Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Пузаков, Михаил Васильевич

• Пузаков, Михаил Васильевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пузаков, Михаил Васильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проблема восстановления потенциала дифференцированной клетки.

1.2. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер.

1.3. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью их слияния с эмбриональными стволовыми клетками.

1.3.1. Классификация клеток обладающих высоким потенциалом.

1.3.2. Получение, поддержание и дифференцировка ЭСК.

1.3.3. Применение ЭСК для изучения генетической регуляции развития и направленного мутагенеза.

1.3.4. Клеточные гибриды между ЭСК и соматическими клетками.

1.4. Методы оценки плюрипотентности ЭСК и гибридных клеток.

1.4.1. Гисто- и иммуногистохимические маркеры.

1.4.2. Анализ экспрессии генов-маркеров плюрипотентности.

1.4.3. Оценка плюрипотентности клеток в тестах in vivo - получение химерных животных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клетки и клеточные линии.

2.2. Культивирование клеток в монослое.

2.3. Замораживание клеток.

2.4. Размораживание клеток.

2.5. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы.

2.6. Оценка активности щелочной фосфатазы.

2.7. Иммуногистохимическое выявление экспрессии ЕСМА7.

2.8. Получение химерных животных.

2.9. Получение эмбриоидных телец in vitro.

2.10. Биохимическое выявление глюкозофосфатизомеразы (ГФИ).

2.11. Выделение ДНК.

2.12. Выделение РНК.

2.13. Синтез кДНК.

2.14. ПЦР-анализ.

2.15. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.16. Рестрикционный анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы в гибридных клетках серии НМС.

3.2. Иммуногистохимический анализ эмбрионального антигена ЕСМА7 в гибридных клетках.

3.3. Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм.

3.4. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в гибридных клетках.

3.5. Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках.

3.6. Инактивация Х-хромосомы при индуцированной in vitro дифференцировке гибридных клеток.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши»

Актуальность. Одной из фундаментальных проблем генетики развития является изучение плюрипотентности - способности клеток к дифференцировке в различные клеточные типы in vitro и in vivo, которая характерна для клеток эмбриона на ранних стадиях развития и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). То, какими механизмами осуществляется контроль над сохранением и утратой этого свойства в процессе дифференцировки клеток, к настоящему времени остается во многом неясным. С этим вопросом связана также не менее важная проблема, касающаяся эпигенетических изменений генома, происходящих при дифференцировке клеток, и возможности репрограммирования генома дифференцированных клеток взрослых животных. Долгое время считалось, что эмбриональные клетки очень рано теряют плюрипотентность, однако было показано, что пересадка ядер дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, в энуклеированные ооциты не препятствует нормальному развитию организма (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998). Таким образом, было установлено, что ядра дифференцированных клеток способны репрограммироваться и даже обеспечить полное развитие организма. Этот метод в последнее время широко применяется в клонировании млекопитающих и является очень эффективным способом репрограммирования ядер дифференцированных клеток. Однако существует альтернативный, не менее эффективный, экспериментальный подход к репрограммированию генома дифференцированных клеток, основанный на использовании высокого потенциала эмбриональных стволовых клеток, при их слиянии с дифференцированными клетками (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001).

В настоящее время ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются "связующим звеном" в исследованиях in vitro и in vivo. При культивировании ЭСК сохраняют плюрипотентные свойства в течение длительного времени. Однако в ЭСК может быть легко индуцирована дифференцировка in vitro с образованием производных трех зародышевых листков. Более того, ЭСК, при введении в бластоцисту, принимают участие в образовании большинства органов и тканей химерных животных, в том числе и гонад (Tarn,

Rossant, 2003). Культуры ЭСК широко используются для исследования ранних этапов дифференцировки, для изучения функции гена и для создания трансгенных животных.

Гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, открывают новые экспериментальные возможности изучения механизмов поддержания плюрипотентности и процессы репрограммирования. Гибридные клетки такого типа сохраняют плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне и, что очень важно, гены дифференцированного партнера репрограммируются в результате взаимодействия с геномом ЭСК (Matveeva et al, 1998; Tada et al, 2001; 2003; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002; Do, Schöler, 2004). Одним из несомненных достоинств такой модельной системы является возможность создания набора гибридных клеток с разным соотношением родительских хромосом. То есть открывается возможность оценить роль индивидуальных хромосом в поддержании плюрипотентности и исследовать способность отдельных хромосом к репрограммированию.

Для изучения плюрипотентности клеток применяют разносторонние методы. Для гисто- и иммуногистохимического анализа плюрипотентности используют маркеры характерные для клеток ВКМ: активность щелочной фосфатазы и поверхностные антигены. Способность участвовать в формировании органов и тканей химерного животного (Tarn, Rossant, 2003), а также в формировании тератом и эмбриоидных телец (Rastan, Robertson, 1985) является наиболее адекватным свидетельством высокого потенциала исследуемых клеток. По наличию экспрессии генов Oct4 и Nanog, генов «плюрипотентности», можно также оценить являются ли клетки плюрипотентными.

В настоящее время практически отсутствуют разработанные методы количественной оценки плюрипотентности, однако использование подобных методов позволило бы больше узнать о том, какое влияние оказывают хромосомы соматического партнера на сохранение плюрипотентности у клеточных гибридов.

В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики были получены внутривидовые клеточные гибриды серии HESS от слияния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток линии НМ-1 мыши линии 129/01а и спленоцитов (клеток селезенки) мыши линии DD/c. Гибридные клетки сохраняли плюрипотентные свойства, характерные для ЭСК, что было доказано тестами in vitro и in vivo (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Таким образом, было показано, что присутствие в клеточных гибридах хромосом дифференцированной клетки не препятствует сохранению плюрипотентности.

В той же лаборатории были получены межвидовые гибриды серии НМС от слияния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M. caroli. Полученные гибридные клоны сохраняли фенотип ЭСК и имели подробно описанный состав хромосом (Пристяжшок и др., 2005). Благодаря этому появилась возможность для более полной оценки плюрипотентности и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом и присутствием хромосом соматического партнера.

Цели и задачи работы.

Цель работы заключалась в оценке плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши Mus musculus и спленоцитов М. caroli.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток in vitro с помощью маркеров, характерных для недифференцированных клеток: активности щелочной фосфатазы и эмбрионального поверхностного антигена ЕСМА7.

2. Сравнить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток в экспериментах in vivo - получение химерных животных, с последующей оценкой вклада гибридных клеток в формирование тканей и органов химер.

3. Изучить в клонах межвидовых гибридных клеток экспрессию генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

4. Сравнить экспрессию родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках и, тем самым, оценить способность к репрограммированию генома дифференцированных клеток взрослого животного.

5. Оценить активность Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Научная новизна.

1. Впервые проведено комплексное исследование плюрипотентности межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток мышей М. musculus линии 129/01а и спленоцитов М. caroli. Для оценки плюрипотентности использовали молекулярные, гисто- и иммуногистохимические маркеры, а также тест на получение химерных животных. Показано, что уровень плюрипотентности в гибридных клетках типа ЭСК-спленоцит мало зависим или полностью независим от числа хромосом соматического партнера в гибридном кариотипе, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак.

2. В данной работе впервые описаны химерные животные, полученные микроинъекционным способом с использованием межвидовых клеточных гибридов серии НМС. Показано сохранение хромосом соматического партнера в потомках гибридных клеток при развитии химерного организма.

3.В гибридных клетках серии НМС впервые проведен анализ активности Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, и показано отсутствие предпочтительной инактивации Х-хромосом при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Практическая значимость. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о процессах поддержания плюрипотентности и репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в НГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XL международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003), на 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 3-м съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2006), на ХЫУ международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006), на международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине», (Новосибирск, 2006).

Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах, содержит 16 рисунков и 8 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Пузаков, Михаил Васильевич

ВЫВОДЫ

1. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток М. musculus со спленоцитами взрослой самки М. caroli, показано присутствие маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам: активность щелочной фосфатазы и присутствие эмбрионального антигена ЕСМА7. По активности щелочной фосфатазы выявлены межклональные различия, возможно обусловленные присутствием разного числа хромосом соматического партнера.

2. Установлено, что клон гибридных клеток, содержащий единичные хромосомы М. caroli, и клоп с высоким содержанием хромосом М. caroli способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных, что является свидетельством сохранения ими плюрипотентпости и, более того, доминирования этого свойства у гибридных клеток.

3. В клонах гибридных клеток показана экспрессия генов-маркеров плюрипотентпости Nanog и Oct4 и реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla М. caroli, неактивных в геноме сгшеноцитов.

4. Анализ экспрессии генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю».

5. Полученные данные свидетельствуют, что клоны гибридных клеток серии НМС сохраняют плюрипотентные свойства на уровне сходным с ЭСК, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Однако в некоторых клонах, такие как НМС6 и НМС44, имеются признаки снижения их потенциала и повышенная склонность к дифференцировке.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пузаков, Михаил Васильевич, 2007 год

1. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов О.Л. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют шпорипотентность. // Докл. РАН, 1996, Т.249, №1, С.129-132.

2. Пристяжшок И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г, Круглова А.А., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках. // Онтогенез, 2005, Т.36, №2, С.150-157.

3. Рингерц II., Сэвидж Р. Гибридные клетки. // "Мир" Москва, 1979, С.191-209.

4. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжшок И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках. // Онтогенез, 2003, Т. 34, №3, С. 216-227.

5. Adler D.A., West J.D., Chapman V.M. Expression of alpha-galactosidase in preimplantation mouse embryos. //Nature, 1977, V.267 (5614), P.838-839.

6. Ambrosi D.J., Tanasijevic В., Kaur A., Obergfell C., O'Neill R.J., Krueger W., Rasmusscn T.P. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embryonic stem cells. // Stem Cells, 2007, V.25, №5, P.l 104-1113.

7. Ambrosi D.J., Rasmussen T.P. Reprogramming mediated by stem cell fusion. // J. Cell Mol. Med., 2005, V.9, P.320-330.

8. Andrews P.W., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic ccll hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cells. // Somat. Cell Genet., 1980, V.6, P.271-284.

9. Artzt K., Jacobs-Cohen R.J., DiMeo A., Alton A.K., Darlington G. Reexpression of a T/t-complex antigen (tl2) in thymocyte x embryonal carcinoma cell hybrids. // Somatic. Ccll Genet., 1981, V.7, P.423-434.

10. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N. and Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. // Genes and Dev., 2003, V.17, №1, P.126-140.

11. Avner P. and Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. // Nat Rev Genet, 2001, V.2, P.59-67.

12. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice. // Mol. Biol. Med., 1989, V.6, P.481-492.

13. Blau H.M., Brazelton T.R. and Weimann J.M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? // Cell, 2001, V.105, P.829-841.

14. Bradley A., Evans M., Kaufman M.H., Robertson E. Formation of germ-line chimeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. // Nature, 1984, V.309, P.255-256.

15. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science, 2000, V.290, P.758-766.

16. Briggs R., King T.J. Nuclear transplantation studies on the early gastrula (Rana pipiens). // Dev. Biol., 1960, V.2, P.252-270.

17. Briggs R., King T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frog' eggs. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1952, V.38, P.455-463.

18. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V.94, P.5709-5712.

19. Buehr M. and McLaren A. An electrophoretically detectable modification of glucosephosphate isomerase in mouse spermatozoa. // J. Reprod. Fert., 1981, V.63, P.169-173.

20. Calarco-Gillam P. Cell-cell interaction in mammalian preimplantation development. // Dev. Biol, a comprehensive synthesis V.2. The cellular basis of morphogenesis. Ed. Browder L.W. Plenum, 1986, P.329-371.

21. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. //Nature, 1996, V. 380, P. 64-66.

22. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. // Cell, 2003, V.l 13(5), P.643-655.

23. Chapman V.M., Shows T.B. Somatic cell genetic evidence for X-chromosome linkage of three enzymes in the mouse. // Nature, 1976, V.259, P.665-667.

24. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells. // Nat. Biotechnol., 1998, V.16, P.642-646.

25. Cowan A., Atienza J., Melton D., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with embryonic stem cells. // Science, 2005, V.309, P.1369-1373.

26. DeLorenzo R.J., Ruddle F.H. Genetic control of two electrophoretic variants of glucose phosphate isomerase. // Biochem. Genet., 1969, V.3, P.151-162.

27. Di Berardino M.A. Genomic potential of differentiated cells. // Columbia University Press, New York, 1997, 386 p.

28. Do J.T., Scholcr H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. // Stem Cells, 2004, V.22, P.941-949.

29. Doetschman T., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. // J. Embryol. Exp. Morph, 1985, V.87, P.27-45.

30. Doetschman T, Maeda N, Smithies O. Targeted mutation of the Hprt gene in mouse embryonic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, V.85(22), P.8583-8587.

31. Edwards M.K.S., Harris J.F. and McBurney M.W. Induced muscle differentiation in an embryonal carcinoma cell line. // Molecular and Cellular Biology, 1983, V.3, N.12, P.2280-2286.

32. Everett C.A., West J.D. Evidence for selection against tetraploid cells in tetraploid <-» diploid mouse chimeras before the late blastocyst stage. // Genet. Res., 1998, V.72, P.225-228.

33. Everett C.A. and West J.D. The influence of ploidy on distribution of cells in chimaeric mouse blastocysts. // Zigote, 1996, V.4, P.59-66.

34. Farivar, S., Yamaguchi, S., Sugimoto, M., Takagi, N. X-chromosome inactivation in differentiating mouse embryonic stem cells carrying X-linked GFP and lacZ transgenes // Int. J.Dev. Biol., 2004, V.48, P.629-635.

35. Flechon J.-E. What are ES cells? // In Transgenic Animals: Generation and Use, 1995, P.157-166.

36. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K., Nosek J. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell Dif, 1984, V.15, P.229-234.

37. Freeman T.C., Dixon A.K., Campbell E.A., Tait T.M., Richardson P.J., Rice K.M., Maslen G.L., Metcalfe A.D., Streuli C.H., Bentley D.R. Expression Mapping of Mouse Genes. // MGI Direct Data Submission, 1998.

38. Galli R., Borello U., Gritti A., Minasi M.G., Bjornson C., Coletta M., Mora M., De Angelis M.G., Fiocco R., Cossu G., Vescovi A.L. Skeletal myogenic potential of human and mouse neural stem cells. // Nat. Neurosci., 2000, V.3, P.986-991.

39. Gossler A., Joyner A.L., Rossant J., Skarnes W.C. Mouse embryonic stem cells and report constructs to detect developmentally regulated genes. // Science, 1989, V.28, P.463-465.

40. Grover A., Oshima R.G. and Adamson E.D. Epithelial layer formation in differentiating aggregates of F9 embryonal carcinoma cells. // The Journal of Cell Biology, 1983, V.96, P.1690-1696.

41. Hadjantonakis A.-K., Macmaster S. and Nagy A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. // BMC Biotechnology, 2002, V.2, P.l 1.

42. Hahnel A.C., Rappolee D.A., Millan J.L., Manes T., Ziomek C.A., Theodosiou N.G., Werb Z., Pedersen R.A. and Schultz G.A. Two alkaline phosphatase genes are expressed during early development in the mouse embryo. // Development, 1990, V.110, P.555-564.

43. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human. // Dev Dyn, 2004, V.230 (1), P.187-198.

44. Hatano S.-Y., Tada M., Kimura H., Yamaguchi S., Kono T., Nakano T., Suemori II., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. // Mechanisms of Development, 2005, V.123, P.67-79.

45. Hollands P. Embryonic stem ccll grafting: the therapy of the future? // Hum. Reprod., 1991. V.6(l). P.79-84.

46. Hong Y., Winkler C., Schartl M. Production of mcdakafish chimeras from a stable embryinic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, V.95, P.3679-3684.

47. Hooper M.L. Metabolic co-operation between mammalian cells in culture. // Biochimica et Biophysica Acta, 1982, V.657, P.85-103.

48. Iannacone P.M., Taborne G.U., Garton R.L., Caplice M.D., Brenin D.R. Pluripotent embryonic stem cells from rat are capable of producing chimeras. // Dev. Biol. 1994. V. 163. P. 288-292.

49. Jones-Villenneuve E.M.V., McBurney M.W., Rogers K.A. and Kalnins V.I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells differentiate into neurons and glial cells. // The Journal of Cell Biology, 1982, V.94, P.253-262.

50. Jones-Villeneuve E.M., Rudnicki M.A., Harris J.F., McBurney M.W. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. // Mol. Cell Biol., 1983, V.3(12), P.2271-2279.

51. Kamachi Y., Uchikawa M., and Kondoh H. Pairing SOX off. // Trends Genet., 2000, V. 16, №4, P. 182-187.

52. Kawase E., Suemori H., Takahashi N., Okazaki K., Hashimoto K., Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. // Int. J. Dev. Biol. 1994. V. 38 (2). P.385-390.

53. Kimura H., Tada M., Hatano S., Yamazaki M., Nakatsuji N, Tada T. Chromatin rcprogramming of male somatic cell-derived Xist and Tsix in ES hybrid cells. // Cytogenet. Genome Res., 2002, V.99, P. 106-114.

54. Lallemand Y., Brulet P., An in situ assessment of the routes end extents of colonization of the mouse embryo by embryonic stem cells and their descendants. // Development, 1990, V.l 10, P.1241-1248.

55. Latham K.E. Mechanisms and control of embryonic genome activation in mammalian embryos. // Int. Rev. Cytol., 1999, V.193, P.71-124.

56. Lawson K.A. and Hage W.J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. // In Germline Development Ciba Foundation Symposium, 1994, V.182, P.68-91.

57. Ledermann B., K. Burki. Establishment of a germ-line competent C57BL/6 embryonic stem cell line. //Exp. Cell. Res. 1991. V. 197. P. 254-258.

58. Lee J.T. and Jaenisch R. Long-range cis-effects of ectopic X-inactivation centers on a mouse autosome. // Nature, 1997, V.386, P.275-279.

59. Lo C.W., Coulling M. and Kirby C. Tracking of mouse cell lineage using microinjected DNA sequences: analysis using genomic Southern blotting and tissue-section in situ hybridization. // Differentiation, 1987, V.35, P.37-44.

60. Low M.G. and Saltiel A.R. Structural and functional roles of glycosyl-phosphatidylinositol in membranes. // Scicnce, 1988, V.239, P.268-275.

61. Lyko F., Paro R. Chromosomal elements conferring epigenetic inheritance. // BioEssays., 1999, V.21, P.824-832.

62. Magin T.M., McWhir J., Melton D.W. A new mouse embryonic stem ccll line with good germ line contribution and gene targeting frequency. // Nucl. Acid. Res., 1992, V.20, P.3795-3796.

63. Martin G.R. and Evans M.J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, V,72, N.4, P.1441-1445.

64. Matsui Y., Zsebo K. and Hogan B.L. Derivation of pluripotcntial embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell, 1992, V.70, P.841-847.

65. McBurney MW. Hemoglobin synthesis in cell hybrids formed between teratocarcinoma and Friend erythroleukemia cells. // Cell, 1977, V.12, P.653-662.

66. McBurney MW, Featherstone MS, Kaplan H. Activation of teratocarcinoma-derived hemoglobin genes in teratocarcinoma-Friend cell hybrids. // Cell, 1978, V.15, P.1323-1330.

67. McBurney M.W., Jones-Villeneuve E.M., Edwards M.K., Anderson P.J. Control of musclc and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line.//Nature, 1982, V.299(5879), P.165-167.

68. McGrath J., Solter D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. II Science, 1984, V.226, P.1317-1319.

69. McKinnell R.G. Intraspecific nuclear transplantation in frogs. // J.Hered., 1962, V.53, P.199-207.

70. Miller R.A., Ruddle F.II. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids. // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

71. Miller RA, Ruddle FH. Properties of teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids. // Somat. Cell Genet., 1977, V.3, P.247-261.

72. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segavva K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epibiast and ES cells. // Cell, 2003, V.l 13(5), P.631-642.

73. Moens A., Flechon B., Degrouard J., Vignon X., Ding J., Flechon J.-E., Bctteridge K.J., Renard J.-P. Ultrastructural and immunocytochemical analysis of diploid germ cells isolated from fetal rabbit gonads // Zygote, 1997, V.5, P.47-60.

74. Morcau J.F., Donaldson D.D., Bennett F., Witek-Giannotti J., Clark S.C., Wong G.G. Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells. // Nature, 1988, V.336, P.690-692.

75. Mummery C.L., Feyen A., Freund E., Shen S. Characteristic of cmbryonic stem cell differentiation: a comparison with two embryonal carcinoma cell lines. // Cell Diff. Devel., 1990, V.30, P.195-206.

76. Nagy A., Gocza E., Diaz E.M., Prideaux V.R., Ivanyi E., Markkula M., Rossant J. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. // Development, 1990, V. 110, P.815-821.

77. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture derived mice from early-passage cmbryonic stem cells. // I'roc. Natl. Acad. Sci USA, 1993, V.90 (18), P.8424-8428.

78. Narisawa S., Frohlander N., Millan J.L. Inactivation of two mouse alkaline phosphatase genes and establishment of a model of infantile hypophosphatasia. // Dev. Dyn., 1997, V.208(3), P.432-46.

79. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K, Niwa H, Klewe-Nebenius D, Chambers I, Scholer H, Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo on the POU transcription factor Oct4. II Cell, 1998, V.95, P.379-391.

80. Niwa II., Miyazaki J. and Smith A.G. Quantitative expression oCOct-3/4 defines differetiation, ddifferentiation of self-renewal of ES cells. // Nature Genetics, 2000, V.24, N.4, P.372-376.

81. Pain B., Clark M.E., Shen M., Nakazavva H., Sakura M., Samarut J., Etches R.J. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities // Development, 1996, V.122, P.2339-2348.

82. Panning, B., Dausman, J., Jaenisch, R. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization. // Cell, 1997, V.90(5), P.907-916.

83. Pells, S., Di Domenico, A.I., Gallagher, E.J., McWhir, J. Multipotentiality of neuronal cells after spontaneous fusion with embryonic stem cells and nuclear reprogramming in vitro. // Cloning Stem Cells, 2002, V.4, P.331-338.

84. Pesce M., Gross M.K., Schöler II.R. In line with our ancestors: Oct4 and the mammalian germ. //Bioessays, 1998, V.20, P.722-732.

85. Pesce M., Schöler H.R. Oct4: Gatekeeper in the biginnings of mammalian development // Stem Cells, 2001 V.19. P.271-278.

86. Piedrahita J.A., Anderson G.B., BonDurant R.H. On the isolation of embryonic stem cells: comparative behavior of murine, porcine and ovine embryos // Thcrigenology. 1998. V. 34. P. 879-891.

87. Prelle K., Vassiliev I.M., Vassilieva S.G., Wolf E., Wobus A.M. Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species present status and future prospects. // Cells Tissues Organs, 1999, V.165, P.220-236.

88. Prelle K., Zink N. and Wolf E. Pluripotent stem cells model of embryonic development, tool for gene targeting, and basis of cell therapy. // Anat. Histol. Embryol., 2002, V.31, P.169-186.

89. Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Kruglova A.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Visible and "cryptic" segregation of parental chromosomes in embryonic stem hybrid cells. // Russian J. Develop. Biol., 2005, V.36, P.119-126.

90. Rastan S., Robertson E.J. X-chromosome deletions in embryo-derived (EK) cell lines associated with lack of X-chromosome inactivation. // J. Embryol. Exp. Morphol, 1985, V.90, P.379-388.

91. Rcsnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P.L. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. //Nature, 1992, V.359, P.550-551.

92. Risau W., Sariola H., Zerwes H.G., Sasse J., Ekblom P., Kemler R., Doetschman T. Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic-stem-cell-derived embryoid bodies. II Development, 1988, V.102(3), P.471-478.

93. Roach M.L., Stock J.L., Byrum R., Koller B.H., McNeish J.D. A new embryonic stem cell line from DBA/llacJ mice allows genetic modification in a murine model of human inflammation. //Exp.Cell Res., 1995, V.221(2), P.520-525.

94. Robertson E.J., Conlon F.L., Barth K.S., Costantini F., Lee J.J. Use of embryonic stem cells to study mutations affecting postimplantation development in the mice. // Ciba. Found. Symp., 1992, V.165, P.237-250.

95. Robertson E., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. // Nature, 1986, V.323, P.445-448.

96. Robertson E.J. Embryo-derived stem cell lines. Teratocarcinomas and embryonic stem cells. A practical approach. // Oxford: IRL Press, 1987, P.71-112.

97. Rossant J., Croy B.A., Clark D.A., Chapman V.M. Interspecific hybrids and chimcras in mice. //J. Exp. Zool, 1983, V.228(2), P.223-233.

98. Rossant J., McBurney M.W. The developmental potential of a euploid male teratocarcinoma cell line after blastocyst injection. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1982, V.70, P.99-112.

99. Rousset J.P., Bucchini D., Jami J. Hybrids between F9 nullipotent teratocarcinoma and thymus cells produce multidifferentiated tumors in mice. // Dev. Biol., 1983, V.96, P.331-336.

100. Rousset J-P., Jami J., Dubois P., Aviles D., Ritz E. Developmental potentialities and surface antigens of mouse teratocarcinoma-lymphoid cell hybrids. // Somat. Cell Genet., 1980, V.6, P.419-433.

101. Rousset J.P., Dubois P., Lasserre C., Aviles D., Fellous M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mous teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids. // Somatic Cell Genet., 1979, V.5(6), P.739-752.

102. Schaap G.H., Devilee P., van Klaveren P., Jongkind F. Gene expression in flow sorted mouse teratocarcinoma-human fibroblast heterokaryons. // Differentiation, 1984, V.26, P.127-133.

103. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development. // Trends. Genet., 1991, V.7, P.323-329.

104. Selfridge J., Pow A.M., McWhir J., Magin T.M., Melton D.W. Gene targeting using a mouse IIPRT minigene/HPRT-deficient embryonic stem cell system: inactivation of the mouse ERCC-1 gene. // Somat Cell Mol Genet, 1992, V.18(4), P.325-336.

105. Shen C.N., Slack J.M. and Tosh D. Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver. // Nat. Cell Biol., 2000, V.2, P.879-887.

106. Shiels P.G, Kind A.J, Campbell K.H, Waddington D, Wilmut I, Colman A, Schnieke A.E. Analysis of telomere lengths in cloned sheep. // Nature, 1999, V.399, P.316-317.

107. Shuman R.M. Production of transgenic birds. // Experientia, 1991, V.47 (9), P.897-905.

108. Smith A.G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. // J. Tiss. Cult. Meth., 1991, V.13, P.89-94.

109. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogere D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. // Nature, 1988, V.336, P.688-690.

110. Soltcr D. Dolly is a clone and no longer alone. // Nature, 1998, V.394, P.315.

111. Solter D. Role of cell surface molecules in mammalian development. // Progr. Immunol. V.6, 6lh Int. Congress Immunol., 1986, P. 1070-1078.

112. Stewart C.L., Gadi I. and Bhatt II. Stem cell from primordial germ cells can reenter the gene line. // Dev. Biol., 1994, V.161, P.626-628.

113. Strelchenko N. Bovine pluripotent stem cells. // Theriogcnology, 1998, V.45, P.131-140.

114. Strickland S., Mahdavi V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. // Cell, 1978, V.15 (2), P.393-403.

115. Studer L., Csete M., Lee S.-H., Kabbani N., Walikonis J., Wold B., McKay R. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergetic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. // J. Neurosci., 2000, V.20, P.7377-7383.

116. Sun L., Bradford C.S., Ghosh C., Collodi P. ES-like cell cultures derived from early Zebrafish embryos // Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1995, V.4, P.193-199.

117. Surani, M.A. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. // Nature, 2001, V.414, P.122-128.

118. Tada M., Tada T., Lefebvre L., Barton S.C, Surani M.A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. // The EMBO Journal., 1997, V.15, P.6510-6520.

119. Tada M., Morizane A., Kimura IT, Kawasaki H., Ainscough J.F.X., Sasai Y., Nakatsuji N. and Tada T. Plutipotency of reprogrammed somatic genomes inembryonic stem hybrid cells. // Developmental Dynamics, 2003, V.227, P.504-510.

120. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N. and Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. // Current Biology, 2001, V.l 1, P.1553-1558.

121. Takagi, N. Requirement of mitoses for the reversal of X-inactivation in cell hybrids between murine embrynal carcinoma and normal thymocytes. // Exp. Cell Res., 1988, V.175, P.363-375.

122. Talbot N.C., Rexroad C.E.Jr., Pursel V.G., Powell A.M. Alkaline phosphotase of pig and sheep epiblast cells in culturc. // Mol. Rcprod. And Devel., 1993, V.36, P.139-147.

123. Tam P.P.L. and Rossant J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. // Development, 2003, V.130, P.6155-6163.

124. Terada N., Hamazaki T., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E. and Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. // Nature, 2002, V.416, P.542-545.

125. Thomson J.A., Kalishman J., Golos T.G., Durning M., Harris C.P., Hearn J.P. Pluripotcnt cell lines derived from common marmoset (Callithrix jacchus) blastocysts. // Biol.Rcprod., 1996, V.55, P.254-259.

126. Thomson J.A., Itskovitz-Eldon J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst. // Sciencc, 1998, V.282, P.l 145-1147.

127. Thomson J.A., Kalishman J., Golos T.G., Durning M., Harris C.P., Becker R.A., Hearn J.P. Isolation of primate embryonic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, V.92, P.7844-7848.

128. Tsunoda Y, Tokunaga T, Imai II, Uchida T. Nuclcar transplantation of male primordial germ cells in the mouse. //Development, 1989, V.l07, P.407-411.

129. Tsunoda Y., KatoY. Nuclear transplantation of embryonic stem cells in mice. // J. Reprod. Fertil., 1993, V.98, P.537-540.

130. Wakayama T., Perry A.C.F., Zuccotti M., Jihnson K.R., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. //Nature, 1998, V.394, P.369-379.

131. Wells D.N., Misika P.M., Day T.A., Tervit H.R. Production of cloned lambs from an established embryonic cell line: A comparison between in vivo- and in vitro-matured cytoplasts. // Biol. Reprod., 1997, V.57, P.385-393.

132. Wells D.N., Misika P.M., Tervit H.R. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa cells. // Biol. Reprod., 1999, V.60, № 4, P.996-1006.

133. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review. // Reprod. Fert. Dev., 1994, V.6, P.563-568.

134. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. // Nature, 1997, V.385, P.810-813.

135. Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo. // Exptl. Cell Res., 1984, V.152, P.810-813.

136. Wolffe A.P., Matzke M.A. Epigenetics: regulation through repression. // Science. 1999. V.286.P. 481-486.

137. Wood S.A., Pascoe W.S., Schmidt C., Kemler R., Evans M.J., Allen N.D. Simple and efficient production of embryonic stem cell-embryo chimeras by co-culture. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, V.90, P.4582-4585.

138. Ying Q.-L., Nichols J., Evans P.E. and Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion. // Nature, 2002, V.416, P.545-548