Модифицированные природные хлорины направленного действия по отношению к опухолевым клеткам различного генеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Суворов Никита Владимирович

  • Суворов Никита Владимирович
  • кандидат науккандидат наук
  • 2019, ФГБОУ ВО «МИРЭА - Российский технологический университет»
  • Специальность ВАК РФ02.00.10
  • Количество страниц 111
Суворов Никита Владимирович. Модифицированные природные хлорины направленного действия по отношению к опухолевым клеткам различного генеза: дис. кандидат наук: 02.00.10 - Биоорганическая химия. ФГБОУ ВО «МИРЭА - Российский технологический университет». 2019. 111 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Суворов Никита Владимирович

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Направленная доставка противоопухолевых препаратов за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза

1.2. Перспективные мишени и лиганды в онкологии

1.2.1. Фолатные рецепторы

1.2.2. Интегрины

1.2.3. Простатспецифический мембранный антиген

1.2.4. ОШТ-рецепторы

1.3. Таргетные ФС для ФДТ рака

1.3.1 Конъюгаты ФС с фолиевой кислотой

1.3.2 Конъюгаты ФС с лигандом к ПСМА

1.3.3 Конъюгаты ФС с КОО-пептидами

I.4 Пассивный таргетинг в противоопухолевой терапии

1.4.1. Конъюгаты ФС с биодеградируемыми полимерами

1.4.2 Включение ФС в состав липосом

1.4.3 Конъюгаты ФС с наночастицами золота

1.4.4 Конъюгаты ФС с наночастицами магнетита

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРИРОДНЫЕ ХЛОРИНЫ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ

II.1. Конъюгаты производных хлорина е6 с фолиевой кислотой

11.2 Конъюгаты производных хлорина е6 с ПСМА-лигандом

1

11.2.1. Региоселективное введение ПСМА-лиганда в 13 - и 15 - положения

хлоринового макроцикла

11.2.2. Реакция тетразин-алкенового присоединения в синтезе хлоринов с ПСМА-лигандом

11.2.3. Синтез таргетного бактериопурпуринимида с вектором к ПСМА

11.3. Нанокомплексы на основе частиц магнетита и производного

бактериохлорофилла а

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

IV. ВЫВОДЫ

V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ФС фотосенсибилизатор

ФДТ фотодинамическая терапия

ПСМА простатспецифический мембранный антиген

ЯМР ядерный магнитный резонанс

РОЭ рецептор-опосредованный эндоцитоз

КМТМ конъюгаты с малыми таргетными молекулами

АФС активная фармацевтическая субстанция

ФР фолатный рецептор

ФК фолиевая кислота

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

^ равновесная константа диссоциации

GCPII глутаматкарбоксипептидаза II

GLUT глюкозный транспортер

TPP-COOH 5,10Д5-трифенил-20-(пара-карбоксифенил)порфирин

Boc2O ди-треда-бутилдикарбонат

THF тетрагидрофуран

m-THPC 5,10,15 -тетракис(3 -гидроксифенил)-хлорин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЛФ готовая лекарственная форма

AuNP наночастицы золота

HPPH 3-(1 -гексилоксиэтил)-3 -девинилпирофеофорбид a

EPR эффект повышенной проницаемости и удержания

TIS триизопропилсилан

DBU 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен

HBTU гексафторфосфат 2-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-

тетраметилурония

ПЭГ полиэтиленгликоль

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

НЧ наночастицы

АЛК 5-аминолевулиновая кислота

RGD аргинилглициласпарагиновая кислота

HOBt 1-гидроксибензотриазол

GABA у-аминомасляная кислота

PBS натрий-фосфатный буфер

!фп интенсивность флуоресценции

Cbz бензилоксикарбонил

DCC 1,3-дициклогексилкарбодиимид

EDC 1 -этил-3 -(3 -диметиламинопропил)карбодиимид

NHS N-гидроксисукцинимид

DCM дихлорметан

DMSO диметилсульфоксид

Py пиридин

i-PrOH изопропанол

DMF диметилформамид

DIPEA диизопропилэтиламин

TFA трифторуксусная кислота

DMAP 4-диметиламинопиридин

L-Lys(Z)-OtBuxHCl трет-бутил-К6-[(бензилокси)карбонил]^-лизинат

гидрохлорид

IEDDA реакция Дильса-Альдера

ИК50 концентрация полумаксимального ингибирования

дипропокси-БПИ О-пропилоксим-Ы-пропоксибактериопурпуринимид

COSY гомоядерная корреляционная спектроскопия

NOESY спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера

ESI electrospray ionization

ТСХ тонкослойная хроматография

ВВЕДЕНИЕ

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модифицированные природные хлорины направленного действия по отношению к опухолевым клеткам различного генеза»

Актуальность работы

Молекулярно-таргетная терапия является одним из новых направлений медикаментозного лечения (фармакотерапии) рака. Как вид молекулярной медицины, таргетная терапия блокирует рост раковых клеток с помощью вмешательства в механизм действия конкретных ключевых молекул, необходимых для канцерогенеза и роста опухоли, а не просто препятствует размножению всех быстро делящихся клеток. Целевое воздействие только на опухоль не наносит вреда здоровым тканям вокруг нее и здоровью больного в целом, что исключает негативные последствия, которые возникают при химиотерапии или лучевом воздействии.

В настоящее время существует два подхода к увеличению туморотропности химиопрепаратов и, в частности, фотосенсибилизаторов (ФС). Создание конъюгатов последних с векторными молекулами позволяет реализовать активный таргетинг в опухолевые клетки. В качестве таких молекул могут выступать таргетные пептиды, стероиды, углеводы, а также производные фолиевой кислоты. Сверхэкспрессия рецепторов определенного типа на поверхности опухолей различного генеза позволяет увеличить накопление препаратов за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза. Другим подходом к увеличению селективности накопления является иммобилизация активных фармацевтических субстанций на наночастицы различной природы, что обеспечивает пассивный таргетинг, включающий экстравазацию нагруженных наночастиц из дефектных сосудов опухоли и удержание их в интерстиции за счет нарушенной лимфодренажной системы опухоли (EPR-эффект).

Большинство фотосенсибилизаторов, используемых на сегодняшний день для фотодинамической терапии рака, являются природными или синтетическими макрогетероциклическими соединениями, включая порфирины, хлорины, фталоцианины и их металлокомплексы. Хотя природа данных молекул способствует их удержанию в опухолевом узле, а прицельное облучение светом определенной длины волны минимизирует риски повреждения окружающих тканей, тем не менее проблема повышения селективности накопления фотосенсибилизаторов в зоне интереса остается весьма актуальной. Учитывая это, создание конъюгатов фотосенсибилизаторов с малыми таргетными молекулами, а также с наночастицами представляет перспективный подход к увеличению эффективности метода фотодинамической терапии и расширению области его клинического использования.

Цель работы и задачи

Цель работы заключается в направленной функционализации природных хлоринов и бактериохлоринов с помощью присоединения на периферию макроцикла биологически

активных молекул и иммобилизации пигмента на железооксидные наночастицы для создания фотодинамических агентов таргетного действия.

Достижение поставленной цели потребовало решения следующих задач:

• Получение аминоамидов хлорина е6 с остатком фолиевой кислоты, разработка их водорастворимой формы и изучение специфической активности in vitro на клетках HeLa, имеющих высокую экспрессию фолатных рецепторов.

• Разработка региоселективного синтеза 131-, 152- амидов хлорина е6, а также 17 -амида бактериопурпуринимида, с лигандами к простат-специфическому мембранному антигену (ПСМА) и оценка их биологической эффективности на клетках рака простаты, обладающих сверхэкспрессией рецепторов ПСМА и без них.

• Изучение реакции тетразин-алкенового присоединения между арилтетразинами и природным хлорином для региоселективного введения лиганда к ПСМА в положение 3 макроцикла ФС и оценки фотоцитотоксичности полученного конъюгата на клетках рака предстательной железы

• Получение наночастиц магнетита и нековалентная иммобилизация 0-пропилоксим-#-пропоксибактериопурпуринимида на их поверхность и оценка биологической активности нанокомплексов.

Научная новизна

1. Осуществлено региоселективное введение лиганда к ПСМА в 3-, 13-, 15-, 17- положения макроцикла природных хлоринов и бактериопурпуринимида для эффективной интернализации ФС в опухолевые клетки рака предстательной железы.

2. Впервые изучена реакция тетразин-алкенового присоединения между производным хлорофилла а и арилзамещенными тетразинами, которая позволила ввести лиганд к ПСМА в 31-положение хлоринового макроцикла.

3. Получены аминоамиды хлорина е6, содержащие спейсеры различной длины, с фолиевой кислотой для активного таргетинга к клеткам со сверхэкспрессией фолатных рецепторов.

4. Получены нековалентные комплексы на основе производных бактериопурпуринимида с наночастицами магнетита для сочетанных методов терапии и диагностики в онкологии.

Практическая значимость работы

Разработаны фотоактивные субстанции на основе природных хлоринов, которые могут использоваться для направленного транспорта фотосенсибилизаторов в опухоли различной этиологии. Поглощение полученных пигментов в области 660-800 нм позволяет осуществлять фотодинамическую терапию глубокозалегающих и пигментированных опухолей. На основании

проведенных исследований разработан и запатентован способ получения таргетного фотосенсибилизатора для лечения рака предстательной железы (Патент РФ № 2670087, 2018 г.). Получены конъюгаты на основе бактериопурпуринимида и наночастиц магнетита, которые в дальнейшем могут найти применение для ФДТ и магнитно-резонансной томографии.

Публикации по теме работы

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, входящих в Перечень ВАК и в международные базы цитирования Scopus и WoS, 7 тезисов докладов (из них 4 представлены на международных конференциях), получен 1 патент РФ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены и обсуждены на: XII Международной конференции «Синтез и применение порфиринов и их аналогов» (Иваново, 2016); XVI Международной научной конференции «High-Tech in Chemical Engineering -2016» with elements of school of young scientists (Москва, 2016); Научной конференции грантодержателей РНФ «Фундаментальные химические исследования XXI-века», (Москва, 2016); III Российской конференции по медицинской химии (Казань, 2017); 16th World congress IPA (Coimbra, Portugal, 2017); VI Всероссийской конференции «Фотодинамическая терапия и Фотодиагностика (Pocтов-на-Дону, 2017); II Международной научно-практической школе-конференции «Магнитные наноматериалы в биомедицине: получение, свойства, применение» (Звенигород, 2017).

Личный вклад автора

Диссертантом выполнен весь объем синтетической части работы, проведены физико-химические и спектральные исследования, проанализирован массив данных, полученных в ходе биологических испытаний, сформулированы цель работы, задачи и выводы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 117 наименований источников. Работа изложена на 111 страницах печатного текста и содержит 14 рисунков, 28 схем и 8 таблиц.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Направленная доставка противоопухолевых препаратов за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза

Рецептор-опосредованный эндоцитоз (РОЭ) представляет собой высокоизбирательное поглощение лигандов клеткой, в ходе которого последние, связанные с трансмембранными рецепторами клеточной поверхности, концентрируются в определенных участках мембраны. Связывание транспортируемых веществ с рецепторами вызывает инвагинацию плазматической мембраны с образованием эндосом. Созревание от ранних эндосом (рН около 6,5) до поздних эндосом (рН около 5,5) и, наконец, до лизосом (рН около 4,5) происходит за счет протонных помп, что способствует диссоциации макромолекулярного комплекса лиганда с рецептором и возвращению последнего на клеточную мембрану [1]. При этом происходит высвобождение транспортируемого агента в цитоплазме. Интернализируемые вещества также могут высвобождаться из эндосом в цитоплазму путем конформационных или структурных изменений.

Создание конъюгатов противоопухолевых агентов с векторными молекулами позволяет осуществить направленный транспорт препаратов в опухоли за счет РОЭ. Известно, что белки, такие как фолатные рецепторы, интегрины, HER2, EGFR и другие опухолевые биомаркеры сверхэкспрессированы на поверхности раковых клеток-мишеней, что позволяет увеличить селективность накопления препарата. Одной из актуальных задач медицинской химии является поиск специфических лигандов, в качестве которых могут выступать моноклональные антитела, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, производные фолиевой кислоты, лиганды к простат специфическим антигенам, углеводы, а также некоторые другие биологически активные молекулы [2].

Использование антител для селективной доставки цитотоксических соединений в опухолевые клетки позволило достичь существенных успехов в повышении эффективности химиотерапевтических агентов [3]. Три продукта на основе моноклональных антител (трастузумаб эмтанзин, брентуксимаб ведотин и инотузумаб озогамицин) были выведены на фармацевтический рынок [4]. Создание конъюгатов противоопухолевых агентов с малыми таргетными молекулами (КМТМ) является альтернативным подходом для направленной доставки лекарств в опухоли [4,5]. Данный подход обладает рядом преимуществ, такими как, управляемый синтез и неиммуногенный характер [6,7]. Молекулярная масса таких конъюгатов потенциально намного ниже, что приводит к лучшей интернализации в опухолевые клетки и лучшей стабильности in vitro и in vivo [8,9].

Большинство КМТМ состоит из векторного лиганда, спейсера и терапевтического агента. Дизайн таких молекул предусматривает введение легкоразрушаемого линкера, который

стабилен в кровотоке, но лабилен после попадания в опухолевые клетки, высвобождая противоопухолевый агент (Рисунок 1). Выбор каждого из компонентов непосредственно влияет на свойства конечного КМТМ.

Рисунок 1. Структура таргетного низмолекулярного конъюгата.

Подбор лиганда влияет на селективность и специфичность связывания, поскольку основная цель создания целевых соединений заключается в снижении токсичности терапевтического агента по отношению к нормальным клеткам [4]. Клеточные мишени должны связываться с КМТМ в наномолярном диапазоне концентраций. Критерий, выдвинутый Low et al., определяет значения равновесных констант диссоциации (Kd) векторных лигандов, которые должны быть меньше или равны 10 нМ [10]. Найти такие лиганды с чрезвычайно высокой аффинностью крайне сложная задача.

Спейсер обычно служит связующим звеном между лигандом и терапевтической субстанцией и играет важную роль для поддержания связывания с рецептором. Использование не оптимального спейсера может привести к снижению аффинности связывания. Близкое расположение лиганда и терапевтической молекулы может негативно влиять на аффинность связывания, повышая неспецифическую адсорбцию конъюгатов на поверхности клеток. Другая функция спейсера заключается в повышении гидрофильности КМТМ [4]. Таргетные лиганды и терапевтические агенты обычно являются гидрофобными соединениями, что требует использования солюбилизирующих систем. Высокая липофильность может привести к нежелательным неспецифическим взаимодействиям с липопротеинами, липидными бислоями и мембранами. Использование водорастворимых спейсеров, таких как полисахариды, гидрофильные аминокислоты, ПЭГ и пептидогликаны, как правило, повышает водорастворимость конечных препаратов [11].

Активность КМТМ зависит также от наличия расщепляемого линкера и его способности к высвобождению терапевтического агента из состава конъюгата после проникновения в клетки-мишени [12]. Известно два класса линкеров: дисульфидные и рН-чувствительные.

Спейсер

Расщепляемый линкер

Использование дисульфидных линкеров наиболее оптимально, так как их восстановление под действием внутриклеточного глутатиона, тиоредоксина, пероксиредоксинов и никотинамид-адениндинуклеотидов обеспечивает эффективное расщепление в раковых клетках. Кислая среда эндосом позволяет использовать линкеры, чувствительные к низким значениям рН, например, ацетали или гидразоны. [12,13].

Биологическая активность КМТМ также зависит от размера комплекса [14,15], который влияет на доставку лекарственного средства в солидные опухоли, трансмембранный перенос, удержание препарата в зоне интереса и его выведение из организма. Хотя низкомолекулярные конъюгаты не накапливаются в опухолях путем EPR-эффекта, тем не менее, они проникают в опухолевые ткани более активно и быстро, чем макромолекулярные аналоги. Кроме того, молекулы с массой менее 40 кДа эффективнее и быстрее выводятся из организма [9]. КМТМ обычно быстро выводятся из тканей, клетки которых не являются мишенями, таким образом снижая нежелательную общую токсичность препарата [16-18].

1.2. Перспективные мишени и лиганды в онкологии

На сегодняшний день известно большое количество рецепторов на поверхности опухолевых клеток. В рамках концепции таргетной терапии такие рецепторы должны отвечать ряду требований, необходимых для создания связанных с ними лигандов. Среди таких критериев основным является сверхэкспрессия мембранных белков в опухолевых клетках по сравнению со здоровыми. Не менее важными факторами также являются тканеспецифичность и доступность для таргетных препаратов, находящихся в кровотоке.

1.2.1. Фолатные рецепторы

Одними из наиболее перспективных мишеней в таргетной противоопухолевой терапии являются фолатные рецепторы (ФР). ФР были найдены в поляризованных эпителиальных клетках и макрофагах. В организме они присутствуют в трех изоформах (а, в и у), практически идентичных в аминокислотной последовательности и различающихся уровнями экспрессии [19]. ФР а и ФР в являются мембраноассоциированными гликозилфосфатидилинозитольными (ГФИ) якорными белками. ФР у не содержат ГФИ-якоря и постоянно секретируются в виде растворимых форм ФР человека в едва детектируемых количествах.! Кроме того, была обнаружена нуклеотидная последовательность 5 изоформы в участке генома человека. Однако экспрессия ФР 5 как в эпителиальных клетках взрослого организма, так и в эмбриональных клетках отсутствует [20].

Экспрессия фолатных рецепторов тканеспецифична. ФР-а экспрессируются в незначительных количествах в клетках некоторых здоровых тканей (почек, плаценты, сосудистого сплетения), тогда как их концентрация в эпителиальных клетках злокачественных новообразований, в частности, в клетках яичников, матки, эндометрия, мозга, почек и мезотелия, повышена [21]. Ввиду того, что ФР селективно экспрессируются на апикальной поверхности мембраны определенных эпителиальных клеток, они защищены от фолат-направленных агентов в плазме крови. Однако при трансформации эпителиальных клеток их полярность теряется и рецептор становится доступным для таргетных препаратов в кровотоке. Результаты исследований связывания ^-меченной фолиевой кислоты с плазматической мембраной клеток выявили существенную разницу в количестве ФР-а в тканях одинакового происхождения: разница в количестве рецепторов на нормальных и опухолевых клетках составляет от полутора (мозг, яичники) до трех (матка) порядков [22]. У пациенток с диагностированным раком яичников степень сверхэкспрессии ФР-а коррелирует со степенью гистологической дифференцировки и со стадией заболевания, что связано с потребностью быстрорастущих опухолей в фолатах. При этом наблюдается прямая зависимость между уровнем экспрессии фолатных рецепторов и резистентностью опухолей к стандартной химиотерапии. Опухоли, выживающие при конвенциональной химиотерапии, обычно имеют более высокие уровни содержания ФР-а [23].

Лигандом к фолатным рецепторам является фолиевая кислота 1, более известная как витамин В9 (Схема 1). Данное соединение участвует во множестве важных биохимических процессов, таких как, регуляция активности генов, регенерация кожи и слизистой кишечника, биосинтез красных и белых кровяных телец, синтез веществ, регулирующих функцию мозга [24]. Было установлено, что фолиевая кислота играет ключевую роль в синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, метаболизме гомоцистеина, репликации и метилировании ДНК. Химическая структура фолиевой кислоты представлена тремя составляющими: птерин (2), пара-аминобензойная кислота (3) и глутаминовая кислота (4). Птерин присоединен к пара-аминобензойной кислоте через метиленовую группу, тогда как пара-аминобензойная кислота присоединена к глутаминовой кислоте посредством амидной связи.

соон

2 3 4

Схема 1. Структура фолиевой кислоты и ее составные части.

Известно, что ФР-а связывается с фолиевой кислотой с высокой аффиностью (^=0.1 нM), а конъюгаты с ней поглощаются клетками млекопитающих путем рецептор-опосредованного эндоцитоза [25]. При этом связывание с ФР происходит, главным образом, за счет птеринового фрагмента, тогда как остаток глутаминовой кислоты находится вне участка связывания.

Проведено множество клинических исследований препаратов на основе фолиевой кислоты, особенно в онкологии. Был разработан ряд конъюгатов фолиевой кислоты с различными химиотерапевтическими агентами, моноклональными антителами, пептидами, контрастными агентами [26, 27]. Некоторые из них находятся на завершающем этапе клинических испытаний, включая препарат Винтафолид для селективной доставки винбластина, являющегося цитостатическим лекарственным препаратом из группы алкалоидов барвинка, механизм действия которого связан с блокадой тубулина и остановкой клеточного деления в метафазе [28]. Другой фолатсодержащий препарат Этарфолатид технеция включает фолиевую кислоту и хелатор для Также известен ряд конъюгатов паклитакцеля

и митомицина С с фолиевой кислотой [29].

1.2.2. Интегрины

Другими перспективными мишенями в таргетной терапии являются интегрины, представляющие собой трансмембранные гетеродимерные клеточные рецепторы, взаимодействующие с внеклеточным матриксом и передающие различные межклеточные сигналы [30]. От их функционирования зависит форма клетки, её подвижность и регуляция клеточного цикла. Данные рецепторы клеточной адгезии состоят из а и в субъединиц, которые связаны вместе нековалентно. Среди 24 различных гетеродимеров интегринов изоформа а^3 сверхэкспрессирована на поверхности различных опухолевых клеток, при этом экспрессия в

клетках эндотелия сосудов, здоровых органов существенно ниже [31]. Наличие большой разницы в степени экспрессии позволяет использовать данный тип рецепторов для таргетной доставки противоопухолевых агентов, существенно снижая токсичность препаратов для нормальных тканей. Связывание c данными рецепторами ингибирует взаимодействие между интегрином и белками внеклеточного матрикса, что может вызывать апоптоз опухолевых клеток.

Лигандом к интегринам является аргинилглициласпарагиновая кислота (RGD-пептид), представляющий из себя короткий мотив внеклеточного матрикса человека и белков плазмы, таких как ламинин, витронектин, фибриноген. Линейная форма данного пептида, а также его модифицированные производные широко используются для доставки цитостатиков (паклитаксел, доксорубицин, доцетаксел и др.) в составе липосом, биосовместимых полимеров и наночастиц [32]. Наряду с линейными, широкое распространение получили циклические RGD-пептиды, обладающие химической стабильностью, а также высокой стабильностью in vivo, увеличенным периодом полувыведения и повышенной биологической активностью [33].

I.2.3. Простатспецифический мембранный антиген

Простатспецифический мембранный антиген (ПСМА) - онкомаркер опухолей предстательной железы. ПСМА представляет собой трансмембранный гликопротеин, представляющий глутаматную карбоксипептидазу II (GCPII), которая является перспективным рецептором для направленной доставки лекарств и диагностических агентов. Он гомологичен N-ацетил-а-связанной кислой дипептидазе, которая катализирует гидролиз N-ацетил-аспартил-глутамата до глутамата и N-ацетил-аспартата [34]. Сверхэкспрессия этих рецепторов наблюдается в клетках рака предстательной железы и коррелирует с уровнем гистологической дифференцировки опухолей, особенно в случае с метастазами. Рецепторы ПСМА также экспрессируются в неоваскулярном эндотелии большинства солидных опухолей (легких, толстой кишки, поджелудочной железы, клетках почек и меланомы) [35, 36]. За последние два десятилетия были разработаны большое количество активных фармацевтических субстанций на основе антител, низкомолекулярных соединений и РНК-аптамеров, конъюгированных с радионуклидами и терапевтическими миРНК [37]. Например, препарат на основе 111In-меченных моноклональных антител (Prostascint®) был одобрен в 1997 году Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в качестве диагностического агента [38].

В ходе изучения строения рецептора ПСМА было найдено несколько низкомолекулярных лигандов, которые можно разделить на две группы: аналоги переходного состояния и субстраты NAAG [39]. Аналоги субстратов обычно включают производные амидов

(5) и мочевины (6), тогда как аналоги переходного состояния представлены фосфонатом (7) и тиолсодержащими лигандами (8, 9). Недостатками последних являются плохой фармакокинетический профиль и низкая метаболическая стабильность [40]. В то же время было показано, что лиганды на основе мочевины являются мощным инструментом для направленной доставки терапевтических и диагностических агентов [41, 42].

r2

,coor3 COOR4

R2 R3

о

Л.

соон

Ri—Р—X СООН

ri n n r4 Н Н

I

он

x: c,n

hs

Схема 2. Низкомолекулярные лиганды к ПСМА.

I.2.4. GLUT-рецепторы

Особое место среди мишеней для таргетной терапии занимают рецепторы, регулирующие транспорт глюкозы (GLUT). Данные рецепторы сверхэкспрессированы на поверхностях опухолевых клеток рака печени, поджелудочной железы, молочной железы, пищевода, головного мозга, почек, легких, кишечника, эндометрия, яичников и шейки матки [43]. Основная функция данных рецепторов заключается в переносе глюкозы между внеклеточным и внутриклеточным пространством, поскольку высокая гидрофильность не позволяет ей проникать сквозь липидный бислой путем диффузии. Повышенное содержание GLUT-рецепторов на поверхности опухолевых клеток обусловлено особенностями формирования сети сосудов опухолей - скорость ангиогенеза отстает от скорости канцерогенеза, что приводит к появлению областей гипоксии и повышенной потребности в глюкозе. Другими потенциальными мишенями для углеводов являются галектины, обладающие специфичностью к в-галактозидам [44]. Было установлено, что данные рецепторы играют важную роль в дифференциации, регуляции роста и апоптоза опухолевых клеток. Наиболее высокой экспрессией в раковых клетках обладают галектин-1, галектин-3 и галектин-8. Кроме того, описаны другие рецепторы, имеющие сродством к различным сахарам [45].

Введение углеводного остатка в состав терапевтических агентов может обеспечить направленную доставку последних в опухоль. На сегодняшний день известен препарат Глюфосфамид, имеющий сродство к GLUTI рецепторам и находящийся на третьей фазе клинических испытаний [46].

В рамках данного обзора будут рассмотрены конъюгаты ФС с векторными молекулами для таргетной ФДТ рака.

I.3. Таргетные ФС для ФДТ рака

I.3.1 Конъюгаты ФС с фолиевой кислотой

Для получения конъюгатов фолиевой кислоты с тетраазамакроциклами используется стратегия создания амидной связи между у-карбоксильной группой глутаминового фрагмента ФК и спейсером, соединенным с фотосенсибилизатором. Используются спейсеры различной природы, содержащие терминальную аминогруппу - полиэтиленгликоли, диаминоалканы, полисахариды, пептиды и белки.

R. Schneider с соавторами [47] впервые получили конъюгаты 5,10,15-трифенил-20-(пара-карбоксифенил)порфирина (TPP-COOH) с производными фолиевой кислоты, используя два спейсера: диаминогексан 10 и 2,2'-этилендиокси-бис-(этиламин) 15 (Схемы 3 и 4). Схема синтеза включала получение Boc-защищенных соединений 11 и 16 с последующим присоединением их либо к фолиевой кислоте, либо к TPP-COOH. После удаления защитных групп, полученные терминальные амины 13 и 18 взаимодействовали с сукцинимидными эфирами соответствующих кислот с образованием конъюгатов 14 и 19.

h,n

hon

О о Voh

¿ÛW

J. „

h2n n n

nh,

NHBoc

10

11

о °

yw

«

h2n n"n

: R = Boc

J "'

: R= H

12: R = Boc 13

nhr

Схема 3. Получение конъюгата ТРР-СООН и ФК.

Реагенты и условия: (I) В0С2О, СНС13; (II) фолиевая к-та, БСС, Ру; (с) ТГА, 25 °С; (Ш) ЫН8-эфир ТРР-СООН, Ру, БЫ8О.

rhn

H,N

H,N

S

s

X

X

s

s

nh2

NHBoc

15

16

17: R = Boc

S^J 18: R = H

H2N N N OH

Схема 4. Получение конъюгата TPP-COOH и ФК с 2,2'-этилендиокси-бис-(этиламином) в качестве спейсера.

Реагенты и условия: (i) Boc2O, CHCl3, 0 oC; (ii) NHS-эфир карбоксипорфирина, THF; (iii) TFA, 25 oC; (iv) NHS-эфир фолиевой к-ты, Py, DMSO

Наличие двух карбоксильных групп (а- и у-) в составе молекулы ФК обуславливает образование смеси двух изомеров в ходе вышеописанной реакции. Используя ВЭЖХ и спектроскопию ЯМР, авторами было показано, что образуется 85% изомера, в котором присоединение реализовано через у-карбоксильную группу.

Было проведено исследование цито- и фототоксичности соединений 14 и 19 in vitro на клетках назофаренгиальной карциномы (KB), экспрессирующих ФР. Показано, что введение остатка ФК увеличило внутриклеточное накопление в 7 раз по сравнению с исходным TPP-COOH. При этом накопление конъюгатов резко снижалось при добавлении избытка ФК в культуральную среду, что говорит о конкурентном ингибировании ФР. Azais и др. оценили фотодинамическую эффективность конъюгата 19 in vivo [48]. В качестве модели была использована аденокарцинома NuTu-19, клетки которой прививали крысам для создания опухоли рака яичников. Было показано, что накопление ФС в опухоли оказалось в 9.6 раз выше, чем в нормальных тканях (Рисунок 2). В опытах с официнальным ФС Фотофрином коэффициент накопления составил 2.1.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Суворов Никита Владимирович, 2019 год

- Ч о

Н02С^|Ам^С02Н

Н Н

23

24

R02C

25: R = Н

26: R = СН3

Н3С~ Н3С02С О;

со2сн3

ОСН3

Схема 6. Региоселективное введение лиганда ПСМА в положение 3 триметилового эфира хлорина е6 с помощью реакции тетразин-алкенового присоединения.

Реагенты и условия: (i) EDC, NHS, DMF, 20 oC, 48 ч; (ii) 10 % TFA/DCM, 16 ч; (iii) DMF, 20 oC, 24 ч; (iv) SOCI2, CH3OH/DCM, 20 oC, 1,5 ч.

+

Фототоксичность конъюгата 25 (Таблица 3) оценивали на клеточных линиях рака простаты 22Rv1 и PC-3 в условиях, аналогичных ранее описанным для 13- и 15-замещенных хлоринов (гл. П.2.1). В качестве референсного ФС использовали Радахлорин (RadaPharma, Россия). На обеих линиях наблюдалась более высокая фотодинамическая активность пигмента 25 по сравнению с Радахлорином. При этом с увеличением времени инкубации уменьшается концентрация полумаксимального ингибирования (ИК50). Следует отметить, что 3-замещенный хлорин 25 оказался эффективным на обеих клеточных линиях в отличие от 13-замещенного конъюгата 12, который активен только на линии 22Rv1 (ПСМА+) и 15-замещенного конъюгата 18, уступающего по активности Радахлорину (разд. П.2.1, таблица 2).

Таблица 3. Фототоксичность конъюгатов 25 и Радахлорина3.

ИК50, мкМ

Время инкубации, часы 0,5 1 2 4 6

22Rv1 (ПСМА+)

25 10.2±0.3 6.7±0.2 2.3±0.2 0.9±0,1 0.7±0,1

Радахлорин 15±0.4 11.3±0.4 6.0±0.2 3.9±0.2 2.1±0.2

РС-3 (ПСМА-)

25 3.4±0.2 2.9±0.2 2.1±0,1 0.6±0,1 0.6±0,1

Радахлорин 15.3±0.4 9.1±0.3 6.5±0.2 4.4±0.2 2.7±0.2

Таким образом, мы показали, что click-реакция тетразин-алкенового присоединения, протекающая в мягких условиях при отсутствии катализатора, является эффективным способом региоселективного введения достаточно сложных биологически активных молекул в производные хлорофилла а. Введение лиганда к ПСМА в положение 3 макроцикла с помощью вышеописанной реакции привело к значительному увеличению фототоксичности полученного ФС по сравнению с официнальным препаратом, используемым в клинике.

II.2.3. Синтез таргетного бактериопурпуринимида с вектором к ПСМА

Ранее в нашей лаборатории был получен бактериопурпуринимид, представляющий собой О-пропилоксим-Ж-пропоксисибактериопурпуринимид (дипропокси-БПИ), который оказался стабильным ФС с высокими фотоиндуцированной цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам и фотодинамической эффективностью in vivo на опухолях различного генеза [111].

Для повышения эффективности интернализации вышеназванного лидерного ФС в опухолевые клетки предстательной железы ПСМА-лиганд был присоединен по пропионовому остатку бактериопурпуринимида.

В схеме синтеза использовали пептидомиметик 27 с незащищенными карбоксильными группами (Схема 7), так как условия удаления трет--бутильных защитных групп (10-15% TFA в CH2Cl2) после конъюгации с бактериопурпуринимидом являются достаточно жесткими для природного пигмента. Амидирование дипропокси-БПИ проводилось методом активированных эфиров путем образования промежуточного Ж-сукцинимидного эфира О-пропилоксим-Ж-

3 Эксперименты выполнены в МНИОИ им. П.А. Герцена научным сотрудником отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии, к.б.н. А. Д. Плютинской

пропоксибактериопурпуринимида 29, который был выделен из реакционной смеси хроматографически. Последний был введен в реакцию с пептидомиметиком 27 с образованием соединения 30 (Схема 8). В масс-спектре высокого разрешения был обнаружен молекулярный ион, соответствующий целевому продукту. Для подтверждения структуры методом ЯМР свободные карбоксильные группы в соединении 30 были прометилированы с помощью диазометана. Полученный пигмент 31 растворялся в СОС13, а сигналы в спектре ЯМР соответствовали предложенной структуре.

COOtBu r-^NH

к о Vta

X X X

tBuOOC N N COOtBu H H

СООН

NH,

i,ii

ч оС ; i 1 НООС N^N^COOH Н Н

5 27

Схема 7. Удаление защитных групп в пептидомиметике 5.

Реагенты и условия: (i) H2, Pd/C, CH3OH, 20 oC; (ii) 10% TFA/DCM, 20 oC.

28

Q^yz.0

COOR r^N' -O

k О V

X X X

ROOC"^ N N COOR H H

III

30: R = H

31: R = CH3

Схема 8. Направленное введение лиганда ПСМА в состав молекулы дипропокси-БПИ. Реагенты и условия: (i) EDC, NHS, ДХМ, 24 ч.; (ii) 27, DCM/i-PrOH; (iii) CH2N2, DCM.

Полученный конъюгат 30 растворялся в натрий-фосфатном буфере (рН=7.2) и был стабилен при длительном хранении. При этом спектральные свойства исходного дипропокси-БПИ 28 сохранялись, что свидетельствует об отсутствии агрегации ФС в водной среде (Рисунок 6).

Длина волны,нм

Рисунок 6. Спектр поглощения конъюгата 30 в PBS.

Фотоиндуцированная цитотоксичность конъюгата 30 была изучена на линии клеток рака предстательной железы со сверхэкспрессией рецепторов ПСМА (22Rvl) при инкубации 0.5, 2 и 4 часов после облучения. В качестве референсного ФС была использована эмульсия исходного дипропокси-БПИ 28 в Kolliphor. Было установлено, что фотоиндуцированная цитотоксичность полученного таргетного ФС 30 в 5 раз меньше, чем у свободного дипропокси-БПИ (Таблица 4). Неожиданный результат может быть связан с высокой гидрофильностью конъюгата 30, имеющего в своей структуре три карбоксильные группы, что снижает эффективность трансмембранного переноса по сравнению с пассивным транспортом мицеллярной формы дипропокси-БПИ.

Таблица 4. Фотоцнндуцнрованная цитотоксичность конъюгата О-пропилоксим-N-пропокснбактериопурпуринимнда с ПСМА-лнгандом и дгтропоксн-БПИ на клетках рака простаты 22Rvl~.

ИК50, мкМ

ФС/Время инкубирования -

0,5 ч 2 ч 4 ч

Соединение 30 1.55±0.12 1.29±0.15 1.10±0.10

Эмульсия дипропокси-БПИ

0.27±0.03 0.21±0.02 0.20±0.03

в Kolliphor ELP (4%)

Таким образом, изучение взаимосвязи «структура ФС-активность» показывает, что прямое цитотоксическое действие исследуемых ФС является многофакторным процессом, зависящим от природы макроцикла (хлорин или бактериохлорин), наличия или отсутствия векторной молекулы в структуре пигмента, ее местоположения на периферии макроцикла и от

общей амфифильности ФС, определяющей биодоступность как на клеточном, так и на организменном уровне.

II.3. Нанокомплексы на основе частиц магнетита и производного бактериохлорофилла а

Включение различных противоопухолевых агентов в состав биосовместимых наноматериалов позволяет увеличить селективность накопления препаратов в опухоли за счет EPR-эффекта. Среди различных наноносителей наибольшее внимание исследователей привлекают наночастицы магнетита, в связи с их низкой токсичностью, возможностью функционализации, относительной агрегативной устойчивостью, а также собственными суперпарамагнитными свойствами. В данной работе был разработан метод иммобилизации ФС на поверхность таких наночастиц.

В качестве фотосенсибилизатора, иммобилизуемого на наночастицы магнетита, был выбран O-пропилоксим-N-пропоксибактериопурпуринимид 28, использованный нами ранее (глава II.2.3.), имеющий максимум поглощения в области 800 нм и обеспечивающий возможность лечения глубокозалегающих и пигментированных опухолей [111]. В настоящей работе для доставки дипропокси-БПИ в опухолевые клетки предложены наночастицы магнетита, которые кроме известных преимуществ наноразмерных материалов, обладают суперпарамагнитными свойствами, благодаря чему могут использоваться в магнитно-резонансной томографии в качестве контрастных агентов. Иммобилизация фотосенсибилизатора на поверхность таких наночастиц позволяет создавать тераностики для флуоресцентной визуализации опухоли, МРТ-диагностики и лечения методом ФДТ.

Наночастицы магнетита сферической формы получали по стандартной методике, исходя из олеата железа (III) [112]. Средний размер частиц по данным ПЭМ составил 12 нм. На начальном этапе работы иммобилизация дипропокси-БПИ проводилась на наночастицах магнетита, покрытых плюроником F127 - амфифильным блок-сополимером полиэтилен- и полипропиленгликоля, являющимся солюбилизатором гидрофобных красителей и лекарств [113]. Однако при использовании такого подхода наблюдалась агрегация ФС, сопровождающаяся смещением длинноволновой полосы поглощения в область 900 нм, тушением флуоресценции и подавлением генерации синглетного кислорода.

Олеиновая к-та

28 32

Схема 9. Получение железооксидных наночастиц, нагруженных дипропокси-БПИ.

Другой подход, использованный нами в этой работе, заключался в иммобилизации гидрофобного ФС на наночастицы магнетита, покрытых олеиновой кислотой, и последующей обработкой их плюроником F127. Сначала были приготовлены сферические наночастицы магнетита из олеата железа (III) и инкубированы с ФС в хлористом метилене. Вслед за этим, хлористый метилен был удален при пониженном давлении и смесь была растворена в гексане. Избыток ФС 28, не растворимого в гексане, был удален центрифугированием. Полученные нанокомплексы, как и исходные наночастицы, напротив, оказались хорошо растворимы в неполярных растворителях. Затем полученные наночастицы, нагруженные ФС, обрабатывали водным раствором плюроника F127, с последующим осаждением их центрифугированием (Схема 9). Использование такого подхода позволило преодолеть агрегацию фотосенсибилизатора и сохранить его спектральные свойства (Рисунок 7). После загрузки ФС и покрытия наночастиц плюроником F127 средний гидродинамический диаметр частиц, определенный методом динамического светорассеяния (ДСР), составил 125 нм. Концентрации наночастиц и ФС в полученном растворе составили 2,9 мг/мл и 295 мкг/мл соответственно, а загрузка ФС на поверхность наночастиц составила 9,2 %масс. Согласно литературным данным по получению и исследованию аналогичных комплексов НЧ с ФС данные значения сопоставимы с полученными другими авторами [114].

A B C

Рисунок 7. Микрофотография ПЭМ наночастиц с ФС и гистограмма распределения по размерам наночастиц (А), электронный спектр поглощения дипропокси-БПИ, иммобилизованного на наночастицы магнетита (В). Диаграмма распределения по гидродинамическому диаметру мицелл ФС в плюронике F127 (1) и наночастиц, загруженных дипропокси-БПИ (2) (С).

Изучение внутриклеточного накопления наноструктурированного дипропокси-БПИ проводилось на двух клеточных линиях - ЬКСаР (ПСМА+) и PC-3 (ПСМА-), а для сравнения была взята мицеллярная форма того же фотосенсибилизатора в плюронике F127. В ходе исследования было показано диффузное окрашивание цитоплазмы клеток обеих линий, инкубированных с ФС-НЧ, по сравнению с интактными клетками, в среду культивирования которых ФС не добавляли (Рисунки 8 и 9). Для сравнения динамики накопления двух форм ФС - мицеллярной и наноструктурированной - была оценена интенсивность флуоресценции клеток. В случае клеточной линии ЬКСаР (Рисунок 10А) показано, что в первые 60 мин инкубирования интенсивность флуоресценции, а, следовательно, и концентрация ФС в клетках, достаточно быстро возрастает. Однако в дальнейшем скорость накопления ФС в клетках данной линии начинает уменьшаться. Кроме того, разница в скорости накопления мицеллярной и наноструктурированной форм ФС в клетках линии LNCaP несущественна. Для клеток линии РС-3 было показано, что накопление двух форм ФС в них наиболее активно происходит в первый час инкубирования и в дальнейшем содержание ФС в клетках значительно не изменяется (Рисунок 10В). При этом для клеток линии РС-3 было выявлено существенное различие в эффективности накопления мицеллярной и наноструктурированной форм ФС. Накопление последней оказалось в два раза больше. Данное обстоятельство можно объяснить различием в морфологии клеток LNCaР и PC-3 и разными размерами частиц. При этом окончательные выводы о влиянии размера частиц ФС на его туморотропность могут быть сделаны только после экспериментов на животных-опухоленосителях.

А В С D Е

F G Н 1 J

15 мин 30 мин 45 мин 60 мин 120 мин

Рисунок 8. Флуоресцентные микрофотографии клеток рака предстательной железы ЬЫСаР с мицеллярной формой дипропокси-БПИ в плюронике F127 (A-E) и c наноструктурированной формой ФС (F-J) через 15, 30, 45, 60 и 120 минут после добавления пигмента к клеткам, а также фотография интактных клеток (K).

А В С D Е 1

Г

F G Н 1 J

15 мин 30 мин 45 мин 60 мин 120 мин

Рисунок 9. Флуоресцентные микрофотографии клеток рака предстательной железы PC-3 с мицеллярной формой дипропокси-БПИ в плюронике F127 (A-E) и c наноструктурированной формой ФС (F-J) через 15, 30, 45, 60 и 120 минут после добавления пигмента к клеткам, а также фотография интактных клеток (K).

Time, min

Time, min

А В

Рисунок 10. Кинетика накопления мицеллярного (1) и наноструктурированного (2) фотосенсибилизатора в клетках линии ЬЫСаР (А) и РС-3 (В).

Поскольку в данном случае в составе наноконструкции 32 отсутствует векторный фрагмент, зависимость ее накопления от экспрессии рецепторов (ПСМА+ или ПСМА-) не наблюдается.

Таким образом, в настоящей работе нами предложен метод получения железооксидных наночастиц с иммобилизованным бактериопурпуринимидом, который позволяет сохранять фотодинамическую активность пигмента, сочетая ее с возможностями диагностики онкологических заболеваний методом магнитно-резонансной томографии за счет наличия в конструкции магнитоактивных наночастиц.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Растворители были очищены и приготовлены по стандартным методикам. Для колоночной хроматографии использовали силикагель 40/60 («Merck», Германия). Для препаративной ТСХ использовали силикагель 60 («Merck», Германия). Аналитическую ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 F245 («Merck», Германия).

Спектры ЯМР были зарегистрированы на спектрометрах Bruker DPX300, Avance 400 и Avance-AV 600 в CDCl3 или DMSO-d6. Остаточные сигналы ядер 1Н использовались для калибровки шкалы. Эксперименты были поставлены по стандартным методикам Bruker. Для обработки данных спектроскопии ЯМР использовался программный комплекс Bruker TopSpin 3.5. Масс-спектры высокого разрешения были зарегистрированы на масс-спектрометрах Orbitrap Elite (Thermo Scientific) и Bruker micrOTOF II с использованием ESI. Масс-спектры MALDI были получены на масс-спектрометре Bruker Ultraflex TOF/TOF c использованием 2,5-дигидроксибензойной кислоты в качестве матрицы. Спектры поглощения зарегистрированы на спектрометре Shimadzu UV1800 UV/VIS в воде или QH2Cl2 (DCM). Спектры флуоресценции были получены на приборе CARY Eclipse (Varian, USA). Размер наночастиц определяли методом динамического светорассеяния, используя Malvern Zetasizer Nano ZS. Получение фотосенсибилизатора и его иммобилизация на наночастицы проводились в условиях инертной атмосферы и защиты от света.

Хлорин е6 14 был получен из метилового эфира феофорбида а 1 согласно описанной методике [115]. О-пропилоксим-Ы-пропоксибактериопурпуринимид 2S был синтезирован из бактериопурпурина по методике, разработанной на кафедре ХТБАСМиОХ [116]. 3-Фенил-1,2,4,5-тетразин и (1,2,4,5-тетразин-3-ил)бензойная кислота были синтезированы согласно представленной схемы [117]. Нумерация атомов для соединений 13, 19, 26 и 31 представлена в Приложении.

Общая схема синтеза диметиловых эфиров 131-^-(аминоалкил)амидов

хлорина е6 (2a-d)

К раствору метилового эфира феофорбида а 1 (41 мг, 0,066 ммоль) в дихлорметане (2 мл) были добавлены соответствующий диаминалкан (30 экв., 1.98 ммоль) и DIPEA (115 мкл, 0.66 ммоль). Реакция перемешивалась в течение 2 часов при 40 0С в инертной атмосфере. Ход реакции отслеживался с помощью аналитической ТСХ. Реакционная смесь была разбавлена дихлорметаном (50 мл) и промыта водой (3х50мл.). Органический слой был высушен над сульфатом натрия и упарен при пониженном давлении. Соединения 2a-d были очищены с использованием препаративной ТСХ (изократическое элюирование, DCM/MeOH, 13/1, v/v).

Диметиловый эфир 131-^-(4-аминобутил)амида хлорина е6 (2a)

Выход 58,5% (23.4 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3, 5, м.д.): 9.68 (Н, c, 10-Н), 9.60 (Н, c, 5-Н), 8.83 (1Н, c, 20-Н), 8.01 (H, дд, J = 17.8 Гц, 11.5 Гц, 31-Н), 6.82 (H, т, J = 5.2 Гц, 132-NH), 6.30 (H, д, J = 17.8 Гц, Е-32-Н), 6.06 (Н, дд, J = 11.5 Гц, Z-32-H), 5.50 (Н, д, J = 18.9 Гц, 15-СН2а), 5.23 (Н, д, J = 18.9 Гц, 15-CH2b), 4.48 (Н, м, 18-Н), 4.37 (Н, м, 17-Н), 3.82 (2H, м, 81-СН2), 3.78 (3Н, с, ^-COOC^), 3.62 (3Н, с, 12-СНэ), 3.54 (3Н, с, H^COOC^), 3.49 (3Н, с, 2-СНэ), 3.48 (2H, м, 133-CH2), 3.31 (3Н, с, 7-СН3), 2.68 (2Н, м, 136-СН2), 2.55 (Н, м, 172-СН2а), 2.25 (Н, м, 171-СН2а), 2.18 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.79 (Н, м, 171- СН2Ь), 1.73 (3H, д, J = 7.1 Гц, 18-CH3), 1.69 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СН3), 1.45 (4H, м, 134-135-СН2), -1.60 (Н, уш.с, I - NH), -1.89 (Н, уш.с, III - NH). UV/VIS (CHCh), Xmax, нм (s, M'W): 403 (143000), 502 (16000), 527 (7500), 604 (5300), 663 (46000).

Диметиловый эфир 131-^-(6-аминогексил)амида хлорина е6 (2b)

Выход 53,3% (21.3 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3, 5, м.д.): 9.69 (Н, c, 10-Н), 9.64 (Н, c, 5-Н), 8.80 (1Н, c, 20-Н), 8.06 (H, дд, J = 17.3 Гц, 11.4 Гц, 31-Н), 6.60 (H, т, J = 5.0 Гц, 132-NH), 6.35 (H, д, J = 17.3 Гц, Е-32-Н), 6.06 (Н, дд, J = 11.4 Гц, 7-32-Н), 5.56 (Н, д, J = 18.5 Гц, 15-СН2а), 5.24 (Н, д, J = 18.5 Гц, 15-СН2Ь), 4.47 (Н, м, 18-Н), 4.34 (Н, м, 17-Н), 3.79 (2H, м, 81-СН2), 3.77 (3Н, с, ^-COOC^), 3.60 (3Н, с, 12-СН3), 3.52 (3Н, с, H^COOC^), 3.46 (3Н, с, 2-СН3), 3.41 (2H, м, 133-CH2), 3.29 (3Н, с, 7-СН3), 2.84 (2Н, м, 138-СН2), 2.51 (Н, м, 172-СН2а), 2.27 (Н, м, 171-СН2а), 2.21 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.77 (Н, м, 171- СН2Ь), 1.73 (3H, д, J = 7.1 Гц, 18-CH3), 1.68 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СН3), 1.41 (8H, м, 134-137-СН2), -1.23 (Н, уш.с, I - NH), -1.73 (Н, уш.с, III - NH). UV/VIS (CHCh), Xmax, нм (s, M'W): 404 (145000), 506 (14000), 528 (8000), 604 (6000), 663 (43000).

Диметиловый эфир 131-^-(8-аминооктил)амида хлорина е6 е6 (2c)

Выход 58,8% (23.5 мг).

ЯМР (300 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 9.63 (Н, с, 10-Н), 9.61 (Н, с, 5-Н), 8.81 (1Н, с, 20-Н), 8.09 (H, дд, J = 17.7 Гц, 11.4 Гц, 31-Н), 6.74 (H, т, J = 5.5 Гц, 132-NH), 6.32 (H, д, J = 17.7 Гц, Е-32-Н), 6.10 (Н, дд, J = 11.4 Гц, 7-32-Н), 5.55 (Н, д, J = 18.7 Гц, 15-СН2а), 5.24 (Н, д, J = 18.7 Гц, 15-СН2Ь), 4.46 (Н, м, 18-Н), 4.34 (Н, м, 17-Н), 3.76 (2H, м, 81-СН2), 3.65 (3Н, с, 152-СООСНэ), 3.61 (3Н, с, 12-СН3), 3.52 (3Н, с, 173-СООСНэ), 3.43 (3Н, с, 2-СНэ), 3.40 (2H, м, 133-CH2), 3.33 (3Н, с, 7-СН3), 2.76 (2Н, м, 1310-СН2), 2.51 (Н, м, 172-СН2а), 2.27 (Н, м, 171-СН2а), 2.21 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.77 (Н, м, 171- СН2Ь), 1.74 (3H, д, J = 7.1 Гц, 18-CH3), 1.64 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СНэ), 1.41 (12H, м, 134-139-СН2) -1.67 (Н, уш.с, I - NH), -1.75 (Н, уш.с, III - NH). UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (s, М"1см"1): 403 (144000), 504 (14500), 527 (8000), 604 (6000), 663 (45000).

Диметиловый эфир 131-^-(10-аминодецил)амида хлорина е6 (2d)

Выход 51,4% (20.5 мг)

1Н ЯМР (300 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 9.69 (Н, с, 10-Н), 9.65 (Н, с, 5-Н), 8.82 (1Н, с, 20-Н), 8.11 (H, дд, J = 17.5 Гц, 11.3 Гц, 31-Н), 6.61 (H, м, 132-NH), 6.36 (H, д, J = 17.5 Гц, Е-32-Н), 6.14 (Н, дд, J = 11.3 Гц, 7-32-Н), 5.56 (Н, д, J = 18.7 Гц, 15-СН2а), 5.26 (Н, д, J = 18.7 Гц, 15-СН2ь), 4.49 (Н, м, 18-Н), 4.34 (Н, м, 17-Н), 381 (2H, м, 81-СН2), 3.64 (3Н, с, 152-СООСН3), 3.61 (3Н, с, 12-СН3), 3.48 (3Н, с, 173-СООСН3), 3.42 (3Н, с, 2-СН3), 3.37 (2H, м, 133-CH2), 3.33 (3Н, с, 7-СН3), 2.75 (2Н, м, 1312-СН2), 2.54 (Н, м, 172-СН2а), 2.23 (Н, м, 171-СН2а), 2.18 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.77 (Н, м, 171- СН2Ь), 1.74 (3H, д, J = 7.1 Гц, 18-CH3), 1.67 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СН3), 1.42 (16H, м, 134-1311-СН2), -1.54 (Н, уш.с, I - NH), -1.83 (Н, уш.с, III - NH). UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (s, M'W1): 403 (146000), 504 (15000), 527 (8000), 604 (6000), 663 (45000).

Общая схема синтеза конъюгатов диметиловых эфиров 131-^-(аминоалкил)амидов

хлорина е6 c фолиевой кислотой (3a-d)

Аминоамидное производное 2a-d (1 экв., 0.03 ммоль), фолиевая кислота (13.2 мг, 0.03 ммоль) и DCC (7.21 мг, 0.035 ммоль) были растворены в смеси диметилсульфоксида (500 мкл) и пиридина (200 мкл). Реакция перемешивалась в течение 72 часов в атмосфере аргона. Затем реакционную смесь по каплям вводили в смесь диэтилового эфира (40 мл) и ацетона (10 мл) при 0 0С и интенсивном перемешивании. Образовавшийся осадок зелёного цвета был отфильтрован, промыт диэтиловым эфиром и высушен при пониженном

давлении. Соответствующие продукты 3a-d были перекристаллизованы в смеси DCM/MeOH, 5/1, v/v, а затем промыты PBS и дистиллированной водой. Полученные соединения были высушены под вакуумом.

Конъюгат метилового эфира 131-^-(аминобутил)амида хлорина е6

с фолиевой кислотой (3a)

Выход 35.7% (11.3 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6, 5, м.д.): 9.76 (Н, c, 10-Н), 9.73 (Н, c, 5-Н), 9.10 (2Н, оба c, 20-Н, птерин-H), 8.64 (Н, д, J = 9.3 Гц, Phe , 3'-Н), 8.29 (H, дд, J = 17.6 Гц, 11.4 Гц, 31-Н), 8.19 (Н, д, J = 7.1 Гц, a-Glu-NH), 7.81 (Н, м, Phe-NH), 7.66 (Н, д, J = 8.3 Гц, Phe, 5'-Н), 6, 89 (2H, м, 132-NH, 137-NH), 6.64 (2Н, д, J = 8.3 Гц, Phe, 2'-H, 6'-Н), 6.45 (H, д, J = 17.6 Гц, Е-32-Н),

6.17 (Н, дд, J = 11.4 Гц, 7-32-Н), ), 5.53 (Н, д, J = 18.9 Гц, 15-СН2а), 5.31 (Н, д, J = 18.9 Гц, 15-СН2Ь), 4.61 (2Н, м, 18-Н, 17-Н), 3.82 (2H, м, 81-СН2), 3.65 (3Н, с, 152-СООСН3), 3.56 (3Н, с, 12-СНэ), 3.52 (3Н, с, П^СООС^), 3.49 (3Н, оба с, 7-СНэ, 2-СНэ), 3.12 (4H, м, 133-CH2, 136-CH2), 2.67 (Н, м, 172-СН2а), 2.26 (Н, м, 171-СН2а), 2.17 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.79 (Н, м, 171-СН2Ь), 1.67 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СНэ), 1.63 (3H, д, J = 7.3 Гц, 18-CH3), 1.45 (4H, м, 134,135-CH2), -1.78 (Н, уш.с, I - NH), -2.06 (Н, уш.с, III - NH). Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]: 1118.27, найдено: 1118.91. UV/VIS (CHCh), W нм (s, M"1см"1): 407 (104500), 503 (19600), 527 (9000), 667 (36200).

Конъюгат метилового эфира 131-^-(аминогексил)амида хлорина е6

с фолиевой кислотой (3b)

Выход 41.2% (12.9 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6, 5, м.д.): 9.78 (Н, c, 10-Н), 9.75 (Н, c, 5-Н), 9.11 (2Н, оба c, 20-

H, птерин-H), 8.63 (Н, д, J = 9.4 Гц, Phe , 3'-Н), 8.32 (H, дд, J = 17.6 Гц, 11.7 Гц, 31-Н), 8.11 (Н, д, J = 7.4 Гц, a-Glu-NH), 7.81 (Н, м, Phe-NH), 7.66 (Н, д, J = 8.4 Гц, Phe, 5'-Н), 6, 93 (2H, м, 132-NH, 139-NH), 6.62 (2Н, д, J = 8.4 Гц, Phe, 2'-H, 6'-Н), 6.45 (H, д, J = 17.6 Гц, Е-32-Н),

6.18 (Н, дд, J = 11.7 Гц, 7-32-Н), ), 5.53 (Н, д, J = 18.8 Гц, 15-СН2а), 5.30 (Н, д, J = 18.8 Гц, 15-СН2Ь), 4.61 (2Н, м, 18-Н, 17-Н), 3.82 (2H, м, 81-СН2), 3.67 (3Н, с, 152-СООСНэ), 3.56 (3Н, с, 12-СНэ), 3.53 (3Н, с, 173-СООСНэ), 3.50 (3Н, оба с, 7-СНэ, 2-СНэ), 3.12 (4H, м, 133-CH2, 138-CH2), 2.67 (Н, м, 172-СН2а), 2.27 (Н, м, 171-СН2а), 2.16 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.79 (Н, м, 171- СН2Ь),

I.67 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СНз), 1.63 (3H, д, J = 7.3 Гц, 18-CH3), 1.52 (8H, м, 134- 137-CH2), -1.81 (Н, уш.с, I - NH), -2.10 (Н, уш.с, III - NH). Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]:

1146.30, найдено: 1146.71. UV/VIS (CHCI3), W, нм (s, М"1см"1): 406 (101600), 504 (18500), 527 (8000), 668 (43700).

Конъюгат метилового эфира 131-^-(аминооктил)амида хлорина е6

с фолиевой кислотой (3с)

Выход 33.5% (10.5 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6, 5, м.д.): 9.78 (Н, с, 10-Н), 9.75 (Н, с, 5-Н), 9.11 (2Н, оба с, 20-

H, птерин-H), 8.63 (Н, д, J = 9.4 Гц, Phe , 3-Н), 8.32 (H, дд, J = 17.6 Гц, 11.7 Гц, 31-Н), 8.11 (Н, д, J = 7.4 Гц, a-Glu-NH), 7.81(Н, м, Phe-NH), 7.66 (Н, д, J = 8.6 Гц, Phe, 5'-Н), 6, 86 (2H, м, 132-NH, 1311-NH), 6.62 (2Н, д, J = 8.6 Гц, Phe, 2'-H, 6'-Н), 6.45 (H, д, J = 17.6 Гц, Е-32-Н), 6.19 (Н, дд, J = 11.7 Гц, 7-32-Н), ), 5.52 (Н, д, J = 18.8 Гц, 15-СН2а), 5.30 (Н, д, J = 18.8 Гц, 15-СН2Ь), 4.61 (2Н, м, 18-Н, 17-Н), 3.83 (2H, м, 81-СН2), 3.67 (3Н, с, 152-СООСНэ), 3.56 (3Н, с, 12-СН3), 3.52 (3Н, с, 173-СООСНэ), 3.50 (3Н, оба с, 7-СНэ, 2-СНэ), 3.08 (4H, м, 133-CH2, 1310-CH2), 2.66 (Н, м, 172-СН2а), 2.29 (Н, м, 171-СН2а), 2.19 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.79 (Н, м, 171- СН2Ь),

I.69 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СНэ), 1.62 (3H, д, J = 7.3 Гц, 18-CH3), 1.41 (12H, м, 134- 139-CH2), -1.80 (Н, уш.с, I - NH), -2.10 (Н, уш.с, III - NH). Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]: 1174.52, найдено: 1174.37. UV/VIS (CHCI3), W, нм (s, M"1см"1): 408 (100500), 507 (21000), 527 (9000), 667 (42900).

Конъюгат метилового эфира 131-^-(аминодецил)амида хлорина е6

с фолиевой кислотой (3d)

Выход 30.3 % (9.5 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6, 5, м.д.): 9.78 (Н, с, 10-Н), 9.76 (Н, с, 5-Н), 9.11 (2Н, оба с, 20-

H, птерин-H), 8.59 (Н, д, J = 9.3 Гц, Phe , 3'-Н), 8.32 (H, дд, J = 17.6 Гц, 11.4 Гц, 31-Н), 8.19 (Н, д, J = 7.1 Гц, a-Glu-NH), 7.78 (Н, м, Phe-NH), 7.66 (Н, д, J = 8.3 Гц, Phe, 5'-Н), 6, 89 (2H, м, 132-NH, 1313-NH), 6.64 (2Н, д, J = 8.3 Гц, Phe, 2'-H, 6'-Н), 6.45 (H, д, J = 17.6 Гц, Е-32-Н), 6.18 (Н, дд, J = 11.4 Гц, 7-32-Н), ), 5.53 (Н, д, J = 18.7 Гц, 15-СН2а), 5.30 (Н, д, J = 18.7 Гц, 15-СН2Ь), 4.61 (2Н, м, 18-Н, 17-Н), 3.82 (2H, м, 81-СН2), 3.66 (3Н, с, 152-СООСНэ), 3.56 (3Н, с, 12-СН3), 3.53 (3Н, с, 173-СООСНэ), 3.50 (3Н, оба с, 7-СНэ, 2-СНэ), 3.16 (4H, м, 133-CH2, 1312-CH2), 2.68 (Н, м, 172-СН2а), 2.26 (Н, м, 171-СН2а), 2.17 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.79 (Н, м, 171- СН2Ь),

I.67 (3H, т, J = 7.6 Гц, 82-СН3), 1.63 (3H, д, J = 7.3 Гц, 18-CH3), 1.37 (16H, м, 134-1311-CH2), -1.83 (Н, уш.с, I - NH), -2.13 (Н, уш.с, III - NH). Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]: 1202.40, найдено: 1202.54. UV/VIS (CHCI3), W, нм (s, M'W): 406 (100900), 508 (20900), 527 (8500), 668 (43900).

Три-трет-бутил(9$,13Л)-3,11-диоксо-1-фенил-2-оксо-4,10,12-триазопентадекан-9,13,15-трикарбоксилат (5)

Гидрохлорид ди-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты 4 (500 мг, 1.69 ммоль) и триэтиламин (800 мкл, 5.7 ммоль) были растворены в дихлорметане (15 мл). После охлаждения смеси до -78 0С в реакцию по каплям был введён раствор трифосгена (163 мг, 0.57 ммоль) в дихлорметане (5 мл). После этого реакционная смесь была доведена до комнатной температуры и поставлена на перемешивание в течение получаса. По истечении этого времени в реакцию был добавлен L-Lys(Z)-OtBuxHCl (630 мг, 1.69 ммоль), растворённый в триэтиламине (1 мл, 7.2 ммоль) и дихлорметане (3 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 часов реакционная смесь была разбавлена дихлорметаном (50 мл) и промыта водой (2х100 мл.). Органический слой был высушен над сульфатом натрия и упарен при пониженном давлении. Соединение 5 (420 мг, выход 78%) было очищено с использованием колоночной хроматографии (изократические элюирование, EtOAc/Hex, 2/3, v/v) и представляло собой бесцветное маслянистое вещество. !Н ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5, м.д.) 7.35 (5H, м, Lys, 14-C6H5), 5.40 (2H, д, Lys, 7-NH, Glu, 1-NH), 5.09 (2H, м, Lys, 13-CH2), 4.31 (2H, м, Lys, 6-CH, Glu, 2-CH), 3.16 (2H, м, Lys, 2-CH2), 2.28 (2H, м, Lys, 3-CH2), 1.67 (8H, м, Lys, 4,5-CH2, Glu, 3,4-CH2), 1.44 (18-H, оба с, Lys, 63-C(CHb)3, Glu, 23-C(CHb)b), 1.42 (9H, с, Glu, 52-C(CH3)3). 13С ЯМР (90 МГц, CDCh, 5, м.д.): 172.5, 172.4, 157.0, 156.6, 136.7, 128.5, 128.1, 128.0, 82.2, 81.7, 80.5, 66.5, 52.3, 53.0, 40.6, 32.6, 31.6, 29.3, 28.3, 28.1, 28.0, 22.3. Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 622.3698, найдено: 622.3702.

Ди-трет-бутил(((Л)-6-амино-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)карбомоил)-Ь-глутамат (6)

В раствор три-трет-бутил (95',135')-3,11-диоксо-1-фенил-2-оксо-4,10,12-триазопентадекан-9,13,15-трикарбоксилата 5 (373 мг, 0.6 ммоль) в метаноле (30 мл) в атмосфере аргона при интенсивном перемешивании был добавлен 5% Pd/C (98 мг). Реакция протекала в течение 8 часов в атмосфере водорода (р = 1 бар). Ход реакции отслеживали с помощью аналитической ТСХ. Реакционная смесь была отделена от катализатора с использованием фильтрации через целит и центрифугирования. Полученная масса была упарена и высушена при пониженном давлении. Полученное прозрачное маслянистое вещество 6 (287 мг, выход 98%) использовалось без дальнейшей очистки. 1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3, 5, м.д.) 6.21 (H, д, Lys, 7-NH), 6.13 (H, д, Glu, 1-NH), 4.37 (2Н, м, Lys, 6-CH, Glu, 2-CH), 3.13 (2H, м, Lys, 2-CH2), 2.33 (2H, м, Glu, 4-CH2), 2.28 (2-H, м, Lys, 3-

CH2), 1.67 (8H, м, Lys, 4,5-CH2, Glu, 3,4-CH2), 1.44 (18-H, м, Lys, 63-С(СНз)з, Glu, 23-С(СНз)з), 1.42 (9-H, с, Glu, 52-С(Шз)з). 13С ЯМР (90 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 172.6, 172.5, 172.4, 157.0, 82.0, 81.6, 80.5, 53.4, 53.0, 41.5, 32.8, 32.5, 31.6, 28.4, 28.07, 28.02, 28.00, 22.3. Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 488.3330, найдено: 488.3340.

Ди-трет-бутил (((Л)-6-(11-азидоундеканамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)карбамоил)-Ь-глутамат (7)

К раствору 11-азидоундекановой кислоты (173 мг, 0.76 ммоль) в DMF (4 мл) при перемешивании были добавлены EDC (78.5 мг, 0.5 ммоль) и NHS (58.3 мг, 0.51 ммоль). Через час в реакционную смесь был добавлен раствор ди-трет-бутил(((5)-6-амино-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)карбомоил)^-глутамата 6 (70 мг, 0.1 ммоль) в DMF (1 мл). После перемешивания в течение 24 часов реакционная смесь была разбавлена дихлорметаном (50 мл) и промыта водой (3х50 мл.). Органический слой был высушен над сульфатом натрия и упарен при пониженном давлении. Соединение 7 (73 мг, выход 30%) было очищено с использованием колоночной хроматографии (изократическое элюирование, EtOAc/Hex, 2/3, v/v).

1Н ЯМР (300 МГц, CDCI3, 5, м.д.) 6.38 (H, т, Lys, 1-NH), 5.62 (H, д, Lys, 7-NH), 5.46 (H, д, Glu, 1-NH), 4.28 (2H, м, Lys, 6-CH, Glu, 2-CH), 3.24 (2Н, т, Lys, 111-СН2) 3.20 (2H, м, Lys, 2-CH2), 2.30 (2H, м, Glu, 4-CH2), 2.18 (2H, т, 12-CH2), 1.67 (8H, м) 1.44 (27H, м, Lys, 63-С(Шз)з, Glu, 23-, 52-C(CH3)3). 13С ЯМР (90 МГц, CDCh, 5, м.д.): 173.8, 173.3, 172.4, 172.1, 157.4, 82.2, 81.3, 80.4, 53.5, 52.9, 51.4, 39.0, 36.5, 32.4, 31.6, 29.36, 29.33, 29.1, 28.9, 28.8, 28.1, 27.99, 27.93, 26.6, 25.9, 22.9. Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 697.4858, найдено: 697.4862.

(Л)-2-(3-((Л)-5-(11-азидоундеканамидо)-1-карбоксипентил)уреидо) пентадионовая кислота (8)

Ди-трет-бутил (((S)-6-(11 -азидоундеканамидо)-1 -(трет-бутокси)-1 -оксогексан-2-ил)карбамоил)^-глутамат 7 (73 мг, 0.037 ммоль) был растворён в дихлорметане (5 мл) c добавлением TFA (0,5 мл). Реакцию перемешивали в течение 12 часов. Вещество 8 (48 мг, выход 91%) было очищено с помощью обращёно-фазовой хроматографии с использованием колонки C18PuriFlash (15ц, HP, градиентное элюирование, CH3CN/H2O 580%, 25 мин, 20 мл/мин).

1H ЯМР (300 ЫГц, DMSO-d6, 5, м.д.): 7.75 (1Н, т, J = 4.6 Гц, Lys, 1-NH), 6.33 (2Н, уш с, Lys, 7-NH, Glu, 1-NH), 4.05 (2Н, м, Lys, 6-CH, Glu, 2-CH), 3.27 (2Н, м, Lys, 12-СН2), 2.92 (2H, м, Lys, 2-CH2), 2.50 (2Н, м, Glu, 4-CH2), 2.01 (2Н, м, Lys, 13-CH2), 1.34 (24H, м, Lys, 14! 79

111, 4 , 5-СН2, Glu, 3-CH2).13C ЯМР (90 МГц, CDCh, 5, м.д.): 175.0, 174.6, 174.1, 172.6, 157.8, 52.7, 52.1, 51.1, 48.7, 38.7, 35.9, 32.9, 32.2, 31.05, 30.32, 29.0, 28.7, 27.9, 26.6, 26.2, 25.8, 23.1. Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 529.2980, найдено: 529.2979.

Диметилововый эфир 131-(пропаргиламидо)хлорина е6 (9)

Метиловый эфир феофорбида а (40 мг, 0.063 ммоль) и пропаргиламин (200 мкл, 3.1 ммоль) были растворены в дихлорметане (2 мл) с добавлением DIPEA (100 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов. Ход реакции отслеживался с помощью аналитической ТСХ. После полной конверсии исходного реагента, смесь была разбавлена дихлорметаном (100 мл) и промыта 0.1 М раствором соляной кислоты (350 мл). Органический слой был высушен над сульфатом натрия и упарен при пониженном давлении. Соединение 9 (43 мг, выход 98%) было очищено с использованием колоночной хроматографии (система элюентов: DCL/MeOH, 50/1, v/v).

1Н ЯМР (300 МГц, CDCI3, 5, м.д.) 9.71 (Н, с, 10-Н), 9.64 (Н, с, 5-Н), 8.82 (Н, с, 20-Н), 8.11 (Н, дд, J = 17.9 Гц, 11.6 Гц, 31-Н), 6.64 (Н, т, J = 5.4 Гц, 132-NH), 6.40 (Н, дд, J = 17.7 Гц, J = 1.4 Гц, 32-На), 6.18 (Н, дд, J = 11.6 Гц, 1.5 Гц, 32-Нь), 5.50 (Н, д, J = 19.0 Гц, 15-СН2а), 5.26 (Н, д, J = 19.0 Гц, 15-СН2Ь), 4.59 (Н, дд, J = 5.4 Гц, 2.6 Гц N-C^), 4.53 (Н, дд, J = 4.6 Гц, 2.7 Гц, N-CH2b), 4.46 (Н, м, 18-Н), 4.39 (Н, м, 17-Н), 3.83 (3Н, с, 152-СООСН3), 3.78 (2Н, к, J = 7.8 Гц, 81-СН2), 3.62 (3Н, с, П^СООС^), 3.56 (3Н, с, 12-СН3), 3.49 (3Н, с, 2-СН3), 3.30 (3Н, с, 7-СНз), 2.56 (Н, м, 172-СН2а), 2.41 (Н, т, J = 2.2 Гц, 135-Ш), 2.25 (Н, м, 171-СН2а), 2.15 (Н, м, 172-СН2Ь), 1.80 (Н, м, 171- СН2Ь), 1.73 (3Н, д, J = 18.2 Гц, 18-СН3), 1.71 (3Н, т, J = 7.8 Гц, 82-СН3), -1.60 (Н, I - NH), -1.83 (Н, III - NH). UV/VIS (CHCI3), W, нм (s, М"1см"1): 391 (116500), 500 (11550), 528 (4300), 557 (2100), 608 (4200), 663 (33500).

Диметилововый эфир 15 -(пропаргиламидо)хлорина е6 (15)

К раствору хлорина е6 14 (49 мг, 0,82 ммоль) в дихлорметане (7 мл) были добавлены EDC (17 мг, 0.11 ммоль) и DMAP (4,4 мг, 0.036 ммоль). После перемешивания в течение 2 часов в реакционную смесь был добавлен пропаргиламин (20 мкл, 0.31 ммоль). По истечении 12 часов в реакционную колбу был добавлен диазометан (2 мл). Полученный раствор перемешивался 30 минут. Ход реакции отслеживался с помощью аналитической ТСХ. Растворитель был упарен при пониженном давлении. Сухой остаток был разбавлен дихлорметаном (100 мл) и промыт дистиллированной водой (3х50 мл). Органический слой был высушен над сульфатом натрия и упарен при пониженном давлении.!Соединение 15 (18.4 мг, выход 77%) было очищено с использованием препаративной ТСХ (изократическое элюирование, DCM/MeOH, 50:1, v/v).

>Н ЯМР (300 МГц, CDCI3, S, м.д.) 9.76 (Н, с, 10-Н), 9.63 (Н, с, 5-Н), 8.82 (Н, с, 20-Н), 8.07 (Н, дд, J = 17.4 Гц, 11.6 Гц, 31-Н), 6.38 (Н, дд, J = 17.9 Гц, 32-На), 6.18 (Н, дд J = 11.4 Гц, 32-Нь), 5.89 (Н, м, 132-NH), 5.24 (Н, д, J = 19.0 Гц, 15-СН2а), 5.09 (Н, д, J = 18.5 Гц, 15-СН2Ь), 4.48-4.42 (2Н, м, J = 7.4 Гц, N-CH2a, N-CH2b), 4.27 (3Н, с, 131-СООСНэ), 4.20 (Н, м, 18-Н), 3.93 (Н, м, 17-Н), 3.81 (2Н, м, 81-СН2), 3.60 (3Н, с, 173-СООСНэ), 3.54 (3Н, с, 12-СНэ), 3.50 (3Н, с, 2-СН3), 3.32 (3Н, с, 7-СН3), 2.56 (Н, м, 172-СН2а), 2.40-2.14 (3Н, м, 171-СН2а, 172-СН2Ь, 171-СН2Ь), 1,90 (Н, т, J = 7.1 Гц, 156-Н), 1.78 (3Н, д, J = 18.2 Гц, 18-СНэ), 1.73 (3Н, т, J = 7.8 Гц,82-СНэ), -1.50 (Н, NH). UV/VIS (CHCI3), W, нм (s, М"1см"1): 399 (116500), 500 (15500), 528 (4300), 557 (2100), 608 (4200), 665 (31500).

Общая схема синтеза Zn-комплексов производных хлорина е6 (10, 16)

К раствору соответствующего производного хлорина 9 или 15 в дихлорметане (1 мл) был добавлен насыщенный раствор Zn(OAc)22H2O в метаноле (100 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. Ход реакции контролировался спектрофотометрически. Затем в реакционную смесь был добавлен насыщенный водный раствор NaHCO3 (2 мл). По истечении 10 минут образовавшийся белый осадок бикарбоната цинка был отделен фильтрацией. Полученный раствор был разбавлен дихлорметаном (100 мл) и промыт дистиллированной (4х100 мл) и подкисленной (4х10 мл) водой. Органический слой был высушен над сульфатом натрия и упарен при пониженном давлении. Сухой остаток был растворён и закристаллизован в петролейном эфире.

Zn-комплекс диметилового эфира 131-(пропаргиламидо)хлорина е6 (10)

Исходя из соединения 9 (51 мг, 0.077 ммоль), выход соединения 10 составил 73% (34.4 мг).

>Н ЯМР (300 MHz, CDCI3, 5, м.д.): 9.36 (H, c, 10-H), 9.31 (H, c, 5-H), 8.59 (H, c, 20-H), 8.037.88 (Н, дд, J = 18.3 Гц, 11.8 Гц, 31-Н), 6.43 (H, т, 132-NH), 6.13-6.07 (Н, дд, J = 18.0 Гц, 32-На), 5.96-5.93 (Н, дд, J = 11.6 Гц, 32-Нб), 5.12 (Н, д, J = 19.0 Гц, 15-СН2а), 4.86 (Н, д, J = 19.0 Гц, 15-СН2ь), 4.39-4.09 (4H, м, N-CH", N-CH2b, 18-Н, 17-Н), 3.76 (3Н, с, 152-СООСНэ), 3.57-3.47 (5Н, м, 173-СООСНэ, J = 7.7 Гц, 81-СН2), 3.36 (3Н, с, 12-СНэ), 3.20 (3Н, с, 2-СНэ), 3.13 (3Н, с, 7-СН3), 2.55-2.40 (Н, м, 172-СН2а), 2.32 (Н, т, J = 2.2 Гц, 135-Н), 2.20-1.91 (3Н, м, 171-СН2ь, 172-СН2ь, 171-СН2а), 1.70 (3Н, д, J = 18.1 Гц, 18-СН3), 1.61 (3Н, т, J = 7.7 Гц, 82-СН3). UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (s, M'W): 413 (101500), 507 (11550), 530 (4300), 566 (3050), 635 (73100).

2

Zn-комплекс диметилового эфира 15 -(пропаргиламидо)хлорина е6 (16)

Исходя из соединения 15 (43 мг, 0.065 ммоль), выход соединения 16 составил 76% (36.3 мг).

>Н ЯМР (300 МГц, CDCI3, 5, м.д.) 9.51 (Н, с, 10-Н), 9.45 (Н, с, 5-Н), 8.61(Н, с, 20-Н), 8.01 (Н, дд, J = 18.6 Гц, 11.8 Гц, 31-Н), 6.19 (Н, дд, J = 11.4 Гц, 32-На), 6.03 (Н, дд, J = 17.6 Гц, 32-Нь), 5.83 (Н, м, 132-NH), 4.81 (Н, д, J = 18.9 Гц, 15-СН2а), 4.63 (Н, д, J = 19.0 Гц, 15-СН2Ь), 4.32 (Н, дд, J = 7.3 Гц, N-C^), 4.19 (Н, дд, J = 8.9 Гц, N-CH2b), 4.02 (3Н, с, 131-СООСН3), 3.97 (2Н, м, 17-Н, 18-Н), 3.70 (2Н, м, 81-СН2), 3.39 (6Н, с, 12-СН3, П^СООС^), 3.35 (3Н, с, 2-СН3), 3.24 (3Н, с, 7-СН3), 2.31 (Н, м, 172-СН2а), 2.10-1.90 (3Н, м, 171-СН2а, 172-СН2Ь, 171-СН2Ь), 1.87 (Н, т, J = 7.0 Гц 156-Н), 1.73 (3Н, д, J = 18.3 Гц, 18-CH3), 1.66 (3Н, т, J = 7.9 Гц, 82-СН3). UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (s, M"1см"1): 417 (101500), 510 (11550), 535 (4300), 566 (3050), 635 (73000).

Общая схема синтеза ПСМА-замещённых производных Zn-комплекса диметилового

эфира хлорина е6 (11, 17)

К раствору Zn-комплекса метилового эфира соответствующего хлорина 10 или 16 (1 экв.) и (((¿')-5-(11-азидоундеканамидо)-1-карбоксипентил)карбамоил)-Ь-глутаминовой кислоты 8 (1 экв.) в DMF (1,3 мл) были добавлены иодид меди (I) (1.4 экв.), DIPEA (1 экв.) и дистиллированная вода (50 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Ход реакции отслеживался с помощью аналитической ТСХ. Растворитель был упарен при пониженном давлении, а сухой остаток был поочередно промыт смесью ацетонитрил/вода (1/1), ацетонитрилом и гексаном, выделяя целевой продукт центрифугированием на каждом этапе промывки. Полученные кристаллы были высушены под вакуумом.

131-ПСМА- производное Zn-комплекса диметилового эфира

хлорина е6 (11)

Исходя из соединения 10 (33.7 мг, 0.048 ммоль), выход соединения 11 составил 98% (59 мг).

Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 1252.5301, найдено: 1252.5350. UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (s, M'W): 432 (131500), 521 (5300), 598 (9500), 641 (66000).

15 -ПСМА- производное Zn-комплекса диметилового эфира

хлорина е6 (17)

Исходя из соединения 16 (34 мг 0.051 ммоль), выход соединения 17 составил 89% (30 мг).

Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 1252.5301, найдено: 1252.5350. UV/VIS (H2O), Xmax, нм (в, M'W): 414 (171000), 519 (4200), 597 (11500), 632 (62000).

Общая схема синтеза конъюгатов ПСМА с производными метилового эфира хлорина е6 (12, 18)

Раствор соответствующего ПСМА-замещенного производного Zn-комплекса метилового эфира хлорина е6 11 или 17 в 11% р-ре TFA в DMSO (3 мл) перемешивался при комнатной температуре в течение 30 минут в токе аргона. Ход реакции отслеживался спектрофотометрически. Затем полученная смесь была в два раза разбавлена дистиллированной водой и отцентрифугирована. Осадок был промыт дистиллированной водой три раза с выделением на каждом этапе и перерастворён в водном растворе PBS. Растворитель был упарен при пониженном давлении.

производное метилового эфира хлорина е6 (12)

Исходя из соединения 11 (10 мг, 0.008 ммоль), выход соединения 12 составил 85% (12.1 мг).

Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 1252.5380, найдено: 1252.5350. UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (в, M'W): 390 (114000), 503 (15200), 530 (9800), 607 (6700), 665 (44100).

15 -ПСМА

производное метилового эфира хлорина е6 (18)

Исходя из соединения 17 (15 мг мг 0.012 ммоль) выход соединения 18 составил 85% (12.1 мг).

Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 1190.6245, найдено: 1190.6214. UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (в, M'W): 401 (161000), 500 (21500), 557 (9600), 606 (9190), 660 (32000)

Общая схема получения конъюгатов триметилового эфира хлорина е6 с замещёнными арилтетразинами (21, 22)

Триметиловый эфир хлорина е6 20 и соответствующий арилтетразин (1 экв.) были растворены в DMF (2 мл) при перемешивании. Ход реакции отслеживался при помощи аналитической ТСХ. После полной конверсии исходного соединения растворитель был упарен при пониженном давлении. Сухой остаток был высушен с использованием

глубокого вакуума (4 мбар). Соединения 21, 22 были очищены с использованием препаративной ТСХ (изократическое элюирование, DCM/MeOH, 40/1, v/v).

8-этил-2,7,12,18-тетраметил-13-метоксикарбонил-15-(2-метокси-2-оксоэтил)-17-(3-метокси-3-оксопропил)-3-(3-фенилпиридазин-4-ил)-17,18-дигидропорфирин (21)

Исходя из соединения 14 (21 мг, 0.032 ммоль), выход соединения 21 составил 94% (22 мг).

1H ЯМР (600 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 9.77 (H, с, 10-H), 9.60 (H, д, J = 4.7 Гц, 5'-H) , 9.20 (H, с, 5-H), 8.71+8.72 (H, с, 20-H), 8.07+8.06 (H, д, J = 4.7 Гц, 6'-H), 7.62 (2H, м, о-Phe), 7.12 (H, м, p-Phe), 7.02 (H, м, m-Phe), 5.42+5.40 (H, д, J = 18.8 Гц, 151-CH2a), 4.46 (2H, м, 18-H, 17-H), 4.30 (3H, с, 132-Шз), 3.81 (3H, с, 153-Шз), 3.80 (2H, к, J = 7.7 Гц, 81-CH2), 3.71+3.65 (3Н, с, 174-Шз), 3.62 (3Н, с, 12-CH3), 3.20 (3Н, с, 7-CH3), 2.95+2.93 (3Н, с, 2-CH3), 2.60 (H, м, 172-CH2a), 2.28 (2H, м, 171-CH2a, 171-CH2b), 1.84 (H, м, 171-CH2b), 1.75 (3H, д, J = 18.1 Гц, 18-CH3), 1.74 (3H, т, J = 7.7 Гц, 82-CH3), -1.33 (H, с, I - NH), -1.72 (H, с, III - NH). 13C ЯМР (150 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 173.5, 172.9, 169.4, 169.2, 167.8, 162.0, 154.5, 149.6, 145.2, 138.2, 137.4, 136.3, 135.9, 134.3, 133.2, 133.1, 133.0, 131.7, 130.9, 129.5, 129.5, 128.9, 128.3, 124.4, 102.8, 102.8, 102.1, 99.4, 94.2, 94.1, 53.3, 52.1, 51.7, 49.3, 38.5, 31.9, 29.71, 23.1, 19.66, 17.64, 14.11, 12.43. Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 767.3552, найдено: 767.3542. UV/VIS (CHCI3), Xmax, нм (в, M'W): 395 (178000), 497 (17500), 524 (4500), 603 (5000), 665 (72000).

3-[3-(4-карбоксифенил)пиридазин-4-ил]-8-этил-2,7,12,18-тетраметил-13-метоксикарбонил-15-(2-метокси-2-оксоэтил)-17-(3-метокси-3-оксопропил)-17,18-

дигидропорфирин (22)

Исходя из соединения 14 (25 мг, 0.04 ммоль), выход соединения 22 составил 93% (29 мг).

1H ЯМР(300 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 9.76 (H, с, 10-H), 9.63 (H, д, J = 4.6 Гц, 5'-H), 9.16 (H, с, 5-H), 8.69 (H, с, 20-H), 8.12+8.09 (H, д, J = 4.6 Гц, 6'-H), 7.68 (4H, м, Phe), 5.40+5.38 (H, д, J = 18.8 Гц, 151-CH2a), 4.43 (2H, м, 18-H, 17-H), 4.28 (3H, с, 132-CH3), 3.79 (3H, с, 153-CH3), 3.77 (2H, к, J = 7.7 Гц, 81-CH2), 3.68-3.64 (3Н, с, 174-CH3), 3.61 (3Н, с, 12-CH3), 3.17 (3Н, с, 7-CH3), 2.91-2.89 (3Н, с, 2-CH3), 2.61 (H, м, 172-CH2a), 2.34 (2H, м, 171-CH2a, 172-CH2b), 1.83 (H, м, 171-CH2b), 1.72 (3H, д, J = 18.1 Гц, 18-CH3), 1.72 (3H, т, J = 18.1 Гц, 82-CH3), -1.76 (H, с, I -NH), -1.81 (H, с, III - NH). 13C ЯМР (75 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 173.6, 173.0, 172.9, 169.8, 169.3, 168.2, 167.8, 161.1, 154.4, 149.9, 149.7, 145.3, 142.1, 137.8, 137.7, 136.4, 136.0, 133.9, 133.7, 132.1, 131.5, 131.4, 131.1, 130.4, 130.0, 129.6, 124.5, 102.9, 102.8, 102.0, 99.2, 94.4, 52.2, 51.7,

49.2, 38.5, 31.0, 29.7, 29.4, 23.1, 22.9, 19.6, 18.9, 17.7, 14.1, 12.4, 11.8, 11.3. Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 811.3450, найдено: 811.3432. UV/VIS (CHCI3), W нм (s, M"1см"1): 397 (154000), 498 (17500), 524 (5500), 605 (5000), 667 (59000).

Общая схема метилирования производных хлорина е6 (13, 19, 20, 26)

Соединение 12, 18, 19, 25 (1 экв.) растворяли в смеси DCM/MeOH (1 мл, 1/1, v/v) с добавлением тионилхлорида (10 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. Ход реакции отслеживали при помощи аналитической ТСХ. Затем реакционная смесь была разбавлена дихлорметаном (10 мл) и промыта 5% водным раствором NaHCO3 (2x20 мл). Экстракт был высушен над безводным сульфатом натрия и упарен под вакуумом. Соединения 13, 19, 26 были очищены с использованием препаративной ТСХ (система элюентов: DCM/MeOH, 30/1, v/v). Соединение 20 было очищено с использованием препаративной ТСХ (система элюентов: DCM/MeOH, 50/1, v/v).

Пентаметиловый эфир 13х-ПСМА-замещённого хлорина е6 (13)

Исходя из соединения 12 (7 мг, 0.0063 ммоль) выход соединения 13 составил 83% (6 мг).

Данные спектроскопии ЯМР приведены в таблице 1.

Пентаметиловый эфир 15 -ПСМА-замещённого хлорина е6 (19)

При загрузке соединения 18 (14 мг, 0.013 ммоль) выход соединения 18 составил 85% (11.9 мг).

Данные спектроскопии ЯМР приведены в таблице 1.

Триметиловый эфир хлорина е6 (20)

Исходя из соединения 14 (50 мг, 0.084 ммоль), выход соединения 20 составил 90% (48 мг).

1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3, 5, м.д.): 9.71 (Н, с, 10-Н), 9.56 (Н, с, 5-Н), 8.78 (Н, с, 20-Н), 8.108.00 (Н, к, J = 17.8 Гц, 11.5 Гц, 3^^, 6.39-6.32 (Н, дд, J = 17.8 Гц, 1.5 Гц, 32-СН2а), 6.166.12 (Н, дд, J = 11.5 Гц, 1.5 Гц, 32-СН2Ь), 5.43-5.24 (2Н, к, J = 18.8 Гц, 151-СН2а, 151-СН2Ь), 4.54-4.41 (2Н, м, 18-Н, 17-Н), 4.30 (3Н, с, 131-COOCH3), 3.81 (3Н, с, 152-COOCH3), 3.83-3.74 (2Н, к, J = 7.3 Гц, 81-СН2а, 81-СН2Ь), 3.67 (3Н, с, 173-COOCH3), 3.61 (3Н, с, 12-СН3), 3.48 (3Н, с, 2-СН3), 3.30 (3Н, с, 7-СНз), 2.68-2.51 (2Н, м, 172-СН2а, 172-СН2Ь) 2.32-2.15 (2Н, м, 171-СН2а, 171-СН2Ь), 1.78 (3Н, д, J = 7.3 Гц, 18-СН3), 1.74 (3Н, т, J = 7.7 Гц, 82-СН3), -1.26 (Н, с, I - NH), -1,42 (Н, с, III - NH).

Метилированный ПСМА-пиридазин-замещённый хлорин е6 (26)

Исходя из соединения 25 (25 мг, 0.023 ммоль), выход соединения 26 составил 61% (15.8 мг).

Данные спектроскопии ЯМР приведены в таблице 2.

Ди-трет-бутил (((Л)-6-(3-(я-амидофенил )- 1,2,4,5-тетразин)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)карбамоил)-Ь-глутамат (23)

К раствору 4-(1,2,4,5-тетразин-3-ил)бензойной кислоты (26 мг, 0.13 ммоль) в DMF (1 мл) при перемешивании были добавлены EDC (32 мг, 0.182 ммоль) и NHS (21 мг, 0.182 ммоль). Через час в реакционную смесь был добавлен раствор ди-даредабутил(((5')-6-амино-1-(дареда-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)карбомоил)-Ь-глутамата 6 (70 мг, 0.143 ммоль) в DMF (500 мкл). Реакцию перемешивали в течение 48 часов. Ход реакции отслеживался с помощью аналитической ТСХ. Затем растворитель был упарен при пониженном давлении. Соединение 23 (69.9 мг, выход 80%) было очищено с использованием препаративной ТСХ (система элюентов: DCM/MeOH, 60/1, v/v).

1H ЯМР(300 МГц, CDCI3, 5, м.д.): 10.27 (1H, с, тетразин), 8.65 (2H, д, J = 8.4 Гц, Phe), 8.13 (2H, д, J = 8.4 Гц, Phe), 7.44 (1Н, т, J = 4.5 Гц, Lys, 1-NH), 5.58 (1Н, д, J = 7.9 Гц, Glu, 1-NH), 5.39 (1Н, д, J = 7.9 Гц, Lys, 7-NH), 4.26 (2H, м, Lys, 6-CH, Glu, 2-CH), 3.51 (2H, м, Lys, 2-CH2), 2.28 (2H, м, Glu, 4-CH2), 2.18 (1H, м, GIU-CH2) 1.72 (7H, м, GIU-CH2, Lys-CH2), 1.45 (9Н, с, tBu), 1.43 (2H, м, Lys-CH2), 1.42 (9Н, с, tBu), 1.40 (9Н, с, tBu). Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]: 672.78, найдено: 672.43.

^)-2-(3-(-6-(3-(я-амидофенил)-1,2,4,5-тетразин)-1-карбоксипентил)уреидо)пентадионовая кислота (24)

Ди-трет-бутил (((S)-6-(3 -(и-амидофенил)-1,2,4,5 -тетразин)-1 -(третбутокси)-1 -

оксогексан-2-ил)карбамоил)-L-глутамат 23 (87.4 мг, 0.13 ммоль) был растворён в дихлорметане (5мл) с добавлением TFA (0,5 мл). Реакцию перемешивали в течение 12 часов. Раствор был разбавлен дихлорметаном (50 мл) и упарен при пониженном давлении. Процедура была проведена трижды. Соединение 24 (59.6 мг, выход 91%) использовалось без дальнейшей очистки.

Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]: 504.47, найдено: 505.33.

ПСМА-пиридазин-замещённый триметиловый эфир хлорина е6 (25)

К триметиловому метиловому эфиру хлорина е6 20 (23 мг, 0.037 ммоль), растворённому в DMF (800 мкл), была добавлена ($)-2-(3-(($)-5-(3-(и-амидофенил)-1,2,4,5-тетразин)-1-карбоксипентил)уреидо)пентадионовая кислота 24 (18.6 мг, 0.037 ммоль), растворённая в DMF (1 мл). Полученный раствор перемешивали в течение 60 минут. Ход реакции отслеживали с помощью аналитической ТСХ. Растворитель был упарен под вакуумом. Сконцентрированная реакционная масса была разбавлена водой и отцентрифугирована. Отделенный осадок был высушен при пониженном давлении. Выход продукта 25 составил 95% (38.5 мг).

Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 1112.4685, найдено: 1112.4683.

(((Л)-5-амино-1-карбоксипентил)карбомоил)-Ь-глутаминовая кислота (27)

Ди-даредабутил(((5')-6-амино-1 -(трет-бутокси)-1 -оксогексан-2-ил)карбомоил)-Ь-глутамат 6 (25 мг, 0.051 ммоль) был растворён в дихлорметане (5мл) c добавлением TFA (0,5 мл). Реакцию перемешивали в течение 12 часов. Раствор был разбавлен дихлорметаном (50 мл) и упарен при пониженном давлении. Процедура была повторена трижды. Вещество 27 (15 мг, выход 91%) было очищено с помощью обращёно-фазовой хроматографии с использованием колонки C18PuriFlash (15ц, HP, градиентное элюирование, CH3CN/H2O 580%, 35 мин, 12 мл/мин).

1Н ЯМР (300 МГц, CDCI3, 5, м.д.) 6.35 (2H, м, Lys, 7-NH, Glu, 1-NH), 4.08 (2Н, м, Lys, 6-CH, Glu, 2-CH), 2.76 (2H, м, Lys, 2-CH2), 2.23 (2H, м, Glu, 4-CH2), 2.28 (2-H, м, Lys, 3-CH2), 1.93 (Н, м, Lys, 5- CH/), 1.68 (18-H, м, Lys, 5- CH2b, Glu, 3-CH2ü), 1.53 (3H, м, Glu, 3-CH2b, Lys, 3-CH2), 1.33 (2H, м, Lys, 4-СН2).

173-Сукцинимидный эфир О-пропилоксим-^-пропоксибактериопурпуринимида (29)

К раствору О-пропилоксим-Ы-пропоксибактериопурпуринимида 28 (55 мг, 0.079 ммоль) в дихлорметане (4 мл) при перемешивании были добавлены EDC (15.8 мг, 0.1 ммоль) и NHS (12.5 мг, 0.11 ммоль). Реакцию перемешивали в течение 48 часов. Затем растворитель был упарен при пониженном давлении. Соединение 29 (21.9 мг, выход 35%) было очищено с использованием колоночной хроматографии на силикагеле (система элюентов: DCM/MeOH, 30/1, v/v).

!Н ЯМР (300 МГц, CDCl3, 5, м.д.) 8.65 (Н, с, 10-Н), 8.56 (Н, с, 5-Н), 8.42 (Н, с, 20-Н), 5.25 (Н, м, 17-Н), 4.54 (4H, м, 34-СН2, 133-СН2), 4.19 (2Н, м, 17-Н, 18-Н), 4.03 (Н, м, 8-H), 3.63 (3Н, с, 12-CH3), 3.28 (3Н, c, 2-CH3), 2.76 (4Н, c, 1-NHS-Œ2, 2-NHS-Œ2), 2.73 (Н, м, 32-CH2),

2.45 (4Н, м, 172-СН2а, 171-СН2а, 172-СН2Ь, 171-СН2Ь), 2.10 (4H, м, 35-СН2, 134-СН2), 1.94 (2Н, м, 81-СН2), 1.78 (3Н, д, 7-СН3), 1.62 (6Н, м, 36-СН3, 135-СН3), 1.16 (3Н, м, 82-CH3), 0.08 (с, I - NH), -0.28 (c, III - NH). Масс-спектр (MALDI) m/z рассчитано [M+H+]: 793.38 , найдено: 794.21.

Конъюгат бактериопурпуринимида с лигандом к ПСМА (30)

Сукцинимидный эфир О-пропилоксим-Ы-пропоксибактериопурпуринимида 9 (21 мг, 0.026 ммоль) и ((5-амино-1-карбоксипентил)карбомоил) глутаминовая кислота 27 (8.3 мг, 0.026 ммоль) были растворены в дихлорметане с добавлением триэтиламина (40 мкл, 0.0027 ммоль). Реакцию перемешивали в течение 48 часов. Ход реакции отслеживался с помощью аналитической ТСХ. Растворитель был упарен при пониженном давлении. Соединение 30 (17.6 мг, выход 60%) было очищено с использованием препаративной ТСХ (система элюентов, DCM/MeOH, 10/1, v/v)

Масс-спектр (ESI-HRMS) m/z рассчитано [M+H+]: 998.15, найдено: 997.48.

Конъюгат бактериопурпуринимида с метилированным лигандом к ПСМА (31)

К раствору конъюгата бактериопурпуринимида с лигандом к ПСМА 30 (45 мг, 0.045 ммоль) в дихлорметане был добавлен насыщенный раствор дихлорметана в диэтиловом эфире (2 мл). Реакцию перемешивали в течение 30 минут. За ходом реакции следили с помощью аналитической ТСХ. Растворитель был упарен при пониженном давлении в присутствии фильтра, смоченного уксусной кислотой. Соединение 31 (40.3 мг, выход 86%) было очищено с использованием препаративной ТСХ (система элюентов: DCM/MeOH, 50/1, v/v).

Данные спектроскопии ЯМР приведены в таблице 3.

Приготовление наночастиц магнетита

Олеат железа (800 мг, 0.86 ммоль) и хлорид натрия (10 мг, 0.17 ммоль) были добавлены в смесь олеиновой кислоты (110 мкл, 0.35 ммоль), воды (60 мкл) и 1-октадецена (10 мл). После дегазирования полученный раствор был нагрет до 320 oC со скоростью 3.3 оС/мин и выдержан при этой температуре в течение двух часов, затем охлаждён до комнатной температуры. После чего в раствор был добавлен изопропиловый спирт (30 мл). Выпавшие наночастицы магнетита были промыты изопропиловым спиртом три раза с центрифугированием на каждом этапе и растворены в гексане.

Комплекс дипропокси-БПИ с наночастицами магнетита (32)

К раствору 0-пропилоксим-#-пропоксибактериопурпуринимида 28 (3 мг, 0.0004 ммоль) в дихлорметане (1 мл) был добавлен раствор наночастиц магнетита в гексане (5 мл, 2.5 мг/мл). По истечении 10 минут растворитель был упарен при пониженном давлении, а остаток повторно растворен в гексане (3 мл). Образовавшийся осадок был удален центрифугированием. К супернатанту был добавлен водный раствор плюроника Б127, полученный смешиванием 45 мг солюбилизатора с 3 мл воды. Образовавшуюся двухфазную систему перемешивали в течение 48 часов в атмосфере аргона. Водорастворимые наночастицы, нагруженные ФС, были отделены центрифугированием, растворены в деионизованной воде (3.5 мл) и пропущены через шприцевой фильтр с диаметром пор 220 нм.

Приготовление мицеллярного раствора дипропокси-БПИ

К водному раствору плюроника Б127, приготовленному смешиванием 50 мг солюбилизатора с 2 мл воды, был добавлен дипропокси-БПИ (0.6 мг, 0.00087 ммоль), растворенный в дихлорметане (2 мл). В полученную смесь, нагретую до 41 оС, барботировался аргон до полного испарения органического слоя.

Таблица 1. Данные 1HЯМР ПСМА-производных 13 и 19.

Ô (м.д.), мультиплетность, J (Гц)

1H _

13 19

Chl

NH(A) 1.70, уш. с 1.39, уш. с

NH(B) 1.85, уш. с 1.52, уш. с

H-21 3.50, с 3.47, с

H-31 8.09, дд, 17.9; 11.7 8.0б, дд, 17.8, 11.4

H-32a б.3б, д, 17.9 б.37, дд, 17.8

H-32b б.17, д, 11.7 б.17, дд, 11.4

H-5 9.б7, с 9.59, с

H-71 3.33, с 3.33, с

H-81 3.80, кв, 7.7 3.79, кв, 7.6

H-82 1.70, т, 7.7 1.51, т, 7.6

H-10 9.71, с 9.71, с

H-121 3.5б, с 3.51, с

H-132 7.5б, уш. с -

H-133 - 4.22, с

H-151a 5.52, д, 19,0 5.24, д, 19.0

H-151b 5.45, д, 19.0 5.11, д, 19.0

H-153 - б.34, т, 5.7

H-154 3.71, с -

H-17 4.40, м 4.39, м

H-171a 2.31, м 2.34, м

H-171b 1.83, м 1.89, м

H-172a 2.53, м 2.55, м

H-172b 2.14, м 2.10, м

H-175 3.б2, с 3.58, с

H-18 4.48, м 4.33, м

H-181 1.72, д, 7.5 1.б0, д, 7.4

H-20 8.85, с 8.75, с

H-1a 5.10, дд, 15.Q; 5.2 4,49, м

H-1b 4.95, дд, 15.Q; 5.2 4.47, м

H-2 8.02, с 7.53, с

H-41 4.48, т, б.9 4.15, т, 7.Q

H-42 1.98, м 1.73, м

H-43 1.27, м 1.19, м

H-44 1.27, м 1.19, м

H-45 1.27, м 1.19, м

H-46 1.27, м 1.19, м

H-47 1.27, м 1.19, м

H-48 1.57, м 1.54, м

H-49 2.02, м 2.08, м

Lys

H-1 4.41, м 4.40, м

H-2 2.59, м 2.35, м

H-3 1.86, м 2.05, м

H-4 1.44, м 1.51, м

H-5 1.83, м 1.73, м

H-6 4.38, м 4.33, м

H-63 3.58, с 3.55, с

H-7 5.80, д, S.Q 5.70, д, S.Q

Glu

H-1 5.72, д, S.Q 5.71, д, 7.9

H-2 4.45, м 4.41, м

H-23 3.59, с 3.56, с

H-3 2.05, м 2.17, м

H-4 2,31, м 2.52, м

H-43

3.50, с

3.53, с

Таблица 2. Данные 1HЯМР ПСМА-производного 26.

1H Ô (м.д.), мультиплетность*, J (Гц)

13

Chl

NH(A) 1.74, уш. с

NH(B) 1.80, уш. с

H-21 2.90, с

H-5 9.20, с

H-71 3.20, с

H-81 3.72, м

H-82 1.74, м

H-10 9.78, с

H-121 3.61+3.56, с

H-132 7.56, уш. с

H-133 4.29, с

H-151a 5.39, д, 19.Q

H-151b 5.36, д, 19.Q

H-154 3.80, с

H-17 4.53, м

H-171a 2.42, м

H-171b 1.97, м

H-172a 2.69, м

H-172b 2.42, м

H-175 3.64+3.62, с

H-18 4.44, м

H-181 1.73, м

Н-20 8.72, с

Pyr

Н-5 9.63, д, 4.6

Н-6 8.12+8.10, д, 4.6

Н-22 7.45, д, 8.4

Н-23 7.64, д, 8.4

Н-25 7.64, д, 8.4

Н-26 7.45, д, 8.4

Lys

Н-1 8.59, т, 4.5

Н-2 3.26, м

Н-3 1.97, м

Н-4 1.44, м

Н-5 1.97, м

Н-6 4.42, м

Н-63 3.75, с

Н-7 6.20, м

Glu

Н-1 6.02, м

Н-2 4.47, м

Н-23 3.74,с

Н-3 1.97, м

Н-4 2,40, м

Н-43 3.81, с

* приведены сигналы двух конформационных изомеров

Таблица 3. Данные 1HЯМР ПСМА-производного 31.

Ô (м.д.), мультиплетность, J (Гц)

1H _

13

NH(A) NH(B) H-21

H-34

H-35

H-36

31-Me

H-5

H-7

H-71

H-8

H-8

1b

H-8

H-82

H-10

H-121

H-133

H-13

H-13

H-17

H-17

H-17

H-17

H-17

H-18

H-18

4

5

1a

1b

2a

2b

Bcl

1.74, уш. с 1.80, уш. с 3.2б, с 4.4б, м 2.10, м 1.22, м 2.73, с 8.52, с

4.31, м 1.79, д, 7.3

4.00, м

2.32, м 2.02, м

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.