Разнолигандные комплексы природных бактериохлоринов с металлами для комбинированной противоопухолевой терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Тихонов Сергей Иванович

• Тихонов Сергей Иванович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Тихонов Сергей Иванович

Оглавление

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ 6 Положения, выносимые на защиту

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Препараты на основе металлов

2.2. Механизмы активации металлокомплексов

2.3. Применение металлокомплексов в онкологии

2.3.1. Металлокомплексы платины

2.4.2. Металлокомплексы соединений золота

2.4.3. Металлоорганические соединения и комплексы олова (IV)

2.5. Особенности синтеза металлокомплексов

2.5.1. Особенности синтеза металлокомплексов золота (I)

2.5.2. Особенности синтеза металлокомплексов олова (IV)

2.6. Комбинированная терапия в онкологии 59 2.6.1. Сочетание фотодинамической терапии (ФДТ) с химиотерапией

3.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Препараты комбинированного действия

3.2. S-донорные комплексы золота (I) 66 3.2.1. Поэтапная сборка металлокомплексов Au (I) (путь 1)

3.2.3. Изучение биологической активности S-донорных комплексов золота (I) in vitro и in vivo

3.3. С-донорные комплексы золота (I)

3.3.1. Поэтапная сборка металлокомплексов Au (I) на молекуле ФС (путь 1)

3.3.2. Синтез С-донорных комплексов золота (I) с последующей конъюгацией с молекулой ФС (путь 2)

3.3.3. Изучение биологической активности C-донорных комплексов золота (I) in vitro и in vivo

3.4. N-донорные и O-донорные комплексы олова (IV)

3.4.1. Присоединение металлокомплекса олова (IV) к модифицированному ФС (путь 1)

86

3.4.2 Синтез аминокислотных комплексов олова (IV) и их бактериохлориновых

производных (путь 2)

3.4.3. Тест на связывание с ДНК 0-донорых комплексов олова (IV)

3.4.4. Изучение биологической активности конъюгатов дипропокси-БПИ с комплексами олова (IV) in vitro'

4.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Материалы и методы

4.2. Синтез

4.2.1. Получение тиолсодержащих производных дипропокси-БПИ 2a и 2b

4.2.2. Получение комплексов золота (I) на основе цистеина и аминоэтантиола

4.2.3. Получение конъюгатов комплексов золота (I) и дипропокси-БПИ

4.2.4. Получение гистидин и гистамин содержащих производных дипропокси-БПИ

4.2.4. Получение NHC-гистидин и NHC-гистаминсодержащих производных дипропокси-БПИ

4.2.5. Получение С-донорных комплексов золота (I) на основе NHC-гистидина и NHC-гистамина

4.2.6. Синтез конъюгатов С-донорных комплексов золота (I) и дипропокси-БПИ

4.2.7. Синтез аминокабоксилатного комплекса олова (IV)

4.2.8. Получение карбоксилатных комплексов парааминобензойной кислоты и а-Fmoc-s-Boc-Лизина

4.2.9. Получение конъюгатов карбоксилатных комплексов олова (IV) и дипропокси-БПИ

4.3 Молекулярный докинг комплексов олова (IV)

4.4 Тест связывания ДНК и комплексов олова (IV)

4.5. Приготовление мицеллярных растворов соединений 1, 3a,e, 6, 7a,b, 8a,b, 9a,b, 17,18,19,20

4.6. Исследования in vitro S-донорных комплексов золота (I)

4.7. Исследования in vitro C-донорных комплексов золота (I)

4.8. Исследования in vitro O-донорных комплексов олова (IV) 109 4.8.1. Исследования фотоиндуцированной и темновой цитотоксичности 109 4.8.2 Изучение внутриклеточного распределения

4.9. Исследования in vivo S-донорных комплексов золота (I)

4.10. Исследования in vivo C-донорных комплексов золота (I)

5.ВЫВОДЫ

6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

Ar - арильный заместитель

Cp* - циклопентадиенил

SAR - взаимосвязь структура-активность

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма

NADH - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма

GSH - глутатион, восстановленная форма

GSSG - глутатион, окисленная форма

ФС - фотосенсибилизатор

МОС - металлоорганические соединения

red/ox - окисление/восстановление

FDA - Food and Drug Administration

MW - молекулярный вес

NAD(P)H - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФТТ - фототермическая терапия

ФАХТ - фотоактивирующая химиотерапия

АФК - активные формы кислорода

CXCL10 - хемокин

ИК - инфракрасная спектроскопия

РНК - рибонуклеиновая кислота

МТТ - тест оценки метаболической активности с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-

2,5 - дифенил-тетразолиум бромида

IC50 - полуингибирующая концентрация

ИГК - иммуногенная гибель клеток

HSP - белки теплового шока

HMGB1 - высокоподвижные белки группы B1

IFN - интерферон

MDSCs - клетки супрессоров миелоидного происхождения CTLs - цитотоксические Т-лимфоциты CIK - цитокин-индуцированные киллеры TCR - T-клеточные рецепторы MHC - основной комплекс гистосовместимости

HNSCC - клеточная линия плоскоклеточного рака головы и шеи

CHO - клеточная линия нормальных яичников

Avp3 - белок интегрин

HDAC - кислотная гистондеацетилаза

EA.hy926 - эндотелиальные клетки пупочной вены человека

NHS - #-гидроксисукцинимид

NHC - ^-гетероциклический карбен

KCs - клетки Капфера

GLUT1 - транспортер глюкозы

AQP3 - акваглицеропорин

HEK29 - эмбриональной почки человека

ТРО - торможение роста опухоли

Balb/c - генетическая линия лабораторных мышей Bagg Albino C HUVEC - эндотелиальные клетками человека 518A2 - клетки меланомы

MDA-MB-231 - клетки модели рака молочной железы

PYTH - 2-меркаптопиридин

MPMTH - 2-меркапто-4-метилпиримидин

PMTZH - 2-меркаптобензотиазол

PMTH - 2-меркаптопиримидин

ТФФА - хлоридтрифенилфосфина золота^)

TRX - белок тиоредоксин

TRXR - белок тиоредоксинредуктаза

GR - глутатион редуктаза

АОС - антиоксидантная система

EMA - Европейское медицинское агенство

EEDQ - ^-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин

EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

DCC - 1,3 - дициклогексилкарбодиимид

DMSO d6 - д6 диметилсульфоксид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разнолигандные комплексы природных бактериохлоринов с металлами для комбинированной противоопухолевой терапии»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Ограниченные возможности существующих методов лечения онкологических заболеваний диктуют поиск новых путей воздействия на опухоли, в том числе, сочетание известных методов в онкологии. Химиотерапия является одним из первых и широко используемых методов лечения опухолей различных нозологий и локализаций. Цитостатики повреждают быстро пролиферирующие клетки опухоли, однако, клетки некоторых здоровых тканей, которые имеют физиологически обусловленную высокую частоту деления, тоже повреждаются под действием химиотерапии, вследствие чего наблюдаются побочные эффекты. В первую очередь это сказывается на короткоживущих гранулоцитах (нейтропения), тромбоцитах (тромбоцитопения) и, в конечном итоге, на эритроцитах (анемия). Бесплодие обусловлено торможением сперматогенеза или созревания яйцеклетки. Большинство цитостатиков влияют на метаболизм ДНК, поэтому имеется опасность повреждения генетического материала здоровых клеток - мутагенное действие. Всех вышеперечисленных побочных эффектов химиотерапии можно избежать если реализовать нацеливающее действие противоопухолевых средств. В начале ХХ века было обнаружено, что раковые клетки способны селективно удерживать и накапливать макрогетероциклические соединения - порфирины, а позже было установлено, что гидрированные аналоги порфиринов - хлорины и бактериохлорины - также обладают туморотропным действием.

Показано, что комбинированное лечение с использованием фотодинамической и химиотерапии, например, цисплатина, является более эффективным по сравнению с монотерапией. Важным является и тот факт, что предлагаемый вариант комбинированного лечения приводит к синергическому эффекту, снижая повреждающее действие цисплатина за счёт уменьшения его дозы без ущерба для эффективности проводимого лечения.

Другой подход к повышению эффективности противоопухолевой терапии связан с сочетанием в одном препарате фотодинамической субъединицы, представленной порфирином или его гидрированными аналогами, с химиотерапевтическим агентом, например, комплексами золота, олова, платины и др. Как было показано в работах по порфирин-цисплатиновым конъюгатам, последние проявляют синергический эффект.

Преимущества комбинированной терапии по сравнению с монотерапией заключаются в таргетной доставке химиопрепаратов в зону интереса за счет связи с порфирином, следствием чего является уменьшение терапевтической дозы препарата и снижение системной токсичности на организм. Еще одной проблемой химиотерапии является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток. Резистентность развивается по разным причинам: ослабление

захвата препарата клеткой, усиление защитного транспорта из клетки, например, усиление продукции P-гликопротеина, ослабление биоактивации пролекарства для перехода его в активную форму, повышение эффективности механизмов репарации ДНК при ее повреждении. В этом случае ФДТ уничтожает резистентные опухолевые клетки, выжившие после химиотерапии.

Настоящая работа по созданию препаратов комбинированного действия, содержащих как химиотерапевтические, так и ФДТ-агенты, является частью научных исследований, проводимых на кафедре химии и технологии биологически активных соединений, медицинской и органической химии имени Н.А. Преображенского института тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова Федерального государственного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА - Российский технологический университет» при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований РФФИ гранты №16-03-00519 и №19-03-00302, Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (ГЗ №075-00701-24-07 от 03.04.2024; FSFZ-2024-0013).

Степень разработанности темы

В настоящее время в научной литературе представлено большое количество работ, посвященных синтезу и изучению механизмов действия препаратов на основе различных металлов. Свойства химиотерапевтических агентов на основе металлорганических соединений зависят как от природы металла, так и от его лигандного окружения. Использование аминокислот при конструировании противоопухолевых фармацевтических субстанций обусловлено повышенной селективностью их накопления в опухоли. Например, моно L-аспартилхлорин е6 (Талапорфин) является фотосенсибилизатором (ФС) второго поколения. Структура аминокислот делает их потенциальными комплексообразователями для катионов различных металлов и металлоорганических комплексов, которые обладают собственной противоопухолевой активностью [1-3]. Особое внимание уделено, так называемым, неплатиновым препаратам, содержащим металлы, отличные от платины, включая золото (I), (III), серебро (I), рутений (IV) и олово (IV). Металлорганические соединения (МОС) золота (I) и олова (IV) способны снижать активность глутатионовой и тиоредоксиновой антиоксидантных систем клетки. Этот механизм можно использовать при создании ФС комбинированного действия для повышения чувствительности клеток к активным формам кислорода - ключевым медиаторам клеточной гибели при фотодинамической терапии. МОС на основе золота (I) могут вызывать перекисное окисление липидов мембран митохондрий, которое приводит к повышению эффективности сочетанной терапии. Что касается макрогетероциклических структур, то практически не описаны металлокомплексы, в которых атом металла находится на периферии макроцикла [4-5].

В данной работе впервые реализован синтез золото- и оловосодержащих конъюгатов на основе бактериопурпуринимида, имеющих потенциал для использования в комбинированной фотодинамической и химиотерапии.

Цель заключается в разработке синтеза разнолигандных комплексов золота (I) и олова (IV) на основе природных бактериохлоринов и изучение их физико-химических, фотофизических и биологических свойств в качестве потенциальных препаратов комбинированного действия в онкологии.

Достижение поставленной цели потребовало решения следующих задач:

• Разработка подходов к синтезу металлокомплексов бактериопурпуринимида, включая поэтапную сборку на макрогетероциклической платформе, а также конъюгацию с предварительно полученными металлокомплексами на основе аминокислот;

• Синтез комплексов золота (I), содержащих S- и С- донорные фрагменты, и их конъюгация с дипропокси-БПИ. Исследования in vitro и in vivo специфической активности в отношении опухолей, склонных к гиперэкспресии белков, участвующих в антиоксидантной системе опухолевых клеток, и гистаминовых рецепторов;

• Получение комплексов олова (IV) содержащих N- и O- донорные фрагменты и их конъюгация с дипропокси-БПИ. Изучение связывания последних с ДНК. Исследования in vitro фотоиндуцированной и темновой цитотоксичности лидерных конъюгатов в отношении клеточных линий опухолей с множественной лекарственной устойчивостью.

Научная новизна

1. Предложены два подхода к получению ФС комбинированного действия на основе разнолигандных комплексов металлов и бактериопурпуринимида.

2. Синтезированы новые комплексы золота (I) на основе гистамина, гистидина, цистеина и цистеамина, а также их конъюгаты с дипропокси-БПИ.

3. Получены комплексы олова (IV) на основе лизина, п-аминобензойной кислоты и их конъюгаты с дипропокси-БПИ.

4. Изучено цитотоксическое действие лидерных соединений in vitro как в условиях облучения, так и в отсутствии света. Показана селективность накопления в опухоли и наличие комбинированного действия металлокомплексов дипропокси-БПИ на организменном уровне in vivo.

5. Показано связывание полученных металлокомплексов и конъюгатов с ДНК, а также их внутриклеточное распределение и наличие комбинированного цитотоксического действия на опухолевые клетки различного гистогенеза.

6. Для всех лидерных соединений показано увеличение цитотоксичности до 3-х раз по сравнению с исходным ФС в исследованиях in vitro. Для конъюгатов ФС с комплексами золота (I) наблюдается увеличение эффективности в 2 раза по сравнению с дипропокси-БПИ и 100%-ное торможение роста опухоли (ТРО) в течение 21 дня после процедуры ФДТ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны агенты на основе бактериопурпуринимида и комплексов золота (I) и олова (IV), сочетающие фотодинамическое и химиотерапевтическое действие. Полученные фотоактивные субстанции обладают поглощением в области 800 нм, что позволяет осуществлять лечение глубокозалегающих и пигментированных опухолей. Предлагаемые ФС комбинированного действия имеют различные биологические мишени, поэтому обладают высокоэффективным противоопухолевым действием и, после проведения доклинических и клинических испытаний, могут быть включены в схемы лечения с использованием комбинированной терапии в онкологии.

Методология и достоверность диссертационного исследования

Методики получения производных дипропокси-БПИ и комплексов металлов, разработанные в ходе выполнения диссертационной работы, изложены достаточно подробно с целью возможности их воспроизведения. Строение новых соединений подтверждено с помощью современных физико-химических методов анализа: ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения, спектроскопии ЯМР. Биологические свойства целевых соединений предсказаны методами in silico и исследованы методами in vitro и in vivo в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств.

Положения, выносимые на защиту:

1.Разработка стратегии получения и синтез конъюгатов ФС и комплексов золота (I) на основе S-донорных лигандов. Изучение темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности полученных соединений на линиях опухолевых клеток и противоопухолевой эффективности на животных-опухоленосителях.

2. Синтез конъюгатов ФС и комплексов золота (I) на основе С-донорных лигандов. Изучение комбинированного фотодинамического и химиотерапевтического действия in vitro и in vivo.

3.Разработка стратегии получения и синтез конъюгатов ФС c комплексами олова (IV) на основе N-донорных и О-донорных лигандов. Расчет взаимодействий с потенциальной мишенью - ДНК и оценка релевантности выбранных моделей физическому эксперименту. Изучение темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности на линиях опухолевых клеток с множественной

лекарственной устойчивостью.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, входящих в Перечень ВАК и международные базы цитирования Scopus и WoS, 7 тезисов докладов (из них все представлены на международных конференциях).

Апробация работы. Основные результаты диссертации работы были представлены на различных конференциях, в том числе международных: 16th International Photodynamic Therapy world congress, June 8-13, 2017, Coimbra, Portugal, p. 287; VI Всероссийской конференции "Фотодинамическая терапия и Фотодиагностика", 14-16 Сентября, 2017, Ростов-на-Дону; 3rd Russian Conference on Medicinal Chemistry, September 28 - October 03, 2017, Kazan; The Russian Cluster of Conferences on Inorganic Chemistry "Inorg-Chem 2018"; XIII - International conference Synthesis and application of porphyrins and their analogues, 24-27 June, 2019; XXV Всероссийской конференции молодых учёных-химиков (Нижний Новгород, 2022); 5-й Российской конференции по медицинской химии с международным участием MedChem 2021 (Волгоград, 2022); XIV Международной конференции «Синтез и применение порфиринов и их аналогов» (Иваново, 2022); XVII Всероссийская научно-практическая конференция имени А.Ю. Барышникова с международным участием «Новые перспективные противоопухолевые препараты и медицинские технологии: проблемы, достижения, перспективы» (Москва, 2023); 6-я Российская конференция по медицинской химии (Нижний Новгород, 2024); XV Международная конференция «Синтез и применение порфиринов и их аналогов» (ICPC-15) (Иваново, 2024).

Личный вклад автора. Диссертантом выполнен весь объем синтетической работы, проведены физико-химические и спектральные исследования, реализованы расчеты in silico и тесты связывания полученных препаратов с ДНК, проанализирован массив данных, полученных в ходе биологических испытаний, сформулированы цель работы, задачи и выводы. Результаты исследований подготовлены для публикации и представлены на научных конференциях по соответствующей тематике.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Препараты на основе металлов

Препараты на основе металлов, их солей и металлоорганических соединений (МОС) применяются достаточно давно. На сегодняшний день существует множество методов для изучения строения металлорганических соединений с целью установления зависимости структура-активность, а также мишеней для этих соединений и установления механизма биологического действия [1].

Смесь соединений 3-амино-4-гидроксифенил-AsIII известная как Сальварсан, содержащая мышьяк в ациклической форме As3 и As5, была получена Эрлихом в начале 20 века. Сальварсан поставлялся компанией Hoechst и являлся препаратом от сифилиса. Спустя более чем полвека в 1978 году FDA одобрило препарат cis-[PtnCh(NH3)2], ставший известным как цисплатин для применения в онкологии. С него началась медицинская неорганическая химия. С этого момента началась новая волна исследований в области применения металлоорганических молекул для применения, как в онкологии, так и в других областях медицины. Было изучено множество металлсодержащих структур, однако, только часть из них перешла на стадию клинических испытаний [2,3].

Существует ряд проблем, связанных с изучением и предсказанием активности металлоорганических соединений. Например, правило Липински содержит рекомендацию, касающуюся того, что молярная масса соединения должна быть меньше 500 дальтон. Но большая часть потенциальных препаратов на основе МОС, имеющих в своем составе переходные металлы, имеют молекулярную массу, превышающую эти значения, включая препарат ауранофин (MW 678 Дальтон), который обладает высокой биологической активностью и допущен к применению FDA [4-6].

Факторы, которые определяют биологическую активность агентов на основе МОС включают тип металла, лигандное окружение, а также способ активации, метаболизм соединения в организме. Существует несколько механизмов активации металлоорганических соединений, включая внутренние, под действием эндогенных факторов организма, а также внешних, под действием разных видов облучения или при взаимодействии с другими препаратами. Знания о механизмах действия можно использовать при дизайне структуры препарата [7,8].

2.2. Механизмы активации металлокомплексов

Основным механизмом активации для препаратов, содержащих переходные металлы, является гидролиз, который включает процесс замены слабого о-донорного лиганда на молекулу воды. Данный процесс зависит от рН среды. Некоторые металлокомплексы более стабильны при щелочном рН, некоторые, напротив, в кислой среде (Рис 1.) [9].

Рисунок 1. Стабильность металлокомплексов при различных значениях рН.

Гидролиз комплексов переходных металлов включает замещение слабосвязанных s-донорных лигандов на молекулы воды. Скорость гидролиза зависит от прочности связи металл-лиганд, при этом время варьируется от наносекунд до десятков лет. Инертность к гидролизу комплексов тяжелых переходных металлов может быть использована при разработке лекарств [10-15].

Вторым важным направлением активации металлосодержащих препаратов является окислительно-восстановительный механизм (рис. 2). Металлокомплексы могут по-разному влиять на red/ox баланс, как на прямую, посредством восстановления или окисления металла или его лигандов, так и опосредованно, взаимодействуя с биоактивными молекулами в организме. В идеальном случае red/ox активация металлокомплекса должна быть связана с образованием цитотоксичных агентов в опухолевых клетках для минимизации побочных эффектов [16-20].

РМ175

I _ « -

[ Цитоплазм;

V

СБН

Рисунок 2. Окислительно-восстановительный механизм активации металлокомплексов.

Состояние гипоксии может вызывать восстановление и активировать малоактивные металлокомплексы на основе PtIV , Яи111 , Со111, и так как состояние гипоксии характерно для опухолевых клеток, данный тип активации является относительно селективным. В здоровых клетках обратное-окисление происходит достаточно быстро, что приводит к деактивации металлокомплекса. Изучение механизма активации платиновых препаратов на основе PtIV и PtII показало, что основными био-восстановителями для них являются: глутатион (GSH), аскорбат, и белки с большим количеством цистеинов. Комплексы рутения обладают схожим механизмом восстановительной активации и похожим образом после восстановления способны связываться с ДНК и белками в клетке. В случае комплексов кобальта было обнаружено, что в их активации большую роль играет восстановление лигандов [17-19].

Восстановление лигандного окружения металлов — это механизм, который в большинстве случаев связан с образованием окисленной формы глутатиона GSSG, что приводит к увеличению уровня АФК в клетке. В некоторых случаях механизм может быть связан с ингибированием белков антиоксидантной системы путем их восстановительного присоединения к этим биомолекулам [20,21].

Рисунок 3. Комплексы, которые образуются в белке при взаимодействии с металлосодержащими препаратами.

Окислительная активация особенно характерна для ферроцена и ему подобных структур, они могут вызывать реакцию Фентона в клетках, что приводит к перепроизводству H2O2 и генерации НО*- радикалов с последующим разрушением ДНК. При изучении окислительной активации Ru-Fe комплексов была показана корреляция между Fe+/0 восстановительным потенциалом и токсичностью [22].

В случае окислительной активации лигандов механизм обычно имеет сложный характер, и в большинстве случаев связан с присоединением к лиганду глутатитона или связыванием с цистеином в глутатион^-трансферазе, а также с замещением какой-либо биоактивной частицы лиганда на глутатион (с последующим образованием GSSG). Например, высвобождение биоактивного I- из комплекса №ат-[PtIV(en)(OH)2I2] с последующим восстановлением платины [23].

Металлосодержащие препараты также могут быть селективно активированы в фотодинамической терапии (ФДТ), фототермальной терапии (ФТТ) и фотоаквивируемой химиотерапии (ФАХТ) [24].

В случае ФДТ присутствие металла в полости порфиринового макроцикла может изменять как его спектральные свойства, так и уровень генерации синглетного кислорода и

других АФК. В случае металлов на периферии макроцикла, металлокомплекс активируется одним из вышеописанных механизмов и играет роль химиотерапевтического агента [25].

Принцип ФТТ основан на способности некоторых металлов в виде наноструктур генерировать тепло путем поглощения фотонов. Например, наночастицы золота (0) при облучении в ИК диапазоне 750-1400 нм посредством плазмонного резонанса вызывают гипертермическую смерть опухолевых клеток, при этом клетки селективно нагреваются до температуры 41-43оС, а для более эффективной абляции необходимы температуры превышающие 50оС [26,27].

В случае ФАХТ, свет активирует инертные пролекарства путем реакций фотопереключения, разрыва линкерных молекул или реакций фотоокисления-фотовосстановления. ФАХТ-агенты имеют преимущества над ФДТ-агентами в клетках с выраженной гипоксией, однако, при этом имеют ряд ограничений в применении. Эти ограничения можно устранить путем создания комбинированных препаратов [28-30].

Существуют также механизмы активации металлокомлексов с помощью ионизирующего облучения, сонодинамики и термальной активации [31].

Механизм активации посредством облучения основан на радиосесибилизирующем эффекте некоторых металлокомплексов, которые под действием рентгеновского излучения способны производить различные формы АФК, а также на повреждении клеток самим облучением [32]. У некоторых металлокомплексов порфиринов и неорганических наночастиц была замечена способность генерировать синглетный кислород под действием рентгеновского излучения (X-ray ФДТ или XPDT). Данный метод имеет преимущество по сравнению с классической ФДТ за счет неограниченной глубины проникновения рентгеновского излучения в ткани [33].

Активация посредством механических волн, так называемая, сонодинамическая терапия, изначально разрабатывалась как возможная замена ФДТ. Сонолюминисценция, концентрация энергии за счет поглощения ультразвука, может также возбуждать фотосенсибилизаторы. Некоторые порфирины и металл-порфириновые комплексы, а также неорганические и металлорганические наночастицы показали перспективность в in vitro исследованиях [34,35].

Термальная активация основана на селективном нагреве с помощью ИК излучения под действием повышенной температуры тканей или с помощью биохимических реакций. Металлокомплексы, конъюгированные с термоакивируемыми фрагментами, после активации образуют радикальные частицы с высокой активностью, что и приводит к цитотоксическому эффекту [36,37].

МО катализ является еще одним механизмом активации металлосодержащих агентов. МО катализаторы в малых дозах могут катализировать множество биохимических реакций, включая

15

переносное гидрирование, разрыв С-С с помощью кросс-каплинга, разрыв связей путем гидролиза или окисления, азид-алкиновое циклоприсоединение и аллил-кармабатный разрыв. Успешность катализа в живых системах требует следующих условий: высокая степень конверсии в физиологических условиях, хорошая энантиоселективность, устойчивость к водному окружению и присутствию нуклеофилов [38].

Никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) и его восстановленная форма NADH являются ключевыми кофакторами в множестве биохимических реакций, включая окислительно-восстановительный баланс клетки. Показано, что в опухолевых клетках понижен уровень NAD+/NADH по сравнению со здоровыми клетками. Переносное гидрирование NAD+/NADH может быть вызвано комплексами Irm Cp*, Rhm Cp* и Run Ar. Механизм катализа включает формирование аддуктов металл-формиат, перенос гидрида на металл и высвобождение молекулы CO2 с последующим переносом гидрида на NAD+. Данный процесс увеличивает концентрацию восстановителей в клетке и вызывает неапопточическую смерть клетки. Было отмечено, что в клетках с гипоксией пируват восстанавливается до лактата с помощью лактатдегидрогеназы и NADH, что было использовано как мишень для комплексов осмия (II). Эти комплексы превращали пируват в D-лактат в присутствии формиата с более высокой селективностью в опухолевых клетках [39,40].

Металлокомплексы также способны окислять NADH в NAD+, вызывая у клетки окислительный стресс с последующим апоптозом. Так, например, комплексы Irm и Rhm Cp* восстанавливают кетоны в присутствии NADH в качестве ко-кофактора. Комплексы иридия (III) могут переносить гидрид ион на молекулу кислорода с образованием перекиси и АФК. Фотокатализаторы на основе иридия также способны вызывать образование радикалов NAD из NADH в присутствии облучения, что также приводит к апоптозу [41].

Баланс между восстановленным и окисленным глутатионом (клеточный GSH:GSSG от 30 к 1 до 100 к 1) играет основную роль в большинстве клеточных окислительно-восстановительных процессов. Рутениевые комплексы на основе азопиридинов могут катализировать окисление GSH в GSSG посредством одноэлектронного восстановления N=N связи глутатионом, а также генерировать супероксид анион в присутствии кислорода [42].

Металлокомплексы, являющиеся сильными кислотами Льюиса, участвуют в гидролитическом и окислительном разрыве связей. Было показано, что металлокомплексы на основе тетра-#-метилированого циклама (ТМЦ) могут разрезать AP пептиды в области 36-43 аминокислот, при этом наблюдалось падение каталитической активности в ряду Con > Znn > Cun > Nin МО соединения на основе меди используются для расщепления связей в вирусной РНК и G-квадруплексе теломеров ДНК. Механизм их действия основан на окислении-восстановлении

пары Cun / Cum c последующим образованием АФК, которые разрушают связь [43].

16

2.3. Применение металлокомплексов в онкологии 2.3.1. Металлокомплексы платины

Молекулярные механизмы действия цисплатина и его производных включают сшивание пуриновых оснований в ДНК, приводящее к повреждению ДНК и апоптозу раковых клеток. Однако лишь небольшое количество препарата достигает ядер раковых клеток, поскольку остальная его часть может взаимодействовать с другими мишенями в кровотоке, клеточной мембране, цитоплазме и органеллах, участвуя в белковых взаимодействиях и окислительно-восстановительных процессах [44-45].

Недавние исследования показали, что препараты на основе платины могут значительно влиять на иммунную систему пациента, а иммунный ответ играет важную роль в их противоопухолевой активности. Имеются данные, свидетельствующие о том, что препараты на основе платины, включая цисплатин, могут вызывать иммуногенную гибель клеток (ИГК), что приводит к модуляции иммунитета. Во время ИГК стрессоры вызывают изменения в клеточной мембране и иммунной сигнализации в микроокружении опухоли, что приводит к экспонированию калретикулина, белков теплового шока (ЖР) 70/90 на поверхности клеток и высвобождению белка 1-й группы с высокой подвижностью (НМОВ1), интерферона 1-го типа (ШК) и белка СХСЬ10 [46, 47].

В исследованиях последних лет иммуномодулирующие эффекты цисплатина были исследованы на различных моделях рака. На мышиной модели меланомы В16 было обнаружено, что лечение цисплатином избирательно снижает уровни клеток-супрессоров миелоидного происхождения (MDSCs). Это сопровождалось потерей маркера MDSC Gr-1 и увеличением маркера дендритных клеток С040 на поверхности клеток. Кроме того, активность в отношении цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLs) и цитокин-индуцированных киллеров (С1К) эффекторных клеток была снижена при лечении цисплатином. В модели голой мыши с ксенотрансплантатом меланомы человека лечение цисплатином также приводило к снижению иммуноингибирующих функций MDSCs и усилению пролиферации СТЬ наряду с выработкой интерферона-с при совместном культивировании с предварительно обработанными цисплатином MDSCs [48].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тихонов Сергей Иванович, 2024 год

- I - -

! *

1 .1 . l ;.,.. 1........ J... 1

■ ......... - ..........

Рисунок 13. Масс спектры высокого разрешения для конъюгатов 9a и 9b.

Таблица 5. Результаты элементного анализа С-донорных комплексов золота (I).

Соединение Рассчитано (%): Найдено (%):

9a (C48H61AUCIN9O7) C 52.01; H 5.55; N 11.37; Au 17.77; O 10.10; Cl 3.30 C 52.06; H 5.58; N 11.39; Cl 3.27

9b (C46H59AUCIN9O5) C 52.60; H 5.66; N 12.00; Au 18.75; O 7.62; Cl 3.38. C 52.62; H 5.68; N 12.01; Cl 3.36

13a (C9H15AUN3CIO2) C 25.16; H 3.52; N 9.78; Au 45.84; O 7.45; Cl 8.25. C 25.13; H 3.55; N 9.76; Cl 8.29.

13b (C7H13AUN3CI) C 22.62; H 3.53; N 11.31; Au 53.00; O 0.00; Cl 9.54 C 22.67; H 3.55; N 11.31; Cl 9.52.

Спектры полученных хлоринов 9а и 9Ь отличались от исходных наличием полосы поглощения 210 нм в УФ области для КИС производных и снижением интенсивности флуоресценции на 30-40%.

Рисунок 14. Графики спектров поглощения и флуоресценции полученных конъюгатов.

3.3.3. Изучение биологической активности C-донорных комплексов золота (I) in vitro и in

vivo

3

Специфическая активность гистидин и гистаминсодержащих ФС была изучена на двух линиях клеток аденокарциномы простаты (РС-3) с гиперэкспрессией гистаминовых рецепторов [Phuong L. N. et а1, 2021] и карциномы кишечника (ИСШ6) без этих рецепторов. Было изучено два типа активности - фотоиндуцированная и темновая токсичность. Для оценки эффекта комбинированного фотодинамического и цитотоксического действия для исследованных препаратов была использована двухэтапная схема эксперимента. Клетки инкубировали с соединениями в течении 4 часов с последующим облучением светом, имеющим длину волны, соответствующую максимуму поглощения ФС. После облучения плашки с клетками помещали в СО2 инкубатор на 48 и 72 часа для изучения цитотоксическое действия Аи(1). Результаты представлены на Рис.15.

Все соединения показали высокую фотоиндуцированную активность. Сочетанный эффект был обнаружен для соединений 9а и 9Ь, при этом комплекс 9Ь проявлял большую фотоидуцированную активность по сравнению с 9а на 20-30%, что, по-видимому, связано с особенностями взаимодействия с белками антиоксидантной системы.

3 Исследования цитотоксичности in vitro и фотоиндуцированной противоопухолевой активности in vivo выполнены в Отделении экспериментальной фармакологии и токсикологии, МНИОИ имени П.А. Герцена - филиале ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, зав.отд., к.б.н. Панкратов А.А.

Рисунок 15. Комбинированная активность соединений in vitro в зависимости от времени инкубации с ФС (темно-синие столбцы - 48 ч, светло-голубые столбцы - 72 ч).

На основе исследований in vitro и in silico были выбраны два соединения для дальнейших in vivo исследований, включая NHC-производное дипропокси-БПИ с гистамином 8b и конъюгат комплекса золота на его основе 9b. Соединением сравнения был взят дипропокси-БПИ 1.

Исследования проводили на иммунодифицитных мышах с привитыми ксенографтами человеческой аденокарциномы (PC-3). Все соединения быстро накапливались в опухолевой ткани, нормализованная флуоресценция достигла максимальных значений через 15 минут после введения. Флуоресценция имела высокие значения в течение 2-х часов для соединения 1, в то время как для соединений 8b и 9b сохранялась в течение 4 часов. Более длительное удержание, по-видимому, связано с взаимодействием с гистаминовыми рецепторами. Элиминирование ФС происходило через 24 часа после введения. Индекс флюоресцентной контрастности наблюдался с 15 минут до 4-х часов после введения и изменялся в диапазоне от 2.3 до 3.0 (рис. 16).

Рисунок 16. Результаты изучения накопления соединений 8b и 9b.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что соединения имеют специфическую активность в отношении линий клеток с гиперэкспрессией гистаминовых рецепторов.

Изучение специфической активности вышеописанных соединений проводили на аналогичной модели иммунодифицитных мышей с привитыми ксенографтами человеческой аденокарциномы (PC-3). Соединения вводили в дозе 1 мг/кг, подобранной на основании активности дипропокси-БПИ. ФС показали высокую противоопухолевую активность, представленную в таблице 6.

Таблица 6. Изучение комбинированной активности ФС in vivo.

Соединение Тип исследования Замедление роста опухоли, %

Время наблюдения, дни

^опухоли А® ФДТ 4 7 14 21

1 обл. 108±7 100 100 87 33

теми. 114+4 2 6 2 13

8Ь обл. 104+9 100 100 88 75

теми. 114±5 5 5 4 3

9Ь обл. 106±8 100 100 100 100

теми. 112±7 20 32 33 23

В отсутствии облучения соединение 9b показало значительное ингибирование роста опухоли, что свидетельствует о химотерапевтическом эффекте. Соединения 1 и 8b при облучении имели 76%-ное торможение роста опухоли (ТРО), тогда как пигмент 9b показал 100% ТРО, что можно объяснить наличием противоопухолевого действия Au (I). Эти данные также коррелируются с экспериментом in vitro, в котором наблюдалось цитотоксическое действие через время после облучения. Таким образом конъюгат 9b может стать основой для препарата комбинированного действия.

3.4. N-донорные и O-донорные комплексы олова (IV)

В настоящее время оловоорганические соединения рассматриваются как перспективные противоопухолевые агенты, являющиеся альтернативой для платиносодержащих цитостатиков. Оловоорганические карбоксилаты являются стабильными при физиологических значениях pH и не деметаллируются в кровотоке, при этом проявляют высокую антипролиферативную активность против клеток опухолей различного генеза, включая платинорезистентные опухоли,

а также обладают значительно меньшей системной токсичностью по сравнению с препаратами платины.

Карбоксилатные и аминокарбоксилатные комплексы олова с аминокислотами могут выступать как самостоятельные лекарственные агенты, так и в составе более сложных структур. Разнообразие аминокислот, включая непротеиногенные, а также их металлокомплексы, позволяет получать лекарства, нацеленные на различные клеточные мишени, что перспективно в борьбе с опухолями различной этиологии.

Механизм активации карбоксилатных комплексов олова (IV) зависит от количества и структуры не-углеродных лигандов у атома олова. Карбоксилатные и аминокарбоксилатные комплексы олова могут активироваться как по механизму гидролиза, так и по ОВР-механизму. В данной части работы в качестве основы для металлокомплекса был выбран хлорид триметилолова (IV), так как комплексы на его основе более склонны к взаимодействию с белками антиоксидантной системы. В качестве же связующего звена между ФС и металлокомплексом были выбраны лизин и парааминобензойная кислота. Комплексы олова и аминобензойных кислот хорошо описаны в литературе и являются перспективными химиотерапевтическими агентами. В то время как лизин является удобной основой для синтеза карбоксилатных и аминокарбоксилатных комплексов.

3.4.1. Присоединение металлокомплекса олова (IV) к модифицированному ФС (путь 1)

Первым этапом данной части работы стало получение аминокарбоксилатного комплекса олова (IV) на основе дипропокси-БПИ, модифицированного метиловым эфиром лизина 14. Последний взаимодействовал с хлоридом триметилолова в присутствии триэтиламина EtзN с получением металлокомплекса 15. К сожалению, данный комплекс оказался нестабильным и в физиологических условиях деметаллировался, что сделало его непригодным для дальнейших биологических исследований.

ОС3Н7

ОС3Н7

о

\

Схема 12. Получение аминокарбоксилатного комплекса олова (IV). 1- СН3СК, Б13К, 16, Аг, 30 минут; п (15) = 20%;

Поэтому альтернативный подход включал образование карбоксилатных комплексов 19 и

20, в которых в качестве лигандов выбраны две аминокислоты: непротеиногенная п-

аминобензойная кислота и защищенный по а- и 8- аминогруппам лизин.

3.4.2 Синтез аминокислотных комплексов олова (IV) и их бактериохлориновых

производных (путь 2)

Вначале были получены комплексы олова 17 и 18 (схема 12) с вышеназванными аминокислотами по известным методикам [АПопепко, Т. et а1., J. О^апоте1 ^ет. 2020] с оптимизацией, реализованной нами экспериментальным путем (таблица 7). Было установлено, что время, необходимое для полного металлирования аминокислот составляет 96 часов вместо известных 10 часов.

Схема 13. Получение комплексов олова (IV) на основе аминокислот 17 и 18. 1- п-аминобензойная к-та, 1М КОН водный р-р, СН3ОН, 45оС, 96 часов; п (17) = 57%; п- К-а-Бшое-К-8-Бое-Ьу8, 1М КОН водный р-р, СН3ОН, 45оС, 96 часов; п (18) = 49%.

/ \

Таблица 7. Оптимизация условий синтеза комплексов

Соединение Избыток КОН Температура Время Выход

17 1 45оС 10 ч 10 %

1,2 45оС 10 ч 8 %

1,2 50оС 10 ч 9 %

1 45оС 24 ч 23 %

1 45оС 48 ч 37 %

1 45оС 72 ч 44 %

1 45оС 96 ч 57 %

18 1 45оС 24 ч 22 %

1,5 45оС 24 ч 20 %

1,5 45оС 96 ч 33 %

1 45оС 96 ч 49 %

В ИК-спектрах комплексов олова с аминокислотами 17 и 18 были обнаружены характеристические полосы валентных колебаний связей О^п и С^п (550 см-1 и 620 см-1), а также характерные для карбоксилатных комплексов олова полосы колебаний связей С-О (1250 см-1) (рис.17.). Сигналы протонов трех метильных групп, связанных с атомом олова, были обнаружены в спектрах 1Н ЯМР при 0,45 м.д. для комплекса 17 и при 0,38 м.д. для комплекса 18 (рис. 18.). В масс спектрах присутствовали сигналы молекулярных ионов с изотопным расщеплением, характерным для катиона олова.

Рисунок 17. ИК-спектры комплексов 17 и 18.

Рисунок 18. Спектры 1Н-ЯМР комплексов 17 и 18.

Далее комплексы 17 и 18 присоединяли к дипропокси-БПИ по методике амидирования 173 положения макроцикла описанной выше (схема 13). Полученные соединения были выделены методом тонкослойной хроматографии.

Схема 13. Синтез конъюгатов металлокомплексов и ФС. i- 1) CH2CI2, EDC, NHS, 0 °C, 30 минут, 2) соединение 17, EfeN, 48 ч; п (19) = 37%; ii- 1) CH2CI2, EDC, NHS, 0 °C, 30 минут, 2) соединение 18, Et3N, 48 часов.) п (20) = 45%.

На ИК-спектрах (рис. 19) также наблюдались характеристические полосы валентных колебаний связей для конъюгата 19: О^п и С^п (504 см-1, 548 см-1), а также характерные для

карбоксилатных комплексов олова полосы колебаний связей группы С(0)-0- (симм. 1288 см 1, асим. 1602 см-1) и конъюгата 20: 0^п и С^п (574 см-1, 675 см-1), С(0)-0- (симм. 1115 см-1, асим. 1546 см-1).

Рисунок 19. ИК-спектры конъюгатов 19 и 20.

На спектрах 1Н-ЯМР были найдены как характерные для дипропокси-БПИ сигналы, так и сигналы водородов метильных групп лигандов у атома олова (рис. 20).

Рисунок 20. 1Н-ЯМР спектр конъюгатов 19 и 20.

Исследование фотофизических свойств показало, что в случае конъюгата дипропокси-БПИ с Sn-комплексом лизина 20 изменений в положении и интенсивности полос поглощения не наблюдается, тогда как для конъюгата ФС с Sn-комплексом и-аминобензойной кислоты 19 на ЭСП появляется новый максимум (Х= 267 нм), соответствующий фенильному кольцу.

Длина волны (нм) Длина волны (нм)

Рисунок 21. Электронные спектры поглощения (а) и спектры флуоресценции (Ь) дипропокси-БПИ и конъюгатов 19 и 20.

Положение полос в спектрах флуоресценции дипропокси-БПИ с комплексами олова не отличается от исходного пигмента 1, однако их интенсивность для комплекса с лизином 20 выше, чем для 1 и 19.

3.4.3. Тест на связывание с ДНК 0-донорых комплексов олова (IV)

При активации по механизму гидролиза основной мишенью комплексов олова (IV) является молекула ДНК. В данной работе были проведены исследование т silico по изучению взаимодействия полученных соединений с молекулой ДНК, с последующим тестом связывания.

Рисунок 22. Результаты докинга соединения 20 в модельную молекулу ДНК. Положение в молекуле (слева), таблица полной энергии взаимодействия и параметры связывания (справа).

Для оценки взаимодействия между одноцепочечной ДНК (SS-DNA) и синтезированными соединениями был использован метод абсорбционной спектроскопии в УФ-видимой области.

91

Связывание соединений с ДНК вызывает изменение интенсивности поглощения. На основании измерений оптической плотности определяли внутренние константы связывания соединений с ДНК в соответствии с уравнением Бенези-Хильдебранда (рис. 23). Для проведения эксперимента соединения растворяли в 70% растворе этилового спирта в фосфатном буфере рН=7.4. Затем прибавляли к заранее приготовленным растворам ДНК. После инкубации в течении часа при температуре 37оС с растворов снимали спектры поглощения и оценивали изменения оптической плотности в зависимости от концентрации ДНК в пробе.

Рисунок 23. Спектры поглощения комплексов конъюгат-ДНК.

Из результатов, представленных в таблице (рис 22, справа) следует, что конъюгат 20 является лидерным соединением из всех изученных, при этом была установлена закономерность, заключающаяся в том, что у тех соединений, где участок с металлом при компьютерном

моделировании лучше взаимодействовал с молекулой ДНК, у них наблюдалось и лучшее сродство с ДНК в эксперименте.

3.4.4. Изучение биологической активности конъюгатов дипропокси-БПИ с комплексами

олова (IV) in vitro4'5

Нами были проведены исследования внутриклеточного распределения соединений 1, 19, 20 на клеточной линии A549. При этом не было обнаружено солокализации 1, 19 и 20 с ядерным красителем Hoechst 33342, что свидетельствует об отсутствии внутриядерного накопления полученных соединений (рис. 24). Однако взаимодействия с ДНК для полученных соединений могут быть возможны и вне ядра.

Рисунок 24. Распределение 1, 19 и 20 в клетках линии A549: (a-c) флуоресцентные изображения металлокомплексов; (d-f) флуоресцентные изображения с красителем Hoechst 33342; (g-i) наложение флуоресцентных изображений (синий — Hoechst 33342; красный - 1, 19 и 20); (j-l) изображения клеток в проходящем свете.

Далее были изучены темновая и фотоиндуцированная цитотоксичности металлокомплексов Sn (IV) in vitro на культурах опухолевых клеток человека: аденокарциноме предстательной железы (РС-3); аденокарциноме молочной железы (MCF-7); карциноме легкого (А-549), а также мышиной саркоме S-37.

Было показано, что конъюгаты 19 и 20, а также ФС сравнения дипропокси-БПИ 1 проявляли высокую и схожую специфическую активность при 24 часах инкубации с клетками. Увеличение времени инкубации до 48 часов приводило к возрастанию фотоиндуцированной

4 Исследование внутриклеточного накопления проведено н.с., к.б.н. Игнатовой А.А. в лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН под руководством проф. А.В. Феофанова.

5 Исследования цитотоксичности in vitro и фотоиндуцированной противоопухолевой активности in vivo выполнены в Отделении экспериментальной фармакологии и токсикологии, МНИОИ имени П.А. Герцена - филиале ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, зав.отд., к.б.н. Панкратов А.А.

активности конъюгата 20 по сравнению с ФС 1 относительно опухолевых клеток культур Б-37, МСБ-7 и А-549 в 2 - 2,5 раза, по-видимому, за счет цитотоксического эффекта Бп (IV). Что подтверждают результаты по ФС 1, так как фотоиндуцированная активность не сохраняется в течении длительного времени. (таблица 8, помечены красным).

Таблица 8. Фотоиндуцированная активность соединений 1, 19 и 20 относительно опухолевых

клеток различных линий.

Соединения Культура клеток

S-37 РС-3 MCF-7 А-549

Время инкубации после воздействия светом, часы

24 48 24 48 24 48 24 48

Величина ИК50,мкМ

1 0,21±0,04 0,17±0,01 0,14±0,01 0,09±0,04 0,19±0,04 0,14±0,04 0,23±0,04 0Д6±0,01

19 0,23±0,05 0,13±0,04 0,08±0,03 0,07±0,05 0,22±0,08 0,12±0,05 0,18±0,06 0Д1±0,02

20 0,20±0,01 0,06±0,02 0,08±0,01 0,06±0,04 0Д0±0,06 0,05±0,01 0,13±0,04 0,09±0,03

При оценке цитотоксической активности соединений 1, 17, 18, 19 и 20 отмечено, что при увеличении времени инкубации цитотоксичность комплексов олова (IV) возрастала. Соединения 17 и 18 (без коньюгирования с бактериопурпуринимидом) оказывали меньшее цитотоксическое действие на опухолевые клетки всех представленных культур (таблица 9), что может быть связано с худшим проникновением в клетку, что согласуется с литературными данными [122].

Таблица 9. Цитотоксическая активность (темновая) соединений 1, 17, 18, 19 и 20 по отношению

к опухолевым клеткам различных линий.

Соединения Культура клеток

S-37 РС-3 MCF-7 А-549

Время инкубации с соединениями, часы

24 48 24 48 24 48 24 48

Величина ИК50,мкМ

1 3,3±0,3 3,3±0,6 2,3±0,7 1,0±0,1 10,8±0,2 3,9±0,5 6,2±0,9 2,8±0,8

17 33,8±1,4 5,9±0,07 32,2±1,3 10,3±0,4 46,5±0,7 26,9±0,3 34Д±1Д 9,5±0,5

18 15,8±3,1 12,8±1,2 15,5±0,9 5,5±0,6 20,6±0,3 16,5±0,5 18,2±1Д 8,5±1,0

19 5,7±0,9 2,7±0,2 1,9±0,5 1Д±0,7 9,7±0,4 6,9±0,4 9,8±0,5 3,0±0,3

20 5,2±1,5 3,1+1,1 0,9±0,4 0,6+0,2 6,8±0,1 3,1±0,2 7,7±1Д 2,2+0,2

При оценке результатов in vitro были обнаружены корреляции с результатами расчетов взаимодействия in silico и теста связывания. При изучении двумерных диаграмм связывания, полученных методами in silico было показано, что фрагмент с оловом в конъюгате 20 чаще был развернут внутрь молекулы ДНК, в отличии от конъюгата 19. Таким образом конъюгат 20 может быть использован в качестве агента комбинированного действия для лечения цисплатин-резистентных опухолей.

Следует также отметить, что при исследовании стабильности всех полученных конъюгатов было отмечено, что раствор соединения 20 сохраняет свои свойства в течении длительного времени хранения.

Для всех конъюгатов комплексов металлов с дипропокси-БПИ в экспериментах in vitro было обнаружено наличие химиотерапевтического эффекта металла комплекса, что подтверждает нашу гипотезу об улучшении эффективности за счет использования агентов комбинированного действия.

4.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Материалы и методы

Использованные в диссертационной работе органические растворители (включая дейтерированные) и реактивы были получены из коммерческих источников (Сольвекс, Россия, Москва; ХИММЕД, Россия, Москва; Acros Organics - часть Thermo Fischer Scientific, США, Уолтем, Массачусетс; Merck, Дармштадт, Германия; Abcr GmbH, Германия, Карлсруэ) и были дополнительно подготовлены по общепризнанным методикам. Для приготовления мицеллярных растворов использовали Kolliphor ELP (BASF, Людвигсхафен, Германия). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 40/60 (Merck, Дармштадт, Германия). Препаративную тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на стеклянных пластинках с силикагелем c флуоресцентной меткой F254 (Merck, Дармштадт, Германия). Аналитическая ТСХ выполнялась на алюминиевых пластинках с силикагелем c флуоресцентной меткой F254 (Merck, Дармштадт, Германия).

Электронные спектры поглощения и флуоресценции регистрировали на спектрофотометрах Shimadzu UV1800 UV/VIS (Shimadzu, Дуйсбург, Германия) и Shimadzu RF-5301 (Shimadzu, Дуйсбург, Германия) в кварцевых кюветах (0,4*1,0 см) с длиной оптического пути 1 см (спектральная щель ширина 1 нм), в качестве растворителя использовали дихлорметан (CH2CI2), 4%-ный водно-мицеллярный раствор Kolliphor ELP и ацетон (СзНбО). Спектры поглощения записывались в диапазоне 350-900 нм. Спектры флуоресценции записывали в диапазоне 600-800 нм (длина волны возбуждения 550 нм), используя в качестве растворителей дихлорметан (CH2CI2), 4%-ный водно-мицеллярный раствор Kolliphor ELP и ацетон (СзНбО). На спектрометре Bruker DPX 300 (Bruker, Альценау, Германия) были зафиксированы спектры 1Н и 13С ЯМР. Образцы ЯМР готовили в дейтрированных растворителях d6 -ацетоне, d6 -диметилсульфоксиде (d6 -ДМСО) и CDCb. Масс-спектры высокого разрешения с помощью матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) записывали на спектрометре Bruker Ultraflex TOF/TOF (Bruker, Альценау, Германия) с 2,5-дигидроксибензойной кислотой в качестве матрицы. Элементный анализ проводили на анализаторе Vario Micro Cube (Elementar, Германия, Берлин). ДНК для спектра связывания было получено путем разведения препарата Деринат (ФармПак, Россия, Москва).

4.2. Синтез

Выделение бактериохлорофилла а из биомассы бактерий Rhodobacter capsulatus, а также получение бактериопурпурина и О-пропилоксим-Ы-пропоксибактериопурпуринимида (дипропокси-БПИ, соединение 1) проводили по известным методикам, разработанным в нашей научной группе [158-162].

4.2.1. Получение тиолсодержащих производных дипропокси-БПИ 2a и 2b

Соединение 2a и 2b были получены по схожим методикам с небольшим различием в избытках реагентов и времени активации.

(2a) Дипропокси-БПИ (35 мг, 0,05 ммоль) растворяли в 2 мл хлористого метилена в среде аргона, затем к раствору добавляли №этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин (EEDQ) (18 мг, 0,075 ммоль) и перемешивали на холоду в течении 15 минут. Далее к реакции добавляли 0,09 ммоль метилового эфира цистеина и перемешивали 48 часов. Реакцию контролировали по ТСХ. Реакционную смесь промывали подкисленной водой и экстрагировали хлористым метиленом. Органический слой затем упаривали и очищали на препаративной ТСХ в системе СШС^СНзОН 30:1. После отмывки от сорбента вещество кристаллизовали из раствора хлористый метилен:гексан 1:5.

Выход (2а): 66%, темно красные кристаллы.

Масс-спектр соединения (2а) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C43H56N7O7S [М]: 813.01, найдено: [М+H]: 814.25.

1H ЯМР соединения (2а) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 8.77 (Н, s, 5-Н), 8.68 (Н, s, 10-Н), 8.64 (Н, s, 20-Н), 8.15 (H, J=8.20 d, 173 -NH), 7.13 (H, m, SH), 5.30 (Н, m, 17-Н), 4.33 (4H, m, -ОСН2СН2СН3), 4.20 (2Н, m, 7-Н, 18-Н), 4.09 (Н, m, 8-H), 3.98 (3Н, s, 12-СНз ), 3.56 (3H, m, CHCH2SH), 3.34 (3Н, s, 2-СН3), 2.70 (3Н, s, 32 -СН3), 2.56 (Н, m, 172 -СН2), 2.45 (3Н, m, 81 -СН2 , 171 -СН2, 172 -СН2), 2.15 (2Н, m, 81 -СН2, 171 -СН2), 1.91 (3Н, J=7.24 Н d, 7-СН3), 1.62 (9Н, m, 18-СН3, -ОСН2СН2СН3), 1.25 (4Н, т,-ОСН2СН2СН3), 1.24 (3Н, m, 82 -СН3), 0.11 (s, ЫН), -0.22 (s, ЫН).

(2b) Дипропокси-БПИ (35 мг, 0,05 ммоль) растворяли в 2 мл хлористого метилена в среде аргона, затем к раствору добавляли EEDQ (18 мг, 0,075 ммоль) и перемешивали на холоду в течении 20 минут. Далее к реакции добавляли гидрохлорид аминоэтантиола (11 мг 0,1 ммоль) и перемешивали 48 часов. Реакцию контролировали по ТСХ. По окончании реакционную смесь промывали подкисленной водой и экстрагировали хлористым метиленом. Органический слой

затем упаривали и очищали на препаративной ТСХ в системе CH2Ch:CH3OH 25:1. После отмывки от сорбента вещество кристаллизовали из раствора хлористый метилен:гексан 1:5.

Выход: 53%, темно красные кристаллы.

MALDI TOF m/z рассчитано для C41H53N7O5S [М+]: 755.38, найдено [М+Н+]: 756.43.

1H ЯМР соединения (2b) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 8.76 (Н, s, 5-Н), 8.69 (Н, s, 10-Н), 8.65 (Н, s, 20-Н), 8.14 (H, J=8.20 d, 173 -NH), 7.12 (H, m, SH), 5.30 (Н, m, 17-Н), 4.33 (4H, m, -OCH2CH2CH3), 4.20 (2Н, m, 7-Н, 18-Н), 4.09 (Н, m, 8-H), 3.97 (3Н, s, 12-CH3), 3.56 (4H, m, CH2CH2SH), 3.33 (3Н, s, 2-CH3), 2.70 (3Н, s, 32 -CH3 ), 2.56 (Н, m, 172 -CH2), 2.45 (3Н, m, 81 -СН2 , 171 -СН2, 172 -CH2), 2.14 (2Н, m, 81 -СН2, 171 -СН2), 1.91 (3H, J=7.24 Hz d, 7-СН3), 1.61 (9Н, m, 18-СН3, -OCH2CH2CH3), 1.25 (4H, m, -OCH2CH2CH3), 1.24 (3Н, m, 82 -CH3), 0.11 (s, NH), -0.22 (s, NH)

4.2.2. Получение комплексов золота (I) на основе цистеина и аминоэтантиола

(5a) Гидрохлорид метилового эфира Z-цистеина (18 мг, 0,1 ммоль) растворяли в 1 мл холодного метанола и затем к нему по каплям прибавляли 0,25 мл 1М р-ра NaOH в метаноле, реакция перемешивалась в течении 15 минут в токе аргона. Хлорид трифенилфосфинаурата (ТФФА) (50 мг, 0,1 ммоль) растворяли в 1 мл холодного метанола и добавляли к реакции. После перемешивания в течении 4 часов в атмосфере аргона, растворитель удаляли на вакууме, получившиеся желтые кристаллы промывали водой и хлористым метиленом и затем перекристаллизовывали из метанола. Выход: 64%, желтые аморфные кристаллы.

Масс-спектр соединения (5a) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C22H23AuNO2PS [М+]: 593.09, найдено: 593.43 [М+].

31Р ЯМР соединения (5a) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 29.5 (стандарт ТФФА); 33.53 (S-Au-

p);

Элементный анализ соединения (5a). Рассчитано для C22H23AuNO2PS (%): C, 44.53; H, 3.91; N, 2.36; S, 5.40. Найдено (%): C, 44.66; H, 3.99; N, 2.28; S, 5.15.

(5b) Гидрохлорид аминоэтантиола (23 мг, 0,2 ммоль) растворяли растворяли в 1 мл ДМФА, затем к раствору прикапывали 55 мкл триэтиламина, реакция перемешивалась в течении 15 минут в токе аргона. Затем хлорид трифенилфосфинаурата (ТФФА) (100 мг, 0,2 ммоль) добавляли к реакции. После перемешивания в течении 3 часов при нагревании до 50оС в атмосфере аргона, растворитель удаляли на вакууме, получившиеся желтые кристаллы промывали водой и хлористым метиленом и затем перекристаллизовывали из метанола. Выход: 71 %, желтые аморфные кристаллы.

Масс-спектр соединения (5b) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C20H21AUNPS [М+]: 579.07, найдено: 579.40 [М+].

31Р ЯМР соединения (5b) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 29.5 (стандарт ТФФА); 33.52 (S-Au-

p);

Элементный анализ соединения (5b): рассчитано для C2oH21AuNPS (%): С, 44.87; Н, 3.95; N, 2.62; S, 5.99. Найдено (%): C, 44.91; H, 3.89; N, 2.42; S, 5.66.

(5c) ТФФА (50 мг, 0,1 ммоль) растворяли в 1 мл ДМФА. L-цистеина (12 мг, 0,1 ммоль) растворяли в 0,5 мл ДМФА и по каплям добавляли к раствору 69 мкл триэтиламина в течении 10 минут, затем полученную смесь приливали к раствору ТФФА и перемешивали в среде аргона в течении 3 часов. Растворитель удаляли на вакууме, полученные стеклоподобные аморфные кристаллы, промывали водой и хлористым метиленом.

Масс-спектр соединения (5c) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C21H21AuNO2PS [М+]: 535.08, найдено: 536.40 [М+И+].

31Р ЯМР соединения (5c) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 29.5 (стандарт ТФФА); 33.55 (S-Au-

p);

Элементный анализ соединения (5c): Рассчитано для C21H21AuNO2PS (%): С, 43.53; Н, 3.65; N, 2.42; S, 5.53. Найдено (%): C, 43.84; H, 3.41; N, 2.36; S, 5.19.

4.2.3. Получение конъюгатов комплексов золота (I) и дипропокси-БПИ

Соединение 3 a было выделено как не основной продукт при получении соединения 6.

(3a и 6) Дипропокси-БПИ (35 мг, 0,05 ммоль) растворяли в 2 мл хлористого метилена в среде аргона, затем к раствору добавляли ^этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (EEDQ) (18 мг, 0,075 ммоль) и перемешивали на холоду в течении 30 минут. Далее к реакции добавляли соединение 5a (89 мг, 0,15 ммоль) и перемешивали 48 часов. Реакцию контролировали по ТСХ. По окончании реакции смесь промывали подкисленной водой и экстрагировали хлористым метиленом. Органический слой упаривали и очищали на препаративной ТСХ в системе GR^b^^OH 25:1. Было получено 2 фракции. После отмывки от сорбента вещество кристаллизовали из раствора хлористый метилен:гексан 1:5. Выход: 5% (3a), 35% (6), темно красные кристаллы.

Масс-спектр соединения (3а) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C6lH7оAuN7O7PS [М+Н+]: 1272.44, найдено: 1272.37 [М+И+].

Элементный анализ соединения (3a). Рассчитано для C6lH69AuN7O7PS (%): С, 57.59; Н, 5.47; N, 7.71; S, 2.52. Найдено (%): C, 57.51; H, 5.52; N, 7.70; S, 2.51.

Масс-спектр соединения (6) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C81H87Au2N8O8P2S2 [М+Н+]: 1819.48, найдено: 1819.40 [М+И+].

Элементный анализ соединения (6). Рассчитано для C81H86Au2N8O8P2S2 (%): C 53.46; H 4.76; N 6.16; S 3.52; Найдено (%): C 55.10; H 5.01; N 6.31; S 3.11.

1H ЯМР соединения (6) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 8.77 (Н, s, 5-Н), 8.68 (Н, s, 10-Н), 8.64 (Н, s, 20-Н), 7.6-7.45 (30H, m, PPh3), 7.01 (2H, J=8.20 d, 173-NH, NH), 5.30 (Н, m, 17-Н), 4.33 (4H, m, -OCH2CH2CH3), 4.20 (2Н, m, 7-Н, 18-Н), 4.09 (Н, m, 8-H), 3.98 (3Н, s, 12-CH3), 3.56 (4H, m, -CHCH2S), 3.34 (3Н, s, 2-CH3), 2.70 (3Н, s, 32-C№), 2.56 (2Н, m, CHCH2S), 2.45 (2Н, m, 172-CH2), 2.15 (4Н, m, 81-СН2, 171-СН2), 1.91 (3H, J=7.24 Hz d, 7-СН3), 1.62 (9Н, m, 18-СН3, -OCH2CH2CH3), 1.25 (4H, m, -OCH2CH2CH3), 1.24 (3Н, m, 82-CH3), 0.11 (s, NH), -0.22 (s, NH).

(3b) Дипропокси-БПИ (35 мг, 0,05 ммоль) растворяли в 2 мл хлористого метилена в среде аргона, затем к раствору добавляли EEDQ (18 мг, 0,075 ммоль) и перемешивали на холоду в течении 30 минут. Далее к реакции добавляли соединение 5b (87 мг, 0,15 ммоль) и перемешивали 48 часов. Реакцию контролировали по ТСХ. Реакционную смесь промывали подкисленной водой и экстрагировали хлористым метиленом. Органический слой затем упаривали и очищали на препаративной ТСХ в системе CH2Ch:CH3OH 30:1. После отмывки от сорбента вещество кристаллизовали из раствора хлористый метилен:гексан 1:5. Выход: 45%, темно красные кристаллы.

Масс-спектр соединения (3b) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C59H57AuN?O5PS [М+]:, найдено: [M+H+] 1215.60.

Элементный анализ соединения (3b). Рассчитано для C59H67AuN7O5PS (%): C, 58.36; H, 5.56; N, 8.07; S, 2.64. Найдено (%): C 58.55; H 5.42; N 7.95; S 2.35.

Спектр 1H ЯМР соединения (3b) (300 МГц, CDCI3) 5H м.д.: 8.77 (Н, s, 5-Н), 8.68 (Н, s, 10-Н), 8.64 (Hs, 20-Н), 7.6-7.45 (15H, m, PPh3), 7.00 (H, J=8.20 d, 173-NH), 5.30 (Н, m, 17-Н), 4.33 (4H, m, -OCH2CH2CH3), 4.20 (2Н, m, 7-Н, 18-Н), 4.09 (Н, m, 8-H), 3.98 (3Н, s, 12-CH3), 3.56 (2H, m, -CH2CH2S), 3.34 (3Н, s, 2-CH3), 2.70 (3Н, s, 32-C№), 2.56 (2Н, m, -CH2CH2S), 2.45 (2Н, m, 172-CH2), 2.15 (4Н, m, 81-СН2, 171-СН2), 1.91 (3H, J=7.24 Hz d, 7-СН3), 1.62 (9Н, m, 18-СН3, -OCH2CH2CH3), 1.25 (4H, m, -OCH2CH2CH3), 1.24 (3Н, m, 82-C№), 0.16 (s, NH), -0.24 (s, NH).

(3e) Дипропокси-БПИ (35 мг, 0.05 ммоль) растворяли в 2 мл хлористого метилена в среде аргона, затем к раствору добавляли DCC (16 мг, 0,075 ммоль), перемешивали на холоду в течении часа. Затем к реакции добавляли N-гидроксисукцинимид (NHS) (0,15 ммоль) и перемешивали еще 1 час. Растворитель удаляли на вакууме, сукциниловый эфир соединения 1 выделяли при помощи препаративной ТСХ в системе CH2Ch:CH3OH 50:1. Полученные красные кристаллы растворяли в 1 мл хлористого метилена, прибавляли 0,15 ммоль соединения 5b и перемешивали 36 часов. Реакцию контролировали по ТСХ. Реакционную смесь промывали подкисленной водой

100

и экстрагировали хлористым метиленом. Органический слой упаривали и очищали на препаративной ТСХ в системе СШС^СБзОН 50:1-25:1-50:1. После отмывки от сорбента вещество кристаллизовали из раствора хлористый метилен:гексан 1:5. Выход: 30%, темно красные кристаллы.

Масс-спектр соединения (3e) (MALDI TOF) m/z рассчитано для C60H68AUN7O7PS [М+Н+]: 1258.42, найдено: 1258.34 [М+Н+].

Элементный анализ соединения (3e). Рассчитано для C60H67AUN7O7PS (%): С 57.27; Н 5.37; N 7.79; S 2.55; Найдено (%): C 57.31; H 5.61; N 8.01; S 2.01.

1H ЯМР соединения (3e) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 8.77 (Н, s, 5-Н), 8.68 (Н, s, 10-Н), 8.64 (Н, s, 20-Н), 7.58-7.46 (15Н, m, РРЬз), 7.01 (Н, J=8.20 d, 173-NH), 5.30 (Н, m, 17-Н), 4.33 (4H, m, -ОСН2СН2СН3), 4.20 (2Н, m, 7-Н, 18-Н), 4.09 (Н, m, 8-H), 3.98 (3Н, s, 12-СНз), 3.56 (1H, m, -CHCH2S), 3.34 (3Н, s, 2-СН3), 2.70 (3Н, s, 32-СН3), 2.56 (2Н, m, -CHGEaS), 2.45 (2Н, m, 172-СН2), 2.15 (4Н, m, 81-СН2, 171-СН2), 1.91 (3H, J=7.24 Hz d, 7-СН3), 1.62 (9Н, m, 18-СН3, -ОСН2СН2СН3), 1.25 (4H, m, -ОСН2СН2СН3), 1.24 (3Н, m, 82-СН3), 0.11 (s, NH), -0.22 (s, NH)

4.2.4. Получение гистидин и гистамин содержащих производных дипропокси-БПИ

Дипропокси-БПИ (60 мг, 0,09 ммоль) растворяли в 2 мл хлористого метилена, затем добавляли EDC (0,135 ммоль) и NHS (0,234 ммоль) и перемешивали при 0 °C. После активации, которая продлилась 1 час, гидрохлорид метилового эфира гистидина или гидрохлорид гистамина (0,45 ммоль) добавляли в реакцию с последующим прикапыванием 200 мкл Et3N. Реакцию проводили в среде аргона 36 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Продукты выделяли при помощи препаративной ТСХ в системе хлористый метилен:метанол 20:1 (7a) и 15:1 (7b).

Выход (7a): 60%, темно красные кристаллы.

1H ЯМР соединения (7a) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 8.53 (1Н, s, 5-Н); 8.48 (1Н, s, 10-Н); 8.43 (1H, bs, 7'-NH); 8.36 (1Н, s, 20-H); 7.49 (1H, s, 8'-H); 7.15 (1H, s, 6'-H); 5.11 (1H, d, 1'-NH); 4.504.36 (4H, m, 2Х-ОСН2СН2СН3); 4.33 (1H, t, 2'-СН); 4.20-3.91 (3H, m, 7-H, 18-H, 8-H); 3.75 (3H, s, 2'-СООСН3); 3.55 (3H, s, 21-СН3); 3.41 (2H, m, 3'-СШ); 3.24 (3H, s, 121-СН3); 2.7 (3H, s, 32-С№); 2.48 (6H, m, 171 СН2; 2Х-ОСН2СН2СН3); 2.31 (2H, m, 81-СН2); 1.99 (2H, m, 172-СШ); 1.78 (3H, d, -ОСН2СН2СН3); 1.68 (3H, d, -ОСН2СН2СН3); 1.26 (3H, s, 181-СН3); 1.17 (3H, t, 71-СН3); 1.07 (3H, t, 82-СН3); 0.42 (1H, bs, NH); 0.12 (1H, bs, NH).

13С ЯМР соединения (7a) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 175.8, 173.3, 171.3, 171.1 - С173, С19,

С6, С9; 174.3 - C2''; 165.7, 161.2, 159.9 - С16, С151, С131; 151.0 - С31; 141.9, 138.2, 134.4, 134.0,

132.4, 129.9, 128.9, 112.8 - С11, С12, С1, С4, С14, С2, С13, С3; 134.5 - C6'; 131.6 - C4'; 118.2 -

101

C8'; 102.0, 100.8, 98.4, 95.8 - C5, C10, C20, C15; 78.6, 76.3 - 2x-OCH2CH2C№; 55.2 - C2'; 52.0 -C3'; 53.8, 52.7, 48.6, 48.1 - C7, C18, C17, C8; 34.1, 31.2, 30.1 - C173; C81; C172; 29.7 - COOCH3; 23.3, 22.8, 22.5 - C71, 2x-OCH2CH2CH3; 11.8, 11.7, 10.8, 10.5, 10.2 - C121, C21, C82, 2x-OCH2CH2CH3

Выход (7b): 60%, темно красные кристаллы.

1H ЯМР соединения (7b) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 8.498 (1H, s, 5-H); 8.478 (1H, s, 10-H); 8.361 (1H, s, 20-H); 7.804 (1H, bs, 5'-CH); 7.160 (1H, s, 7'-CH); 5.040 (1H, s, 1'-NH); 4.438 (2H, t, -OCH2CH2CH3); 4.37 (2H, t, -OCH2CH2CH3); 4.20-4.00 (3H, m, 7-H, 18-H, 8-H); 3.96 (2H, m, 1'-CH2); 3.63 (3H, m, 21-CH3); 3.51 (3H, s, 121-CH3); 3.23 (2H, m, 3'-CH2); 2.70 (3H, s, 32-C№); 2.32 (2H, m, 81-CH2); 2.08-1.92 (8H, m, 172-CH2; 2x-OCH2CH2CH3); 1.78 (3H, d, -OCH2CH2CH3); 1.65 (3H, d,-OCH2CH2CH3); 1.62 (2H, s, 171-CH2); 1.10 (6H, d, 181-CH3; 71-CH3); 0.86 (3H, d, 82-C№); 0.38 (1H, bs, NH); 0.08 (1H, bs, NH).

13С ЯМР соединения (7b) (300 МГц, CDCI3) 5 м.д.: 175.8, 173.3, 171.3, 171.1 - C173, C19, C6, C9; 165.7, 161.2, 159.9 - C16, C151, C131; 151.0 - C31; 141.9, 138.2, 134.4, 134.0, 132.4, 129.9, 128.9, 112.8 - C11, C12, C1, C4, C14, C2, C13, C3; 134.5 - C6'; 131.6 - C4'; 118.2 - C8'; 102.0, 100.8, 98.4, 95.8 - C5, C10, C20, C15; 78.6, 76.3 - 2x-OCH2CH2C№; 55.2 - C2'; 52.0 - C3'; 53.8, 52.7, 48.6, 48.1 - C7, C18, C17, C8; 34.1, 31.2, 30.1 - C173; C81; C172; 23.3, 22.8, 22.5 - C71, 2x-OCH2CH2CH3; 11.8, 11.7, 10.8, 10.5, 10.2 - C121, C21, C82, 2x-OC№C№CH3

4.2.4. Получение NHC-гистидин и NHC-гистаминсодержащих производных

дипропокси-БПИ

Соединение 7a или 7b (25 мг, 0,03 ммоль) растворяли в ацетонитриле, затем добавляли иодметан (60 мкл, 0,60 ммоль), (8% в ацетонитриле) и K2CO3 (41мг, 0,30 ммоль). Реакцию проводили при кипячении в течение 16 часов в атмосфере аргона. Далее реакционную массу остужали до комнатной температуры. Растворитель удаляли при пониженном давлении. К осадку добавляли хлористый метилен и полученную суспензию отфильтровывали через бумажный фильтр. Фильтрат концентрировали под вакуумом и затем продукты перекристаллизовывали из петролейного эфира.

Выход (8a): 37%, темно красные кристаллы.

HRMS m/z рассчитано для: 876,48 (M+), найдено: 876,4730 (M+).

Выход (8b): 52%, темно красные кристаллы.

HRMS m/z рассчитано для: 818,47 (M+), найдено: 818,4384 (M+).

4.2.5. Получение С-донорных комплексов золота (I) на основе NHC-гистидина и NHC-

гистамина

Соединения lla и llb были получены по стандартной методике [163]. Далее проводили удаление boc-защиты. Boc-защищенное соединение NHC (lla или llb) 150 мг растворяли в 5 мл 2М HCl в диоксане, реакцию проводили в течение 24 ч при комнатной температуре. Снятие защиты контролировалось методом TLC. Продукт был выделен путем удаления растворителя в вакууме.

NHC соединения (l2a или l2b) (100 мг или 70 мг, 0,5 ммоль) растворяли в хлористом метилене, колбу укрывали темной светонепроницаемой пленкой и затем добавляли (115 мг, 0,5 ммоль) оксида серебра (I). Реакцию проводили при перемешивании в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение часа. Затем добавляли хлорид диметилсульфида золота (I) (200мг, 0,5 ммоль) к реакционной массе, реакция перемешивалась еще час в тех же условиях. По завершению реакции растворитель удаляли под вакуумом и получали бледно желтые кристаллы. Продукт выделяли перекристаллизацией из системы хлористый метилен:гексан 1:1. Выход (l2a): 78% темно желтая маслянистая жидкость;

1H ЯМР (300 MHz, CDCb) S м.д.: 3.24 (t, 2H, CH2), 3.77 (t, 3H, -OCH3), 3.97 (d, 3H, 2xN-CH3), 5.70 (s, 1H, 5-Ar-H), 7.30 (s, 1H, 3-Ar-H), 9.79 (s, 1H, NH).

13C ЯМР (300 MHz, CDCb) S м.д.: 26.43-O-CH3; 34.34-N-CH3; 36.73-N-CH3; 52.01-OCH3; 53.21-CH; 121.47-5-Ar-C; 131.72-1-Ar-C; 137.13-3-Ar-C; 170.64-C=O. Выход (l2b): 89% темно желтая маслянистая жидкость;

1H ЯМР (300 MHz, CDCb) S м.д.: 2.90 (t, 2H, CH2), 3.39 (t, 2H, CH2), 3.91 (s, 3H, N-CH3), 3.95 (s, 3H, N-CH3), 5.51 (s, 1H, N-H), 7.37 (s, 1H, 5-Ar-H), 9.60 (s, 1H, 3-Ar-H).

13C ЯМР (300 MHz, CDCb) S м.д.: 24.53-CH2; 34.39-N-CH3; 36.50-N-CH3; 38.18-CH2; 121.68-5-Ar-C; 131.71-1-Ar-C; 137.14-3-Ar-C;

Выход (^a): 72% аморфные желтые кристаллы;

13C ЯМР соединения (13a) (300 MHz, CDCb) Sм.д.: 26.48-O-CH3; 34.34-N-CH3; 36.73-N-CH3; 50.91-CH; 53.21-CH2; 122.71-5-Ar-C; 132.68-1-Ar-C; 144.137-C-Au; 170.64-C=O.

Элементный анализ соединения (13a). Рассчитано для C9Hl5AuN?ClO2 (%): C 25.16; H 3.52; N 9.78; Au 45.84; O 7.45; Cl 8.25. Найдено (%): C 25.13; H 3.55; N 9.76; Cl 8.29. Выход (13b): 89% аморфные желтые кристаллы;

13C ЯМР соединения (1ЗЬ) (300 MHz, CDCb) S м.д.: 34.34-N-CH3; 36.74-N-CH3; 52.01-CH2; 53.21-CH2; 122.68-5-Ar-C; 132.61-1-Ar-C; 144.98-C-Au;

Элементный анализ соединения (1ЗЬ). Рассчитано для C?Hl3AuN3Cl (%): C 22.62; H 3.53; N 11.31; Au 53.00; O 0.00; Cl 9.54. Найдено (%): C 22.67; H 3.55; N 11.31; Cl 9.52.

4.2.6. Синтез конъюгатов С-донорных комплексов золота (I) и дипропокси-БПИ

Дипропокси-БПИ (60 мг, 0,09 ммоль) растворяли в 2 мл CH2CI2, затем добавляли EDC (0,135 ммоль) и NHS (0,234 ммоль) с последующим перемешиванием в атмосфере аргона при 0оС в течение 1 часа. По завершению активации добавляли 0,45 ммоль комплекса (13a или 13b). Далее реакция проводилась в течение 36 часов в атмосфере аргона при перемешивании. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Продукт выделяли методом препаративной ТСХ в системе хлористый метилен:метанол 10:1.

Выход (9a): 25%, темно красные кристаллы.

HRMS (m/z): Рассчитано для (C48H62AUCIN9O7): 1107.40 [М+Н+], найдено: 1107.4002 [M+H+].

Элементный анализ соединения (9a). Рассчитано для (C48H61AUCIN9O7) (%): C 52.01; H 5.55; N 11.37; Au 17.77; O 10.10; Cl 3.30; Найдено (%): C 52.06; H 5.58; N 11.39; Cl 3.27

Выход (9b): 32%, темно красные кристаллы.

HRMS (m/z): Рассчитано для (C46H59AUCIN9O5): 1049.17 [М+]: найдено: 1049.4020 [М+].

Элементный анализ соединения (9b) Рассчитано для (C46H59AUCIN9O5) (%): C 52.60; H 5.66; N 12.00; Au 18.75; O 7.62; Cl 3.38; Найдено (%): C 52.62; H 5.68; N 12.01; Cl 3.36.

4.2.7. Синтез аминокабоксилатного комплекса олова (IV)

Дипропокси-БПИ модифицированный метиловым эфиром лизина 14 был получен по ранее отработанной методике [164].

Соединение 14 (84 мг, 0,1 ммоль) растворяли в 5 мл ацетонитрила и добавляли 200 мкл триэтиламина, спустя 30 мин добавляли триметилолово хлорид (50 мг, 0,25 ммоль) и перемешивали в течение суток. Ход реакции контролировали хроматографически. Затем проводили экстракцию реакционной смеси хлористым метиленом и водой. Полученный экстракт концентрировали и очищали методом препаративной ТСХ дихлорметан:метанол 30:1.

Выход (15): 20%, темно красные кристаллы.

MALDI-MS (m/z) [М+]: рассчитано для C49H70^O7Sn 1002.44 (100.0%), 1000.44 (75.9%), 1001.44 (59.5%), 1003.44 (49.0%), 999.44 (41.9%), 998.44 (38.6%), 1006.44 (15.6%), 1004.44 (14.8%), 1004.45 (13.3%), 1002.45 (10.2%), 1007.45 (8.6%), 1005.44 (7.2%), 1003.45 (6.1%); найдено: [M+H+] 1003.44 (100%), 1001.44 (70.1%), 1002.44 (58.5%), 1003.44 (48.0%), 999.44 (41.9%), 998.44 (38.6%), 1006.44 (13.1%), 1004.44 (14.8%), 1004.45 (7.3%), 1002.45 (5.2%)

4.2.8. Получение карбоксилатных комплексов парааминобензойной кислоты и a-Fmoc-s-

Boc-Лизина

4-Аминобензойную кислоту (138 мг, 1 ммоль) или a-Fmoc-8-Бос-Лизин (482 мг, 1 ммоль) растворяли в 4 мл метанола и добавляли 1 мл 1 M KOH. Реакцию перемешивали в 10 минут и затем добавляли триметилолово хлорид (200 мг, 1 ммоль). Далее реакцию проводили при перемешивании и нагревании до 45оС в течение 96 часов. Реакционную массу остужали до комнатной температуры и затем растворитель удаляли на вакууме. Осадок перерастворяли небольшим количеством хлороформа. Полученную суспензию отфильтровывали через бумажный фильтр, фильтрат упаривали. Продукт получали перекристаллизацией из смеси этанол:петролейный эфир 1:1.

Выход (17): 57%, белые аморфные кристаллы;

ИК: V (O-Sn) 429 см-1, v (C-Sn) 505 см-1, v (СОО- сим.) 1516 см-1, v (COO- асим.) 1647

-1 см ;

1Н-ЯМР соединения (17) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 7.57 (d, 2Н, J = 7.7 Hz), 6.49 (d, 2H, J = 7.7 Hz), 5.57 (br. s, 2H), 0.45 (t, 9H, J = 34.2 Hz).

Выход (18): 49%, белый порошок;

ИК: v(O-Sn) 548 см-1, v(C-Sn) 621 см-1, v (COO- сим.) 1248 см-1, v (COO- асим.) 1516 см-1;

1Н-ЯМР соединения (18) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 7.13-7.91 (m, 8Н), 6.73 (m, 1Н), 5.73 (m, 1Н), 4.20 (m, 2H), 3.76 (m, 1H), 3.36 (m, 1H), 2.87 (q, 2H, J = 6.0 Hz), 1.15-1.42 (m, 15H), 0.38 (t, 9H, J = 34.2 Hz).

4.2.9. Получение конъюгатов карбоксилатных комплексов олова (IV) и дипропокси-БПИ

Дипропокси-БПИ (35 мг, 0,05 ммоль) растворяли в 3 мл дихлорметана. Затем добавляли ББС (0,075 ммоль) и NHS (0,13 ммоль), затем реакция перемешивалась в токе аргона при 0оС в течении часа. Далее добавляли 0,3 ммоль комплекса олова (17 или 18) и 0,02 ммоль триэтиламина. Реакция перемешивалась еще 48 часов в среде аргона. Целевые продукты были выделены методом колоночной хроматографии с использование мсистемы элюэнтов хлороформ:метанол 30:1.

Выход (19): 43%, темно красные кристаллы.

MALDI MS m/z [M+]: рассчитано для C49H6lN7O7Sn 978.37, найдено [M+] 978.74;

ИК: v (O-Sn) 504 см-1, v (C-Sn) 548 см-1, v (COO- сим.) 1288 см-1, v (COO- асим.) 1602

см-1;

^-ЯМР соединения (19) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 8.62 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.90 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 6.65 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 5.23 (m, H), 4.46 (m, 4H), 4.24 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.29 (s, 2H), 2.75 (s, 2H), 2.42 (m, 2H), 2.34 (m, H), 2.002.09 (m, 6H), 1.80 (m, 3H), 1.69 (m, 3H), 1.14-1.26 (m, 9H), 0.58 (t, 9H, J = 34.19 Hz), 0.22 (br. s, 2H).

UV/VIS (CH2CI2) Xmax, nm (s, M-1 см-1): 367 (61,600), 419 (36,200), 546 (20,500), 800 (29,000).

Выход (20): 37%, темно красные кристаллы.

MALDI MS m/z [M + H+]: рассчитано для C53H76№O9Sn 1088.48, найдено [M + H+] 1088.53;

ИК: v(O-Sn) 574 см-1, v(C-Sn) 675 см-1, v (COO- сим.) 1115 cm-1, v (COO- асим.) 1546

^-ЯМР соединения (20) (300 МГц, ДМСО^6) 5 м.д.: 8.62 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 5.11 (m, 2H), 4.45 (m, 4H), 4.34 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 4.02 (m, 1H),3.75 (m, 1H), 3.69 (m, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.52-3.61 (m, 6H), 3.29 (s, 2H), 2.75 (s, 2H), 2.34 (m, 2H), 1.88-2.09 (m, 6H), 1.81 (m, 3H), 1.68 (m, 3H), 1.09-1,26 (m, 9H), 0.00 (m, 18H), -0.07 (brs, 1H), -0.16 (brs, 1H).

UV/VIS (CH2CI2), Xmax, nm (s, M-1 см-1): 367 (72,500), 419 (43,000), 546 (24,600), 800 (34,600).

4.3 Молекулярный докинг комплексов олова (IV)

Исследования молекулярного докинга проводились с использованием программного обеспечения HEX 8.0.0 (Dave Ritchie, Париж, Франция). Приготовление рецептора проводили с использованием программного обеспечения UCSF Chimera 1.15 (Ресурс для биокомпьютеров, визуализации и информатики Калифорнийского университета, Сан-Франциско, Калифорния, США). Кристаллическая структура В-ДНК (PDB ID: 1BNA) была получена из банка данных о белках (http://www.rcsb.org./pdb, доступ к которому был получен 20 октября 2020 г.). Для докинга в HEX использовались следующие параметры: тип корреляции только по форме, постобработка с минимизацией OPLS, режим FFT 3D, размер сетки 0,6, диапазон рецепторов 180, диапазон лигандов 180, диапазон вращения 360 и диапазон расстояний 40.

4.4 Тест связывания ДНК и комплексов олова (IV)

Одноцепочечную ДНК (ss-ДНК) растворяли в деионизированной воде и перемешивали в течение 12 ч (рН = 7,0) при температуре 4°C. Буферный раствор готовили с использованием

деионизированной воды (20 мм фосфатного буфера NaH2PO4-Na2HPÜ4, рН = 7,2). Чтобы подтвердить, что ДНК в значительной степени не содержит белка, для раствора ss-ДНК в буфере было получено значение оптической плотности, равное 2,5115 при длине волны 261 нм. Концентрацию ДНК определяли по закону Бугера-Ламберта-Бера, согласно которому при молярном коэффициенте поглощения, равном 6600 М-1 см-1 (261 нм), концентрация ДНК составляет 7,6 х 10-3 М. Соединения растворяли в 70%-ном этаноле. Концентрация исследуемых соединений составляла 23,8 мкМ. Измерения поглощения в УФ-видимой области проводились при фиксированной концентрации соединений, в то время как концентрация раствора ДНК варьировалась (1-40 мкМ). Чтобы исключить сигналы поглощения самой ДНК при измерении контрольных образцов, также использовались эталонные образцы, содержащие тот же объем ДНК заданной концентрации. Перед экспериментом растворы комплексов инкубировали с ДНК в течение примерно 5 минут при комнатной температуре.

Спектры поглощения регистрировали в кварцевых кюветах (1 см) при комнатной температуре (25 ± 1°C) с шагом 1 нм при 3х сканированиях одной точки.

4.5. Приготовление мицеллярных растворов соединений 1, 3a,e, 6, 7a,b, 8a,b, 9a,b,

17,18,19,20

Раствор соединения в хлористом метилене (1-2 мл) добавляли по каплям к свежеприготовленному 4% водному раствору Kolliphor® ELP (5 мл), нагретому до 42°C при непрерывном барботировании аргоном. Барботирование продолжали до тех пор, пока не начиналось сильное пенообразование. Получали прозрачный раствор с концентрацией 0,25 мг/мл, который затем фильтровали поочередно через ПТФЭ-фильтр с размером пор 0,45 мкм, а затем через ПТФЭ-фильтр с размером пор 0,22 мкм. Таким образом были получены мицеллярные растворы соединений: 1, 3a,e, 6, 7a,b, 8a,b, 9a,b, 17, 18, 19, 20. Контроль концентрации полученных мицеллярных растворов осуществляли спектрофотометрически.

4.6. Исследования in vitro S-донорных комплексов золота (I)

Клеточные линии карциномы толстой кишки человека HCT116 (ATCC), ее сублинии

HCT116p53KO (обе аллели p53 удалены) и карциномы молочной железы MCF7 (ATCC) были

размножены на среде Eagle, модифицированной компанией Dulbecco (PanEco, Россия), с

добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, Logan, UT), 2 мМ раствор L-

глютамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 370 С, 5% CO2 во влажной

атмосфере. Во всех экспериментах использовались ячейки в логарифмической фазе. Соединения

107

4-6 растворяли в ДМСО в виде 10-миллимолярных исходных растворов с последующим последовательным разведением в воде непосредственно перед экспериментами. Цитотоксичность определяли с помощью конверсионного анализа формазана (MTT-тест) [165]. Для изучения внутриклеточного накопления соединения 6 клетки HCT116 (2 х105 в 3 мл культуральной среды) обрабатывали 2 мкМ 6 в течение 1-24 часов при 370°C, 5% CO2 с последующей промывкой холодным физиологическим раствором и немедленным анализом методом проточной цитометрии на приборе BD FACSCanto II (BD Biosciences, США) в лабораторных условиях. Канал PE-CyTM5 (фильтр 670/14). Значения среднего канала флуоресценции, параметра, который соответствует связанной с клетками флуоресценции тестируемых соединений, были рассчитаны на основе гистограмм после получения 10 000 'событий'. Данные были проанализированы с помощью программы FACSDiva (BD Biosciences). Для микроскопического исследования гибели клеток клетки HCT116 помещали в 35-миллиметровые чашки Петри (2x105 в 2,5 мл среды) на ночь и либо оставляли без обработки (интактными), либо обрабатывали 1 мкМ 6 в течение 24 часов при освещении (ФДТ) или без освещения (темновая токсичность) (200 Дж/см2; a 798±2 нм монохроматический источник света (LPhT Biospec, Россия)) с последующим окрашиванием 10 мкг/мл PI в течение 5 мин. Снимки были сделаны с помощью инвертированного микроскопа Carl Zeiss.

4.7. Исследования in vitro C-донорных комплексов золота (I)

Культуры клеток человека, использованные в экспериментах, включали аденокарциному

предстательной железы (PC-3) и колоректальную карциному (HCt116). Опухолевые клетки

инкубировали в пластиковых колбах с поверхностью роста клеток 25 см2 (Costar, Вашингтон,

округ Колумбия, США) на RPMI-1640 (культура клеток PC-3) и среде Eagle (HCt116) с

добавлением раствора L-глютамина и 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (PanEco,

Москва, Россия). Клетки инкубировали при температуре 37°C во влажной среде, содержащей 5%

CO2 (Binder CO2 incubator, Тутлинген, Германия). Использовали клеточные линии от 3 до 7

пассажей. В экспериментах по оценке фотоиндуцированной активности соединений клетки

культивировали в 96-луночных культуральных планшетах в концентрации 105 клеток на мл (где

их инкубировали в течение 24 ч после воздействия света) или 7 х 104 клеток на мл (где их

инкубировали в течение 48 и 72 ч после воздействия света). облучение). Затем добавляли

растворы соединений до конечной концентрации в диапазоне от 0,03 мкМ до 29 мкМ. После 4-

часовой инкубации с фотосенсибилизаторами клетки облучали галогенной лампой через

широкополосный фильтр KS-19 (X > 720 нм). Плотность мощности составляла 19,5 ± 1,0

МВт/см2, а расчетная световая доза - 10 Дж/см2. После завершения облучения чашки с клетками

108

помещали в С02-инкубатор на 24, 48 или 72 часа соответственно. Для оценки цитотоксической активности клетки инкубировали с соединениями в темноте в течение выбранных периодов времени. Выживаемость клеток оценивали с помощью колориметрического МТТ-теста. На основании результатов были рассчитаны значения IC50, т.е. концентрации ФС, которые обеспечивали 50%-ную гибель клеток. Количественные параметры были рассчитаны по результатам трех независимых тестов.

4.8. Исследования in vitro O-донорных комплексов олова (IV) 4.8.1. Исследования фотоиндуцированной и темновой цитотоксичности

В экспериментах использовали следующие культуры клеток человека: аденокарцинома предстательной железы (PC-3); аденокарцинома молочной железы (MCF-7); карцинома легкого (A-549); аденокарцинома шейки матки (Hela); и саркома мыши (S-37). Опухолевые клетки инкубировали в пластиковых колбах с поверхностью роста клеток 25 см2 (Costar, Corning, Нью-Йорк, США) в среде DMEM (культура клеток S-37), RPMI-1640 (культура клеток PC-3) или среде Eagle (MCF-7 и A-549) с L-глютамин с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (PanEco, Москва, Россия). Инкубацию клеток проводили при температуре 37°C во увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2 (инкубатор Binder CO2, Тутлинген, Германия). Использовали клеточные линии от 3 до 7 пассажей. В экспериментах по оценке фотоиндуцированной активности соединений клетки культивировали в 96-луночных культуральных планшетах в концентрации 105 клеток на мл (при инкубации в течение 24 ч после воздействия света) или 7 х 104 клеток на мл (при инкубации в течение 48 ч после облучения). Их инкубировали в течение 28-30 ч при температуре 37°C (увлажненная атмосфера, 5% углекислого газа). Затем добавляли растворы соединений до конечной концентрации от 0,03 мкг/мл до 20 мкг/мл. После 4-часовой инкубации с фотосенсибилизаторами клетки облучали галогенной лампой через широкополосный фильтр KS-19 (X > 720 нм). Плотность мощности составляла 19,5 ± 1,0 МВт/см2, а расчетная световая доза - 10 Дж/см2. После завершения облучения планшеты с клетками помещали в С02-инкубатор на 24 или 48 часов. Для оценки цитотоксической активности клетки инкубировали с соединениями в темноте в течение выбранных периодов времени. Выживаемость клеток оценивали с помощью колориметрического МТТ-теста. На основании полученных результатов были рассчитаны значения IC50, т.е. концентрации ФС, при которых после воздействия происходит гибель 50% клеток. Количественные параметры были рассчитаны по результатам трех независимых тестов.

4.8.2 Изучение внутриклеточного распределения

Клетки A549 инкубировали при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности в среде DMEM/F12 (PanEco, Москва, Россия) с добавлением 2 мМ раствора глутамина и 5% фетальной бычьей сыворотки. Повторный посев проводили два раза в неделю. За день до эксперимента клетки культивировали на покровных стеклах в лунках 24-луночного планшета в количестве 105 клеток на лунку.

Клетки инкубировали с 0,5 мкм соединений 4, 5 или 6 в течение 3 ч. В последние 15 мин инкубации добавляли 5 мкм красителя Hoechst 33342, который избирательно окрашивает клеточные ядра.

Измерения проводились с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 710 (Оберкохен, Германия). Лазер с длиной волны 488 нм использовался для возбуждения флуоресценции 1, 19 или 2G. Флуоресценцию регистрировали в диапазоне >650 нм с помощью высокочувствительного APD-детектора. Для возбуждения флуоресценции красителя Hoechst 33342 использовался лазер с длиной волны 405 нм. Флуоресценция была обнаружена в диапазоне 415-500 нм.

4.9. Исследования in vivo S-донорных комплексов золота (I)

Самки мышей Fl BxD (возраст 8-10 недель, вес 18-22 г) были приобретены в Научно-

исследовательском центре биомедицинских технологий (Андреевка, Россия) и размещены в

помещении Национального медицинского исследовательского центра радиологии. Все

манипуляции проводились в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных

животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS 123). Мышей

содержали при температуре 21±1°С, влажности 50-60%, добавляли корм и воду в

неограниченном количестве. Клетки саркомы S37, размножившиеся в виде опухолевого асцита,

были растворены физиологическим раствором и трансплантированы подкожно. в заднюю ногу

(50 мкл на животное). После того, как объем опухолевых очагов достигал —1-1,5 см3 (обычно к

8-му дню после трансплантации), в хвостовую вену вводили соединение б (5 мг/кг в 200 мкл

физиологического раствора, однократное болюсное введение). Каждая группа состояла из 10

мышей. За процессом накопления б мышей наблюдали с помощью микроскопа LESA Biospec

(Биоспек, Россия) путем измерения флуоресценции локальных тканей с определенными

интервалами времени (каждое измерение проводилось трижды). Для проверки

противоопухолевой терапевтической эффективности 30 мышей с трансплантатами S37 были

110

разделены на три группы. Мышам вводили 200 мкл физиологического раствора (контрольная группа; 10 животных) или 5 мг/кг соединения 6 в 200 мкл физиологического раствора (20 животных). Последнюю группу либо оставляли без ФДТ ("темная"; 10 животных), либо обрабатывали лазером с длиной волны 798±2 нм (300 Дж/см2, плотность мощности 200 МВт/см2) через 3 часа после инъекции соединения 6 (группа "ФДТ"; n=10). За животными наблюдали ежедневно в течение 14 дней. За весь период наблюдения не было зарегистрировано никаких признаков общей токсичности, таких как выпадение шерсти, изменение привычек питания или поведения. Противоопухолевую эффективность определяли путем измерения объема опухоли: V=d1 x d2 x d3, где d1, d2 и d3 - перпендикулярные диаметры опухолевой массы. TGR рассчитывали как [(Vexp-Vctrl)/Vctrl] x 100%, где Vexp и Vctrl - средние объемы опухоли в экспериментальной ("темная" и "ФДТ") когортах и контрольной (физиологический раствор) группах соответственно.

4.10. Исследования in vivo C-донорных комплексов золота (I)

Специфические, не содержащие патогенов (SPF) мыши BALB/c nu/nu, самцы, 8-12-недельного возраста, были получены из Российского национального центра генетических ресурсов лабораторных животных при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук. Все животные были доставлены с ветеринарным паспортом и сертификатом качества. Все процедуры по регулярному уходу за животными проводились в соответствии со стандартными операционными процедурами и санитарными правилами проектирования, оснащения и технического обслуживания экспериментальных биологических клиник и руководством по лабораторным животным [166, 167].

В качестве модели опухоли использовали аденокарциному предстательной железы человека PC-3. Для проведения имплантации животным вводили клеточную суспензию в количестве 7 х106 клеток на мышь в культуральной среде. Для проведения экспериментов клетки PC-3 были инокулированы мышам nu/nu, самцам, в количестве 0,1 мл подкожно в паховую область на внутренней стороне бедра.

Исследование биораспределения и оценка флуоресцентного контраста соединений (доза 2,0 мг/кг в пересчете на дипропокси-БПИ 1, однократное внутривенное введение) были проведены ex vivo у мышей с опухолью PC-3 (110 ± 10 мм3 — 7-й день роста). Для количественного определения содержания ФС в опухоли и окружающей коже использовали локальную флуоресцентную спектроскопию (LFS). Уровень нормализованной флуоресценции, отражающий накопление фотоактивной формы ФС в тканях мышей, оценивали с помощью

лазерной установки для флуоресцентной диагностики и контроля ФДТ "ЛЕСА-01" (BIOSPEK, Биоспек, Россия).

Через различные промежутки времени после инъекции фотосенсибилизатора (5, 15 мин, 2, 4, 6, 14 и 24 ч) животных помещали в камеру для эвтаназии с использованием CO2 (ZOONLAB GmbH, Кастроп-Рауксель, Германия), затем отбирали образцы опухолевой и кожной ткани для оценки их флуоресценции. Экзогенную флуоресценцию измеряли ex vivo сразу после эвтаназии животного контактным методом. Нормализованную флуоресценцию (NF) оценивали при длине волны, соответствующей пику флуоресценции PS, т.е. 811 ± 2 нм. Флуоресценцию возбуждали в красной области спектра (X = 633 нм). Математическую обработку спектров флуоресценции проводили с использованием программного обеспечения LESA-01 O1-BIOSPEC. Интегральную интенсивность флуоресценции ФС в ткани (S1) нормировали на интегральную интенсивность сигнала диффузного обратного рассеяния возбуждающего лазерного излучения (S2). Нормализованную флуоресценцию ФС в биологических образцах определяли как отношение площадей под кривой S1/S2 [168, 169]. Флуоресцентный контраст (FC) ФС в опухолевой ткани рассчитывали по отношению к окружающей коже.

Фотоиндуцированную противоопухолевую активность соединений изучали на мышах с ксенотрансплантатами аденокарциномы PC-3 (110 ± 8 мм3 — 7-й день роста). Доза исследуемых соединений была выбрана равной 1,0 мг/кг (в пересчете на дипропокси-БПИ 1) на этапе предварительных исследований и вводилась однократно внутривенно. Временной интервал перед облучением был определен на основании результатов биораспределения и флуоресцентного контраста и составил 15 минут. Облучение поверхности проводили с помощью лазерного прибора для ФДТ ALHT-ELOMED (Россия) с максимумом излучения 810 нм, мощностью 4 Вт, что соответствует области поглощения исследуемых соединений. Режимы облучения: плотность мощности Ps = 100 МВт/см2, плотность энергии E = 90 Дж/см2. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl или исследуемые соединения без облучения. Опухоль животного облучали одиночным световым пучком диаметром 10 мм, который полностью покрывал опухоль и окружающие ткани на 1-2 мм. За пять-семь минут до облучения животное обезболивали путем внутрибрюшинного введения 0,25% раствора дроперидола в дозе 0,1 мл на мышь. Клинический осмотр животных проводили через 2 ч после лечения и в дальнейшем каждые 2-3 дня. Размер опухоли регистрировали в течение 21 дня, а объем опухоли рассчитывали по формуле: V = a х b х c х 0,52, где a, b и c - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли. Наблюдение продолжалось в течение 30 дней после лечения, затем животных усыпляли и макроскопически оценивали наличие или отсутствие опухолевой массы. Отсутствие опухолевого узла через 30 дней после лечения рассматривали как ремиссию. Критерии оценки эффективности включали: ингибирование роста опухоли (ITG) и количество ремиссий (RN)

112

[170]. ФС считался высокоэффективным, если соблюдался один из критериев: ГТС > 70%, RN = 50-100%.

Были рассчитаны среднее арифметическое значение по группе (М) и стандартная ошибка среднего значения (т) для всех количественных значений и представлены в таблицах и рисунках. Различия между экспериментальной и контрольной группами считались статистически значимыми при р < 0,05.

5.ВЫВОДЫ

1) Разработана эффективная стратегия синтеза комплексов золота (Г) на основе S- и С-донорных лигандов и олова (IV) на основе О-донорных лигандов путем конъюгирования бактериопурпуринимида с аминокислотными комплексами данных металлов, которая позволила снизить образование побочных продуктов и повысить выход целевых соединений.

2) Впервые получен гистидин- и гистаминсодержащий бактериопурпуринимид и его КНС производные, а также комплексы золота (Г) на их основе.

3) Изучена темновая и фотоиндуцированная цитотоксичность бактериохлориновых металлокомплексов золота (Г) и олова (IV) и показано их комбинированное действие на клетки опухолей различного генеза, увеличивающее эффективность ФДТ в 3 раза по сравнению с исходным дипропокси-БПИ, за счет цитотоксического эффекта металлов.

4) Показано таргетное действие бактериохлориновых комплексов золота (Г) в отношении опухолей с гиперэкспрессией белков антиоксидантной системы и гистаминовых рецепторов, приводящее к увеличению противоопухолевой эффективности в 2 раза по сравнению с безметальными ФС.

6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Anthony E. J. et al. Metallodrugs are unique: Opportunities and challenges of discovery and development //Chemical Science. - 2020. - V. 11., № 48. - P. 12888-12917.

2. Lloyd N. C. et al. Salvarsan-the first chemotherapeutic compound //Angewandte Chemie International Edition. - 2005. - V. 44. - P. 941-944.

3. Imberti C., Sadler P. J. 150 years of the periodic table: New medicines and diagnostic agents //Advances in inorganic chemistry. - Academic Press, 2020. - V. 75. - P. 3-56.

4. Frei A. et al. Metal complexes as a promising source for new antibiotics //Chemical science. - 2020.

- V. 11., № 10. - P. 2627-2639.

5. Lipinski C. A. et al. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings //Advanced drug delivery reviews. - 2001.

- V. 46. - P. 3-26.

6. Mjos K. D., Orvig C. Metallodrugs in medicinal inorganic chemistry //Chemical reviews. - 2014. -V. 114., № 8. - P. 4540-4563.

7. Morrison C. N. et al. Expanding medicinal chemistry into 3D space: Metallofragments as 3D scaffolds for fragment-based drug discovery //Chemical science. - 2020. - V. 11., № 5. - P. 12161225.

8. Chen A. Y. et al. Targeting metalloenzymes for therapeutic intervention //Chemical reviews. - 2019.

- V. 119., № 2. - P. 1323-1455.

9. Mingos D. M. P. The Periodic Table II Catalytic, Materials, Biological and Medical Applications Preface //PERIODIC TABLE II: CATALYTIC, MATERIALS, BIOLOGICAL AND MEDICAL APPLICATIONS. - 2019. - V. 182. - P. 175-201.

10. Jaouen G., Metzler-Nolte N. (ed.). Medicinal organometallic chemistry. - Springer, 2010. - V. 32.

- P. 21-56.

11. Mandic A. et al. Cisplatin induces endoplasmic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic signaling. //Journal of Biological Chemistry. - 2003. - V. 278., № 11. - P. 9100-9106.

12. Tshuva E. Y., Miller M. Coordination complexes of titanium (IV) for anticancer therapy //Metallo-Drugs: Development and Action of Anticancer Agents. - 2018. - V. 18. - P. 219-250.

13. Liu Z., Sadler P. J. Organoiridium complexes: anticancer agents and catalysts //Accounts of Chemical Research. - 2014. - V. 47., № 4. - P. 1174-1185.

14. Zhang W. Y. et al. Ligand-centred redox activation of inert organoiridium anticancer catalysts //Chemical Science. - 2020. - V. 11., № 21. - P. 5466-5480.

15. Liu Z. et al. The potent oxidant anticancer activity of organoiridium catalysts //Angewandte Chemie International Edition. - 2014. - V. 53., № 15. - P. 3941-3946.

16. Purohit V., Simeone D. M., Lyssiotis C. A. Metabolic regulation of redox balance in cancer //Cancers. - 2019. - V. 11., № 7. - P. 955.

17. Romero-Canelon I., Sadler P. J. Next-generation metal anticancer complexes: multitargeting via redox modulation //Inorganic chemistry. - 2013. - V. 52., № 21. - P. 12276-12291.

18. Zhang P., Sadler P. J. Redox-active metal complexes for anticancer therapy //European Journal of Inorganic Chemistry. - 2017. - V. 2017., № 12. - P. 1541-1548.

19. Karges J. et al. A multi-action and multi-target RuII-PtIV conjugate combining cancer-activated chemotherapy and photodynamic therapy to overcome drug resistant cancers //Angewandte Chemie International Edition. - 2020. - V. 59., № 18. - P. 7069-7075.

20. Tong K. C. et al. An anticancer gold (III)-activated porphyrin scaffold that covalently modifies protein cysteine thiols //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2020. - V. 117., № 3.

- P. 1321-1329.

21. Patra M., Gasser G. The medicinal chemistry of ferrocene and its derivatives //Nature Reviews Chemistry. - 2017. - V. 1., № 9. - P. 0066.

22. Mu C. et al. Activation by oxidation: Ferrocene-functionalized Ru (II)-arene complexes with anticancer, antibacterial, and antioxidant properties //Inorganic Chemistry. - 2018. - V. 57., № 24.

- P. 15247-15261.

23. Lin Y. et al. Organometallic ruthenium anticancer complexes inhibit human glutathione-S-transferase n //Journal of inorganic biochemistry. - 2013. - V. 128. - P. 77-84.

24. Chen Q. et al. Photodynamic therapy guidelines for the management of oral leucoplakia //International journal of oral science. - 2019. - V. 11., № 2. - P. 14.

25. Kostron H., Hasan T. (ed.). Photodynamic medicine: From bench to clinic. - 2016.

26. Lazic S. et al. Novel Osmium-based Coordination Complexes as Photosensitizers for Panchromatic Photodynamic Therapy //Photochemistry and Photobiology. - 2017. - V. 93., № 5. - P. 1248-1258.

27. Doughty A. C. V. et al. Nanomaterial applications in photothermal therapy for cancer //Materials. -2019. - V. 12., № 5. - P. 779.

28. Xu S. et al. Oxygen and Pt (II) self-generating conjugate for synergistic photo-chemo therapy of hypoxic tumor //Nature Communications. - 2018. - V. 9., № 1. - P. 2053.

29. Shi H., Imberti C., Sadler P. J. Diazido platinum (IV) complexes for photoactivated anticancer chemotherapy //Inorganic Chemistry Frontiers. - 2019. - V. 6., № 7. - P. 1623-1638.

30. Gu B. et al. Precise two-photon photodynamic therapy using an efficient photosensitizer with aggregation-induced emission characteristics //Advanced Materials. - 2017. - V. 29., № 28. - P. 1701076.

31. Gill M. R., Vallis K. A. Transition metal compounds as cancer radiosensitizers //Chemical Society Reviews. - 2019. - V. 48., № 2. - P. 540-557.

32. Zhao Z. et al. A highly X-ray sensitive iridium prodrug for visualized tumor radiochemotherapy //Chemical Science. - 2020. - V. 11., № 15. - P. 3780-3789.

33. Kamkaew A. et al. Scintillating nanoparticles as energy mediators for enhanced photodynamic therapy //ACS nano. - 2016. - V. 10., № 4. - P. 3918-3935.

34. Rosenthal I., Sostaric J. Z., Riesz P. Sonodynamic therapy—a review of the synergistic effects of drugs and ultrasound //Ultrasonics sonochemistry. - 2004. - V. 11., № 6. - P. 349-363.

35. Choi V., Rajora M. A., Zheng G. Activating drugs with sound: mechanisms behind sonodynamic therapy and the role of nanomedicine //Bioconjugate Chemistry. - 2020. - V. 31., № 4. - P. 967989.

36. Keller E. J. et al. Characterization of thermally activated metalloenediyne cytotoxicity in human melanoma cells //Radiation research. - 2018. - V. 190., № 2. - P. 107-116.

37. Garrett J. E. et al. Enhancement of cytotoxicity of enediyne compounds by hyperthermia: effects of various metal complexes on tumor cells //Radiation research. - 2020. - V. 193., № 2. - P. 107-118.

38. Soldevila-Barreda J. J., Metzler-Nolte N. Intracellular catalysis with selected metal complexes and metallic nanoparticles: advances toward the development of catalytic metallodrugs //Chemical reviews. - 2019. - V. 119., № 2. - P. 829-869.

39. Zhang W. Y. et al. Ligand-Controlled Reactivity and Cytotoxicity of Cyclometalated Rhodium (III) Complexes //European journal of inorganic chemistry. - 2020. - V. 2020., № 11-12. - P. 1052-1060.

40. Coverdale J. P. C. et al. Asymmetric transfer hydrogénation by synthetic catalysts in cancer cells //Nature chemistry. - 2018. - V. 10., № 3. - P. 347-354.

41. Starha P. et al. Hydrosulfide adducts of organo-iridium anticancer complexes //Inorganic Chemistry. - 2016. - V. 55., № 5. - P. 2324-2331.

42. Chen F. et al. Effect of sulfonamidoethylenediamine substituents in Ru II arene anticancer catalysts on transfer hydrogenation of coenzyme NAD+ by formate //Dalton Transactions. - 2018. - V. 47., № 21. - P. 7178-7189.

43. Yu Z., Cowan J. A. Metal complexes promoting catalytic cleavage of nucleic acids—biochemical tools and therapeutics //Current opinion in chemical biology. - 2018. - V. 43. - P. 37-42.

44. Manzano C. M., Nakahata D. H., de Paiva R. E. F. Revisiting metallodrugs for the treatment of skin cancers //Coordination Chemistry Reviews. - 2022. - V. 462. - P. 214506.

45. Dasari S., Tchounwou P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action //European journal of pharmacology. - 2014. - V. 740. - P. 364-378.

46. Englinger B. et al. Metal drugs and the anticancer immune response //Chemical reviews. - 2018. -V. 119., № 2. - P. 1519-1624.

47. Wong D. Y. Q., Wong D. Y. Q. Induction of immunogenic cell death by chemotherapeutic platinum complexes //Angewandte Chemie International Edition. - 2015. - V. 54., № 22. - P. 6483-6487.

48. Park S. J. et al. Cisplatin and oxaliplatin induce similar immunogenic changes in preclinical models of head and neck cancer //Oral oncology. - 2019. - V. 95. - P. 127-135.

49. Terenzi A. et al. Anticancer metal drugs and immunogenic cell death //Journal of inorganic biochemistry. - 2016. - V. 165. - P. 71-79.

50. Huang X. et al. Effect of cisplatin on the frequency and immuno-inhibitory function of myeloid-derived suppressor cells in a375 melanoma model //Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. -2015. - V. 16., № 10. - P. 4329-4333.

51. Pages B. J. et al. Multifaceted studies of the DNA interactions and in vitro cytotoxicity of anticancer polyaromatic platinum (II) complexes //Chemistry-A European Journal. - 2016. - V. 22., № 26. -P. 8943-8954.

52. Margiotta N. et al. Monofunctional Platinum (II) Complexes with Potent Tumor Cell Growth Inhibitory Activity: The Effect of a Hydrogen-Bond Donor/Acceptor N-Heterocyclic Ligand //ChemMedChem. - 2014. - V. 9., № 6. - P. 1161-1168.

53. Couto G. K. et al. Tetra-cationic platinum (II) porphyrins like a candidate photosensitizers to bind, selective and drug delivery for metastatic melanoma //Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. - 2020. - V. 202. - P. 111725.

54. Curci A. et al. Novel kiteplatin pyrophosphate derivatives with improved efficacy //Inorganic Chemistry. - 2017. - V. 56., № 13. - P. 7482-7493.

55. Kasparkova J. et al. Cytotoxicity, cellular uptake, glutathione and DNA interactions of an antitumor large-ring PtII chelate complex incorporating the cis-1, 4-diaminocyclohexane carrier ligand //Biochemical pharmacology. - 2010. - V. 79., № 4. - P. 552-564.

56. Gao X. et al. Mechanistic and biological characteristics of different sugar conjugated 2-methyl malonatoplatinum (II) complexes as new tumor targeting agents //European Journal of Medicinal Chemistry. - 2017. - V. 125. - P. 372-384.

57. Abdou A. G., Eldien M. M. S., Elsakka D. GLUT-1 expression in cutaneous basal and squamous cell carcinomas //International journal of surgical pathology. - 2015. - V. 23., № 6. - P. 447-453.

58. Koch A. et al. Glucose transporter isoform 1 expression enhances metastasis of malignant melanoma cells //Oncotarget. - 2015. - V. 6., № 32. - P. 32748.

59. Manzotti C. et al. BBR 3464: a novel triplatinum complex, exhibiting a preclinical profile of antitumor efficacy different from cisplatin //Clinical cancer research. - 2000. - V. 6., № 7. - P. 26262634.

60. Daghriri H., Huq F., Beale P. Studies on activities, cell up take and DNA binding of four multinuclear complexes of the form:[{trans-PtCl (NH3) 2} 2^-{trans-Pd (NH3) 2-(H2N (CH2) nNH2) 2}] Cl4 where n= 4-7 //Journal of inorganic biochemistry. - 2004. - V. 98., № 11. - P. 1722-1733.

61. Teixeira L. J. et al. Cytotoxic activity of metal complexes of biogenic polyamines: polynuclear platinum (II) chelates //Journal of medicinal chemistry. - 2004. - V. 47., № 11. - P. 2917-2925.

62. Schmitt F. et al. Effects of histidin-2-ylidene vs. imidazol-2-ylidene ligands on the anticancer and antivascular activity of complexes of ruthenium, iridium, platinum, and gold //Journal of inorganic biochemistry. - 2016. - V. 163. - P. 221-228.

63. Rehm T. et al. Synthesis, structures and cytotoxic effects in vitro of cis-and trans-[Pt IV Cl 4 (NHC) 2] complexes and their Pt II precursors //Dalton Transactions. - 2019. - V. 48., № 43. - P. 1635816365.

64. Zamora A. et al. Exploring the influence of the aromaticity on the anticancer and antivascular activities of organoplatinum (II) complexes //Chemistry-A European Journal. - 2017. - V. 23., № 23. - P. 5614-5625.

65. Quiroga A. G. et al. Novel tetranuclear orthometalated complexes of Pd (II) and Pt (II) derived from p-isopropylbenzaldehyde thiosemicarbazone with cytotoxic activity in cis-DDP resistant tumor cell lines. Interaction of these complexes with DNA //Journal of Medicinal Chemistry. - 1998. - V. 41., № 9. - P. 1399-1408.

66. Miranda S. et al. Synthesis, characterization, and in vitro cytotoxicity of some gold (I) and trans platinum (II) thionate complexes containing water-soluble PTA and DAPTA ligands. X-ray crystal structures of [Au (SC4H3N2)(PTA)], trans-[Pt (SC4H3N2) 2 (PTA) 2], trans-[Pt (SC5H4N) 2 (PTA) 2], and trans-[Pt (SC5H4N) 2 (DAPTA) 2] //Inorganic chemistry. - 2008. - V. 47., № 13. - P. 56415648.

67. Almotairy A. R. Z. et al. Antitumor platinum (IV) derivatives of carboplatin and the histone deacetylase inhibitor 4-phenylbutyric acid //Journal of Inorganic Biochemistry. - 2017. - V. 177. -P. 1-7.

68. Garmpis N. et al. Targeting histone deacetylases in malignant melanoma: a future therapeutic agent or just great expectations? //Anticancer research. - 2017. - V. 37., № 10. - P. 5355-5362.

69. Margiotta N. et al. Cytotoxicity-boosting of kiteplatin by Pt (IV) prodrugs with axial benzoate ligands //Journal of Inorganic Biochemistry. - 2016. - V. 160. - P. 85-93.

70. Barbanente A. et al. A Pt (IV) prodrug of kiteplatin with the bone-targeting pyrophosphate ligand //Inorganica Chimica Acta. - 2019. - V. 494. - P. 98-104.

71. Barbanente A. et al. A Pt (IV) prodrug of kiteplatin with the bone-targeting pyrophosphate ligand //Inorganica Chimica Acta. - 2019. - V. 494. - P. 98-104.