Природные хлорины, обладающие фотоиндуцированной антибактериальной, противоопухолевой активностью и диагностическим потенциалом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Брусов, Сергей Сергеевич

• Брусов, Сергей Сергеевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Брусов, Сергей Сергеевич

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

1.1. Антимикробная фотодинамическая терапия

1.2. Методы получения катионных фотосенсибилизаторов

1.2.1. Синтез пигментов с кватернизованными остатками пиридина

1.2.2. Получение катионных ФС на основе аммониевых производных хлоринов и бактериохлоринов

1.2.3. Поликатионные фотосенсибилизаторы на основе порфиринов

1.2.4. Фотосенсибилизаторы для антимикробной ФДТ на основе хлоринов

1.2.5. Фотосенсибилизаторы на основе бактериохлорина

1.3. Особенности формирования бактериальных биопленок

1.3.1. Механизмы устойчивости биоплёнок к антибактериальным препаратам

1.3.2. Фотодинамическая инактивация планктонных бактерий и биопленок Pseudomonas aeruginosa 5-аминолевулиновой кислотой

1.4. Современные методы ранней диагностики рака

I.4.1. Тераностика - тренд современной медицины

1.5. Подходы к созданию контрастных агентов с катионом Gd3+

1.5.1. Лиганды на основе ДОТА

1.5.2. Лиганды на основе ДО3А

1.5.3. Макромолекулярные контрастные агенты

1.5.3.1. Контрастные агенты на основе порфиринов

1.5.3.2. Металлокомплексы конъюгатов циклена с макроциклами

1.5.3.3. Контрастные агенты на основе хлорофилла а

1.5.4. Гетероядерные металлокомплексы в качестве контрастных агентов

1.5.5. Контрастные агенты с улучшенными спектральными характеристиками

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

11.1. Катионные фотосенсибилизаторы с гетероциклическими фрагментами

11.1.1. Катионный пурпуринимид, обладающий антибактериальной активностью, и его применение для фотодинамической терапии бактериальных биопленок

11.1.2. Катионные фотосенсибилизаторы с гетероциклическими фрагментами на основе бактериопурпуринимида

11.2. Фотосенсибилизаторы на основе хлорина e6 и их фотоиндуцированная антимикробная и противоопухолевая активность

11.2.1. Фотоиндуцированная противоопухолевая активность in vitro аминоамида хлорина е6 11 и его катионного производного 12

11.2.2. Накопление и распределение соединений 11 и 12 в клетках А549 и U251

11.2.3. Темновая и фотоиндуцированная цитотоксичность соединений 11 и 12 в отношении клеток А549

11.2.4. Антимикробная фотодинамическая активность соединений 11 и 12 в отношении бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa

11.3. Синтез поликатионного производного хлорин-цикленового конъюгата и его фотоиндуцированная антимикробная активность

11.4. Металлокомплексы природных хлоринов с модифицированным цикленом, их спектральные свойства и диагностический потенциал

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

IV. ВЫВОДЫ

IV. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВН ЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АФК — активные формы кислорода

БПИ — бактериопурпуринимид

ГЛФ — готовая лекарственная форма

ДО3А — циклен-1,4,7-триуксусная кислота

ДОТА — циклен-1,4,7,10-тетрауксусная кислота

ДТТА — диэтилентриамин-N, N, N", N'-тетраацетат

ДТПА — диэтилентриаминпентауксусная кислота

ИК — инфракрасный

КОЕ — колониеобразующие единицы

КТ — компьютерная томография

МРТ — магнитно-резонансная томография

МИК — минимальная ингибирующая концентрация

ПЭТ — позитронно-эмиссионная томография

ТСХ — тонкослойная хроматография

ТФК — трифторуксусная кислота

ФД — флуоресцентная диагностика

ФДТ — фотодинамическая терапия

ФС — фотосенсибилизатор

ЯМР — ядерный магнитный резонанс

DIPEA — диизопропилэтиламин

ДМСО — диметилсульфоксид

MALDI — Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Природные хлорины, обладающие фотоиндуцированной антибактериальной, противоопухолевой активностью и диагностическим потенциалом»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Известные структуры молекул природных хлорофиллов, включая хлорофилла а и бактериохлорофилл а, открывают широкие возможности для их направленной модификации с целью получения высокостабильных производных с улучшенными фотофизическими характеристиками, повышенной гидрофильностью, а также для создания конъюгатов с другими молекулами. Введение на периферию хлоринового макроцикла гетероциклических фрагментов, в том числе производных пиридина, азамакрогетероциклов, а также аминоалкильных групп и катионов переходных металлов во внутренние сферы субъединиц, позволяет реализовывать направленный синтез фармакологически активных соединений для различных биомедицинских применений. Одним из них является борьба с инфекционными заболеваниями, связанная с возрастающей резистентностью штаммов патогенных бактерий к антибиотикам широкого спектра действия, а также образование бактериальных биопленок, практически не поддающихся терапии с помощью антибиотиков. Для антимикробной фотодинамической терапии, в которой основным бактерицидным агентом является синглетный кислород, перспективна разработка катионных фотосенсибилизаторов. Оптимизация структуры хлориновых систем с одним или несколькими положительными зарядами, поглощающих в области 700-800 нм, повышает эффективность фотодинамической терапии локальных очагов инфекции за счет увеличения доли светового излучения, которое возбуждает находящиеся в тканях молекулы фотосенсибилизатора. Другим прикладным аспектом химии порфиринов и их гидрированных аналогов является разработка комплексонов различных металлов на основе природных хлоринов с азамакроциклами, в том числе цикленом, для создания контрастных агентов, позволяющих исследовать биологические ткани на различных глубинах и с высокой степенью разрешения, что существенно повышает эффективность ранней диагностики рака. Очевидно, что разработка универсальной платформы на основе природных хлоринов с

азотсодержащими фрагментами позволит получать на ее основе инновационные препараты различного спектра действия.

Цель работы заключается в реализации направленного синтеза модифицированных природных хлоринов, содержащих азотсодержащие заместители различной природы на периферии макроцикла, и создании на их основе моно- и поликатионных субстанций, а также металлокомплексов для изучения их антибактериальных, противоопухолевых и диагностических свойств.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

В настоящее время в клинической практике разрабатываются новые методы диагностики и лечения злокачественных новообразований, а также бактериальных и грибковых инфекций. Трендом современной медицины являются инновационные подходы, получившие название «тераностических», когда в одном препарате реализуются терапевтическая активность и диагностический потенциал. В качестве соединений с подобными свойствами могут выступать порфирины и их гидрированные аналоги.

Порфирины — это тетрапиррольные макрогетероциклические соединения, имеющие сопряженную п-электронную систему и обладающие высокими значениями ряда фотофизических характеристик, включая квантовые выходы синглетного кислорода, флуоресценции и т.д.

Хлорины и бактериохлорины — это гидрированные аналоги порфиринов, искажение планарной структуры которых приводит к смещению основной полосы поглощения в электронных спектрах по сравнению с порфиринами в длинноволновую область, что повышает возможности использования хлоринов и бактериохлоринов в фотодинамической терапии глубокозалегающих очагов поражения. Введение переходных металлов во внутреннюю полость макроцикла изменяет распределение электронной плотности в молекуле фотосенсибилизатора (ФС), приводя к изменению баланса между терапевтическими и диагностическими свойствами пигмента.

Присоединение к хлориновым макроциклам других азамакроциклов, в том числе циклена, циклама, азакраунэфиров, создает возможности дополнительного комплексообразования и создания гомо- и гетероядерных металлокомплексов с новыми фармакологическими свойствами.

1.1. Антимикробная фотодинамическая терапия

Во всем мире стремительный рост лекарственно-устойчивых бактерий привел к крупной научно-исследовательской проблеме - поиску альтернативных способов лечения, к которым бактерии не смогут вырабатывать резистентность. Повсеместно применяемые последние полвека антибиотики теряют свою эффективность, и все чаще врачи выбирают комбинированные подходы к лечению инфекционных заболеваний.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) включает в себя использование фотосенсибилизаторов в сочетании с видимым светом определенной длины волны для их возбуждения. Последние передают энергию молекулярному кислороду, в результате чего образуются активные формы кислорода (АФК), основным цитотоксическим агентом среди которых является синглетный кислород, способный убивать раковые клетки или бактерии за счет окисления жизненно важных внутриклеточных структур [1-3].

Антимикробная ФДТ является сравнительно новым способом лечения бактериальных заражений. Данный метод борьбы с патогенными микроорганизмами имеет ряд преимуществ: возможность локализованного воздействия на участок заражения за счет местного облучения, высокую активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий [4-6]. Попадая в организм и связываясь с клеткой-мишенью, сам по себе фотосенсибилизатор не оказывает негативного воздействия. Для запуска фотохимических реакций необходим свет. Фотосенсибилизаторы способны поглощать излучение во всей видимой области спектра, но эффективность фотореакций многократно усиливается при облучении светом с длиной волны, находящейся в строго определенном, узком диапазоне, который является специфичным для каждого вещества и носит название «пик поглощения». Например, для препаратов группы хлорина он составляет 660670 нм, а для бактериохлоринов - на 100 нм больше.

Антимикробная ФДТ обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционной противомикробной химиотерапией антибиотиками, а именно:

• короткое время инактивации;

• эффективность не зависит от резистентности к существующим антибиотикам;

• не развивается резистентность к ФДТ после многокурсового лечения;

• не вызывает дисбактериоз;

• наличие широкого спектра микроорганизмов-мишеней [7].

Значительным преимуществом фотодинамического воздействия

является возможность локального воздействия на инфицированные участки, расположенные как на поверхности, так и в подлежащих тканях, без нежелательного влияния на окружающие ткани и микрофлору соседних зон.

В 90-х годах было показано, что существует различие в восприимчивости к ФДТ между грамположительными и грамотрицательными бактериями. Нейтральные, анионные и катионные молекулы ФС могут эффективно связываться с грамположительными бактериями, в то время как только катионные ФС или нейтральные ФС в сочетании с мембран-проницаемыми агентами способны связываться с грамотрицательными бактериями [8].

Израильская группа ученых Nitan et а1.) предложила использовать поликатионный препарат Полимиксин В (РМВ^ для того чтобы увеличить проницаемость наружной мембраны грамотрицательных бактерий и позволить проникнуть ФС внутрь бактерий [9]. Другой подход опубликовал О. ВеЛо1ош с соавторами [10], который обнаружил, что использование этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) также повышает проницаемость наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

Разница в чувствительности бактерий к ФДТ объясняется их строением. Грамположительные бактерии имеют цитоплазматическую мембрану, окруженную пористой клеточной стенкой, состоящей из пептидогликана и липотейхоевой кислоты, что позволяет ФС легко связываться с ней. Оболочка грамотрицательных бактерий состоит из наружной и внутренней цитоплазматических мембран, разделенных слоем пептидогликана. Внешняя

мембрана образует эффективный барьер проницаемости в клетку для многих веществ. Клеточные стенки патогенных грибов имеют достаточно толстый слой бета-глюкана и хитина, и их проницаемость занимает промежуточное значение между грамположительными и грамотрицательными бактериями (Рис. 1).

Поскольку внешние мембраны патогенных бактерий и грибов несут отрицательный заряд, то универсальными ФС широкого спектра действия для антимикробной терапии являются молекулы с положительными зарядами.

Рисунок 1. Строение мембран патогенных бактерий и грибов.

В настоящее время известно много научных работ, направленных на использование синтетических порфиринов в ФДТ. Их катионные производные в ряде исследований показали бактерицидную эффективность против грамположительных и грамотрицательных бактерий [8, 9].

1.2. Методы получения катионных фотосенсибилизаторов

Катионные ФС, содержащие аммониевые и пиридиниевые группы, были синтезированы на основе порфиринов, хлоринов и фталоцианинов. Синтез подобных конъюгатов включает ковалентное присоединение макроцикла к полимеру, содержащему амино или иминогруппы, включая полилизин или полиэтиленимин [11, 12].

1.2.1. Синтез пигментов с кватернизованными остатками пиридина Одним из традиционных методов создания катионных ФС является кватернизация атома азота в остатках пиридина, находящихся на периферии макроцикла. Ученые из Португальского университета в г. Авейра (1.Л.Б. СауаЫго й а1.) синтезировали 7п-комплексы катионных фталоцианинов, несущих 4 и 8 остатков пиридина. Кватернизация атомов азота в последних путем обработки красителя избытком метилиодида привела к соединениям 1-3 (Схема 1) [13].

Схема 1. Металлокомплексы фталоцианинов 7пРсН12Ру4 (1), 7пРсН8БРу8 (2) и 7пРсЕ88Ру8 (3).

В синтезе катионных ФС используются приемы, в которых галогенпроизводные пигментов взаимодействуют с пиридином и другими гетроциклическими основаниями, генерируя положительный заряд в гетероцикле. В рамках совместного индо-болгарского проекта проводились исследования тетракатионных производных порфирина, два из которых,

я

я

мезо-пиридинийзамещенный порфирин (PyP) 4 и мезо-имидазолилзамещенный порфирин (ImP) 5 представлены на Схеме 2 [14].

©м

о

Ч-

-С8Н16

/

С8Н16 /

о

с/ 4 n ■

о

С8Н16

г

МЛ

=n0

\\ )

Схема 2. Строение катионных порфиринов PyP (4) и ImP (5).

1.2.2. Получение катионных ФС на основе аммониевых производных

хлоринов и бактериохлоринов

Группой ученых из штата Северная Каролина (США) в качестве исходного соединения был взят синтетический 3,13-дибромбактериохлорин 6, который растворяли в смеси толуола с DMF, добавляли в качестве катализатора Pd(PPhз)4 и после нескольких часов нагревания в инертной атмосфере с модифицированным диамином 7 получали 3,13-ди-

(Лг-(2-Аг',Лг'-диметиламиноэтил)амид)бактериохлорин 8. Последний обрабатывали избытком метилиодида при комнатной температуре и получали дикатионное производное 9. Авторами отмечено, что реакция кватернизации терминальных аминогрупп протекала дольше по сравнению с аналогичной реакцией для остатков пиридина (схема 3) [15].

4

I

Схема 3. Схема получения 3,13-ди-(Аг-(2-Аг',Аг',Аг'-триметиламмонийэтил) амид)бактериохлорина (9).

I.2.3. Поликатионные фотосенсибилизаторы на основе порфиринов

Анализ научной литературы не позволяет сделать однозначный вывод о влиянии количества положительных зарядов в молекуле пигмента на антибактериальную активность, однако, прослеживается тенденция к созданию поликатионных ФС. Группой ученых из Швейцарии были синтезированы три фотосенсибилизатора на основе порфиринов, два из которых являлись дикатионными (соединения 10 и 11), а третий -трикатионным ФС 12 (схема 4) [16].

Все три ФС были растворимы в натрий-фосфатном буфере (PBS) при pH 7.4. В зависимости от строения их гидрофильность увеличивалась в ряду 1011-12. Примечательно, что положение алкоксиаммониевого заместителя (мета- или пара-) в фенильных кольцах также влияло на гидрофильность. В работе были использованы бактериальные штаммы S. aureus (грамположительный) и E. coli (грамотрицательный), которые выращивали аэробно при 37°C. Катионные ФС хорошо поглощались бактериями S. aureus, и при концентрации 1.0 мкМ у соединения 12 обнаружилась высокая фотоиндуцированная антибактериальная активность, при которой инактивация бактериальных клеток составила 99.9%. Вместе с тем, два

других ФС 10 и 11 показали значительно более высокую фотодинамическую активность, при которой 99%-ная фотоиндуцированная инактивация бактериальных клеток была достигнута при концентрации пигментов, равной 0.005 мкМ (Рис. 2). Все три катионных ФС не проявили достаточной активности по отношению к грамотрицательным бактериям E. Coli, хотя дикатионные порфирины 10 и 11 при концентрации более 10 мкМ оказались эффективнее трикатионного производного 12 (Рис. 3).

cl

q ©n-cl /

0.01 0.1 1

Коьцентрацкя, мкМ

Рисунок 2. Антибактериальный фотодинамический эффект катионных порфиринов 12 (a), 11 (b) и 10 (c) на культуру S.aureus.

(а)

1 ООЕ•08

i оое■о:

1 ООЕ-00

1 ООЕ-08

Ш

О I ООЕ-04 J

I ООЕ-02 ■

О О 01 0 1 1

Концентрация, мкМ

О 01 0 1 1

Концентрация, мкМ

I I до облучения

I I после облучения

Рисунок 3. Антибактериальный фотодинамический эффект катионных порфиринов 11 (a) и 10 (b) на культуру E. Coli.

Результаты представленного исследования позволяют сделать вывод об

эффективном фотоиндуцированном бактерицидном действии всех трех ФС

10-12 относительно грамположительных бактерий и их умеренной

активности относительно грамотрицательных бактерий, причем трикатионный ФС 12 проявил меньшую активность по сравнению с дикатионными 10 и 11.

Учеными из Аргентинского университета была изучена фотодинамическая инактивация бактерий E. Coli под действием производных тетрафенилпорфирина, содержащих разное число заряженных групп, включая 5,10,15,20-тетракис-(4 -N, N, Аг-триметиламмонийфенил)порфирин (TMAP4+) 13, 5,10-ди(4-метилфенил)- 15,20-ди-(4-ДД^триметиламмоний

фенил)порфирин

(MPAP2+)

14

и

5,10,15,20-тетра-(4-

сульфонатфенил)порфирин (TPPS ") 15 (схема 5) [17].

Ri

R;

Ri

R;

13 TMAP4+ R!=R2: -N+(CH3)3 j-Tos'

14 MPAP2+ Rj: -N+(CH3)3I- R2: -CH3

15 TPPS4- R!=R2 : -SO3Na

Схема 5. Строение заряженных производных тетрафенилпорфирина.

Клетки E. Coli обрабатывали вышеназванными ФС в течение различного времени (2.5, 5, 10 и 15 мин) в темноте. Для оценки влияния температуры эксперименты проводились при 4 С и 37 С. Результаты экспериментов показали, что наиболее эффективно при каждой из температур c микробными клетками связывается тетракатионный ФС (TMAP4+) 13. Последний быстро накапливается в клетках E. Coli в течение 2.5 мин, причем дальнейшая инкубация (15 мин) с клетками не увеличивает его накопления. Другие

заряженные порфирины 14, 15 значительно уступают по накоплению лидерному ФС 13 (Рис. 4).

Время инкубации, мин

TPPS 4- при 37°С ~"~TPPS 4- при 4°С -А-МРАР 2+ при 37°С -*-МРАР 2+ при 4°С -*~ТМАР 4+ при 37°С ТМАР 4+ при 4°С

Рисунок 4. Накопление катионных и анионного производных ТФП в клетках Е. Сой при 4°С и 37°С. На графике представлены усредненные значения двух независимых экспериментов для каждого измерения.

Учеными из Италии исследовалось влияние тетрапиридиниевого производного порфирина 16 на дезактивацию планктонной культуры Р. aeruginosa РАО 1 (схема 6) [18].

Схема 6. 5,10,15,20-Тетракис-(Лг-бензилпиридиний-4-ил)порфирин (16).

Суспензии клеток получали из экспоненциально и стационарно растущих культур. При инкубации с ФС 16 (5 и 10 мкМ) и облучении роста культуры РАО1 отмечено не было, в то время как снижение концентрации ФС до 1 мкМ в тех же условиях приводило к значительному росту культуры (Рис. 5).

Концентрация (16) Концентрация (16)

Рисунок 5. Ингибирование роста планктонной культуры P. Aeruginosa PAO1 под действием тетракатионного порфирина 16.

I.2.4. Фотосенсибилизаторы для антимикробной ФДТ на основе

хлоринов

М. Hamblin совместно с учеными из Массачусетского университета предположили, что поликатионные молекулы эффективнее связываются как с грамположительными, так и с грамотрицательными бактериями [12]. В качестве лидерного соединения был взят конъюгат хлорина e6 17 с поли-L-лизином (pL). Для изучения влияния заряда были получены: поликатионный (pL-ce6) 19, нейтральный (pL-ce6-ac) и анионный (pL-ce6-succ) конъюгаты

(Схема 7). В качестве сравнения были взяты свободный хлорин e6 (ce6) и ce6-аминоэтиламид 18 (схема 7).

Испытания проводились на бактериях Porphyromonas gingivalis (грамотрицательные бактерии) и Actinomyces viscosus (грамположительные бактерии), для контроля были взяты эпителиальные клетки HCPC-1.

Lys -Lys -Lys -Lys -Lys -Lys-Lys -Lys — Lys

17 18 19

Схема 7. Структуры хлорина e6 (17), се6-аминоэтиламида (18), конъюгата поли-Ь-лизина и хлорина е6 (19).

Результаты исследований показали, что поликатионный конъюгат 19 хорошо связывается как с грамположительными, так и с грамотрицательными бактериями, вследствие чего показывает высокую фототоксичность при облучении красным светом (Рис. 7). При этом последний слабо связывался с эпителиальными клетками, что позволяет сделать вывод о его селективности к бактериальным патогенам и, как следствие, безопасности использования в антимикробной ФДТ.

4 6

Концентрация (цМ)

12

2 4 6 8

Концентрация (цМ)

Рисунок 7. Связывание хлоринов in vitro с бактериями i3, gingivalis (а), А. viscosus (b), и с клетками НСРС-1 (с).

М. Hamblin с сотрудниками исследовали эффективность катионных ФС с еще одним полимером - полиэтиленимином [19]. Были получены три конъюгата хлорина &в 17 с полиэтилениминами (PEI): с большой молекулярной массой и разветвленным полимером (PEI-Себ HMW) и с PEI

относительно малых молекулярных масс: линейным полимером 20 (PEI-Ce6 lin) и разветвленным полимером 21 (PEI-Ce6 LMW) (схема 8).

Схема 8. Структурные формулы PEI-Ce6 lin (20) и PEI-Ce6 LMW (21).

Испытания проводились на грамположительных и грамотрицательных бактериях, а так же на дрожжевых микроорганизмах при облучении красным светом.

Хороший результат на всех видах используемых патогенов, в том числе и очень устойчивых к внешнему воздействию грамотрицательных бактериях P. aeruginosa, показал конъюгат с большой молекулярной массой и разветвленной структурой (PEI-Ce6 HMW) (Рис. 8), в то время как линейный конъюгат 20 оказался эффективен только против грамположительных бактерий и дрожжевых микроорганизмов. Низкомолекулярный разветвленный конъюгат показал себя как наименее эффективный противомикробный ФС.

20

21

1 ОД □ П П

]

А Н и 0,01

Ж О) 0,001 I 1 • PEI-себ lin

PQ S S 0,0001 1 -■-PEI-себ LMW PEI-себ HMW

S QQ 1Е-05 1 себ Свет

1Е-06

0 20 „ 40 60 „ ,80 100 Интенсивность (J/cm/J 120

Рисунок 8. Фото индуцированная антимикробная активность конъюгатов хлорина с полиэтилениминами на грамотрицательных бактериях Р.

aeruginosa.

В отличие от полилизиновых конъюгатов, PEI-конъюгаты хлорина являются устойчивыми к деградации под действием протеаз, например, трипсина, который гидролизует лизин-лизиновые пептидные связи, что дает преимущество PEI-ФС при использовании в ФДТ in vivo.

1.2.5. Фотосенсибилизаторы на основе бактериохлорина Использование бактериохлоринов для создания инновационных ФС перспективно в связи с их поглощением в ближней ИК-области спектра (700-830 нм), где проницаемость света в ткани максимальна (~2см), что позволяет воздействовать на глубокозалегающие воспаленные ткани.

Ученые из Массачусетского университета синтезировали четыре конъгата на основе бактериохлорина: нейтральный 22 и бактериохлорины с 2-мя (23), 4-мя (24) и шестью (25) положительными зарядами (схема 9) [15].

R: о

но 1 I

I Л <е

N^OH HN^ w

22 —/ 23 —4 ©N- ^

S ^

(® iе

( ©N _/© е

N -У 7 4 HN —'

24 -Ч 25 -Ч

О о

Схема 9. Синтетические бактериохлорины с положительно заряженными группами.

Концентрация бактериохлорина (цМ)

Рисунок 9. Фотоиндуцированная антимикробная активность нейтрального бактериохлорина (22) и катионных бактериохлоринов (23), (24) и (25) по отношению к грамположительным (а) и грамотрицательным бактериях (Ь).

Все четыре соединения показали активность против грамположительных

бактерий и селективность к бактериальным клеткам. При этом увеличение

положительного заряда привело к увеличению фотоиндуцированной

активности против грамотрицательных бактерий (Рис. 9).

1.3. Особенности формирования бактериальных биопленок Описанные в предыдущих главах исследования проводились на планктонных бактериях, однако, в естественной среде бактерии чаще всего локализуются в биопленках. Бактериальные биопленки - это организованные сообщества бактерий одного или нескольких видов, состоящие из активно функционирующих клеток и их покоящихся форм, включенных в покрывающий различные доступные поверхности внеклеточный матрикс (Рис. 10) [20].

\1

■

*

Матрикс

Высокая активность клеток Средняя активность клеток Низкая активность клеток Покоящиеся клетки

Рисунок 10. Активность клеток в микроколонии бактериальной биопленки

Бактерии в прикрепленном состоянии, интегрированные в биопленку, защищены от повреждающих факторов внешней среды и антибактериальных препаратов в организме хозяина [21].

Бактериальная биопленка образуется в результате сложного координированного взаимодействия микроорганизмов с поверхностью и между собой. Последовательность событий в общем виде выглядит следующим образом: начальное прикрепление к поверхности (адгезия), образование монослоя, движение по поверхности с образованием микроколоний, созревание биопленки и формирование трехмерной структуры (Рис. 11) [22].

Рисунок 11. Схема процесса формирования бактериальных биопленок

1.3.1. Механизмы устойчивости биоплёнок к антибактериальным

препаратам

Самым важным свойством биопленок в клинической практике является их устойчивость к антибактериальным препаратам. Резистентность бактерий к антибиотикам в биопленке многократно превосходит устойчивость бактерий в планктонной культуре. Особая устойчивость - более чем в 1000 раз - по сравнению со свободно растущими клетками наблюдается для биопленок P. aeruginosa [23,24]. Известен также парадоксальный факт усиления роста биопленки Staphylococcus capitis в присутствии высоких терапевтических концентраций оксациллина [25].

Резистентность связана с нарушением взаимодействия антибиотика и его мишени. У планктонных бактерий такое явление наблюдается на уровне бактериальной клетки в условиях ее непосредственного контакта с препаратом. Классическими считаются следующие типы механизмов устойчивости планктонных бактерий к антибиотикам: модификация мишени, инактивация антибиотика, активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс), нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки, формирование метаболического «шунта».

Формирование биоплёночной резистентности происходит сложнее. Включаются механизмы, которые препятствуют проникновению антибиотиков в глубокие слои биоплёнки и нарушают непосредственный контакт с бактериальными клетками [26]:

• ограниченное проникновение антимикробных веществ в биопленки (матрикс замедляет этот процесс и связывает антибиотики). Матрикс не только связывает клетки в единую структуру, но и заполняет межклеточные пространства, образуя трехмерную фильтрующую систему. Это позволяет назвать биопленку «молекулярным фильтром» и считать фильтрацию одной из важнейших функций биопленки. Элементы матрикса являются не только пассивным фильтром, замедляя диффузию антибиотиков сквозь биопленку, но и активно связывают антибиотики. Матрикс, который

продуцируется некоторыми патогенами, заполняя межклеточное пространство в биопленках, также может обладать свойством связывать антибактериальные препараты. Структуры матрикса действуют против разных антибиотиков избирательно, что зависит не только от типа антибиотика и видовой принадлежности биопленкообразующих бактерий, но и от их штаммовых особенностей, а также от возраста биопленки, т.е. параметров, которые могут определять химический состав и архитектуру матрикса.

• различия в метаболической активности и скорости роста отдельных клеток бактерий (медленно растущие и/или не растущие клетки слабо восприимчивы ко многим антибактериальным агентам);

• ограничение питательных веществ и измененная микросреда в биопленке приводят к уменьшению скорости деления бактерий, вследствие чего остается меньше мишеней для действия антибиотиков;

• сигналы «quorum sensing»;

• повышенная мутабельность бактерий в биопленке.

Например, под воздействием сильной антибиотикотерапии количество мутаций, приводящих к антибиотикорезистентности в биопленках P. aeruginosa, может достигать 20% [23]. Основной причиной мутаций являются повреждения ДНК, часто вызванные окислительным стрессом и нарушением систем репарации у бактерий. В результате накопления мутаций могут селекционироваться штаммы, устойчивые сразу ко многим антибактериальным препаратам (multidrug-resistant strains) [24].

• экспрессия невыявленных генов резистентности;

• межвидовая передача генов антибиотикорезистентности, которая более успешно реализуется в условиях тесного контакта бактерий внутри биопленки;

• эффлюксная помпа.

Одним из механизмов резистентности являются системы активного выброса (эффлюкс) антибиотика, а также продуктов синтеза самой клетки.

27

Одним из продуктов, которые транспортируются через эффлюксные помпы у P. aeruginosa, являются ß-лактамазы, обеспечивающие устойчивость биоплёнок к антибиотикам ß-лактамного ряда (дезактивируют большинство ß-лактамных антибиотиков) [27];

• наличие в популяциях бактериальных клеток, способных выживать в стрессовых условиях (клетки-персистеры) [24].

Очевидно, что с ростом резистентности бактерий к антибиотикам снижается эффективность стандартных режимов их дозирования. Это стимулирует разработку новых антибактериальных препаратов и новых схем терапии. Главным отличием фотодинамической терапии от антибиотикотерапии является отсутствие резистентности к основному цитотоксическому агенту - синглетному кислороду.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Брусов, Сергей Сергеевич, 2018 год

V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mroz, P., Hamblin, MR,. Advances in photodynamic therapy: basic, translational and clinical // Artech House; Norwood: 2008.

2. Maisch T., A new strategy to destroy antibiotic resistant microorganisms: antimicrobial photodynamic treatment // Mini Rev Med Chem 2009, Vol. 9, p. 947-983.

3. Liyi H., Yi X., Yuichiro K., Zhiyentayev T., Masamitsu T., Hamblin M.R. Type I and Type II Mechanisms of Antimicrobial Photodynamic Therapy: An In Vitro Study on Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria // Lasers in Surgery and Medicine, 2012, Vol. 44, p. 490-499.

4. Minnock A., Vernon D.I., Schofield J., Griffiths J., Parish J.H., Brown S.T. Photoinactivation of bacteria. Use of a cationic water-soluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both gram-negative and gram-positive bacteria. // J. Photochem. Photobiol. 1996, Vol. 32, p. 159-164.

5. Xavier R.D., Ruiz-Gonzalez R.S., Dai T. Cationic Porphycenes as Potential Photosensitizers for Antimicrobial Photodynamic Therapy // J. Med. Chem. 2010, Vol. 53, p. 7796-7803

6. Corbitt T. S., Sommer J. R., Chemburu S., Ogawa K., Ista L. K., Lopez G. P., Whitten D. G., Schanze K. S., Appl. Mater. Interfaces; Light and dark biocidal activity of cationic poly(arylene ethynylene) conjugated polyelectrolytes // Photochem Photobio Sci, 2009, Vol. 1, p. 48-52.

7. Musetti C., Spagnul C., Mion G., Ros S., Gianferrara T., Sissi C. DNA Targeting by Cationic Porphyrin-Ruthenium(II) Conjugates // ChemPlusChem, Jan. 2015, Vol. 80, p. 158-168.

8. Lauro FM., Pretto P., Covolo L., Jori G., Bertoloni G., Photoinactivation of bacterial strains involved in periodontal diseases sensitized by porphycene-polylysine conjugates // Photochem Photobiol Sci 2002, Vol. 1, p. 468-470.

9. Nitzan Y., Gutterman M., Malik Z., Ehrenberg B. Inactivation of gram-negative bacteria by photosensitized porphyrins // Photochem Photobiol 1992, Vol. 55, p. 89-96.

10. Bertoloni G., Rossi F., Valduga G., Jori G., van Lier J., Photosensitizing activity of water-and lipidsoluble phthalocyanines on Escherichia coli // FEMS Microbiol Lett 1990, Vol. 59, p. 149-155.

11. Dai T., Huang YY., Hamblin M.R. Photodynamic therapy for localized infections - state of the art. // Photodiagnosis Photodyn Ther. 2009, Vol. 6(3-4), p. 170-188.

12. Soukos N.S., Ximenez-Fyvie L.A., Hamblin M.R., Socransky S.S., Hasan T. Targeted Antimicrobial Photochemotherapy. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998, Vol. 42(10) p. 2595.

13. Pereira J.B., Carvalho E.F.A., Faustino M.A.F., Fernandes R., Neves M.G., Cavaleiro J.A.S., Gomes N.C., Cunha A., Almeida A., Tome J.P.C. Phthalocyanine Thio-Pyridinium Derivatives as Antibacterial Photosensitizers // Photochemistry and Photobiology, Feb. 2012, Vol. 88, p. 537-547.

14. Prasanth C.S., Karunakaran S.C, Paul A.K., Kussovski V., Mantareva V., Ramaiah D., Selvaraj L., Angelov I., Avramov L., Nandakumar K., Subhash N. Antimicrobial Photodynamic Efficiency of Novel Cationic Porphyrins towards Periodontal Gram-positive and Gram-negative Pathogenic Bacteria // Photochemistry and Photobiology, May/June 2014, Vol. 90, p. 628-640.

15. Ruzie C., Krayer M., Balasubramanian T., Lindsey J.S. Tailoringa bacteriochlorin building block with cationic, amphipathic, or lipophilic Substituents // J. Org. Chem, 2008, Vol.73, p. 5806-5820.

16. Maisch T., Bosl C., Szeimies R.-M., Lehn N., Abel C. Photodynamic Effects of Novel XF Porphyrin Derivatives on Prokaryotic and Eukaryotic Cells // Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 2005, Vol. 49, p. 1542-1552.

17. Gsponer N.S., Spesia M.B., Durantini N.E.. Effects of divalent cations, EDTA and chitosan on the uptake and photoinactivation of Escherichia coli mediated by cationic and anionic porphyrins // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2015, Vol. 12, p. 67- 75.

18. Orlandi V.T., Caruso E., Banfi S., Barbieri P. Effect of Organic Matter on the In Vitro Photoeradication of Pseudomonas aeruginosa by Means of a

Cationic Tetraaryl-porphyrin // Photochemistry and Photobiology, Feb. 2012, Vol. 88, p. 557-564.

19. Tegos G.P., Anbe M., Yang Ch., Demidova T.N., Satti M., Mroz P., Janjua S., Gad F., Hamblin M.R. Protease-Stable Polycationic Photosensitizer Conjugates between Polyethyleneimine and Chlorin(e6) for Broad-Spectrum Antimicrobial Photoinactivation // Antimicrob. Agents Chemother. 2006, Vol. 50(4), p. 1402.

20. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Ильина Т.С., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Образование биопленок - пример «социального» поведения бактерий. // Микробиология. 2006, Т. 75(4), c. 1-6.

21. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азизбекян Р.Р., Романова Ю.М. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок. // Микробиология. 2010, Т. 79(4), c. 435-446.

22. Darouiche R.O. Device-associated infections: a macroproblem that starts with microadherence. // Clin. Infect. Dis. 2001, Vol. 33(9). р. 1567-1572.

23. Pace J.L., Rupp M.E., Finch R.G. Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy. // CRC Press Taylor&Francis Group. 2005, Vol, 7. р. 109153.

24. Мележик И.А., Яворская Н.В., Шепелевич В.В., Кокозей В.Н. Роль биопленок Pseudomonas аeruginosa в развитии эндогенных болезней. // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал). 2013, Т. 3, c. 1-28.

25. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д., Лазарева А.В., Чистякова В.П. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2012, Т. 14(1), c. 51-58.

26. Лагун Л.В., Жаворонок С.В. Бактериальные биопленки и их роль в развитии инфекции мочевыводящих путей. // Клинич. обзор. 2013. С. 21-27.

27. Rossolini G., Mantegoni E. Treatment and control of severe infections caused by multiresistant Pseudomonas aeruginosa. // Clin Microbiol Infect. 2005, Vol. 11, p. 17-32.

28. Lee C.F., Lee C.J., Chen C.T., Huang C.T. Delta-aminolaevulinic acid mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy on Pseudomonas aeruginosa planktonic and biofilm cultures. // J. Photochem. Photobiol. B. 2004, Vol. 75, p. 21-25.

29. Cholkar K., Hirani N.D., Natarajan C. Chapter 14 - Nanotechnology-Based Medical and Biomedical Imaging for Diagnostics. In: Emerging Nanotechnologies for Diagnostics, Drug Delivery and Medical Devices // Boston: Elsevier. 2017, p. 355-374.

30. Baetke S.C., Lammers T., Kiessling F. Applications of nanoparticles for diagnosis and therapy of cancer // The British Journal of Radiology. 2015, Vol. 88, p. 20150207 (1-25).

31. De Jong M., Essers J., van Weerden W.M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power // Nat. Rev. Cancer. 2014, Vol. 14, p. 481493.

32. Kunjachan S., Ehling J., Storm G., Kiessling F., Lammers T. Noninvasive Imaging of Nanomedicines and Nanotheranostics: Principles, Progress, and Prospects // Chem. Rev. 2015, Vol. 115, p. 10907-10937.

33. Chowdhury S.R., Djordjevic J., Albensi B.C., Fernyhough P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria // Bioscience Reports. 2016, Vol. 36, p. 1-12 (00286).

34. Graef F., Gordon S., Lehr C-M. Anti-infectives in Drug Delivery— Overcoming the Gram-Negative Bacterial Cell Envelope. In: Stadler M, Dersch P, editors. How to Overcome the Antibiotic Crisis : Facts, Challenges, Technologies and Future Perspectives [Internet] // Cham: Springer International Publishing. 2016, Vol. 398, p. 475-496.

35. James N.S, Ohulchanskyy T.Y, Chen Y., Joshi P., Zheng X., Goswami L.N. et al. Comparative Tumor Imaging and PDT Efficacy of HPPH Conjugated in the Mono- and Di-Forms to Various Polymethine Cyanine Dyes: Part - 2. Theranostics. 2013, Vol. 9, p. 703-718.

36. Liu T.W, Huynh E., MacDonald T.D., Zheng G. Chapter 14 -Porphyrins for Imaging, Photodynamic Therapy, and Photothermal Therapy // In: Cancer Theranostics [Internet] Oxford: Academic Press. 2014, p. 229-254.

37. Menze B.H., Jakab A., Bauer S., Kalpathy-Cramer J., Farahani K., Kirby J. et al. The Multimodal Brain Tumor Image Segmentation Benchmark (BRATS) // - IEEE transactions on medical imaging. 2015, Vol. 34, p. 1993-2024.

38. Del Grande F., Subhawong T., Weber K., Aro M., Mugera C., Fayad L.M. Detection of Soft-Tissue Sarcoma Recurrence: Added Value of Functional MR Imaging Techniques at 3.0 T // Radiology. 2014, Vol. 271, p. 499-511.

39. Chou S-HS, Hippe D.S., Lee A.Y., Scherer K., Porrino J.A., Davidson D.J. et al. Gadolinium Contrast Enhancement Improves Confidence in Diagnosing Recurrent Soft Tissue Sarcoma by MRI // Academic Radiology. 2017, Vol. 24, p. 615-622.

40. Ramalho J., Ramalho M., AlObaidy M., Semelka R.C. Technical aspects of MRI signal change quantification after gadolinium-based contrast agents' administration // Magnetic Resonance Imaging. 2016, Vol. 34, p. 13551358.

41. I§m A., Direkoglu C., §ah M. Review of MRI-based Brain Tumor Image Segmentation Using Deep Learning Methods // Procedia Computer Science. 2016, Vol. 102, p. 317-324.

42. Lim E-K., Kim T., Paik S., Haam S., Huh Y-M, Lee K. Nanomaterials for Theranostics: Recent Advances and Future Challenges // Chem. Rev. 2015, Vol. 115, p. 327-394.

43. Kumar R., Shin W.S., Sunwoo K., Kim W.Y., Koo S., Bhuniya S. et al. Small conjugate-based theranostic agents: an encouraging approach for cancer therapy // Chem Soc Rev. 2015, Vol. 44, p. 6670-6683.

44. Jo S.D., Ku S.H., Won Y-Y, Kim S.H., Kwon I.C. Targeted Nanotheranostics for Future Personalized Medicine: Recent Progress in Cancer Therapy // Theranostics. 2016. Vol. 9, p. 1362-1377.

45. Merbach A.E., Helm L., Toth E. The Chemistry of Contrast Agents in Medical Magnetic Resonance Imaging // Wiley: Chichester. 2013.

46. Wadas T.J., Wong E.H., Weisman G.R. Coordinating radiometals of copper, gallium, indium, yttrium, and zirconium for PET and SPECT imaging of disease // C. J. Chem. Rev. 2010, Vol. 110, p. 2858-1902.

47. Eliseeva S.V., Bunzli J.C. Lanthanide luminescence for functional materials and bio-sciences // G. Chem. Rev. 2010, Vol. 39, p. 189-227.

48. Van Zijl P.C., Yadav N.N. Chemical exchange saturation transfer (CEST): what is in a name and what isn't? // Magn. Reson. Med. 2011, Vol. 65, p. 927-948.

49. Ur Rashid H., Khan K., Yaseen M., Hassan W., Naveed U.M. Synthesis and relaxivity measurement of cyclen based magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent // Revue Roumaine de Chimie. 2014, Vol. 59, p. 27-33.

50. Thomsen H. Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging // In: Image Principles, Neck, and the Brain. CRC Press. 2016, p. 61-72.

51. Rashid H.U., Martines M.A.U., Jorge J., de Moraes P.M., Umar M.N., Khan K. et al. Cyclen-based Gd3+ complexes as MRI contrast agents: Relaxivity enhancement and ligand design // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2016, Vol. 24, p. 5663-5684.

52. Boltjes A., Shrinidhi A., van de Kolk K., Herdtweck E., Domling A. Gd-TEMDO: Design, Synthesis, and MRI Application // Chemistry - A European Journal. 2016, Vol. 22, p. 7352-7356.

53. Cakic' N., Gunduz S., Rengarasu R., Angelovski G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents // Tetrahedron Letters. 2015, Vol. 56, p. 759-765.

54. Toth E., Helm L., Merbach A.E. Metal Complexes as MRI Contrast Enhancement Agents // Elsevier Inc. 2015. Vol. 38.

55. Hindre F., Plouzennec M., Certaines J.D., Foultier M.T., Patrice T., Simonneaux G. Tetra-p-aminophenylporphyrin Conjugated with Gd-DTPA: Tumor-specific Contrast Agent for MR Imaging // JMRI. 1993. Vol. 3, p. 59-65.

56. Luo J., Chen L., Hu P., Chen ZN. Tetranuclear Gadolinium(III) Porphyrin Complex as a Theranostic Agent for Multimodal Imaging and Photodynamic Therapy // Inorg. Chem. 2014, Vol. 53, p. 418-419.

57. Desbois N., Michelin C., Chang Yi., Stupar V., Bonnaud M., Pacquelet S., Gros C.P., Synthetic strategy for preparation of a folate corrole DOTA heterobimetallic Cu-Gd complex as a potential bimodal contrast agent in medical imaging // Tetrahedron Letters. 2015, Vol. 56, p.7128-7131.

58. Luo J., Chen L-F, Hu P., Chen Z-N. Tetranuclear Gadolinium(III) Porphyrin Complex as a Theranostic Agent for Multimodal Imaging and Photodynamic Therapy // Inorg. Chem. 2014, Vol. 53, p. 4184-4191.

59. Sour A., Jenni S., Orti-Suarez A., Schmitt J., Heitz V., Bolze F. et al. Four Gadolinium(III) Complexes Appended to a Porphyrin: A Water-Soluble Molecular Theranostic Agent with Remarkable Relaxivity Suited for MRI Tracking of the Photosensitizer // Inorg. Chem. 2016, Vol. 55, p. 4545-4554.

60. Eggenspiller A., Michelin C., Desbois N., Richard P., Barbe J-M, Denat F. et al. Design of Porphyrin-dota-Like Scaffolds as All-in-One Multimodal Heterometallic Complexes for Medical Imaging // European Journal of Organic Chemistry. 2013, Vol. 2013, p. 6629-6643.

61. Goswami L.N., White W.H., Spernyak J.A., Ethirajan M., Chen Y., Missert J.R., Morgan J., Mazurchuk R., Pandey R.K. Synthesis of Tumor-Avid Photosensitizer-Gd(III)DTPA Conjugates: Impact of the Number of Gadolinium Units in T1/T2 Relaxivity, Intracellular localization, and Photosensitizing Efficacy // Bioconjugate Chem. 2010, Vol. 21, p. 816-827.

62. Gros C.P., Eggenspiller A., Nonat A., Barbe JM., Denat F. New potential bimodal imaging contrast agents based on DOTA-like and porphyrin macrocycles // Med. Chem. Commun. 2011, Vol. 2. p. 119-125.

63. Eggenspiller A., Michelin C., Desbois N., Richard P., Barbe JM., Denat F., et al. Design of Porphyrin-dota-Like Scaffolds as All-in-One Multimodal Heterometallic Complexes for Medical Imaging // Eur. J. Org. Chem. 2013, Vol. 1, p. 16.

64. Ke XS., Tang J., Yang Z., Zhang J-L. ^-conjugation of gadolinium(III) DOTA complexes to zinc(II) porpholactol as potential multimodal imaging contrast agents // J. Porphyrins Phthalocyanines. 2014, Vol. 18, p. 1-10.

65. Mironov A.F., Grin M.A., Nochovny S.A., Toukach F.V. Novel cycloimides in the chlorophyll a series. // Mendeleev Commun. 2003, Vol. 4, p. 156-158.

66. Furst A., Berlo R.S., Hooton S., Hydrazine as a Reducing Agent for Organic Compounds (Catalytic Hydrazine Reductions) // Chem. Rev. 1965, Vol. 65, p. 51.

67. Li J.Z., Li L., Kim J.H., Cui B.C., Wang J.J., Shim Y.K., Highly J. efficient synthesis of novel methyl 132-methylene mesopyropheophorbide a and its stereoselective Michael addition reaction // Porphyrins Phthalocyanines, 2011, Vol. 15, p. 264- 270.

68. Брусов С.С., Миронов А.Ф., Грин М.А., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Тиганова И.Г., Степанова Т.В., Колоскова Ю.С., Меерович Г.А. Катионный пурпуринимид, обладающий антибактериальной активностью, и его применение для фотодинамической инактивации бактериальных биопленок. // Патент РФ N 2565450. Опубликовано 20.10.2015, бюлл. № 29.

69. Брусов С.С., Колоскова Ю.С., Грин М.А., Тиганова И.Г., Пагина О.Е., Толордава Э.Р., Степанова Т.В., Меерович Г.А., Романова Ю.М., Миронов А.Ф. Новый катионный пурпуринимид для фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas Aeruginosa // Российский биотерапевтический журнал. 2014, Т. 13, c. 59-63.

70. Kozyrev A.N., Chen Y., Goswami L.N., Tabaczynski W.A., Pandey R.K. Characterization of Porphyrins, Chlorins, and Bacteriochlorins Formed via Allomerization of Bacteriochlorophyll a Synthesis of Highly Stable Bacteriopurpurinimides and Their Metal Complexes // J. Org. Chem. 2006, Vol 71, p. 1949-1960.

71. Брусов С.С., Грин М.А., Меерович Г.А., Миронов А.Ф., Романова Ю.М., Тиганова И.Г. Способ фотодинамической терапии локальных очагов инфекции. // Патент РФ N 2610566. Опубликовано 13.02.2017, бюлл. № 5.

72. Брусов С.С., Ефременко А.В., Лебедева В.С., Щепелина Е.Ю., Пономарев Ф.В., Феофанов А.В., Миронов А.Ф., Грин М.А. Влияние положительного заряда в структуре фотосенсибилизаторов хлоринового ряда на фотоиндуцированную противоопухолевую активность // Российский биотерапевтический журнал. 2015, T. 4, с. 87-92.

73. Grin М.А., Brusov S.S., Shchepelina E.Y., Ponomarev P.V., Khrenova M.K., Smirnov A.S., Lebedeva V.S., Mironov A.F. Conjugates of natural chlorins with cyclen as chelators of transition metals // Mendeleev Communications. 2017, Vol. 4, p. 338-340.