Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Гридина, Мария Михайловна

• Гридина, Мария Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гридина, Мария Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.1. Рост ЭС клеток в культуре.

1.1.2. Способы оценки плюрипотентности ЭС клеток.

1.1.3. Внешние факторы, необходимые ЭС клеткам.

1.1.4. Транскрипционные факторы, регулирующие плюрипотентное состояние ЭС клеток.

1.1.5. Эпигенетическая регуляция плюрипотентности.

1.1.5.1. Организация хроматина в ЭС клетках.

1.1.5.2. Метилирование ДНК в ЭС клетках.

1.1.5.3. Состояние Х-хромосом в ЭС клетках.

1.2. Репрограммирование геномов соматических клеток через слияние с ЭС клетками.

1.2.1. Метод слияния клеток.

1.2.2. Гибридные клетки между ЭС клетками и соматическими клетками

1.2.2.1. Потенциал гибридных клеток между ЭС клетками и соматическими клетками.

1.2.2.2. Профиль экспрессии генов в гибридных клетках.

1.2.2.3. Эпигенетическое состояние генома гибридных клеток.

1.2.3. Для репрограммирования генома соматической клетки необходимо и достаточно ядро ЭС клетки.

1.2.4. Ранние этапы процесса репрограммирования.

1.2.4.1. Ранние этапы процесса перепрограммирования при слиянии двух соматических клеток.

1.2.4.2. Ранние этапы процесса репрограммирования при слиянии ЭС клеток и соматических клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов»

Актуальность. Развитие начинается с деления-дробления оплодотворенной яйцеклетки - зиготы. Программа развития, заложенная в этой тотипотентной клетке, реализуется в процессе онтогенеза через дифференцировку, в результате которой формируется более 200 типов специализированных клеток, представленных во взрослом организме. Процесс дифференцировки сопровождается потерей первоначальной тотипотентности, которую можно условно градуировать: плюрипотентность, мультипотентность, коммитированность и терминальная детерминация. Важным элементом потери потенциала является ее одновекторность и, в большинстве случаев, необратимость. В нормальном развитии эукариот примеры восстановления дифференцированной клеткой утраченного потенциала чрезвычайно редки. В связи с этим исследователями не раз предпринимались попытки экспериментальным путем восстановить утраченный потенциал соматических клеток.

Эксперименты по переносу ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит, впервые выполненные еще в середине XX века на амфибиях, показали, что в результате действия факторов, содержащихся в цитоплазме ооцита, возможно восстановление потенциала соматической клетки. Реконструированные ооциты в редких случаях (не более 2-4%) способны обеспечить развитие эмбриона и рождение животного. Данный метод был успешно применен ко многим видам млекопитающих, таким как: овца, мышь, корова, коза, свинья, кролик, кошка и многие другие (Wilmut etal., 1997; Gurdon, Byrne, 2003). Следует подчеркнуть, что даже при использовании ядер терминально дифференцированных клеток таких как, например, B-лимфоцитов, в которых произошла перестройка иммуноглобулиновых генов, возможно рождение «клонированных» животных (Hochedlinger, Jaenisch, 2002). Процесс, в результате которого происходит восстановление утраченного ранее потенциала соматических клеток, благодаря чему такие клетки способны обеспечить полное развитие организма, был назван репрограммированием. В ходе этого процесса происходит кардинальное изменение профиля экспрессии генов, глобальная реорганизация (ремоделирование) хроматина, деметилирование ДНК, корректировка экспрессии импринтированных генов, изменения модификаций и набора гистоновых белков и восстановление укороченных концов теломер (Tamada, Kikyo, 2004). Всестороннее изучение репрограммирования, в свою очередь, может помочь в понимании процессов, происходящих в развитии и при дифференцировке клеток.

Помимо переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит, существуют и другие способы репрограммирования генома соматической клетки. В 1996 году было обнаружено, что слияние мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и спленоцитов приводит к формированию гибридных клеток, которые обладают многими свойствами ЭС клеток, в том числе способностью участвовать в формировании химерных животных (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Эти данные нашли подтверждение в целом ряде экспериментов по слиянию ЭС клеток с В- и Т-лифмоцитами (Tada et al., 2001; Kimura et al., 2004), незрелыми нейральными клетками (Do et al., 2004), незрелыми гемопоэтическими клетками (Ying et al., 2003) и фибробластами (Sullivan et al., 2006; Kruglova et al., 2008). Высокая репрограммирующая активность ЭС клеток человека была также показана в опытах по их слиянию с фибробластами (Cowan et al., 2005). Исследования таких гибридных клеток показали, что в них происходит: активация генов, неактивных в соматических клетках (таких как Oct4 и Nanog), реактивация неактивной Х-хромосомы, изменения профилей метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков (Tada et al., 2001; Kimura et al., 2004; Do et al., 2007; Battulin et al., 2009). Все это является свидетельствами репрограммирования, происходящего в геноме соматической клетки после слияния с ЭС клеткой. Изменения профиля экспрессии генов, происходящие в гибридных клетках такого типа, а также приобретение этими клетками плюрипотентных свойств говорит о доминировании генома ЭС клеток над геномом соматических клеток.

Представление о доминировании генома одного партнера по слиянию над другим долгое время было популярным не только в случае гибридов, получаемых при слиянии ЭС клеток с соматическими клетками, но и для гибридных клеток, получаемых при слиянии двух соматических клеток различной тканевой принадлежности. После слияния двух соматических клеток возможно, используя ингибиторы клеточного деления, оставить клетку на стадии гетерокариона, когда в общей цитоплазме присутствуют два ядра родительских клеток. В таких гетерокарионах, как правило, доминирует более крупный и чаще делящийся партнер, и под его воздействием меняется организация второго ядра и паттерн экспрессии генов в нем на свойственный доминантному ядру. Примерами такого доминирования могут служить гетерокарионы, полученные при слиянии эритроцитов птиц или амфибий с какими-либо растущими и делящимися в культуре клетками млекопитающих (Harris, 1967) или при слиянии кератиноцитов мыши с миобластами мыши (Zhang etal., 2007). Однако недавно появилась работа, в которой показано обоюдное влияние геномов в гетерокарионах между кератиноцитами и мышечными клетками, а не доминирование одного над другим (Palermo etal., 2009). Таким образом, возникает вопрос - возможно ли альтернативное проявление геномов родительских клеток при слиянии соматических клеток с ЭС клетками или же в данном случае наблюдается строгое доминирование ядер ЭС клеток?

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение динамики становления фенотипа гибридных клеток на ранних стадиях после слияния диплоидных ЭС клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами мыши. Нас интересовали следующие вопросы: 1) характер проявления родительских геномов в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток с фибробластами; 2) когда появляются первые признаки репрограммирования одного из родительских геномов; 3) когда происходит становление фенотипа гибридных клеток.

Для достижения целей были поставлены следующие задачи: 1. Модифицировать метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток на ранних стадиях после слияния ЭС клеток и фибробластов.

2. Провести иммунофлюоресцентный анализ маркеров плюрипотентных ЭС клеток (Ос14 и Ыапод), фибробластов (коллагена I типа и фибронектина) и дифференцированных клеток (ламина А/С) в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы (от 4-ого до 20-ого) и дни (от 1-го до 4-го) после слияния ЭС клеток и фибробластов.

3. Провести анализ профилей метилирования ДНК 5'-регуляторной области гена ОсМ в гибридных клетках через разные интервалы времени после слияния ЭС клеток и фибробластов.

4. Исследовать состояние Х-хромосом в гетерокарионах и гибридных клетках посредством иммунофлюоресцентного анализа факультативного гетерохроматина с использованием антител против триметилированного лизина в 27-ом положении в гистоне НЗ (НЗК27теЗ), маркирующего неактивную Х-хромосому.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Модифицирован метод идентификации продуктов слияния ЭС клеток и фибробластов, позволяющий с 90% точностью дискриминировать гетерокарионы и гибридные клетки от гомокарионов и гибридных клеток, образовавшихся при слиянии двух родительских клеток одного типа (ЭС клетка-ЭС клетка и фибробласт-фибробласт).

2. Впервые обнаружено существование двух фенотипически контрастных типов гетерокарионов и гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток с диплоидными фибробластами - одни имеют признаки ЭС клеток, а другие фибробластов.

3. Впервые показано, что деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена ОсМ в гибридных клетках с фенотипом ЭС клеток происходит в течение первых 4-х дней после слияния, в то же время в гибридных клетках с фибробласто-подобным фенотипом происходит метилирование 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена ОсМ.

4. Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены в работе следующих конференций и симпозиумов: 3-я международная конференция «Наука для медицины» (Новосибирск, 2007); симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». (Москва, 2007); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2007); международная научная конференция молодых ученых «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); 4-ая международная конференция сообщества стволовых клеток северной Рейн-Вестфалии (Дюссельдорф, 2007); LXXIII симпозиум по количественной биологии (Cold Spring Harbor, 2008); 1-ый ежегодный международный конгресс по регенеративной медицине и стволовым клеткам (Фошан, 2008); V съезд Вавиловского общество генетиков и селекционеров (Москва, 2009); 5-ый международный конгресс по биотехнологии стволовых клеток (Тегеран, 2009); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009).

Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественном и международных журналах.

Положения, выносимые на защиту. В клетках, получаемых при слиянии диплоидных ЭС клеток мыши и диплоидных фибробластов мыши, начиная со стадии гетерокариона, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов. В результате чего формируются гибридные клетки, обладающие двумя контрастными фенотипами: ЭС-подобным и фибробласто-подобным.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, проиллюстрирована 27 рисунками и содержит 2 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Гридина, Мария Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Модифицирован метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы после слияния ЭС клеток и фибробластов, основанный на использовании флуоресцентных маркеров, дискриминирующих родительские типы клеток. Показано, что надежность такой идентификации составляет не менее 90%. Впервые установлено, что через 21 ч после слияния выявляются два морфологически различных типа гибридных клеток: один, имеющий сходство с ЭС клетками, другой - с фибробластами.

2. Показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, есть экспрессия ОЫ4 и Ыапод - генов, характерных для плюрипотентных клеток, но отсутствуют коллаген 1-го типа, фибронектин и ламин А/С, маркеры, типичные для фибробластов. Сигнал, выявляемый антителами к НЗК27теЗ, маркирующий неактивную Х-хромосому, не обнаружен в гибридных клетках такого типа.

3. Установлено, что в течение 96 ч после слияния ЭС клеток М. тивсиШв и фибробластов М. сагоН в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, происходит деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена ОсМ, до уровня характерного для этого района в ЭС клетках.

4. Впервые показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках морфологически сходных с фибробластами отсутствуют Ос14 и Ыапод. Для части гибридных клеток такого морфологического типа показана экспрессия коллагена 1-го типа, фибронектина и ламина А/С, а также выявлен сигнал, маркирующий неактивную Х-хромосому.

5. В течение 96 ч после слияния в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с фибробластами, происходит метилирование

ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена ОсМ до уровня характерного для этого района 0&4 фибробластов.

6. Впервые показано, что для гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток и диплоидных фибробластов, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов и формируются контрастные типы гибридных клеток: в одном из которых, доминирует геном, привнесенный ЭС клетками, другом - доминирует геном фибробласта.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гридина, Мария Михайловна, 2010 год

1. Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М. и др. Гибридные клетки, полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетроплоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Доклады АН. 2008. V. 422. Р. 125-127.

2. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И. и др. Гибриды между эмбриональными стволовыми и соматическими клетками сохраняют плюрипотентность //Доклады АН. 1996. V. 349. Р. 129-132.

3. Мензоров А.Г. Матвеева Н.М., Ларкин Д.М., и др. Судьба родительских митохондрий в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Цитология. 2008. V. 50. Р. 711-718.

4. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Темирова С.А., и др. Анализ экспрессии родительских аллелей Xist и Gla в межвидовых эмбриональных гибридных клетка в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом // Онтогенез. 2007. V. 38. Р. 1-8.

5. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки // М.: Мир. 1979. С. 191-209.

6. Ambrosi D.J., Tanasijevic В., Kaur A. et al. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embryonic stem cells // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 1104-1113.

7. Atkin N.B., Baker M.C., Robinson R. et al. Chromosome studies on 14 near-diploid carcinomas of the ovary// Eur. J. Cance. 1974. V. 10. P. 144-146.

8. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 126-40.

9. Baharvand H., Matthaei K.I. The ultrastructure of mouse embryonic stem cells // Reproductive Bio. Med. Online. 2003. V. 7. P. 330-335.

10. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 481-492.

11. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans des cultures in vitro de deux souches cellulaires en association de cellules de caractere "hybride" // C. R. Acad. Sc. 1960. V. 251. P. 1825-1827.

12. Boumil R.M., Lee J.T. Forty years of decoding the silence in X-chromosome inactivation // Hum Mol Genet. 2001. V. 10. P. 2225-2232.

13. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. etal. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells // Cell. 2005. V. 122. P. 947-956.

14. Cartwright P., McLean C., Sheppard A. etal. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism // Development. 2005. V. 132. P. 885-896.

15. Chambers I., Colby D., Robertson M. etal. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113. P. 643-655.

16. Collas P., Noer A., Timoskainen S. Programming the genome in embryonic and somatic stem cells //J. Cell. Mol. Med. 2007. V. 4. P. 602-620.

17. Constantinescu D., Gray H.L., Sammak P.J. et al. Lamin A/C expression is a marker of mouse and human embryonic stem cell differentiation // Stem Cells. 2006. V. 24. P. 177-185.

18. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A. etal. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. P. 1369-1373.

19. Do J.T. and Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells//Stem Cells . 2004. V. 22. P. 941-949.

20. Do J.T. and Scholer H.R. Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential // Reprod Fertil Dev. 2005. V. 17. P. 143-149.

21. Do J.T. Han D.W., Gentile L. et al. Erasure of cellular memory by fusion with pluripotent cells//Stem Cells. 2007. V. 25. P. 1013-1020.

22. Do J.T. Han D.W., Gentile L., et a/. Enhanced Reprogramming of Xist by Induced Upregulation of Tsix and Dnmt3a II Stem Cells. 2008. V. 26. P. 2821-2831.

23. Evans M.J. and Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

24. Farivar S., Yamaguchi S., Sugimoto M. et al. X-chromosome inactivation in differentiating mouse embryonic stem cells carrying X-linked GFP and lacZ transgenes // Int. J. Devel. Biol. 2004. V. 48. P. 629-635.

25. Gidekel S., Bergman Y. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 34521-34530.

26. Gossler A., Doetschman T.C., Korn R. et al. Transgenesis by means of blastocyst derived embryonic stem cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 9065-9069.

27. Gu P., Menuet D., Chung A.C.K. et al. Differential Recruitment of Methylated CpG Binding Domains by the Orphan Receptor GCNF Initiates the Repression and Silencing of Oct4 Expression // Mol. Cel. Biol. 2006. V. 26. P. 9471-9483.

28. Gurdon J.B. and Byrne J.A. The first half-century of nuclear transplantation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 2003. V. 100. P. 8048-8052.

29. Han D.W., Do J.T., Gentile L. etal. Pluripotential reprogramming of the somatic genome in hybrid cells occurs with the first cell cycle // Stem Cells. 2008. V. 26. P. 445-454.

30. Harris H. The reactivation of the red cell nucleus // J. Cell Sci. 1967. V. 2. P. 23-32.

31. Harris H. and Watkins J. F. Hybrid ceils derived from mouse and man: artificial heterokaryons of mammalian cells from different species // Nature. 1965. V. 205. P. 640-646.

32. Hattori N., Nishino К., Ко Y. et al. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J. Biol Chem. 2004. T. 279. P. 17063-17069.

33. Hattori N., Imao Y., Nishino K. etal. Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007. V. 12. P. 387-396.

34. Hiratani I., Leskovar A., Gilbert D.M. Differentiation-induced replication-timing changes are restricted to AT-rich/long interspersed nuclear element (LINE)-rich isochores // Proc Natl Acad Sci. USA. 2004. V. 101. P. 16861-16866.

35. Hochedlinger K. and Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature В and T donor cells // Nature. 2002. V. 415. P. 1035-1038.

36. Hough S.R., Clements I., Welch P.J. etal. Differentiation of mouse embryonic stem cells after RNA interference-mediated silencing of OCT4 and Nanog 11 Stem Cells. 2006. V. 24. P. 1467-1475.

37. Kahan B.W. and Ephrussi B. Developmental potentialities of clonal in vitro cultures of mouse testicular teratoma // J. Natl. Cancer Inst. 1970. V. 44. P. 1015-1036.

38. Kim J., Chu J., Shen X. etal. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells // Cell. 2008. V. 132. P. 1049-1061.

39. Kimura H., Tada M., Hatano S. et al. Chromatin reprogramming of male somatic cell-derived Xist and Tsix in ES hybrid cells // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 106-114.

40. Kimura H., Tada M., Nakatsuji N. et al. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. P. 5710-5720.

41. Kinoshita K., Ura H., Akagi T. etal. GABPalpha regulates Oct-3/4 expression in mouse embryonic stem cells // Biochem Biophys Res Commun. 2007. V. 353. P. 686-691.

42. Ko S.Y., Kang H.Y., Lee H.S. et al. Identification of Jmjdla as a STAT3 downstream gene in mES cells // Cell Struct Funct. 2006. V. 31. P. 53-62.

43. Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I. etal. Embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provid high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. V. 334. P. 371-380

44. Kuroda T., Tada M., Kubota H. etal. Octamer and Sox elements are required for transcriptional eis regulation of Nanog gene expression // Mol Cell Biol. 2005. V. 25. P. 2475-2485.

45. Latha B.M. Role of Signaling pathways and transcription factors in the self renewal and pluripotency of embryonic stem cells // Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. 2008. V. 2. P. 349-366.

46. Legros F., Malka F., Frachon P. et al. Organization and dynamics of human mitochondrial DNA//J. Cell Sei. 2004. V. 117. P. 2653-2662.

47. Li J., Greco V., Guasch G. etal. Mice cloned from skin cells // Proc. Natl. Acad. Sei. 2006. V. 104. P. 2738-2743.

48. Li J. Pan G., Cui K. et al. A dominant-negative form of mouse SOX2 induces trophectoderm differentiation and progressive polyploidy in mouse embryonic stem cells//J Biol Chem. 2007. V. 282. P. 19481-19492.

49. Liu N., Lu M., Tian X. et al. Molecular mechanisms involved in self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells // J. Cell Physiol. 2007. V. 211. P. 279-286.

50. Loh Y.H., Zhang W., Chen X. et al. Jmjdla and Jmjd2c histone H3 Lys 9 demethylases regulate self-renewal in embryonic stem cells // Genes Dev. 2007. V. 21. P. 2545-2557.

51. Maherali N., Sridharan R., Xie W. et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution // Cell Stem Cell. 2007. V. 1. P. 55-70.

52. Maherali N., Ahfeldt T., Rigamonti A. et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells // Cell Stem Cell. 2008. V. 3. P. 340-345.

53. Marikawa Y., Fujita T.C., Alarcon V.B. Heterogeneous DNA methylation status of the regulatory element of the mouse Oct4 gene in adult somatic cell population // Cloning Stem Cells. 2005. V. 7. P. 8-16.

54. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. V. 78. P. 7634-7638.

55. Matsumura H., Tada M., Otsuji T. et al. Targeted chromosome elimination from ES-somatic hybrid cells // Nat. Methods. 2007. V. 4. P. 23-25.

56. Matveeva N.M., Shilov A.G., Kaftanovskaya E.M. et al. In vitro and in vivo study of pluripotency in intraspecific hybrid cells obtained by fusion of murine embryonic stem cells with splenocytes // Mol Reprod Dev. 1998. V. 50. P. 128-138.

57. Mayer W., Niveleau A., Walter J. et al. Demethylation of the zygotic paternal genome // Nature. 2000. V. 403. P. 501-502.

58. Meshorer E., Yellajoshula D., George E. et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells // Dev Cell. 2006. V. 10. P. 105-116.

59. Miller R.A. and Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinomathymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

60. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. P. 631-642.

61. Nagy A., Gocza E., Diaz E.M. et al. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse // Development. 1990. V. 110. P. 815-821.

62. Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryos depends on the POU transcription factor Oct4 II Cell. 1998. V. 95. P. 379-391.

63. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat.Genet. 2000. V. 24. P. 372-376.

64. Niwa H., Burdon T., Chambers I. et al. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3 // Genes Dev . 1998. V. 12. P. 2048-2060.

65. Okada Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two different strains // Exp. Cell Res. 1965. V. 40. P. 154-158.

66. Okita and Yamanaka. Intracellular signaling pathways regulating pluripotency of embryonic stem cells // Curr Stem Cell Res & Therapy. 2006. V. 1. P. 103-111.

67. Oswald J., Engemann S., Lane N. et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 475-478.

68. Palermo A., Doyonnas R., Bhutani N. et al. Nuclear reprogramming in heterokaryons is rapid, extensive, and bidirectional // FASEB J. 2009. V. 23. P. 1431-1440.

69. Pan G.J., Pei D.Q. Identification of two distinct transactivation domains in the pluripotency sustaining factor nanog// Cell Res. 2003. V. 13. P. 499-502.

70. Pan G., Li J, Zhou Y., Zheng H. et al. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal // FASEB J . 2006. V. 20. P. 1730-1732.

71. Panning B. and Jaenisch R. DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence X-linked genes // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1991-2002.

72. Pereira C.F., Terranova R., Ryan N.K. et al. Heterokaryon-based reprogramming of human B lymphocytes for pluripotency requires Oct4 but not Sox2// PLOS Genetics. 2008. V. 4. P.e1000170.

73. Perry P., Sauer S., Billon N. et al. A dynamic switch in the replication timing of key regulator genes in embryonic stem cells upon neural induction // Cell Cycle. 2004. V. 3. P. 1645-1650.

74. Pralong D., Trounson A.O., and Verma P.J. Cell fusion for reprogramming pluripotency toward elimination of the pluripotent genome // Stem Cell Reviews. 2006. V. 2. P. 331-340.

75. Pratt T., Sharp L., Nichols J. et al. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein // Dev. Biol. 2000. V. 228. P. 19-28.

76. Rodda D.J., Chew J,L., Lim L.H. et al. Transcriptional regulation of Nanog by OCT4 and SOX2 // J. Biol Chem. 2005. V. 280. P. 24731-24737.

77. Scholer H.R., Ciesiolka T., Gruss P. A nexus between Oct-4 and E1 A: implications for gene regulation in embryonic stem cells // Cell. 1991. V. 66. P. 291-304.

78. Shen Y., Chow J., Wang Z. et al. Abnormal CpG island methylation occurs during in vitro differentiation of human embryonic stem cells // Hum. Mol. Genet. 2006. V. 15. P. 2623-2635.

79. Silva J. Mak W., Zvetkova I. et al. Establishment of Histone H3 Methylation on the Inactive X Chromosome Requires Transient Recruitment of Eed-Enx1 Polycomb Group Complexes // Dev. Cell. 2003. V. 4. P. 481-495.

80. Silva J., Barrandon O., Nichols J. et al. Promotion of Reprogramming to Ground State Pluripotency by Signal Inhibition // PLoS Biol. 2008. V. 10.

81. Singh A.M., Hamazaki T., Hankowski K.E. et al. A Heterogeneous Expression Pattern for Nanog in Embryonic Stem Cells // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 2534-2542.

82. Smith H.S., Riggs J.L., Mosseson M.W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture // Canser Res. 1979. V. 39. P. 4138-4144.

83. Stead E., White J., Faast R. et al. Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities // Oncogene. 2002. V. 21. P. 8320-8333.

84. Stadtfeld M., Maherali N., Breault D.T. et al. Defining Molecular Cornerstones during Fibroblast to iPS Cell Reprogramming in Mouse // Cell Stem Cell. 2008. V. 2. P. 230-240.

85. Sullivan S., Pells S., Hooper M. et al. Nuclear Reprogramming of Somatic Cells by Embryonic Stem Cells Is Affected by Cell Cycle Stage II Cloning and stem cells. 2006. V. 8. P. 174-188.

86. Tada M., Takahama YM Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr Biol. 2001. V. 11. P. 1553-1558.

87. Tada M., Tada T., Lefebvre L. et ai Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells // EMBO J. 1997. V. 16. P. 6510-6520.

88. Tamada H., Kikyo, N. Nuclear reprogramming in mammalian somatic cell nuclear cloning // Cytogenet Genome Res. 2004. V. 105. P. 285-291.

89. Terranova R., Pereira C.F., Du Roure C. et al. Acquisition and extinction of gene expression programs are separable events in heterokaryon reprogramming // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P. 2065-2072.

90. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., ShapiroS.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

91. Tsumura A., Hayakawa T., Kumaki Y. etal. Maintenance of self-renewal ability of mouse embryonic stem cells in the absence of DNA methyltransferases Dnmtl, Dnmt3a and Dnmt3b // Genes Cells. 2006. V. 11. P. 805-814.

92. Ura H., Usuda M., Kinoshita K. etal. STAT3 and Oct-3/4 control histone modification through Induction of Eed in embryonic stem cells // J. Biol Chem. 2008. V. 283. P. 9713-9723.

93. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V. etal. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes // Mol Rep and Dev. 2007. V. 74. P. 941-951.

94. Veomrtt G., Prescott D.M., Shay J. et al. Reconstruction of mammalian cells from nuclear and cytoplasmic components separated by treatment with cytochalasin B // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. V. 5. P. 1999-2002.

95. Wakayama S., Hikichi T., Suetsugu R. etal. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 986-993.

96. Wiblin A.E., Cui W., Clark A.J. etal. Distinctive nuclear organization of centromeres and regions involved in pluripotency in human embryonic stem cells // J Cell Sci. 2005. V. 118. P. 3861-3868.

97. Williams R.L., Hilton D.J., Pease S. etal. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells II Nature. 1988. V. 336. P. 684-687.

98. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature . 1997. V. 385. P. 810-813.

99. Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P. et al. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 810-813.

100. Yeom Y.I., Fuhrmann G., Ovitt C.E. etal. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells // Development. 1996. V. 122. P. 881-894.

101. Yerganian G. and Nell M.B. Hybridization of dwarf hamster cells by UV-inactivated Sendai virus // Proc Natl Acad Sci. 1966. V. 55. P. 1066-1073.

102. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I. etal. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 // Cell. 2003 V. 115. P. 281-292.

103. Yoshimizu T., Sugiyama N., De Felice M. etal. Germline-specific expression of the Oct-4/green fluorescent protein (GFP) transgene in mice // Dev Growth Differ. 1999. V. 41. P. 675-684.

104. Yu J. and Thomson J.A. Pluripotent stem cell lines // Genes Dev. 2008. V. 22. P. 1987-1997.

105. Zhang F., Pomerantz J.H., Sen G. etal. Active tissue-specific DNA demethylation conferred by somatic cell nuclei in stable heterokaryons // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. V. 104. P. 4395-4400.

106. Zuccotti M., Monk M. Methylation of the mouse Xlst gene in sperm and eggs correlates with imprinted Xist expression and paternal X-inactivation // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 316-320.