Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ДИ- и тетраплоидными фибробластами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Круглова, Анна Александровна

• Круглова, Анна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Круглова, Анна Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гибридизация клеток как способ изучения взаимодействия геномов.

1.1.1. Гетерокарионы как модель изучения взаимодействий ядер разного типа.

1.1.2. Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов.

1.1.3. Соматические гибридные клетки, полученные при слиянии клеток с разной плоидностью.

1.2. Свойства стволовых клеток эмбрионального происхождения и получение гибридных клеток между ними и соматическими клетками.

1.2.1. Характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения.

1.2.2. Дифференцировка стволовых клеток эмбрионального происхождения in vivo и in vitro.

1.2.3. Гибридные клетки между соматическими и стволовыми клетками.

1.2.4. Получение химерных животных с участием гибридных клеток ЭСК-соматическая клетка как метод in vivo оценки их потенциала.

1.2.5. Репрограммирование генома соматического партнера в гибридных клетках типа ЭСК -соматическая клетка.

1.3. Хромосомный состав гибридных клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клетки и клеточные линии.

2.2. Условия культивирования клеток.

2.3. Получение и культивирование клеточных культур и гибридных клеток.

2.3.1. Получение культур первичных эмбриональных фибробластов.

2.3.2. Получение линии тетраплоидных фибробластов мыши.

2.3.3. Получение культуры фибробластов из органов и тканей взрослого животного.

2.3.4. Получение гибридных клеток.

2.3.5. Культивирование эмбриональных стволовых клеток и клонов гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты.

2.3.6. Культивирование фибробластов и гибридных клеток ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

2.4. Анализ маркеров ЭСК в гибридных клетках.

2.4.1. Оценка активности щелочной фосфатазы.

2.4.2 Иммунофлуоресцентный анализ Nanog, Oct4, коллагена 1-го типа (Со/-/) и фибронектина (Fbn) в ЭСК, фибробластах и гибридных клетках.

2.4.3. Анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Coll и Fbn с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.4.3.1. Выделение РНК.

2.4.3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.5 Идентификация родительских хромосом в клонах гибридных клеток.

2.5.1. Анализ хромосомного состава с помощью микросателлитных маркеров.

2.5.1.1. Выделение ДНК.

2.5.1.2. ПЦР-анализ микросателлитных маркеров.

2.5.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и подсчет хромосом в клетках.

2.5.3. In situ гибридизация с хромосомоспецифическими пробами.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Получение гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты.

3.2. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-диплоидные фибробласты.

3.3.Характеристика гибридных клеток типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты.

3.4. Хромосомный и микросателлитный анализы клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер.

3.5. Фенотип гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

3.6. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

3.7. Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ДИ- и тетраплоидными фибробластами»

Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой плюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, оставались не выясненными масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию соматического генома до плюрипотентного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998), или путем слияния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с соматическими клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; Serov et al., 2001; Ambrosi, Rasmussen, 2005). Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии (Tada et al., 2001; 2003; Terada etal., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСК-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada etal., 2001; 2003;). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭСК человека с фибробластами (Cowan et al., 2005). Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их плюрипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Причины доминирования свойств ЭСК на данный момент не выяснены, поэтому крайне важно установить факторы, влияющие на доминирование плюрипотентности в гибридных клетках. Однако при этом следует особо отметить, что для изучения возможных молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме и репрограммирования генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток, поскольку данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭСК-дифференцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСК-спленоциты, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2003; Пристяжнюк и др., 2005). В связи с этим актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов репрограммирования, трудно переоценить.

Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Исследование химерных животных, полученных введением тетраплоидных гибридных клеток в реципиентные бластоцисты, показало лишь незначительный вклад гибридных клеток в органы и ткани химерного животного (Tada et al., 2001). Имеются сообщения о рождении двух химерных животных, полученных при введении около-тетраплоидных плюрипотентных клеток, однако необходимо отметить, что в данных работах нет доказательств получения химерных животных именно из таких клеток, так же как и доказательств сохранения исходного кариотипа клеток при развитии химерного животного (Ying et al., 2002; Pells et al., 2002). Таким образом, в данной работе впервые будет проведен анализ хромосомного состава потомков около-тетраплоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюрипотентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрограммированием дифференцированных хромосом или с их утерей.

Цели и задачи исследования. При выполнении работы преследовалась следующая цель: исследовать влияние плоидности соматического партнера на морфологию и свойства гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с ди- и тетраплоидными фибробластами.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить гибридные клетки между ЭСК Mus musculus линии 129/Ola и диплоидными фибробластами Mus musculus линии DD/c;

2. Получить гибридные клетки между ЭСК M musculus линии 129/Ola и тетраплоидными фибробластами M. musculus линии DD/c;

3. Сравнить уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog (экспрессия которых типична для ЭСК), коллагена 1-го типа и фибронектина (экспрессия которых типична для фибробластов) в полученных клонах гибридных клеток методом ПЦР в реальном времени;

4. Провести анализ хромосомного состава гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты и ЭСК-тетраплоидные фибробласты цитогенетическими методами, а также используя микросателлитные маркеры для идентификации родительских хромосом;

5. Исследовать хромосомный состав потомков гибридных клеток (полученных слиянием ЭСК и диплоидных фибробластов) с около-тетраплоидным набором хромосом, давших вклад в органы и ткани химерных животных.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов.

2. Впервые показано сохранение исходного кариотипа у потомков гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом в химерных животных при in vivo оценке их плюрипотентных свойств.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на II конгрессе общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), IV International Meeting Stem Cell Network North Rhine-Westphalia (Дюссельдорф, 2007), 3rd International Conference Basic Science for Medicine (Новосибирск, 2007), LXXIII Cold Spring Harbor Symosium on Quantitative Biology (Колд Спринг Харбор, 2008).

Материалы диссертации изложены в трех статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 102-х страницах, иллюстрирована 12-ю рисунками и содержит 8 таблиц

Заключение диссертации по теме «Генетика», Круглова, Анна Александровна

ВЫВОДЫ

1. При слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами получено 4 клона гибридных клеток, при слиянии диплоидных ЭСК с диплоидными фибробластами, полученными из взрослой мыши - 11 клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ и анализ микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы, показали, что в большинстве клонов гибридных клеток сохраняются хромосомные наборы обеих линий родительских клеток.

2. Гибридные клетки, полученные при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными фибробластами, имели морфологию и свойства, типичные для эмбриональных стволовых клеток: высокую активность щелочной фосфатазы, сопоставимый с эмбриональными стволовыми клетками уровень экспрессии генов Ос14 и Nanog, и сходную с эмбриональными стволовыми клетками организацию 1-актинового цитоскелета.

3. Впервые установлено, что в тесте на химеризм, применяемом для оценки плюрипотентности, около-тетраплоидный набор хромосом тестируемых гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток с диплоидными фибробластами, сохраняется при развитии химерных животных.

4. При слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками было получено 11 независимых клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ показал, что все клоны содержали около-гексаплоидный набор хромосом и микросателлиты, маркирующие большинство хромосом обеих линий родительских клеток.

5. Все клоны гибридных клеток, полученных при слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками, имели морфологию и свойства, типичные для фибробластов: сходную организацию Г-актинового цитоскелета, отсутствие активности щелочной фосфатазы, высокий уровень экспрессии генов коллагена 1-го типа и фибронектина и полное отсутствие экспрессии генов ОШ и Nanog.

6. Впервые описано альтернативное проявление . родительских геномов в гибридных клетках: доминирование генома ЭСК в клетках типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты и, наоборот, доминирование генома фибробласта в клетках типа диплоидные ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Таким образом, альтернативное проявление родительских геномов в исследованных гибридных клетках определялось плоидностью соматического партнера.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Круглова, Анна Александровна, 2008 год

1. Косимов Р.Б., Сухарев С.И., Поспелова Т.В., Прудовский ИА., Зеленин A.B. Синтез ДНК в гетерокарионах, полученных слиянием лейкоцитов и клеточных культур с разным пролиферативным потенциалом // Цитология. 1991. Т.ЗЗ, №2. С. 48-56.

2. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных // Москва. Мир. 1986. 271 с.

3. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов O.JI. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют плюрипотентность // Докл. РАН. 1996. Т. 349, №1. С. 129-132.

4. Матвеева Н.М., Кузнецов С.Б., Кафтановская Е.М., Серов О.Л. Сегрегация родительских хромосом в гибридных клетках, полученных от слияния эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток взрослого животного // Докл. РАН. 2001. Т. 379, № 1. С. 118-120.

5. Пристяжшок И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 2. С. 151-158.

6. Прудовский И.А., Егоров Е.Е., Косимов Р.Б., Капник Е.М., Гуменюк P.P., Ходаков А.Л., Онищенко Г.Е., Цонг Т. Позитивная и негативная регуляция реплекации в гибридных клетках // Молек. Биол. 1991. Т. 25, №5. С. 1157-1180.

7. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках // Онтогенез. 2003. Т. 34. №3. С. 216-227.

8. Abbondanzo S.J., Gadi I., Stewart C.L. Derivation of embryonic stem cell lines // Methods in Enzymology. 1993. V. 225. P. 803-823.

9. Andrews P.V., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic cell hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cell // Somat. Cell Genet. 1980. V. 6. P. 271-284.

10. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 481-492.

11. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans des cultures in vitro de deux souches cellulaires en association de cellules de caractere "hybride" // C. R. Acad. Sc. 1960. Y. 25l.P. 1825-1827.

12. Beddington R.S., Robertson E.J. An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo // Dev. 1989. V. 105. P. 733737.

13. Brackett B.G., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1971. V. 68. P. 353-357.

14. Carlsson S.-A., Savage R.E., Ringertz N.R. Behavior of differetiated hen nuclei in the cytoplasm of rat myoblasts and myotubes //Nature. 1970. Y. 228. P. 869-871.

15. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. P. 13691373.

16. Di Berardino M.A. Genomic Potential of Differentiated Cells // New York: Columbia University Press. 1997. 386 p.

17. Dinsmore J., Ratliff J., Deacon T., Pakzaban P., Jacoby D., Galpern W., Isacson O. Embryonic stem cell differentiated in vitro as a novel source of cell for transplantation // Cell Transpl. 1996. V. 5. P. 131-143.

18. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells// Stem Cells. 2004. V.22. P. 941-949.

19. Dubbs D.R., Kit S. Reactivation of chick erythrocyte nuclei in heterokaryons with temperature-sensetive Chinese hamster cells // Somat. Cell Genet. 1976. V. 2. P. 11-19.

20. Edwards M.K.S., McBurney M.W. The concentration of retinoic acid determine differentiated cell types formed by teratocarcinoma cell lines // Dev. Biol. 1983. V. 98. P. 187-191.

21. Ephrussi B. Weiss M.C. Interspecific hybridization of somatic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1965. V. 53. P. 1040-1042.

22. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryo //Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

23. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K., Nosek J. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell Differ. 1984. V. 15(2-4). P. 229-234.

24. Forejt J., Saam J.R., Gregorova S., Tilghman S.M. Monoallelic expression of reactivated imprinted genes in embryonal carcinoma cell hybrids // Exp. Cell Res. 1999. Y. 252. P. 416-422.

25. Fougere C., Ruiz F., Ephrussi B. Gene dosage dependence of pigment synthesis in melanoma x fibroblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972. V. 69. P. 330-334.

26. Geijsen N., Horoschak M., Kim K., Gribnau J., Eggan K., Daley G.Q. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells // Nature. 2003. V. P. 1-6.

27. Gledhill B.L., Sawicki W., Croce C.M., Koprowski H. DNA synthesis in rabbit spermatozoa after treatment with lysolecitin and fusion with somatic cells // Exp. Cell Res. 1972. V. 73. P. 33-40.

28. Gmur R., Solter D., Knowles B.B. Independent regulation of H-2K and H-2D gene expression in murine teratocarcinoma somatic cell hybrids // J. Exp. Med. 1980. V. 151. P. 1349-1359.

29. Gordon S., Cohn Z. Macrophage-melanocytes heterokaryons // I. Preparation and Properties. 1971. J. Exp. Med. V. 131. P. 981-1003.

30. Gossler A., Doetschman T.C., Korn R., Serfling E., Kemler R. Transgenesis by means of blastocyst derived embryonic stem cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 9065- 9069.

31. Graves J.A. Chromosome segregation from cell hybrids. I. The effect of parent cell ploidy on segregation from mouse-Chinese hamster hybrids // Can. J. Genet. Cytol. 1984. V. 26(5). P. 557-563.

32. Graves J.A., Barbieri I. Chromosome segregation from cell hybrids. VII. Reverse segregation from karyoplast hybrids suggests control by cytoplasmic factors // Genome. 1992. V. 35(3). P. 537-540.

33. Graves J.A., Wrigley J.M. Chromosome segregation from cell hybrids. II. Do differences in parental cell growth rates and phase times determine direction of loss? // Can. J. Genet. Cytol. 1986. V. 28(5). P. 735-743.

34. Graves J.A., Zelesco P.A. Chromosome segregation from cell hybrids. V. Does segregation result from asynchronous centromere separation? // Genome. 1988. V. 30 (2). P. 124-128.

35. Graham C.F. The fusion of cells with one- and two-cell mouse embryos // Wistar Inst. Symp. Monogr. V. 9. P. 19-33.

36. Harris H. The reactivation of the red cell nucleus // J. Cell Sci. 1967. V. 2. P. 23-32.

37. Harris H., Cook P.R. Synthesis of an enzyme determined by an erythrocyte nucleus in a hybrid cell // J. Cell Sci. 1969. V. 5. P. 121-134.

38. Harris H., Watkins J.F. Hybrid cells derived from mouse and man: artificial heterokaryons of mammalian cells from different species // Nature. 1965. V. 205. P. 640-646.

39. Harris II., Watkins J.F., Ford C.E., Schoefl G.I. Artificial heterokaryons of animl cells from different species // J. Cell Sci. 1966. V. 1. P. 1-30.

40. Hines M.D., Radomska H.S., Eckhardt L.A. Transcription factor effectss on chromosome constitution of cell hybrids // Cytogenet. Cell Genet. 1998. Y. 72. P. 64-72.

41. Hogan B., Beddington R., Constantini F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo // Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 497.

42. Illmensee K., Mintz B. Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 549-553.

43. Johnson R.T., Harris H. DNA synthesis and mytosis in fused cells. II. HeLa chick erythrocyte heterokaryons // J. Cell Sci. 1969. Y. 5. P. 645-697.

44. Kimura H., Tata M., Nakatsuji N., Tada T. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P. 5710-5720.

45. Kuai X.L., Bian Y.H., Cong X.Q., Li X.L., Xiao S.D. Differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes in vitro and in vivo // Chinese J. Digestive Disease. 2003. V. 4. P. 75-80.

46. Kushch A.A., Prudowskii I.A., Zelenin A.V. Chromatin activation in peritoneal exudate leukocytes after fusion with L cell cytoplasts // Cytobiologie. 1978. V. 18. P. 5966.

47. Lassar A.B., Paterson B.M., Weinraub H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts // Cell. 1986. V. 47. P. 649-656.

48. Lasserre C., Jami J., Aviles D. Patterns of chromosome segregation in Chinese hamster x mouse cell hybrids between permanent cell lines and thymus cells // J. Cell Physiol. 1980. V. 104(3). P. 403-413.

49. Ledermann B., Burki K. Establishment of a germ-line competent C57BL/6 embryonic stem cell line // Exp. Cell. Res. 1991. V. 197. P. 254-258.

50. Malawista S.E., Weiss M.C. Expression of differentiated functions in hepatoma cell hybrids: high frequency of induction of mouse albumin production in rat hepatoma-mouse lymphoblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1974. V. 71. P. 927-931.

51. Martin G.R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis // Science. 1980. V. 209. P. 768-776.

52. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 7631-7636.

53. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from the murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

54. McBurney M.W. Hemoglobin synthesis in cell hybrids formed between teratocarcinoma and Friend erythroleukemia cell // Cell. 1977. V. 12. P. 654-662.

55. Miller R.A., Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

56. Miller R.A., Ruddle F.H. Teratocarcinoma x Friend erythroleukemia cell hybrids resemble their pluripotent embryonal carcinoma parent // Dev. Biol. 1977. V. 56. P. 157173.

57. Nakano T., Kodama H., Honjo T. Generation of lymphohaematopoietic cells from embryonic stem cells in culture // Science. 1994. V. 265. P. 1098-1101.

58. Nyman U, Lanfranchi G, Bergman., M, Ringertz NR. Changes in nuclear antigens during reactivation of chick erythrocyte nuclei in heterokaryons // J. Cell Physiol. 1984. V. 120. P. 257-262.

59. Okada Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two different strains // Exp. Cell Res. 1965. V. 40. P. 154-158.

60. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells //Nature. 2007. V.448. P. 313-317.

61. Pells S., Di Domenico A.I., Gallagher E.J., Me Whir J. Multipotentiality of neuronal cells after spontaneous fusion with embryonic stem cells and nuclear reprogramming in vitro// Cloning and Stem Cells 2002. V. 4. P. 331-338.

62. Peterson J.A., Weiss M.S. Expression of differentiated functions in hepatoma cell hybrids: Induction of mouse albumin production in rat hepatoma-mouse fibroblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972. V. 69. P. 571-575.

63. Pierce G.B., Stevens L.C., Nakane P.K. Ultrastructural analysis of the early development of teratocarcinomas // J. Natl. Cancer Res. 1967 V. 39. P. 755-773.

64. Pontecorvo G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment // Somatic. Cell Genet. 1976. V. 1. P. 397-400.

65. Pravtcheva D.D., Ruddle F.H. Normal X-chromosome induced reversion in the direction of chromosome segregation in mouse-hamster somatic sell hybrids // Exp. Cell. Res. 1983. V. 148(1). P. 265-272.

66. Prudovsky I.A., Yegorov Y.E., Zelenin A.V. DNA synthesis in the heterokaryons of non-dividing differentiated cells and culture cells with various proliferative potentials // Cell Differ. 1985. V. 17. P. 239-246.

67. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

68. Ringertz N.R., Carisson S.-A., Ege T., Bolund L. Detection of human and chick nuclear antigens in nuclei of chick erythrocytes during reactivation in heteroKaryons with HeLa cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1971. V. 68. P. 3228-3232.

69. Roach M.I., Stock J.L., Byrum R., Koller B.H., McNeish J.D. A new embryonic stem cell line from DBA/llacJ mice allows genetic modification in a murine model of human inflammation //Exp.Cell Res. 1995. V. 221(2). P. 520-525.

70. Robertson E.J., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector // Nature. 1986. V. 323. P. 445-448.

71. Rousset J.-P., Dubois P., Lassere C. Aviles D., Fellows M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mous teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1979. V. 5(6). P. 739-752.

72. Rousset J.P., Bucchini D., Jami J. Hybrids between F9 nullipotent teratocarcinoma and thymus cells produce multidifferentiated tumors in mice // dev. Biol. 1983. V. 96. P. 331-336.

73. Sawicki W., Koprowski H. Fusion of rabbit spermatozoa with somatic cells cultivated in vitro // Exp. Cell Res. 1971. Y. 66. P. 145-151.

74. Schneider J.A., Weiss M.C. Expression of differentiated functions in hepatoma cell hybrids. I. Tyrosine aminotransferase in hepatoma fibroblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1971. Y. 68. P. 127-131.

75. Scholer H.R., Hatzopoulos A.K., Balling R., Suzuki N., Gruss P. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: Evidence for germline-specific expression of an OCT factor // EMBO J. 1989. V. 8. P. 2543-2550.

76. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

77. Solter D., Skreb N., Damjanov I. Extrauterine growth of mouse egg-cylinders results in malignant teratoma // Nature Lond. 1970. V. 227. P. 503-504.

78. Solter D., Knowles B.B. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1) // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 5565-5569.

79. Sorieul S., Ephrussi B. Kariological demonstration of hybridization of mammalian cells in vitro II Nature. 1961. V. 190. P. 653-654.

80. Spencer R.S., Hauschka T.S., Amos D.B., Ephrussi B. Co-dominance of isoantigens in somatic hybrids of murine cells grown in vitro II J. Natl. Canser Inst. 1964. V. 33. P. 893-903.

81. Stevens L.C. The development of transplantable teratocarcinomas from intratesticular grafts of pre- and postimplantation mouse embryos // Dev. Biol. 1970. V. 21. P. 364-382.

82. Stewart, C.L. Formation of viable chimaeras by aggregation between teratocarcinomas and preimplantation mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morph. 1982. Y. 67. P. 167-179.

83. Sukoyan M.A., Vatolin S.Y., Golubitsa A.N., Zhelezova A.I., Semenova L.A., Serov O.L. Embryonic stem cells derived from morulae, inner cell mass, and blastocysts of mink: Comparisons of their pluripotencies // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 148-158.

84. Tada T., Tada M., Hilton K., Barton S.C., Sado T., Takagi N., Surani M.A. Epigenotype switching of imprintable loci in embryonic germ cells // Dev. Gehne Evol. 1998. V. 207. P. 551-561.

85. Tada M., Morizane A., Kimura H., Kawasaki H., Ainscough J.F.X., Sasai Y., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. V. 227. P. 504-510.

86. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N., Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 15531558.

87. Takagi N. Variable X chromosome inactivation patterns in near-tetraploid murine EC x somatic hybrid cells differentiated in vitro II Genetica. 1993. V. 88. P. 107-117.

88. Takashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. V.126. P. 663-676.

89. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. V. 131. P. 861-872.

90. Terada N., Hamazaki T., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion //Nature. 2002. V. 416. P. 542-545.

91. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marsshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

92. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11457-11462.

93. O.L. Dominant manifestation of pluripotrney in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes //Mol. Reprod. Dev. 2007. V. 74. P. 941-951.

94. Watkins J.F., Grace D.M. Studies on the surface antigens of interspecific mammalian cell heterokaryons // J. Cell Sci. V. 2. P. 193-204.

95. Weiss M.C., Green H. Human-mouse cell lines containing partial complements of human chromosomes and functioning human genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V. 58. P. 1104-1111.

96. Wells N.D., McWhir J., Hooper M.L., Wilmut I. Factor influencing the isolation of murine embryonic stem cells // Theriogenology. 1991. V. 35. P. 293.

97. Wernig M., Meissner A., Foreman R., Brambrink T., Ku M., Hochedlinger K., Bernstein B.E., Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state //Nature. 2007. V.448. P. 318-324.

98. Willing M.C., Nienhuls A.W., Anderson W.F. selective activation of human J3- but not y-globin gene in human fibroblast x mouse erythroleukaemia cell hybrids // Nature. 1979. V.277. P. 534-538.

99. Wobus A.M. Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 810-813.

100. Wobus A.M. Potential of embryonic stem cells // Mol Aspects Med. 2001. V. 22(3). P. 149-64

101. Wollweber L., Munste H., Hoffmann S., Siller K., Greulish K.O. Early phase karyotype analysis of chromosome segregation after formation of mouse-mouse hybridomas with chromosome painting probes // Chromosome Res. 2000. V. 8(1). P. 3744.

102. Yamada T., Yoshikawa M., Kanda S. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green // Stem Cells. 2001. V. 20. P. 146-154.

103. Ying Q-L., Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion //Nature. 2002. V. 416. P. 545-548.pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // Science. V. 318. P. 19171920

104. Zelesco P. A., Graves J. A. Hybrids between irradiated and unirradiated mammaliancells: survival and chromosome segregation // J. Cell. Physiol. 1983 V. 116(1). P. 98-102.