Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Баттулин, Нариман Рашитович

• Баттулин, Нариман Рашитович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Баттулин, Нариман Рашитович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Плюрипотенгность клеток и репрограммирование

1.2. Репрограммирование в нормальном развитии млекопитающих

1.2.1. Репрограммирование в раннем развитии млекопитающих

1.2.2. Репрограммирование в гаметогенезе

1.3. Методы экспериментального репрограммирования генома

1.3.1.Репрограммирование генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер в энуклеированные ооциты

1.3.2. Репрограммирование генома соматических клеток при образовании ИПС клеток

1.3.3. Репрограммирование генома при слиянии соматических и плюрипотентных клеток

1.3.3.1. Гибридные клетки типа клетка эмбриональной карциномы - соматическая клетка

1.3.3.2. Гибридные клетки типа эмбриональная терминальная клетка - соматическая клетка

1.3.3.3. Гибридные клетки типа эмбриональная стволовая клетка — соматическая клетка

1.4. Репрограммирование генома в гибридных клетках

1.5. Транскрипционные факторы — ключевые регуляторы плюрипотентного статуса клеток

1.6. Lamin А/С

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клетки и клеточные линии

2.2. Выделение ДНК

2.3. Работа с РНК

2.3.1. Выделение РНК

2.3.2. Обработка РНК ДНКазой

2.3.3. Синтез кДНК

2.4. Полимеразная цепная реакция

2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.7. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.8. Бисульфитное секвенирование ДНК

2.8.1 Бисульфитная модификация ДНК

2.8.2. ПЦР с вложенными праймерами

2.8.3. Субклонирование фрагментов ДНК

2.9. Микробиологические методы

2.9.1. Приготовление компетентных клеток E.coli

2.9.2. Трансформация компетентных клеток E.coli

2.10. Выделение фрагментов ДНК из гелей

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Экспрессия генов - молекулярных маркеров плюрипотентности Oct! и Nanog в гибридных клетках

3.2. Экспрессия молекулярного маркера дифференцированных клеток гена Lmna в гибридных клетках

3.3. Поиск аллель-специфичных сайтов рестрикции для дискриминации транскриптов разного родительского происхождения

3.4. Экспрессия родительских аллелей гена Oct4 и Nanog в гибридных клетках

3.6. Определение последовательности 5'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna М. caroli

3.7. Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках и спленоцитах

3.8. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в эмбриональных стволовых гибридных клетках

3.9. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, полученных из эмбриональных стволовых гибридных клеток

3.10. Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в ЭС клетках и спленоцитах

3.11. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках

3.12. Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Lmna в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных стволовых гибридных клетках

3.13. Экспрессия тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях взрослых химер

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках»

Актуальность. Восстановление плюрипотентности в дифференцированных клетках и связанные с ним процессы репрограммирования генома являются одними из актуальных проблем современной биологии. Исследования, посвященные данной проблеме, помимо прикладных аспектов, таких как получение иммуносовместимых клеток для трансплантологического лечения различных заболеваний, тесно связаны с другими фундаментальными проблемами биологии (регуляция дифференциальной активности генов, регуляция процессов индивидуального развития и др.). В нормальном развитии эмбриональные клетки при дифференцировке теряют свой изначальный высокий потенциал - плюрипотентность, в результате чего специализированные клетки лишены способности к превращению в другие типы клеток. Долгое время считалось, что утрата плюрипотентности необратима, однако в опытах на амфибиях и млекопитающих было показано, что ядра дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, после пересадки в энуклеированные ооциты способны обеспечить полное развитие организма (Di Berardino, Orr, 1992; Wilmut et al, 1997; Wakayama et al, 1998). Эти данные показали, что ядра некоторых дифференцированных клеток могут быть репрограммированны цитоплазматическими факторами ооцита. На сегодняшний день, помимо метода переноса ядер, существует еще два метода репрограммирования клеток взрослого организма. Это метод слияния эмбриональных стволовых (ЭС) и дифференцированных клеток (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2003; Cowan et al., 2005; Ambrosi et al, 2007) и метод получения индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток, основанный на эктопической экспрессии небольшого числа транскрипционных факторов в культуре соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Maherali et al, 2007; Okita et al, 2007; Wernig et al, 2007). Обе технологии показали высокую эффективность репрограммирования геномов многих типов дифференцированных клеток от фибробластов до В- и Т-лимфоцитов (Hong et al., 2009). Каждый из методов экспериментального репрограммирования клеток имеет свои преимущества и ограничения. Исследование молекулярных механизмов репрограммирования в гибридных клетках предоставляет более широкие возможности, нежели метод переноса ядер в энуклеированные ооциты, поскольку имеется возможность собрать достаточное для анализа количество материала. В отличие от получения ИПС клеток, ЭС клетки при слиянии содержат все необходимые для правильного репрограммирования факторы, в том числе и неидентифицированные. Однако после объединения геномов родительских клеток в ядре гибридной клетки, становится сложно следить за изменениями генной активности и эпигенетических модификаций геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

Попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток была впервые предпринята в 1996 году. С этой целью плюрипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами, клетками селезенки, взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми со свойствами ЭС клеток (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Позднее эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al., 2001; Tada et al, 2003), незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза (Terada et al., 2002) и нейрогенеза (Ying et al., 2002). При слиянии ЭС клеток человека с фибробластами человека, также отмечается высокий уровень плюрипотентности гибридных клеток, сходный с потенциалом родительских ЭС клеток (Cowan et al., 2005). Высокий потенциал эмбриональных стволовых гибридных клеток подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭС клеток. Тот факт, что в гибридах типа ЭС клетка - дифференцированная клетка проявляются лишь свойства плюрипотентного партнера, предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Однако прямых доказательств этого на сегодняшний день не так много. Свидетельства репрограммирования эпиаллелей соматического партнера (эпиаллелями называются аллели, дифференциальная активность которых обусловлена различием эпигенетических модификаций, приобретенных в процессе индивидуального развития) были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов М. musculus molossinus (Tada et al., 2001; Tada et al, 2003; Hatano et al, 2005). Указанием на масштабное репрограммирование генома соматического партнера могут служить данные, полученные с помощью полногеномного анализа транскрипции в гибридных клетках типа ЭС клетка -фибробласт (Cowan et al., 2005; Ambrosi et al, 2007). В этих работах было показано, что по профилю генной активности гибридные клетки сильно отличаются от фибробластов, но имеют сходство с ЭС клетками. Тем не менее, в этих исследованиях отсутствуют прямые доказательства репрограммирования соматического генома в гибридных клетках, поскольку авторы не имели возможности различать аллели разного родительского происхождения.

В исследованиях последних лет были определены транскрипционные факторы, ответственные за поддержание плюрипотентности ЭС клеток и клеток ранних эмбрионов млекопитающих. В настоящее время считается, что ключевыми звеньями сложной генной сети, регулирующей плюрипотентный статус, являются гены Oct4, Nanog и Sox2 (Chambers, Smith, 2004). Показано, что эти гены играют важную роль и в процессах репрограммирования соматических клеток (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al, 2007), так эктопической экспрессии фактора Oct4 достаточно для превращения нервной клетки в плюрипотентную (Kim et ah, 2009), а неполная реактивация гена Oct4 соматического ядра приводит к гибели клонированных эмбрионов мыши на ранних стадиях развития (Yamazaki et al, 2006). Поэтому большое внимание уделяется изучению процессов, сопровождающих реактивацию «генов плюрипотентности», таких как Oct4 и Nanog, при репрограммировании геномов дифференцированных клеток. Важная роль в регуляции активности этих генов отводится эпигенетическим модификациям генома, таким как метилирование ДНК и модификации гистонов.

Необходимым условием репрограммирования генома является не только активация «генов плюрипотентности», но также и подавление активности тканеспецифичных генов, активных в дифференцированных клетках. К такой категории генов, экспрессия которых характерна для всех типов дифференцированных клеток, относится ген белка ядерной ламины - lamin А/С (Lmna) (Constantinescu et al., 2006). На сегодняшний день не опубликовано работ, в которых исследовалась бы экспрессия этого гена в процессе репрограммирования дифференцированных клеток.

В связи с необходимостью различать аллели родительских геномов при исследовании процессов репрограммирования, особый интерес представляют межвидовые гибридные клетки. В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН были получены межвидовые гибриды от слияния плюрипотентных ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши М. caroli. Полученныеклоны гибридных клеток, кариотип которых детально описан (Matveeva et al., 2005; Пристяжнюк и др., 2005), имеют фенотип и ростовые характеристики, сходные с ЭС клетками. Межвидовая вариабельность гомологичных последовательностей ДНК позволяет надежно различать аллели плюрипотентного и соматического партнеров в гибридных клетках. Благодаря этому появилась возможность изучения молекулярных механизмов репрограммирования генома соматической клетки и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом гибридных клеток и присутствием хромосом соматического партнера.

Цели и задачи исследования

Цель работы заключалась в оценке репрограммирования генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, а также гена Lmna, экспрессия которого характерна всех типов дифференцированных клеток, в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli. А также в оценке репрограммирования тканеспецифичных генов при дифференцировке гибридных клеток в составе химерного животного.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить первичную структуру фрагментов генов Oct4 и Nanog М. caroli и провести поиск видоспецифичных сайтов узнавания рестриктаз, позволяющих различать видовую принадлежность транскриптов этих генов в гибридных клетках.

2. Исследовать экспрессию эпиаллелей генов Oct4, Nanog спленоцита в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.

3. Определить первичную структуру 5'-регуляторных областей генов Oct4, Nanog и Lmna М. caroli.

4. Провести сравнительный анализ метилирования 5-регуляторных областей эпиаллелей генов Oct4, Nanog и Lmna в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках.

5. Провести сравнительный анализ метилирования 5-регуляторной области эпиаллелей гена Oct4 при дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных клеток в условиях in vivo (формирование тератом).

6. Оценить экспрессию тканеспецифичных генов с аллелей соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей линии C57BL.

Научная новизна.

1. В работе впервые проведено детальное исследование уровня метилирования 5'-регуляторных областей родительских аллелей генов Oct4 и Nanog в эмбриональных стволовых гибридных клетках. Показано, что реактивация эпиаллелей соматического партнера генов Oct4 и Nanog сопровождается деметилированием их 5-регуляторных областей.

2. Впервые исследовано метилирование 5'-регуляторной области гена Oct4 в тератомах, развившихся из эмбриональных стволовых гибридных клеток. Показано, что диффернцировка гибридных клеток сопровождается гиперметилированием 5-регуляторной области гена Oct4, уровни метилирования родительских аллелей не различаются.

3. Получены новые данные о метилировании 5'-ре1уляторной области гена Lmna в ЭС клетках и фибробластах мыши. Показано, что метилирование района от -300 п.н. до -94 п.н. гена Lmna (относительно первого кодона) поддерживается на одном уровне вне зависимости от того, находится ли ген в активном или репрессированном состоянии.

4. В работе впервые проведена оценка экспрессии тканеспецифичных генов соматического партнера в тканях химер, полученных введением эмбриональных стволовых гибридных клеток в бластоцисты мышей. Показано, что репрограммированные гены соматического партнера экспрессируются тканеспецифичным образом в органах химерного животного.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют наши знания о процессах репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 2007 г.), на международной конференции 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells (Фошань, Китай, 2008 г.), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009 г.).

По теме диссертации опубликованы 3 работы. Две - в рецензируемых зарубежных журналах и одна — в рецензируемом отечественном журнале.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. В работе использованы: гибридные клетки серии НМС, полученные Н.М. Матвеевой, тератомы, полученные А.А. Васильковой, и химерная мышь № 6-17, полученная Е.А. Кизиловой.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 18-ю рисунками и содержит 4 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Баттулин, Нариман Рашитович

ВЫВОДЫ

1. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в межвидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus и спленоцитов М. caroli, показал, что эпиаллели генов Oct4 и Nanog спленоцита реактивируются, что является одним из признаков процесса репрограммирования генома спленоцита.

2. Реактивация эпиаллелей генов Oct4 и Nanog спленоцита в эмбриональных стволовых гибридных клетках сопроволсдается деметилированием 5'-регуляторной области этих генов до уровня, характерного для 5'-регуляторной области Oct4 и Nanog в ЭС клетках. Полученные данные свидетельствуют о том, что репрограммирование генома дифференцированной клетки сопровождается изменением эпигенетического статуса генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

3. При дифференцировке эмбриональных стволовых гибридных в тератомах, образовавшихся в местах введения гибридных клеток иммунодефицитным мышам, происходит гиперметилирование 5'-регуляторпой области гена Oct4, причем уровни метилирования эпиаллелей спленоцита и ЭС клетки не имели существенных различий.

4. Исследование экспрессии гена Lmna, а также уровня метилирования его 5'-регуляторной области в ЭС клетках, фибробластах и эмбриональных гибридных клетках показало, что экспрессия эпиаллеля гена Lmna спленоцита подавляется в гибридных клетках, причем это подавление не связано с изменением метилирования 5'-регуляторной области тепа Lmna.

5. Исследование экспрессии тканеспецифичных генов Alb, Bdh2, Ager, Des, Nefh и Cdx2 в органах взрослой химерной мыши, полученной введениемгибридных клеток клона НМС29-3 в бластоцисты мышей линии C57BL, показало, что эпиаллель гена Des спленоцита экспрессируется тканеспецифичным образом в тонком кишечнике химерной мыши. Активность эпиаллелей генов Alb, Bdh2, Ager, Nefh и Cdx2 спленоцита не была выявлена, по-видимому, из-за невысокой доли потомков гибридных клеток в органах химерной мыши.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Баттулин, Нариман Рашитович, 2010 год

1. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов O.JI. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют плюрипотентность // Докл. РАН. 1996. V. 249. № 1. Р. 129132.

2. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г, Круглова А.А., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Y. 36. № 2. Р. 150-157.

3. Пузаков М.В. Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши : автореферат дис. кандидата биологических наук : 03.00.15. М.: 2007. С.

4. Jakob Н., Boon Т., Gaillard J., Nicolas J., Jacob F. Teratocarcinoma of the mouse: isolation, culture and properties of pluripotential cells. // Ann. Microbiol. (Paris). 1973. V. 124. № 3. P. 269-282.

5. Ambrosi D.J., Tanasijevic В., Kaur A., Obergfell C., O'Neill R.J., Krueger W., Rasmussen T.P. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embiyonic stem cells // Stem Cells. 2007. V. 25. № 5. P. 1104-1113.

6. Andrews P.W., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic cell hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cells // Somatic Cell Genet. 1980. V. 6. №2. P. 271-284.

7. Aoi Т., Yae К., Nakagawa M., Ichisaka Т., Okita K.5 Takahashi К., Chiba Т., Yamanaka S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells // Science. 2008. V. 321. № 5889. P. 699-702.

8. Artzt K., Jacobs-Cohen R.J., DiMeo A., Alton A.K., Darlington G. Reexpression of a T/t-complex antigen (tl2) in thymocyte x embryonal carcinoma cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1981. V. 7. № 4. P. 423-434.

9. Atsumi Т., Shirayoshi Y., Takeichi M., Okada T.S. Nullipotent teratocarcinoma cells acquire the pluripotency for differentiation by fusion with somatic cells // Differentiation. 1982. V. 23. № 1. P. 83-86.

10. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N., Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function // Genes Dev. 2003. V. 17. № 1. p. 126-140.

11. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. 2002. V. 16. № 1. P. 6-21.

12. Briggs R., King T.J. Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1952. V. 38. № 5. P. 455463.

13. Caiafa P., Zampieri M. DNA methylation and chromatin structure: the puzzling CpG islands // J Cell Biochem. 2005. Y. 94. № 2. P. 257-265.

14. Campbell K.H., Alberio R., Choi I., Fisher P., Kelly R.D., Lee J.H., Maalouf W. Cloning: eight years after Dolly // Reprod. Domest. Anim. 2005. V. 40. № 4. P. 256268.

15. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line //Nature. 1996. V. 380. № 6569. P. 64-66.

16. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Ceil. 2003. V. 113. № 5. P. 643-655.

17. Chambers I., Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Oncogene. 2004. V. 23. № 43. P. 7150-7160.

18. Chapman V., Forrester L., Sanford J., Hastie N., Rossant J. Cell lineage-specific undermethylation of mouse repetitive DNA//Nature. 1984. V. 307. № 5948. P. 284286.

19. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 15. P. 2990-2997.

20. Constantinescu D., Gray H.L., Sammak P.J., Schatten G.P., Csoka A.B. Lamin А/С expression is a marker of mouse and human embryonic stem cell differentiation // Stem Cells. 2006. V. 24. № 1. P. 177-185.

21. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. № 5739. P. 1369-1373.

22. Darr H., Mayshar Y., Benvenisty N. Overexpression of NANOG in human ES cells enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features // Development. 2006. V. 133. № 6. P. 1193-1201.

23. Davis R.L., Weintraub H., Lassar A.B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts // Cell. 1987. V. 51. № 6. P. 987-1000.

24. Di Berardino M.A., Orr N.H. Genomic potential of erythroid and leukocytic cells of Rana pipiens analyzed by nuclear transfer into diplotene and maturing oocytes // Differentiation. 1992. V. 50. № 1. P. 1-13.

25. Do J.T., Scholer H.R. Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential // Reprod. Fertil. Dev. 2005. V. 17. № 1-2. P. 143-149.

26. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 6. P. 941-949.

27. Eggan K., Baldwin K., Tackett M., Osborne J., Gogos J., Chess A., Axel R., Jaenisch R. Mice cloned from olfactory sensory neurons // Nature. 2004. V. 428. № 6978. P. 44-49.

28. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154-156.

29. Farthing C.R., Ficz G., Ng R.K., Chan C.F., Andrews S., Dean W., Hemberger M., Reik W. Global mapping of DNA methylation in mouse promoters reveals epigenetic reprogramming of pluripotency genes // PLoS Genet. 2008. V. 4. № 6. P. elOOOl 16.

30. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K., Nosek J. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell Differ. 1984. V. 15. № 2-4. P. 229-234.

31. Fry C.J., Peterson C.L. Chromatin remodeling enzymes: who's on first? // Curr Biol. 2001. V. 11. № 5. P. R185-197.

32. Fujimori Т., Kurotaki Y., Miyazaki J., Nabeshima Y. Analysis of cell lineage in two-and four-cell mouse embryos // Development. 2003. V. 130. № 21. P. 5113-5122.

33. Fulka H., Mrazek M., Tepla.O., Fulka J., Jr. DNA methylation pattern in human zygotes and developing embryos // Reproduction. 2004. V. 128. № 6. P. 703-708.

34. Gidekel S., Bergman Y. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element // J Biol Chem. 2002. V. 277. № 37. P. 34521-34530.

35. Gurdon J.B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles // J. Embryol. Exp. Morphol. 1962. V. 10. № P. 622-640.

36. Hajkova P., Erhardt S., Lane N., Haaf Т., El-Maarri O., Reik W., Walter J., Surani M.A. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells // Mech Dev. 2002. V. 117. № 1-2. P. 15-23.

37. Hanna L.A., Foreman R.K., Tarasenko I.A., Kessler D.S., Labosky P.A. Requirement for Foxd3 in maintaining pluripotent cells of the early mouse embryo // Genes Dev. 2002. V. 16. № 20. P. 2650-2661.

38. Hansis C., Grifo J.A., Krey L.C. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocysts // Mol Hum Reprod. 2000. V. 6. № 11. P. 9991004.

39. Harborth J., Elbashir S.M., Bechert K., Tuschl Т., Weber K. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs // J Cell Sci. 2001. V. 114. № Pt 24. P. 4557-4565.

40. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human // Dev Dyn. 2004. V. 230. № 1. P. 187-198.

41. Hatano S.Y., Tada M., Kimura H., Yamaguchi S., Kono Т., Nakano Т., Suemori H., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity // Mech Dev. 2005. V. 122. № 1. P. 67-79.

42. Hattori N., Imao Y., Nishino K., Ohgane J., Yagi S., Tanaka S., Shiota K. Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007. V. 12. № 3. P. 387-396.

43. Hattori N., Nishino К., Ко Y.G., Ohgane J., Tanaka S., Shiota K. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J Biol Chem. 2004. V. 279. № 17. P. 17063-17069.

44. Hay D.C., Sutherland L., Clark J., Burdon T. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 2. P. 225-235.

45. Hochedlinger K., Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature В and T donor cells // Nature. 2002. V. 415. № 6875. P. 1035-1038.

46. Hong H., Takahashi K., Ichisaka Т., Aoi Т., Kanagawa O., Nakagawa M., Okita K., Yamanaka S. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway // Nature. 2009. V. 460. № 7259. P. 1132-1135.

47. Howell C.Y., Bestor Т.Н., Ding F., Latham K.E., Mertineit C., Trasler J.M., Chaillet J.R. Genomic imprinting disrupted by a maternal effect mutation in the Dnmtl gene // Cell. 2001. V. 104. № 6. P. 829-838.

48. Howlett S.K., Reik W. Methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development//Development. 1991. V. 113. № l.P. 119-127.

49. Huangfu D., Osafune K., Maehr R., Guo W., Eijkelenboom A., Chen S., Muhlestein W., Melton D.A. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2 // Nat Biotechnol. 2008. V. 26. № 11. P. 1269-1275.

50. Illmensee K., Mintz B. Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1976. V. 73. № 2. P. 549-553.

51. Inoue К., Wakao H., Ogonukl N., Miki H., Seino K., Nambu-Wakao R., Noda S., Miyoshi H., Koseki H., Taniguchi M., Ogura A. Generation of cloned mice by direct nuclear transfer from natural killer T cells // Curr. Biol. 2005. V. 15. № 12. P. 11141118.

52. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nat Genet. 2003. V. 33 Suppl. № P. 245-254.

53. Johnson M.H., McConnell J.M. Lineage allocation and cell polarity during mouse embryogenesis // Semin Cell Dev Biol. 2004. V. 15. № 5. P. 583-597.

54. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz В., Pesce M., Gentile L., Boiani M., Lomeli H., Nagy A., McLaughlin K.J., Scholer H.R., Tomilin A. Oct4 is required for primordial germ cell survival // EMBO Rep. 2004. V. 5. № 11. P. 1078-1083.

55. Kimura H., Tada M., Nakatsuji N., Tada T. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. № 13. P. 5710-5720.

56. Kirchhof N., Carnwath J.W., Lemme E., Anastassiadis K., Scholer H., Niemann H. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species // Biol Reprod. 2000. V. 63. № 6. P. 1698-1705.

57. Kleinsmith L.J., Pierce G.B.," Jr. Multipotentiality of Single Embryonal Carcinoma Cells // Cancer Res. 1964. V. 24. № P. 1544-1551.

58. Kohda Т., Inoue К., Ogonuki N., Miki H., Naruse M., Kaneko-Ishino Т., Ogura A., Ishino F. Variation in gene expression and aberrantly regulated chromosome regions in cloned mice // Biol. Reprod. 2005. V. 73. № 6. P. 1302-1311.

59. Lachner M., O'Sullivan R.J., Jenuwein T. An epigenetic road map for histone lysine methylation // J Cell Sci. 2003. V. 116. № Pt 11. P. 2117-2124.

60. Laiosa C.V., Stadtfeld M., Xie H., de Andres-Aguayo L., Graf T. Reprogramming of committed T cell progenitors to macrophages and dendritic cells by C/EBP alpha and PU.l transcription factors // Immunity. 2006. V. 25. № 5. P. 731-744.

61. Lammerding J., Schulze P.C., Takahashi Т., Kozlov S., Sullivan Т., Kamm R.D., Stewart C.L., Lee R.T. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction // J Clin Invest. 2004. V. 113. № 3. P. 370-378.

62. Lane N., Dean W., Erhardt S., Hajkova P., Surani A., Walter J., Reik W. Resistance of IAPs to methylation reprogramming may provide a mechanism for epigenetic inheritance in the mouse // Genesis. 2003. V. 35. № 2. P. 88-93.

63. Lee J., Inoue K., Ono R., Ogonuki N., Kohda Т., Kaneko-Ishino Т., Ogura A., Ishino F. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5 primordial germ cells //Development. 2002. V. 129. № 8. P. 1807-1817.

64. Li J., Ishii Т., Feinstein P., Mombaerts P. Odorant receptor gene choice is reset by nuclear transfer from mouse olfactory sensory neurons // Nature. 2004. V. 428. № 6981. P. 393-399.

65. Lowry W.E., Richter L., Yachechko R., Pyle A.D., Tchieu J., Sridharan R., Clark А.Т., Plath K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. V. 105. № 8. P. 2883-2888.

66. Mali P., Ye Z., Hommond H.H., Yu X., Lin J., Chen G., Zou J., Cheng L. Improved efficiency and pace of generating induced pluripotent stem cells from human adult and fetal fibroblasts // Stem Cells. 2008. V. 26. № 8. P. 1998-2005.

67. Marikawa Y., Fujita T.C., Al'arcon V.B. Heterogeneous DNA methylation status of the regulatory element of the mouse Oct4 gene in adult somatic cell population // Cloning Stem Cells. 2005. V. 7. № 1. P. 8-16.

68. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. V. 78. № 12. P. 7634-7638.

69. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. № 5. P. 841-847.

70. Matveeva N.M., Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Vasilkova A., Shilov A.G., Smith A., Serov O.L. Unequal segregation of parental chromosomes in embryonic stem cell hybrids // Mol Reprod Dev. 2005. V. 71. № 3. P. 305-314.

71. Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. Demethylation of the zygotic paternal genome //Nature. 2000. V. 403. № 6769. P. 501-502.

72. McBurney M.W., Featherstone M.S., Kaplan H. Activation of teratocarcinoma-derived hemoglobin genes in teratocarcinoma-Friend cell hybrids // Cell. 1978. V. 15. №4. P. 1323-1330. .

73. Memili E., First N.L. Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species // Zygote. 2000. V. 8. № 1. P. 87-96.

74. Miller R.A., Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. № 1. P. 45-55.

75. Miller R.A., Ruddle F.H. Properties of teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1977. V. 3. № 3. P. 247-261.

76. Mitalipov S.M., Kuo H.C., Hennebold J.D., Wolf D.P. Oct-4 expression in pluripotent cells of the rhesus monkey // Biol Reprod. 2003. V. 69. № 6. P. 17851792.

77. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 631-642.

78. Monk M., Holding C. Human embryonic genes re-expressed in cancer cells // Oncogene. 2001. V. 20. № 56. P. 8085-8091.

79. Moreira P.N., Robl J.M., Collas P. Architectural defects in pronuclei of mouse nuclear transplant embryos // J. Cell Sci. 2003. V. 116. № Pt 18. P. 3713-3720.

80. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4 // Cell. 1998. V. 95. № 3. P. 379-391.

81. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat Genet. 2000. V. 24. № 4. P. 372-376.

82. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A., Orlova I., Malapetsa A., Scholer H.R. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm Genome. 2001. V. 12. № 4. P. 309-317.

83. Nutt S.L., Heavey В., Rolink A.G., Busslinger M. Commitment to the B-lymphoid lineage depends on the transcription factor Pax5 // Nature. 1999. V. 401. № 6753. P. 556-562.

84. Okamoto I., Otte 'A.P., Allis ;C.D., Reinberg D., Heard E. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development // Science. 2004. V. 303. № 5658. P. 644-649.

85. Okita K., Ichisaka Т., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells // Nature. 2007. V. 448. № 7151. P. 313-317.

86. Olek A., Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint // Nat Genet. 1997. V. 17. № 3. P. 275-276.

87. Ovitt C.E., Scholer H.R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo //Mol HumReprod. 1998. V. 4. № 11. P. 1021-1031.

88. Park I.H., Arora N., Huo H., Maherali N., Ahfeldt Т., Shimamura A., Lensch M.W., Cowan C., Hochedlinger K., Daley G.Q. Disease-specific induced pluripotent stem cells // Cell. 2008. V. 134. № 5. P. 877-886.

89. Pells S., Di Domenico A.I., Gallagher E.J., McWhir J. Multipotentiality of neuronal cells after spontaneous fusion with embryonic stem cells and nuclear reprogramming in vitro // Cloning Stem Cells. 2002. V. 4. № 4. P. 331-338.

90. Pesce M., Anastassiadis K., Scholer H.R. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 144-152.

91. Reik W., Santos F., Mitsuya K., Morgan H., Dean W. Epigenetic asymmetry in the mammalian zygote and early embiyo: relationship to lineage commitment? // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2003. V. 358. № 1436. P. 1403-1409; discussion 1409.

92. Reik W., Walter J. Evolution of imprinting mechanisms: the battle of the sexes begins in the zygote //Nat Genet. 2001. V. 27. № 3. P. 255-256.

93. Rollins R.A., Haghighi F., Edwards J.R., Das R., Zhang M.Q., Ju J., Bestor Т.Н. Large-scale structure of genomic methylation patterns // Genome Res. 2006. V. 16. №2. P. 157-163.

94. Rougier N., Bourc'his D., Gomes D.M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., Viegas-Pequignot E. Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development// Genes Dev. 1998. V. 12. № 14. P. 2108-2113.

95. Rousset J.P., Bucchini D., Jami J. Hybrids between F9 nullipotent teratocarcinoma and thymus cells produce multidifferentiated tumors in mice // Dev. Biol. 1983. V. 96. №2. P. 331-336.

96. Rousset J.P., Dubois P., Lasserre C., Aviles D., Fellous M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mouse teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1979. V. 5. № 6. P. 739-752.

97. Santos F., Hendrich В., Reik W., Dean W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the.early mouse embryo // Dev Biol. 2002. V. 241. № 1. P. 172-182.

98. Schaap G.H., Devilee P., van Klaveren P., Jongkind J.F. Gene expression in flow sorted mouse teratocarcinoma X human fibroblast heterokaryons // Differentiation. 1984. V. 26. № 2. P. 127-133.

99. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development // Trends Genet. 1991. V. 7. № 10. P. 323-329.

100. Senda S., Wakayama Т., Yamazaki Y., Ohgane J., Hattori N., Tanaka S., Yanagimachi R., Shiota K. Skewed X-inactivation in cloned mice II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 321. № 1. P. 38-44.

101. Serov O.L., Zhdanova N.S., Pack S.D., Lavrentieva M.V., Shilov A.G., Rivkin M.I., Matyakhina L.D., Draber P., Kerkis A.Y., Rogozin I.B., et al. The mink X chromosome: organization and inactivation// Prog. Clin. Biol. Res. 1990. V. 344. № P. 589-618.

102. Shiota K. DNA methylation profiles of CpG islands for cellular differentiation and development in mammals // Cytogenet Genome Res. 2004. V. 105. № 2-4. P. 325334.

103. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. № P. 435-462.

104. Stadtfeld M., Brennand K., Hochedlinger K. Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells // Curr Biol. 2008. V. 18. № 12. P. 890-894.

105. Sumi Т., Tsuneyoshi N., Nakatsuji N., Suemori H. Apoptosis and differentiation of human embryonic stem cells induced by sustained activation of c-Myc // Oncogene. 2007. V. 26. № 38. P. 5564-5576.

106. Szabo P.E., Hubner К., Scholer H., Mann J.R. Allele-specific expression of imprinted genes in mouse migratory primordial germ cells // Mech Dev. 2002. V. 115. № 1-2. P. 157-160.

107. Tada M., Morizane A., Kimura H., Kawasaki H., Ainscough J.F., Sasai Y., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. V. 227. № 4. P. 504-510.

108. Tada M., Tada Т., Lefebvre L., Barton S.C., Surani M.A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells // EMBO J. 1997. V. 16. № 21. P. 6510-6520.

109. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N., Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. V. 11. № 19. P.1553-1558.

110. Takagi N. De novo X-chromosome inactivation in somatic hybrid cells between the XO mouse embryQnal carcinoma cell and XY rat lymphocyte // Exp. Cell Res. 1983. V. 145. № 2. P. 397-404.

111. Takagi N. Requirement of mitoses for the reversal of X-inactivation in cell hybrids between murine embryonal carcinoma cells and normal female thymocytes // Exp. Cell Res. 1988. V. 175. № 2. P. 363-375.

112. Takagi N. Variable X chromosome inactivation patterns in near-tetraploid murine EC x somatic cell hybrid cells differentiated in vitro // Genetica. 1993. V. 88. № 2-3. P. 107-117.

113. Takagi N., Yoshida M.A., Sugawara O., Sasaki M. Reversal of X-inactivation in female mouse somatic cells hybridized with murine teratocarcinoma stem cells in vitro // Cell. 1983. V. 34. № 3. P. 1053-1062.

114. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka Т., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. V. 131. № 5. P. 861-872.

115. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

116. Terada N., Hamazaki Т., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion //Nature. 2002. V. 416. № 6880. P. 542-545.

117. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S. Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. № 5391. P. 1145-1147.

118. Utikal J., Polo J.M., StadtfelcLM., Maherali N., Kulalert W., Walsh R.M., Khalil A., Rheinwald J.G., Hochedlinger K. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells // Nature. 2009. V. 460. № 7259. P. 11451148.

119. Wakayama Т., Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K.R., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei // Nature. 1998. V. 394. № 6691. P. 369-374.

120. Wang R.Y., Gehrke C.W., Ehrlich M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. № 20. P. 4777-4790.

121. Wang S.H., Tsai M.S., Chiang M.F., Li H. A novel NK-type homeobox gene, ENK (early embryo specific NK), preferentially expressed in embryonic stem cells // Gene Expr Patterns. 2003. V. 3. № 1. P. 99-103.

122. Weber M., Hellmann I., Stadler M.B., Ramos L., Paabo S., Rebhan M., Schubeler D. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome // Nat Genet. 2007. V. 39. № 4. P. 457-466.

123. Wernig M., Meissner A., Foreman R., Brambrink Т., Ku M., Hochedlinger K., Bernstein B.E., Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state //Nature. 2007. V. 448. № 7151. P. 318-324.

124. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. 1997. V. 385. № 6619. P. 810-813.

125. Xie H., Ye M., Feng R., Graf T. Stepwise reprogramming of В cells into macrophages // Cell. 2004. V. 117. № 5. p. 663-676.

126. Yamanaka S. Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation //Nature. 2009. V. 460. № 7251. P. 49-52.

127. Yamazaki Y., Fujita T.C., Low E.W., Alarcon V.B., Yanagimachi R., Marikawa Y. Gradual DNA demethylation of the Oct4 promoter in cloned mouse embryos // Mol Reprod Dev. 2006. V. 73. № 2. P. 180-188.

128. Yasuda S.Y., Tsuneyoshi N., Sumi Т., Hasegawa K., Tada Т., Nakatsuji N., Suemori H. NANOG maintains self-renewal of primate ES cells in the absence of a feeder layer // Genes Cells. 2006. V. 11. № 9. P. 1115-1123.

129. Yeom Y.I., Fuhrmann G., Ovitt C.E., Brehm A., Ohbo K., Gross M., Hubner K., Scholer H.R. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells //Development. 1996. V. 122. № 3. P. 881-894.

130. Ying Q.L., Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion //Nature. 2002. V. 416. № 6880. P. 545-548.

131. Yu J., Vodyanik M.A., He P., Slukvin, П, Thomson J.A. Human embryonic stem cells reprogram myeloid precursors following cell-cell fusion // Stem Cells. 2006. V. 24. № 1. p. 168-176.

132. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J., JonsdottirG.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin, П, Thomson J.A. Induced10

133. Zhou Q., Brown J., Kanarek A., Rajagopal J., Melton D.A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells // Nature. 2008. V. 455. № 7213. P. 627632.