. Применение такого подхода позволяет исключить травматичную процедуру забора венозной крови у пациентов, значительно облегчает сбор, транспортировку и хранение клинических образцов и является основой для проведения широких сероэпидемиологических исследований в природных очагах возбудителя болезни Лайма.

Заключение

Проведена разработка тест-систем для определения антител классов IgM и IgG методами ЛИФА и ТИФА. Определен состав тест-систем и оптимизированы условия иммуноанализа, обеспечивающие достижение максимальной чувствительности и специфичности.

В опытах титрования положительной сыворотки установлено, что ЛИФА является более чувствительным методом по сравнению с ТИФА: при выявлении IgG антител в 8 раз, при выявлении IgM антител в 4 раза. Это вывод был подтвержден при тестировании клинических образцов, включающих сыворотки крови от пациентов с диагнозом Лайм-боррелиоза и от контрольной группы пациентов с заболеваниями иной этиологии. Преимущества ЛИФА были особенно очевидны при выявлении антител на ранних стадиях заболевания, прежде всего антител IgM класса. Обе разработанные тест-системы характеризовались более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с НРИФ на основе коммерческого антигена штамм Ip-21 B.afzelii и коммерческой ТИФА тест-системы на основе штамма ВЗ1 В. burgdorferi s.s.

При оценке целесообразности использования различных штаммов В. burgdorferi в составе тест-систем (штаммы G39/40 и ВЗ 1 В. burgdorferi s.s., штамм Ip-21 B.afzelii) было установлено, что максимальная чувствительность достигалась при использовании штамма G39/40, хотя штамм G39/40 относится к американскому геновиду B.burgdorferi sensu stricto, а анализируемые сыворотки принадлежат больным Российской Федерации, где, как известно, циркулируют в основном геновиды B.afzelii и B.garinii. Таким образом, нами, как и многими другими европейскими исследователями было показано, что для серодиагностики в России может быть использован любой геновид Borrelia. Более

163 высокая чувствительность серотестов при использовании растворимого антигена G39/40 по сравнению с корпускулярными антигенами В31 и Ip-21, по-видимому, связана с большей доступностью эпитопов при использовании в солюбилизированной форме бактериального антигена.

Показана принципиальная возможность детекции антител в образцах сухих пятен из цельной крови пациентов с чувствительностью, сопоставимой с анализом сывороточных образцов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В связи с обширным нозоареалом инфекции, высоким уровнем заболеваемости населения и тяжестью клинического течения, иксодовые клещевые боррелиозы (болезнь Лайма) представляют актуальную проблему современной инфекционной патологии. Одной из важнейших составляющих проблемы является правильная и своевременная диагностика БЛ. Сложность диагностики БЛ обусловлена широким клиническим полиморфизмом, особенностями иммунного ответа, антигенной и генетической вариабельностью штаммов возбудителя, возможностью одновременной циркуляции нескольких геновидов В. burgdorferi s.l. в одном очаге.

Для решения существующих проблем диагностики болезни Лайма чрезвычайно актуальна разработка высокочувствительных и высокоспецифичных тестов дифференциальной диагностики, учитывающих региональные особенности возбудителя - спирохеты В.burgdorferi', с точки зрения массовых скрининговых исследований, тесты должны быть высокочувствительными, высокоспецифичными, высокопроизводительными, доступными, простыми в техническом выполнении, автоматизированными и безопасными для исследователей.

В настоящее время лабораторная диагностика болезни Лайма включает антигенную диагностику, предназначенную для выявления антигенов спирохеты В.burgdorferi в биологическом и клиническом материале, и серологическую диагностику, направленную на выявление специфических антител к возбудителю в биологических средах организма человека (кровь, ликвор, синовиальная жидкость).

В качестве биологических материалов для выявления боррелий используются клещи-переносчики в популяции которых персистирует возбудитель, или органы мелких грызунов. Для проведения антигенной диагностики применяются как традиционные микробиологические (темнопольная микроскопия и изоляция возбудителя на селективных питательных средах), так и новые, основанные на молекулярных взаимодействиях, методы - твердофазный иммуноферментный анализ, лантанидный иммунофлуоресцентный анализ и метод полимеразной цепной реакции.

Безусловно, наиболее чувствительным методом является ПЦР, который позволяет определить ДНК боррелий различных геновидов в биологическом материале (клещ, кожный биоптат, кровь, моча, ликвор, синовиальная жидкость) [165, 166, 188].

Однако, метод имеет ряд существенных недостатков и применяется в основном для исследовательских целей. В частности, полимеразная цепная реакция ингибируется некоторыми веществами, входящими в состав биологических образцов - агаром [105] или компонентами крови млекопитающих [187], что может привести к ложноотрицательным результатам анализа. Кроме того, высочайшая чувствительность метода ПЦР, когда для инициации каскадной полимеразной реакции достаточно наличие одной «правильной» молекулы ДНК, может привести к ложноположительным результатам за счет контаминации биологического образца [165, 188].

Антигенная диагностика БЛ на основе иммунохимических методов базируется на выявлении специфических белков в биологическом или клиническом материале. Для повышения чувствительности и специфичности тест-систем обычно используют моноклональные антитела, выявляющие различные эпитопы на поверхности антигена [12, 47, 77, 82, 83, 140].

Среди методов иммунохимического анализа указанным требованиям в наибольшей степени отвечает лантанидный иммунофлуоресцентный анализ с временным разрешением, преимуществами которого являются минимальное повреждающее воздействие метки на нативную структуру антител, что обусловливает высокую специфичность взаимодействия меченых антител с антигенными детерминантами возбудителей, стабильность меченых реагентов. Благодаря длительному времени жизни люминесценции, большому стоксовскому сдвигу между длинами волн возбуждения и люминесценции, сигнал регистрируется в режиме временного разрешения, что позволяет существенно повысить чувствительность метода за счет снижения уровня неспецифической фоновой люминесценции. Теоретическая чувствительность ЛИФА достигает 10"14 М [35, 193, 198]. Это обусловило выбор ЛИФА для разработки индикационных тест-систем при выполнении настоящей работы.

По данным литературы, наиболее перспективным для разработки иммунохимических тест-систем является белок OspA, который является основным по количеству видоспецифическим, высоко вариабельным и иммуногенным белком B.burgdorferi, входящим в состав практически всех геновидов [210].

В связи с этим, разработка индикационных тест-систем должна базироваться на изучении антигенной структуры этой белковой молекулы у различных геновидов B.burgdorferi s.l.

К настоящему времени для изучения структуры и функций белка OspA B.burgdorferi описано использование нескольких панелей МКА, что позволило установить значительную антигенную вариабельность американских и европейских штаммов боррелий [68, 219]. Наиболее широкая панель МКА (14 клонов) к OspA B.burgdorferi s.s. (штамм 297) была получена д-ром Д. Букер и охарактеризована д-ром А. Коззолино [88] по эпитопной специфичности, что позволило сгруппировать исследованные антитела в 7 групп по степени реактивности с американскими и европейскими штаммами боррелий. Вместе с тем, несмотря на большое количество накопленных сведений, в литературе не описана гипотетическая модель антигенной структуры белка OspA, в связи с чем, мы провели ряд собственных исследований в этом направлении.

Цель предпринятых нами исследований заключалась в проведении эпитопного картирования белка OspA на основе разработки конкурентного методического подхода [118], использующего конкуренцию меченых ионами Ей-4" и немеченых моноклональных антител за места связывания на антигенных детерминантах белка OspA. Для проведения этих исследований использовали панель из 14 указанных выше моноклональных антител, полученных в лаборатории д-ра Д. Букер в Медицинском Колледже штата Нью-Йорк. Для количественной оценки степени конкуренции был использован лантанидный иммунофлуоресцентный анализ [198].

Конкурентный анализ является удобным методическим подходом для эпитопного картирования белков [118]. Основным условием его использования является факт структурной тождественности меченых и немеченых моноклональных антител, конкурирующих за места связывания на антигене. С этой точки зрения лантанидные метки имеют несомненные преимущества по сравнению с используемыми в других типах анализа (радиоиммунологический, иммуноферментный), так как оказывают минимальное повреждающее воздействие на нативную структуру антител вследствие малых размеров молекул, мягкой процедуры мечения, а также при хранении коньюгатов [35, 193, 198].

С помощью конкурентного ЛИФА было показано, что на поверхности изолированного OspA имеются по крайней мере два основных эпитопа: консервативный ADI и вариабельный ADII, что полностью согласуется с известными из литературы данными [68, 211, 219]. На поверхности изолированного OspA и в составе B.burgdorferi s.s. локализованы две основные и несколько минорных антигенных детерминант (рис. 4, таблица 12). В составе нативной структуры мажорные антигенные детерминанты частично перекрываются между собой и другими минорными антигенными детерминантами OspA, что согласуется с данными литературы о необходимости поддержания нативной конформации белка OspA для полноценной реализации его свойств [102, 145]. На поверхности OspA B.afzelii удалось выявить только один основной консервативный эпитоп (ADI), хотя по данным литературы [219], на поверхности белковой молекулы могут быть расположены по крайней мере два эпитопа. По-видимому, использованная нами панель моноклональных антител является неполной и вследствие этого не позволяет определить второй эпитоп для этого геновида.

Очень сходные результаты эпитопного картирования были получены д-ром Коззолино [88], который использовал метод иммуноблота и генно-инженерные конструкции белка OspA. Было показано, что МКА D6, Е6, F6 и Fl 1 формируют эпитопную группу и взаимодействуют с С-концом OspA (а.к. 201-273). Согласно полученным нами результатам (таблица 12), эти указанные МКА сформировали детерминанту ADII. Остальные 10 МКА по данным Коззолино [88] взаимодействуют с N-концевой (а.к. 16-105) и центральной третью (а.к. 108-168) OspA, адсорбируясь в некоторых случаях как на одну, так и на другую часть этой молекулы. По-видимому, указанные области молекулы OspA сближены и участвуют в формировании основной антигенной детерминанты ADI, так и минорных эпитопов ADIII-ADVII.

В некоторых случаях имеет место отсутствие симметрии в перекрывании антигенных детерминант в составе цельной боррелии B.burgdorferi s.s. (штамм 297). Например, антигенная детерминанта ADIII частично перекрывается с антигенной детерминантой ADII процент конкуренции С=61%, таблица 8), но обратный эффект отсутствует - антигенная детерминанта ADII не перекрывается с ADIII (С=10,9%). Аналогично ADVI перекрывается с ADIII (С=42,3%), но ADIII не перекрывается с ADVI (С=2,2%). Такая ассиметрия во взаимодействии антигенных детерминант хорошо известна по данным литературы [118] и может быть объяснена следующим. Во-первых, область молекулы, рассматриваемая в качестве «антигенной детерминанты», может включать не 5-6 аминокислотных остатков, с которыми взаимодействует индивидуальное МКА, а гораздо более протяженную область. Моноклональные антитела, входящие в одну эпитопную группу, могут взаимодействовать с различными участками этой области, стерически перекрывая, или не перекрывая, соседнюю детерминанту. Во-вторых, известно, что взаимодействие моноклонального антитела с антигенной детерминантой может воздействовать на пространственную структуру белковой молекулы-антигена. Такое воздействие может приводить к опосредованному структурному «перекрыванию» антигенных детерминант, когда взаимодействие МКА с одной из антигенных детерминант приводит к изменению структуры и реакционной способности другой. Этими двумя эффектами можно вполне объяснить наблюдаемое нами отсутствие «симметрии» во взаимодействии соседних антигенных детерминант на молекуле OspA.

С учетом полученных научных данных об эпитопной специфичности исследованной панели МКА были разработаны группоспецифические тест-системы для индикации и дифференциации американских и европейских штаммов B.burgdorferi.

Анализ 64 вариантов построения тест-систем с использованием различных сочетаний МКА к OspA и поликлональных кроличьих антител позволил установить, что для выявления американских штаммов

В. burgdorferi s.s. (297, B31) наиболее эффективны тест-системы на основе МКА к различным антигенным сайтам; наиболее сильная реакция при выявлении обоих штаммов наблюдалась в тест-системах, включающих МКА Е6 (сайт ADII OspA) в качестве улавливающих и меченые хелатом европия МКА D8 (сайт ADI OspA) в качестве детекторных (рис. 15, 16, таблица 12). Для выявления российских изолятов B.afzelii целесообразно использование МКА D8, А1\ или СЗ (все к сайту ADI) в сочетании с поликлональным кроличьим коньюгатом (рис. 14, таблица 12). Чувствительность детекции американских и российских штаммов в этих вариантах тест-систем, в том числе по данным шифрованного опыта (рис. 17-20), составила 5-10 нг/мл, что о соответствует приблизительно (2-5)х10 боррелиям/мл.

Таким образом, проведенные нами исследования по эпитопному картированию поверхностного белка OspA В.burgdorferi с помощью разработанного методического подхода на основе конкурентного ЛИФА и панели МКА, позволили получить данные о числе и локализации антигенных детерминант на поверхности белковой молекулы и выявить различия в локализации эпитопов на поверхности изолированного OspA и в составе нативной бактерии. Эти исследования являются первым шагом на пути изучения антигенной структуры белковой молекулы и свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших исследований. Для построения уточненной модели антигенной структуры белка OspA В. burgdorferi на основе эпитопного картирования методом конкурентного анализа необходимо включение в исследование максимально полных панелей МКА (в том числе полученных к российским вариантам боррелий); существенное расширение номенклатуры анализируемых штаммов, прежде всего, за счет включения изолятов B.garinii, которые мы не изучали в нашей работе и которые, согласно данным литературы, характеризуются наибольшей изменчивостью.

Разработанные тест-системы были использованы для детекции B.burgdorferi в полевых материалах при эпидемиологическом мониторинге природных очагов Лайм-боррелиоза.

Оценка эпидемиологической опасности территорий Московской области по Лайм-боррелиозу весьма актуальна вследствие высокой численности населения и сравнительно высокой заболеваемости на фоне продолжающегося интенсивного освоения территорий. При этом важной составляющей является оценка зараженности клещей.

В России для эпидемиологического мониторинга применяется чувствительный, но достаточно трудоемкий метод темнопольной микроскопии. Кроме того, с помощью ТПМ невозможно идентифицировать геновид боррелий и оценить патогенные свойства возбудителя, а правильная интерпретация результатов ТПМ требует специального опыта исследователя.

Для выявления B.burgdorferi s.l. в лабораторных и полевых клещах мы использовали тест-систему на основе МКА D8 и ПКА, меченых хелатом европия. Возможность использования этой тест-системы предварительно оценивали при анализе 3 групп лабораторных клещей I.persulcatus, экспериментально зараженных B.burgdorferi s.l. (суспензией полевых клещей, собранных в Московской области в 1997 году) с различной степенью зараженности по данным ТПМ (таблица 18). Данные этих опытов показали, что методы ЛИФА и ТПМ (таблица 19, рис. 21) позволяют получить сопоставимые результаты детекции B.burgdorferi s.l. Это явилось предпосылкой для последующего использования указанной тест-системы для выявления боррелий в полевых клещах.

В связи существованием сочетанных очагов возбудителей БЛ и КЭ и возможностью микстинфицирования иксодовых клещей, мы разработали методику ЛИФА для выявления В. burgdorferi и вируса КЭ в одном клеще с применением реакционных буферов различного состава для экстракции антигенов возбудителей (таблица 22, рис. 22). Применение этой методики для обследования природных очагов на территории Московской области в эпидсезоны 1999-2000 гг позволило установить зараженность клещей возбудителями БЛ и КЭ и существенно снизить трудоемкость исследований. Всего было обследовано 710 клещей. Результаты исследования клещей, собранных в эпидсезоны 1999-2000 гг., были сопоставимы, при этом зараженность полевых клещей боррелиями в отдельных районах Московской области составила от 3,1 до 18% (в целом по Московской области - 9%) (таблицы 26, 27); наиболее высокие показатели зараженности были отмечены в 1999 г. в Дмитровском районе.

При исследовании клещей на зараженность вирусом КЭ, за 2 эпидсезона было выявлено 5 зараженных клещей: 2 таежных клеща в Дмитровском районе в 1999 г. и 3 европейских лесных клеща в Ногинском районе в 1999 г. и 2000 г. (таблицы 26, 27). Таким образом, по Московской области степень зараженности составила менее 1%, что вполне укладывается в свойственную для европейской части картину [34].

Для постановки клинического диагноза болезни Лайма важное значение имеет выявление специфических антител к B.burgdorferi в сыворотках крови пациентов.

В России диагноз болезни Лайма устанавливается в основном на основе клинических симптомов и результатов выявления специфических антител к B.burgdorferi s.l. в сыворотках крови пациентов методом непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ), разработанного НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

За рубежом основными методами серодиагностики являются более чувствительный твердофазный иммуноферментный анализ и иммуноблотинг. При постановке этих методов основное внимание должно уделяться правильному выбору антигена, на который адсорбируются специфические антитела, содержащиеся в крови пациента. В методе ТИФА в качестве антигена обычно используется либо цельная боррелия, либо изолированные из этой боррелии белки [149]. В методе иммуноблота антитела, содержащие в сыворотке пациента, реагируют с бактериальными белками после их разделения в SDS-полиакриламидном геле и переноса на нитроцеллюлозную подложку.

Зарубежные коммерческие тест-системы являются дорогостоящими и не всегда отвечают необходимым требованиям, так как большинство тестов остаются не стандартизованными и рекомендуются только для научных исследований. В связи с этим, особенно актуальна разработка высокочувствительных и высокоспецифичных серодиагностических тестов для выявления специфических антител к B.burgdorferi в сыворотках крови пациентов.

Это обусловило направленность проведения нами исследований на разработку тест-систем на основе ЛИФА и ТИФА и последующую сравнительную оценку чувствительности разработанных и коммерческих тест-систем. В ходе разработки тест-систем основное внимание было обращено на решение следующих задач: выбор метода, определение выбора антигенов, оптимизация методик проведения иммуноанализа, возможность использования сухих пятен крови.

В связи с тем, что общепринятые критерии диагностики БЛ пока не сформулированы, многие зарубежные и российские исследователи для подтверждения заболевания руководствуются рекомендациями Центра по контролю и профилактике заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Атланта, США) и собственными критериями.

Для оценки результатов анализа в разработанных нами тест-системах мы использовали рекомендации, предложенные CDC и д-ром Дресслером [208], при этом в качестве порогового уровня брали величину, превышающую на 3 5 среднее значение сигналов от отрицательных контролей.

В опытах по титрованию положительной сыворотки крови пациента с диагнозом БЛ была установлена более высокая чувствительность ЛИФА тест-систем по сравнению с ТИФА: при выявлении IgG антител в 8 раз, при выявлении IgM - в 4 раза (рис. 26, 27). Эти результаты были подтверждены при последующей расширенной клинической апробации тест-систем.

При тестировании сывороток крови пациентов с клиническим диагнозом БЛ, полученных из Института ревматологии от больных на разных стадиях заболевания и от больных контрольной группы с заболеваниями иной этиологии (группа 1) было установлено, что наиболее высокой чувствительностью и специфичностью характеризовался ЛИФА: 79 и 100%, соответственно, по сравнению с 53 и 100% для НРИФ и 70 и 91,4% для ТИФА (таблица 33). Частота выявления антител всеми методами зависела от стадии заболевания и была максимальной при исследовании образцов, собранных на поздней стадии болезни. Эти результаты согласуются с данными литературы о слабой выраженности гуморального иммунного ответа на ранних стадиях заболевания [94]. Вместе с тем, методом ЛИФА выявлялось больше пациентов с ранней стадией заболевания, особенно, при выявлении IgM антител (таблица 34), что определяет перспективность его использования для диагностики «ранних» больных БЛ.

При тестировании сывороток крови пациентов с клиническим диагнозом БЛ из городской клинической инфекционной больницы №1 (группа 2) также были подтверждены данные о более высокой чувствительности тест-систем на основе лантанидного иммунофлуоресцентного анализа. Методом ЛИФА антитела были выявлены у 73 (79%) пациентов, при использовании французской коммерческой иммуноферментной тест-системы «PLATELIA®LYME» (фирмы «Diagnostics Pasteur») - у 62 (67%), при использовании разработанного ТИФА - у 66 (72%) (таблица 35). В целом, отмечалась высокая степень корреляции между результатами выявления антител обоих классов в сыворотках крови пациентов в разработанных нами ЛИФА и ТИФА тест-системах (рис. 28, 29).

С точки зрения чувствительности и специфичности тест-систем при выявлении антител, мы оценили эффективность использования в качестве антигенов цельных или разрушенных боррелий. По данным литературы [149], при использовании в качестве антигенов цельных или разрушенных боррелий, а также боррелий любого геновида [158, 225], обычно получают сопоставимые результаты. При проведении собственных исследований максимальная чувствительность при выявлении антител в 1 и 2 группах пациентов (в пределах 70 и 72%, соответственно) была установлена при использовании штамма G39/40 (B.burgdorferi s.s.), что, по-видимому, было связано с большей доступностью антигенов этого штамма, используемого в виде солюбилизированного препарата (рис. 31, 32, таблицы 36, 37). При использовании цельных суспензий штаммов Ip-21 и В31 чувствительность выявления антител была немного ниже: 68 (группа 1) и 67% (2) для Ip-21 СB.afzelii) и 59 (1) и 60% (2) для В31 (В.burgdorferi

S.S.).

Сравнительная оценка чувствительности методов НРИФ, французской коммерческой иммуноферментной тест-системы и разработанных нами методов на основе ЛИФА и ТИФА при выявлении антител у больных показала, что использование более чувствительного метода ЛИФА позволяет выявить антитела у 79% больных с клиническим диагнозом БЛ по сравнению с 53% в НРИФ и 67% во французской ТИФА тест-системе (рис. 31 и 32).

Для массового обследования населения на БЛ описано применение высушенных на фильтровальной бумаге пятен крови, которые исследуются методом НРИФ [23]. Основой применения такого подхода являются данные о стабильности IgM и IgG антител в сухих пятнах крови после нанесения крови на сорбент при хранении в течение месяцев при температуре 4°С [154, 207]. Для проведения анализа пригодны пробы крови, взятые из пальца на фильтровальную бумагу.

Для исследования пробы вырезают ножницами, измельчают и вымачивают в 0,95 мл физиологического раствора (примерно 8-10 ч) при температуре 4-6° С, затем промешивают пипетированием и отсасывают. Полученную жидкость в серологических реакциях используют как сыворотку, разведенную 1:20 [23]. Неудобство метода заключается в использовании предварительной экстракции биологического материала. В отличие от описанного способа, мы использовали "выбитые" из сухих пятен крови диски диаметром 3 мм, которые анализировали непосредственно в лунках планшета методами ТИФА и ЛИФА без предварительной экстракции антител.

Полученные данные продемонстрировали принципиальную возможность использования методов ТИФА и ЛИФА для определения специфических антител в сухих пятнах крови с чувствительностью

Ill сопоставимой с анализом сывороточных образцов (рис. 30, таблицы 2831). Эти результаты очень важны потому, что возможность использования вместо сывороток сухих пятен крови, с одной стороны, позволяет исключить возможную опасность инфицирования пациентов при заборе венозной крови, с другой стороны, решает проблему сбора, хранения и транспортировки образцов из отдаленных сельских районов. Эта работа имеет перспективное значение и поэтому, с нашей точки зрения, требует проведения дальнейших исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Садыкбекова, Роза Куанышкалиевна, 2001 год

1. Алексеев А.Н. Система клещ-возбудитель и ее эмерджентные свойства. СПб. - 1993. - С.204.

2. Алексеев А.Н., Арумова Е.А., Буренкова Л.А., Чунихин С.П. Об особенностях распространения возбудителя болезни Лайма и поведения зараженных им клещей рода Ixodes. // Паразитол. 1993. - Т.27. - № 6. -С.389-398.

3. Амосов М.Л., Лесняк О.М., Надеждина М.В., Бардина Т.Г. Клинические проявления клещевого энцефалита при его сочетании с Лайм-боррелиозом в остром периоде. // Актуальные проблемы природно-очаговых инфекций. Ижевск. 1998. - С.214-215.

4. Амосов М.Л., Лесняк О.М., Образцова Р.Г., Мельников В.Г., Бардина Т.Г., Андреева Е.А. Клиническая характеристика клещевого энцефалита при его сочетании с Лайм-боррелиозом. // Вопр. вирус. 2000. - №3. -С.25-28.

5. Ананьева Л.П. Боррелиоз Лайма и его ревматические проявления. // Автреф. дис. . докт. мед. наук. Москва. - 1999.

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. - 1962. - С.180.

7. Буссе Т.Л., Христова М.Л., Симонов В.И., Кущ А.А., Стаханова В.М., Харитоненков И.Г. Выявление антител к белку р24 ВИЧ в сыворотках крови человека методом лантанидного иммунофлуоресцентного анализа. // Вопр. вирусол. 1991. - №5. - С.361-364.

8. Васильева И.С. Паразитарная система болезни Лайма, состояние вопроса. Сообщение II. Позвоночные животные прокормители клещей и резервуары возбудителей. // Acarina. - 1998. - Т.6. - С.77-100.

9. Васильева И.С., Наумов Р.Л. Паразитарная система болезни Лайма, состояние вопроса. Сообщение I. Возбудители и переносчики. // Acarina. 1997. - Т.4. - С.53-75.

10. Горелова Н.Б. Музей боррелий Российского Центра по боррелиозам. // Проблемы клещевых боррелиозов. Под ред. Э.И. Коренберга. М. -1993. -С.31-37.

11. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. ВШ, М. 1991.

12. Кадошников Ю.П., Деменев В.А., Громашевский B.JL, Помелова

13. B.Г., Григорьев В.Б., Клименко С.М. Индикация арбовирусов методами электронной микроскопии. // Сб. Арбовирусы. М. - 1986. - С. 173-179.

14. Киселева Т.С. О клещевой эритеме. // Тез. обл. науч.-прак. конф. по клещевому энцефалиту. Пермь. - 1967. - С.42-43.

15. Кисленко Г.С., Короткое Ю.С. Динамика зараженности таежного клеща возбудителем болезни Лайма в двух природных очагах Подмосковья. // 7 акарол. совещ. Тез. докл. СПб. 1999. - С.31.

16. Ковалевский Ю.В., Коренберг Э.И., Левин М.Л. Сезонная и годовая вариабельность зараженности клещей Ixodes persulcatus и I.ricinus возбудителем болезни Лайма. // Проблемы клещевых боррелиозов. Под ред. Э.И. Коренберга. М. - 1993. - С.137-146.

17. Коренберг Э.И. Проблема болезни Лайма в России. // Проблемы клещевых боррелиозов. Под ред. Э.И. Коренберга. 1993. - С. 13-20.

18. Коренберг Э.И. Таксономия, филогенетические связи и области формообразования спирохет рода Borrelia, передающихся иксодовыми клещами. // Успехи современной биологии. 1996. - Т. 116. - Вып.4.1. C.389-406.

19. Коренберг Э.И. Инфекции группы Лайм боррелиоза иксодовые клещевые боррелиозы в России. // Мед. Паразитол. - 1996. - № 3. - С. 1418.

20. Коренберг Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы как группа заболеваний человека и главные итоги ее изучения в России. // Журн. инфек. патолог. 1996. - Т.З. - №4. - С.22-24.

21. Коренберг Э.И. Взаимоотношения возбудителей трансмиссивных болезней в микстинфицированных иксодовых клещах {Ixodidae). II Паразитол. 1999. - Т.ЗЗ. - Вып.4. - С.273-289.

22. Коренберг Э.И., Насонова В.А. // Методические указания по эпидемиологии, диагностике, клинике и профилактике болезни Лайма. -М., МЗ СССР.-1991.

23. Коренберг Э.И., Щербаков С.В., Баннова Г.Г. и др. Зараженность клещей Ixodes persulcatus возбудителями болезни Лайма и клещевого энцефалита одновременно. // Паразитология. 1990. - Т.24. - Вып.2. -С.102-105.

24. Крючечников В.Н., Горелова Н.Б., Щербаков С.В. Идентификация боррелий и изучение изолятов возбудителя болезни Лайма из России и сопредельных стран. // Проблемы клещевых боррелиозов. Под ред. Э.И. Коренберга. 1993. - С.45-54.

25. Лабзин В.В. Паразитирование на млекопитающих. // Кн. «Таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze». Л. Наука. - 1985. - С.291-307.

26. Лобзин Ю.В., Усков А.Н., Антонов B.C., Крумгольц В.Ф. Иксодовые клещевые боррелиозы: итоги и проблемы изучения. // Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Тез. докладов. СПб, Б.И. - 1999. - С.163-164.

27. Лобзин Ю.В., Усков А.Н., Козлов С.С. Лайм-боррелиоз (иксодовые клещевые боррелиозы). СПб. - 2000. - С. 160.

28. Машкиллейсон Л.Н. Хроническая мигрирующая эритема Афцелиуса-Липшютца. Частная дерматология. М. 1965. - С.252-256.

29. Мельникова Е.Э. Антигены арбовирусов для серологических реакций. // Сб. Арбовирусы. М. - 1986. - С.99-104.

30. Новолокин О.В., Субботина Л.С. Использование прямого иммуноферментного анализа для индикации и идентификации вируса клещевого энцефалита. // В кн: Актуальные проблемы медицинской вирусологии. М. - 1985. - С.45-46.

31. Наумов Р.Л., Гутова В.П. Географическая и годовая изменчивость зараженности иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита. // Мед. Паразитол. 1997. -№3. - С.346-355.

32. Помелова В.Г. Лантанидный иммунофлуоресцентный анализ: индикация вирусов, серодиагностика вирусных инфекций. // Вест. РАМН. 1999. - №8. - С.26-33.

33. Самсонов В.А., Шинский Г.Э., Шеклакова М.Н., Ватутина Н.А. Опыт лечения экстенциллином хронической мигрирующей эритемы Афцелиуса-Липшютца. // Вест.дерм.венерол. 1999. - №1. - С.8-10.

34. Соколова М.В., Помелова В.Г., Чудинов А.В., Гайдамович С.Я., Леонов С.В., Харитоненков И.Г., Быченкова Т.А., Буссел Е.П., Злобин

35. B.Н. Конструирование и апробация коньюгатов для постановки лантанидного иммунофлуоресцентного анализа. // Вопр. вирусол. -1991.-№2. С.140-142.

36. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М. - 1964. - С.365.

37. Филлипова Н.А. Таксономические аспекты переноса возбудителей болезни Лайма. // Паразитол. 1990. - № 24. - С.257-267.

38. Харитоненков И.Г., Леонов С.В., Чудинов А.В., Соколова М.В., Помелова В.Г., Злобин В.Н. Использование усиливающих растворов различного состава при постановке лантанидного иммунофлуоресцентного анализа. // Вопр. вирусол. 1991. - №3.1. C.247-250.

39. Alekseev A.N., Arumova Е.А., Vasilieva I.S. Borrelia burgdorferi sensu lato in the female cement plug of Ixodes persulcatus ticks (Acari, Ixodidae). II Exp. Appl. Acarol. 1995. - Vol.19. - №4. -P.519-522.

40. Alekseev A.N., Burenkova L.A., Vasilieva I.S. et al. Preliminary studies on virus and spirochete accumulation in the cement plug of ixodid ticks. // Exp. Appl. Acarol. 1996. - Vol.20. -P.713-723.

41. Gaidamovich S.J., Melnikova J.E., Gresikova M. et al. Two kinds of monoclonal antibodies to tick- borne encephalitis virus. // Acta virol. 1986. - Vol.30. - P.206-212 .

42. Korenberg E.I. Comparative ecology and epidemiology of Lyme disease and tick-borne encephalitis in the former Soviet Union. // Parasitol. Today. -1994.-Vol. 10.-№4.-P. 157-160.

43. Pomelova V.G., Gaidamovich S.Ya., Stephenson J.R. et al. Antigenic analysis of tick-borne encephalitis complex viruses by time-resolved fluoroimmunoassay with monoclonal antibodies. // J. Virol. Meth. 1991. -Vol.31.-P.293-300.

44. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. М.-Медиа Сфера. - 1998. - С.352.

45. Ackermann R., Kabatzki J., Boisten H.P., Steere A.C., Grodzicki R.L., Hartung S., Runne U. Ixodes ricinus spirochete and European erythema chronicum migrans disease. // Yale J. Biol. Med. 1984. - Vol.57. - P.573-580.

46. Afzelius A. Verhandlungen der Dermatologischen Gesellschaft zu Stockholm. // Arch. Derm. Syph. 1910. - Vol.101. - P.404.

47. Anderson J.F. Mammalian and avian reservoirs of Borrelia burgdorferi. II Ann. NY Acad. Sci. 1988. - Vol.539. - P. 188.

48. Anderson J.F. Epizootiology of Borrelia in Ixodes tick vectors and reservoir hosts. // Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol.2. - P.SI451.

49. Antibodies. // In: A Laboratory Manual (Harlow E., Lane D. eds), Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 1988. - P.726.

50. Asbrink E., Hovmark. Early and late cutaneous manifestations in Ixodes-borne borreliosis. // Ann. NY Acad. Sci. 1988. - Vol.539. - P.4.

51. Barbour A.G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. // Yale J. Biol. Med. 1984. - Vol.57. - P.521-525.

52. Barbour A.G. Plasmid analysis of Borrelia burgdorferi the Lyme disease agent. // J. Clin. Micro. 1988. - Vol.26. - P.475.

53. Barbour A.G. The molecular biology of Borrelia. II Rev. Inf. Dis. 1989. -Vol.11.-P.S1470.

54. Barbour A.G., Burgdorfer W., Grunwald E., Steere A.C. Antibodies of patients with Lyme disease to components of the Ixodes dammini spirochete. // J. Clin. Invest. 1983. - V.73. -P.504-515.

55. Barbour A.G., Garon C. Linear plasmids of the bacterium Borrelia burgdorferi have covalently closed ends. // Science. 1987. - Vol.237. -P.409.

56. Barbour A.G., Hayes S.F. Biology of Borrelia species. // Microbiol. Ref. 1986. - Vol.4. - №50. -P.381-400.

57. Barbour A.G., Hayes S.F., Heiland R.A., Schrumpf M.E., Tessier S.L. A Borrelia-specific monoclonal antibody binds to a flagellar epitope. // Infect. Immun. 1986. - Vol.52. - P.549-554.

58. Barbour A.G., Heiland R.A., Howe T.R. Heterogeneity of major proteinsin Lyme disease borreliae. // J. Infect. Dis. 1985. - Vol.152. -P.478-484.

59. Barbour A.G., Schrumpf M.E. Polymorphisms of major surface proteins of Borrelia burgdorferi. II Zentralbl Bakteriol. Hyg. (A). 1986. - Vol.263. -P.83-91.

60. Barbour A.G., Tessier S.L., Hayes S.F. Variation in a major surface protein of Lyme disease spirochetes. // Infect. Immun. 1984. - Vol.45. -P.94-100.

61. Barbour A.G., Tessier S.L., Todd W.J. Lyme disease spirochetes and ixodid tick spirochetes share a common surface antigenic determinant defined by a monoclonal antibody. // Infect. Immun. 1983. - Vol.41. - P. 795-804.

62. Berger В., Johnson R., Kodne C., Coleman L. Cultivation of Borrelia burgdorferi from erythema migrans lesions and perilesional skin. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. - P.359.

63. Bergstrom S., Bundoc V., Barbour A.G. Molecular analysis of linear plasmid encoded major surface proteins: OSP-A, OSP-B of Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. II Mol. Microbiol. 1989. - Vol.3. - P.479.

64. Brandt M.E., Riley В., Radolf J., Norgard M. Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins. // Infect. Immun. -1990.-Vol.58.-P. 983.

65. Brettschneider S., Bruckbauer H., Klugbauer N., Hofman H. Diagnostic value of PCR for detection of Borrelia burgdorferi in skin biopsy and urine samples from patients with skin borreliosis. // J. Clin. Microbiol. 1998. -Vol.36. -P.2658-2665.

66. Bruckbauer H., Preac-Mursic V., Fuchs R., Wilske B. Cross-reactive proteins of Borrelia burgdorferi. II Eur. J.Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1992. -Vol.ll.-P.l-9.

67. Bucher D.J. Chromatographic isolation of the major polypeptides of influenza virus.In:The Negative Strand Viruses (B.W.J. Mahy and R.D.Barry eds). // Academic Press, London.I. 1975. - Vol.1. - P. 133-143

68. Bucher D.J., Li L.-S.S., Kehoe J.M., Kilbourne E.D. Chromatographic isolation of the hemagglutinin polypeptides from influenza virus vaccine and determination of their amino terminal sequences. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1976. - Vol.73. - P.238-242

69. Burgdorfer W., Barbour A.G., Hayes S.F., Benach J.L., Grundwaldt E., Davis J.P. Lyme disease a tick-borne spirochetosis? // Science. - 1982. -Vol.216.-P.1317-1319.

70. Burgdorfer W., Barbour A.G., Hayes S.F., Peter O., Aeschlimann A. Erythema chronicum migrans a tick-borne spirochetosis. // Acta. Trop. -1983.-Vol.40.-P.79-83.

71. Burke W.A., Steinbaugh J.R., O'Keefe E.J. Lyme disease mimicking secondary syphilis. // J. AM. Acad. Dermath. 1986. - Vol.14. - P. 137-139.

72. Burkot Т., Patrican L., Piesman J. Field trial of an surface protein A (OspA) antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Borrelia burgdorferi in Ixodes scapularis. II J. Trop. Med. Hyg. -1994.-Vol.8.-P.354-358.

73. Burkot Т., Wirtz R., Luft В., Piesman J. An OspA antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for detecting North American isolates of Borrelia burgdorferi in larval and nymphal Ixodes dammini. II J. Clin. Micro. 1993.-Vol.31.-P.272-278.

74. Clover J.R., Lane R.S. Evidence implicating nymphal Ixodes pacificus (Acari: Ixodidae) in the epidemiology of Lyme disease in California. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1995. - Vol.53. - №3. - P.237-240.

75. Coleman L.A., Korenberg E.I., Johnson R.C. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates from Former Soviet Union. // Abstr. 95th General Meeting of the American Society for Microbiology. 1995. - P.254-255.

76. Comstock L., Fikrig E., Shoberg R., Flavell R., Thomas D. A monoclonal antibody to OspA inhibits the association of Borrelia burgdorferi with human endothelial cells. // Infect. Immun. 1993. - Vol.61. - P.423-431.

77. Cozzolino A.C. Antigenic structure of outer surface protein A (OSPA) of Borrelia burgdorferi and applications to direct antigen detection. Dissertation of PhD. NY Medical College. 1998.

78. Craft J.E., Grodzicki R.L., Steere A.C. Antibody response in Lyme disease: evaluation of diagnostic test. // J. Infect. Dis. 1984. - Vol.149. -P.789-795.

79. Dattwyler R.J. Specific immune response in Lyme Disease. Characterization of the T cell and В cell responses to Borrelia burgdorferi. II Ann. NY Acad. Sci. 1988. - Vol.539. - P.93.

80. Dorward D.W., Garon C. DNA is packaged within membrane-derived vesicles of gram negative but not gram positive bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol.56. - P.1960.

81. Dressier F., Whalen J., Reinhardt В., Steere A. Western blotting in the serodiagnosis of Lyme disease. // J. Infect. Dis. 1993. - Vol.167. - P.392-400.

82. Durray P., Steere A. Clinical pathologic correlations of Lyme disease by stage. // Ann. NY Acad. Science. 1989. - Vol.539. - P.65-79.

83. Eiffert H., Hanefeld F., Thomssen R., Chirsten H.-J. Reinfection in Lyme borreliosis. // Infection. 1996. - Vol.24. - P.437-439.

84. Eiffert H., Karsten A., Thomssen R., Christen H-J. Characterization of Borrelia burgdorferi strains in Lyme arthritis. // Scand. J. Infect. Dis. 1998. - Vol.30. - P.265-268.

85. Eiffert H., Ohlenbusch A., Christen H.-J., Thomssen R., Spielman A., Matuschka F.-R. Nondifferentiation between Lyme disease spirochetes from vector ticks and human cerebrospinal fluids. // J. Infect. Dis. 1995. -Vol.171.-P.476-479.

86. Engstrom S.M., Shoop E., Johnson R.C. Immimoblot interpretation criteria for serodiagnosis of early Lyme disease. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.419-427.

87. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. Isolation of pure IgGb IgG2a, and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose. // Biochemistry. 1978. - Vol.15. - P.429-436.

88. Fikrig E., Barthold S.W. Borrelia burgdorferi strain 25015: Characterization of outer surface protein A and vaccination against infection. II J. Immuno. 1992. - Vol.148. - P.2256.

89. Fingerle V., Hauser U., Liegl G., Petko В., Preac-Mursic V., Wilske B. Expression of outer surface proteins A and С of Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus. II J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. - P.1867-1869.

90. Fraser C.M., Casjens S., Huang W.M. et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. II Nature. 1997. - Vol.390. -P.580-586.

91. Galfre G., Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. // Method Enzyme. 1981. - Vol.73. - P.3-46.

92. Gibb A.P., Wong S. Inhibition of PCR by agar from bacteriological transport media. // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol.36. -№1. - P.275-276.

93. Ginsberg H.S., Ewing C.P. Habitat distribution of Ixodes dammini (Acari: Ixodidae) and Lyme disease spirocheteson Fire Island, New York. // J. Med. Entomol. 1989. - Vol.26. - №3. - P. 183-189.

94. Godfroid E., Hoyois В., Peter O. et al. Comparison of OspA gene sequences: a phylogenetic study. // VII Int. Congr. Lyme Borreliosis. San Francisco. California. Abstracts. 1996. -P.307.

95. Grodzicki R., Steere A.C. Comparison of immunoblotting and inderect enzyme-linked immunosorbent assay using different antigen preparations for diagnosing early Lyme disease. // J. Infect. Dis. 1988. - Vol.157. - P.790-797.

96. Grun H. Die experimentelle Ubertragung von Ruckfallfieber-Spirochate durch Ornithodorus moubata. // Z. Hyg. Infektionskr. 1950. - Vol.131. -P. 198-218.

97. Halonen P., Meurman O., Longren Т., Hemmila I., Soini E. Detection of viral antigens by time-resolved fluoroimmunoassay. // Curr. Topics Micro. Immunol. 1983. - Vol.104. - P. 133-146.

98. Hansen K., Asbrink E. Serodiagnosis of erythema migrans and acrodermatitis chronica atrophicans by the Borrelia burgdorferi flagellum enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol.27. -P.545-551.

99. Hansen K., Hindersson P., Pedersen N.S. Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in Lyme disease. // J. Clin. Microbiol. 1988. - V.26. - P.338-346.

100. Hansen К., Lebech A.-M. Lyme neuroborreliosis: a new sensitive diagnosis assay for intrathekcal synthesis of Borrelia burgdorferi specific immunoglobulin G, A, and M. // Ann. Neurol. - 1991. - Vol.30. - P. 197-205.

101. Hauser U., Lehnert G., Lobentanzer R., Wilske B. Interpretation criteria for standardized western blots for three European species of Borrelia burgdorferi sensu lato. // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol.35. - P. 1433-1444.

102. Hauser U., Lehnert G., Wilske B. Validity of interpretation criteria for standartized western blots (immunoblots) for the serodiagnosis of Lyme borreliosis based on sera collected throughout Europe. // J. Clin. Microbiol. -1999. Vol.37. - P.2241-2247.

103. Heinz F.X. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. // Adv. Virus. Res. 1986. - Vol.31. - P. 103-168.

104. Hellerstrom S. Erythema chronicum migrans Afzelii. //Acta. Derm. Venereol. 1930. - Vol.11. -P.315.

105. Hemmila I. Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. // Clin. Chem. 1985. - Vol.31. -P.359-370.

106. Hemmila I., Dakubu S., Mukkala J.V.-M., Siitari H., Longren T. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. //Anal. Biochem. 1984. - Vol.137. - P.335-343.

107. Hemmila I., Holttinnen S., Petterson K., Lovgren T. Double-label time-resolved immunofluorometry of lutropin and follitropin in serum. // Clin. Chem. 1987. - Vol.33. - P.2281-2283.

108. Hemmila I., Viljanen M., Lovgren T. // Lanthanides as Probes for Time-Resolved Fluorometric Immunoassays. Turku. - 1986.

109. Herxheimer К., Hartmann К. Acrodermatitis chronicum atrophicans. II Arch. Derm. Syph. 1902. - Vol.61. - P.57.

110. Herzer P., Wilske В., Preac-Mursic V., Schierz G., Schattenkirchner M., Zollner N. Lyme arthritis: clinical features, serological and radiographic findings of cases in Germany. // Klin. Wochenschr. 1986. - Vol.64. -P.206-215.

111. Horst H. Lyme gefahrdet naturfreunde und wanderer. Zecken als ubertrager ciner neuerforschten krankheit. // Naturschutz und Naturparke. -1988.-№129.-P.40-42.

112. Hovind-Hougen K. Ultrastructure of spirochetes isolated from Ixodes ricinus and Ixodes dammini. II Yale J. Biol. Med. -1984. Vol.57. - P.543-548.

113. Huang X., Yang X., Luft B.J., Koide S. NMR identification of epitopes of Lyme disease antigen OspA to monoclonal antibodies. // J. Mol. Biol. -1998. Vol.281. - № 1. - P.61 -67.

114. Hughs C., Johnson R. Methylated DNA in Borrelia species. // J. Bacteriol. 1990. - Vol.172. - P.6602.

115. Hulinska D., Jirous J., Valesova M., Herzogova J. Ultrastructure of Borrelia burgdorferi in tissues of patients with Lyme disease. // J. Basic Microbiol. 1989. - Vol.2. - P.73-83.

116. Hyde F.W., Johnson R. C. Characterization of circular plasmids for Borrelia burgdorferi, etiologic agent of Lyme disease. // J. Clin. Micro. -1988.-Vol.26.-P.2203.

117. Ito K., Oda M., Tsuji A., Maeda M. Simultaneous determination of alphafetoprotein, human chorionic gonadotropin and estriol in serum of pregnant women by time-resolved fluoroimmunoassay. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. - Vol.20. - P. 169-178.

118. Jiang W., Luft B.J., Munoz P., Dattwyler R.J., Gorevic P.D. Cross-antigenicity between the major surface proteins (ospA and ospB) and otherproteins of Borrelia burgdorferi. II J. Immunol. 1990. - Vol.144. - P.284-289.

119. Johnson R.C. The spirochetes. //Annu. Rev. Microbiol. 1977. -Vol.31.-P.89-106.

120. Johnson Y., Durray P., Steere A. Lyme arthritis spirochetes found in synovial microangiopathic lesions. //Am. J. Pathol. - 1985. - Vol.118. - P.26.

121. Johnson B.J., Robbins K.E., Bailey R.E., Cao B.L., Sviat S.L., Craven R.B., et al. Serodiagnosis of Lyme disease: accuracy of a two-step approach using a flagella-based ELISA and immunoblotting. // J. Infect. Dis. 1996. -Vol.174.-P.346-353.

122. Johnson R.C., Schmid G.P., Hyde F.W., Steigerwalt A.G., Brenner D.J. Borrelia burgdorferi sp. no v.: etiologic agent of Lyme disease. // Int. J. Syst. Bacteriol. -1984. Vol.34. - P.496-497.

123. Kalish R., Leong J., Steere A. Early and late antibody responses to full-length and truncated constructs of outer surface protein A of Borrelia burgdorferi in Lyme disease. // Inf. Immun. 1995. - Vol.63. - P.2228.

124. Kawabata H., Masuzawa Т., Yanagihara Y. Genomic analysis of Borrelia japonica sp. nov. Isolated from Ixodes ovatus in Japan. // Micro. Immunol. 1993. - Vol.37. - P.843.

125. Kharitonenkov I.G., Cozzolino A., Bucher D. Detection of surface antigen (OspA) of Borrelia burgdorferi by ELISA and TR-FIA. // Abstr. VI Internal Conference on Lyme Borreliosis, Bologna, Italy, June 19-22. Abstr. 1994. -№P101T.

126. Klaviter E.C., Johnson R.C. Isolation of the outer envelope, chemical components, and ultrastructure of Borrelia hermsii grown in vitro. //Acta. Trop. -1979. Vol.36. -P.123.

127. Kohler D., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature. 1975. - Vol.256. - P.495- 497.

128. Lane R.S., Piesman J., Burgdorfer W. Lyme Borreliosis: relation of its causative agent to its vectors and hosts in North America and Europe. // Annu. Rev. Entomol. 1991. - V.36. - P.587-609.

129. Li H., Dunn J.J., Luft B.J., Lawson C.L. Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol.94. - P.3584-3589.

130. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurment with the Folin phenol reagent // J. Biol.Chem. 1951. - Vol.193. -№1. - P.265-275.

131. Luger S., Krauss E. Serologic tests for Lyme Disease: Interlaboratory variability. // Arch. Intern. Med. April. - 1990.

132. Ma J., Gingrich-Baker C., Franchi P.M., Bulger P., Coughlin R. Molecular analysis of neutralizing epitopes on outer surface proteins A and В of Borrelia burgdorferi. // Infect. Immun. 1995. - Vol.63. - P.2221-2227.

133. Magnarelli L.A., Anderson J.F. Enzyme-linked immunosorbent assays for detection of class-specific immunoglobulins to Borrelia burgdorferi. // An. J. Epidemiol. 1988. - Vol.127. -P.818-825.

134. Magnarelli L.A., Anderson J.F., Johnson R.C. Cross-reactivity in serological tests for Lyme disease and other spirochetal infections. // J. Infect. Dis. 1987. - V.156. - P.183-188.

135. Magnarelli L.A., Meegan J.M., Anderson J.F., Chappell W.A. Comparison of an indirect fluorescent antibody test with an enzyme-linked immunosorbent assay for serological studies of Lyme disease. // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol.20. - P. 181-184.

136. Montgomery R.R., Malawista S.E. Borrelia burgdorferi and the macrophage: routine annihilation but occasional haven? // Parasitology today.- 1994. Vol. 10. - №4. - P. 154-157.

137. Moody K.D., Barthold S.W., Terwilliger G.A. Lyme borreliosis in laboratory animals: effect of host species and in vitro passage of Borrelia burgdorferi. II Am. J. Trap. Med. Hyg. 1990. - Vol.43. - №1. - P.87-92.

138. Nocton J.J., Dressier F., Rutledge B.J., Rys P.N., Persing D.H., Steere

139. A.C. Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerase chain reaction in synovial fluid from patients with Lyme arthritis. // N. Engl. J. Med. 1994. -Vol.330. - P.229-234.

140. Norman G.L., Antig J.M., Bigaignon G., Hogrefe W.R. Serodiagnosis of Lyme borreliosis by Borrelia burgdorferi sensu stricto, B.garinii, and

141. B.afzelii western blots (immunoblots). // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34.- P.1732-1738.

142. Norris S.J., Howell J.K., Garza S.A., Ferdows M.S., Barbour A.G. High-and low-infectivity phenotypes of clonal populations of in v/Yrocultured Borrelia burgdorferi. II Infect. Immun. 1995. - Vol.63. - P.2206-2212.

143. Old I.G., Postic D., Baranton G. et al. Lyme on line: Borrelia burgdorferi infects the Internet. // VII Int. Congr. Lyme Borreliosis. San Fransisco. California. Abstracts. 1996. - P.319.

144. Oschmann P., Kraiczy P. Lyme-Borreliose und Friihsommer-meningoen-zephalitis. l.Auflage. - Bremen: Uni-Med. - 1998. - P. 136.

145. Padula S.J., Dias F., Sampieri A., Craven R.B., Ryan R.W. Use of recombinant OspC from Borrelia burgdorferi for serodiagnosis of early Lyme disease. //J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32. -№7. -P.1733-1738.

146. Patricia A.R., Tom G.S. Molecular biology of Borrelia burgdorferi. II Lyme disease. Eds: Coyle P.K., M.D. Mosby-Year Book. 1993. - P.8-15.

147. Persing D.H. Diagnostic molecular microbiology. Current challenges and future directions. // Diagn. Micro. Infect. Dis. 1993. - Vol.16. - P.l59.

148. Pfister H.-W., Wilske В., Weber K. Lyme borreliosis: basic science and clinical aspects. // Lancet. 1994. - Vol.343. - P.1013-1016.

149. Piesman J., Oliver J.R., Sinsky R.J. Growth kinetics of the Lyme disease spirichete (Borrelia burgdorferi) in vector ticks. // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1990.-Vol.42.-P.352-357.

150. Pollack R.J., Telford S.R.3d., Spielman A. Protection of mice against Lyme disease infection by ear punch biopsy. // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1991. Vol.45. - №3. - P.206-209.

151. Postic D., Korenberg E.I., Gorelova N., Kovalevski Y.V., Bellenger E., Baranton G. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incidence of mixed isolates. // Res. Microbiol. 1997. -Vol.148.-P.691-702.

152. Preac-Mursic V., Weber K., Pfister H.-W., Wilske В., Gross В., Baumann A., Prokop J. Survival of Borrelia burgdorferi in antibiotically treated patients with Lyme borreliosis. // Infection. 1989. - Vol.17. - P.355-359.

153. Preac-Mursic V., Wilske B. Flexible Schraubenbakterien Gatting Borrelia. И In: Burkhardt F. (Ed). Mikrobiologische Diagnostik. Thieme, Stuttgart, New York. - 1992. - P.289-295.

154. Priem S., Rittig M.G., Kamradt Т., Burmester G.R., Krause A. An optimized PCR leads to rapid and highly sensitive detection of Borrelia burgdorferi in patients with Lyme borreliosis. // J. Clin. Microbiol. 1997. -Vol.35.-P.685-690.

155. Ribeiro J.M.C., Mather T.N., Piesman J. et al. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). // J. Med. Entomol. 1987. - Vol.24. - №2. - P.201-205.

156. Roessler D., Hauser U., Wilske B. Heterogeneity of BmpA (P39) among European isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato and influence of interspecies variability on serodiagnosis. // J. Clin. Microbiol. 1997. -Vol.35. - P.2752-2758.

157. Rosa P., Schwan Т., Hogan D. Recombination between genes encoding major outer surface proteins A and В of Borrelia burgdorferi. II Mol. Micro. -1992.-Vol.6.-P.3031.

158. Russel H., Sampson J.S., Schmid G.P., Wilkinson H.W., Plikaytis B. Enzyme linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence assay for Lyme disease. //J. Infect. Dis. 1984. - Vol.149. - P.465-470.

159. Schmid G.P. DNA Characterization of the spirochete that causes Lyme disease. // J. Clin. Micro. 1984. - Vol.20. - P. 155.

160. Schmid G.P. The global distribution of Lyme disease. // Rev. Infect. Dis. 1985. - Vol.7. -P.41.

161. Schmidt B.L. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections. // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - Vol.10. - P. 185201.

162. Schubach W., Mudri S., Dattwyler R., Luft B. Mapping antibody-binding domains of the major outer surface membrane protein (OspA) of Borrelia burgdorferi. II Inf. Immun. 1991. - Vol.59. - P. 1911-1915.

163. Schwan Т., Burgdorfer W., Garon C. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. // Infect. Immun. 1988. - Vol.56. - P.1831-1836.

164. Schwan Т., Kime К., Schrumpf M., Сое J., Simpson W. Antibody response in White-Footed mice (Peromyscus leucopus) experimentally infected with the Lyme disease spirochete (Borrelia burgdorferi). // Infect. Immun. 1989. - Vol.57. - P.3445.

165. Schwartz I., Varde S., Nadelman R.B., Wormser J., Fish D. Inhibition of efficient polymerase chain reaction amplification of Borrelia burgdorferi DNA in blood-fed ticks. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol.56. - №3. -P.339-342.

166. Sears J., Fikrig E., Nakagawa Т., Deponte K., Marcantonio N., Kantor F., Flavell R. Molecular mapping of Osp-A mediated immunity against Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme disease. // J. Immuno. 1991. -Vol.147.-P. 1995-2000.

167. Shanafelt M., Anzola J., Soderberg C., Yssel H., Turck C., Pelz G. Epitopes on the outer surface protein A of Borrelia burgdorferi recognized by the antibodies and T cells of patients with Lyme disease. // J. Immunol. -1992. Vol.148. -P.218.

168. Shin C.M., Pollack R.J., Telford S.R. 3d. et al. Delayed dissemination of Lyme disease spirochetes from the site of deposition in the skin of mice. // J. Infect. Dis. 1992. - Vol. 166. - №4. - P.827-831.

169. Protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium. // N Engl J Med. 1998.- Vol.339.-P.216-222.

170. Siitari H. Time-resolved fluoroimmunoassay for viral antigen and antibody detection. // Ph.D. dissertation. Turku University. Turku. Finland. -1990.

171. Siitari H., Hemmila I., Soini E., Lovgren Т., Koistunen V. Detection of hepatitis В surface antigen using time-resolved fluoroimmunoassay. // Nature (London). 1983. - Vol.301. - P.258-260.

172. Simpson W., Garon C., Schwan T. Analysis of supercoiled circular plasmids in infectious and non-infectious Borrelia burgdorferi. II Micro. Pathog. 1990. - Vol.8. - P. 109.

173. Simpson W.J., Schrumpf M.E., Schwan T.G. Reactivity of human Lyme borreliosis sera with a 39-kilodalton antigen specific to Borrelia burgdorferi. II J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.28. - P.1329-1337.

174. Soini E., Hemmila I. Fluoroimmunoassay: present status and key problems. // Clin. Chem. 1979. - Vol.25. - P.353-361.

175. Soini E., Kojola H. Time-resolved fluorometer for lanthanide chelates -a new generation of nonisotopic immunoassays. // Clin. Chem. 1983. -Vol.29.-P.65-68.

176. Spielman A. et al. Human babesiosis on Nantucket Island, USA: description of the vector, Ixodes (Ixodes) dammini, n. sp. (Acarina: Ixodidae). II J. Med. Entomol. 1979. -Vol.15. - P.218.

177. Stechenberg B.W. Lyme disease: the latest greatimitator. // Ped. Inf. Dis.- 1988. Vol.7. - P.402-409.

178. Steere A.C. Lyme arthritis: an epidemic of oligoarticular arthritis in children and adults in 3 Connecticut communities. // Arthritis Rheum. 1977. - Vol.20.-P.7.

179. Steere A.C. Erythema chronicum migrans and Lyme arthritis: the enlarging clinical spectrum. // Ann. Intern. Med. 1977. - Vol.86. - P.685.

180. Steere A.C. Medical progress Lyme disease. // N. Engl. J. Med. -1989.-Vol.321.-P.586-596.

181. Steere A.C., Grodzicki R.L., Kornblatt A.W., Craft J.E., Barbour A.G., Burgdorfer W., Schmid G.P., Johnson E., Malawista S.E. The spirochetal etiology of Lyme disease. // N. Engl. J. Med. 1983. -Vol.308. - P.733-740.

182. Torrella A., Solis R.L., Rodriguez N., Medina Y., Pita M., Perez I., Licourt N. Ultramicro ELISA to the detection of IgM antibodies in Mycobacterium leprae using dry blood samples. // Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 1994. - Vol.36. - P. 131-138.

183. Tugwell P., Dennis D.T., Weinstein A., Wells G., Shea В., Nichol G., Hayward R., Lightfoot R., Baker P., Steere A.C. Laboratory evaluation in the diagnosis of Lyme disease. // Ann. Intern. Med. 1997. - Vol.127. - №12. -P.l 109-1123.

184. Wallich R. Evaluation of genetic diversity among Borrelia burgdorferi isolates by use of OspA, fla, HSP60, and HSP70 gene probes. // Inf. Immun. -1992. Vol.60. - P.4856-4866.

185. Wilske В., Anderson J.F., Barbour A.G., Hovind-Hougen K., Johnson R.C., Preac-Mursic V. Taxonomy of Borrelia spp. // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 1991. - Vol.77. - P. 108-129.

186. Wilske В., Bader L., Pfister H.W., Preac-Mursic V. Diagnostik der Lyme-Neuroborreliose (Nachweis der intrathekalen antikorperbildung). // Fortschr. Med. 1991. - Vol.109. - P.441-446.

187. Wilske В., Fingerle V., Hauser U., Rossler D. Borrelien. // Diagnostische Bibliothek. 1997. - Vol.48. - P. 1-12.

188. Wilske В., Fingerle V., Herzer P., Hofmann A., Lehnert G., Peters H., Pfister H.-W., Preac-Mursic V., Soutschek E., Weber K. Recombinant immunoblot in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. // Med. Microbiol. Immunol. 1993. - Vol.182. - P.255-270.

189. Wilske В., Preac-Mursic V. Microbiological diagnosis of Lyme borreliosis. // In: K. Weber, W. Burgdorfer (Eds). Aspects of Lyme borreliosis. Springer-Verlag. 1993. -P.267-299.

190. Wilske В., Preac-Mursic V., Fuchs R., Bruckbauer H., Hofmann A., Zumstein G., Jauris S., Soutschek E., Motz M. Immunodominant proteins of

191. Borrelia burgdorferi', implications for improving serodiagnosis of Lyme borreliosis. In: Neu HC (eds) New antibacterial strategies. Churchill Livingstone, London. //Microbiol.diagnosis ofL.B. 1990. -P.299.

192. Wilske В., Preac-Mursic V., Schierz G. Antigenic heterogeneity of European Borrelia burgdorferi strains isolated from patients and ticks. // Lancet. 1985. - Vol.1. - P. 1099.

193. Wilske В., Preac-Mursic V., Schierz G., Busch K. Immunochemical and immunological analysis of European Borrelia burgdorferi strains. // Zentralbl Bakteriol. Hyg. (A). 1986. - Vol.263. - P.92-102.

194. Wilske В., Preac-Mursic V., Schierz G., Kuhbeck R., Barbour A.G., Kramer M. Antigenic variability of Borrelia burgdorferi. II Ann. NY. Acad. Sci. 1988. - Vol.539.-P. 126-143.

195. Wilske В., Schierz G., Preac-Mursic V., Weber K., Pfister H.W., Einhaupl K. Serological diagnosis of erythema migrans disease and related disorders. // Infection. 1984. - Vol.12. - P.331-337.

196. Xu Y., Kodner C., Coleman L., Johnson R.C. Correlation of plasmids with infectivity of Borrelia burgdorferi sensu stricto type strain B31. // Infect. Immun. 1996. - Vol.64. - P.3870-3876.

197. Zoeller L., Burkard S., Schaefer H. Validity of Western immunoblot band patterns in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. // J. Clin. Microbiol. -1991.-Vol.29.-P. 174-182.

198. Zoeller L., Haude M., Hassler D., Burkard S., Sonntag H.-G. Spontaneous and post-treatment antibody kinetics in late Lyme borreliosis. // Serodiagn. Immunoth. Inf. Dis. 1989. - Vol.3. - P.345-353.

199. Zung J.L. Fine structural evidence for penetration of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi through the gut and salivary tissues of Ixodes dammini. II Can. J. Zool. 1989. - Vol.67. - P. 1737.