Процессы формирования B-структуры в фибриллярных и глобулярных белках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Рагулина, Лариса Евгеньевна

• Рагулина, Лариса Евгеньевна
• кандидат физико-математических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Рагулина, Лариса Евгеньевна

Введение.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическое значение работы.

Первая

глава. Обзор литературы.

Вторая

глава. Материалы и методы.

Выборка белков и методы ее анализа.

Программы для предсказания вторичной структуры белков по их аминокислотной последовательности.

Выбор инструментов для разработки нового метода расчета антипараллельной p-структуры в белках.

Третья

глава. Анализ аминокислотной последовательности спидроинов первого и второго типов пауков различных видов.37 Выравнивание аминокислотных последовательностей спидроинов.

Сходства и различия.

Фурье-анализ аминокислотных последовательностей спидроинов.45 Теоретическое конструирование рекомбинантных аналогов спидроинов.

Четвёртая

глава. Предсказание вторичных структур.

Предсказание вторичной структуры спидроинов.

Экспериментальные исследования.

Глава пятая. Предсказание антипараллельной J3 - структуры в белках по их аминокислотной последовательности.

Глава шестая. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Процессы формирования B-структуры в фибриллярных и глобулярных белках»

В связи с акцептированием интересов в области молекулярной биофизики на нанотехнологиях и наноматериалах важная роль отводится фибриллярным биополимерам как носителям особых физических характеристик. Источником этих характеристик являются физико-химические свойства макромолекул, которые определяются последовательностью их химических единиц. В настоящее время в мире активно ведутся исследования свойств и структур биополимеров, поскольку они являются основой новых уникальных материалов. Знание структуры биополимера, понимание ее связи с последовательностью химических символов и процессами фибриллогенеза позволит создавать искусственные волокна с заданными свойствами.

Весьма перспективными биополимерами для получения новых материалов считаются белки, образующие паутину. Паук выделяет до пяти типов нитей шелка для различных целей, но особый интерес представляет основная нить паутины, поскольку именно она обладает уникальными свойствами. Например, ее прочность более, чем в три раза превышает прочность кевлара (синтетического волокна, соперничающего со сталью). Кроме того, волокна паучьего шелка обладают высокой биосовместимостью с организмом человека, что открывает большие возможности для использования их в медицине.

Получать нить паутины в промышленных масштабах подобно шелку шелкопряда невозможно из-за биологических особенностей пауков, но такую возможность может предоставить генная инженерия, хотя здесь тоже имеются свои трудности. Гены белков паутины очень длинны, как и сами белки, а потому процесс их воспроизведения сложен и дорог. В связи с этим встает задача упрощения белковой цепи и конструирования искусственного гена, а для этого необходимо знать характерные особенности таких цепей.

Фибрилла основной нити паука состоит из белков двух типов - спидроинов 1 и 2. Хотя исследованию структуры и физико-химических свойств нитей паутины посвящено достаточно много работ, а ее механические свойства изучены достаточно хорошо, к настоящему времени известно всего несколько полных аминокислотных последовательностей белков шелка пауков. Немногое известно и о структуре фибрилл, образующих паутину. Это связано с тем, что экспериментальные методы исследования структуры фибриллярных белков, такие как ЯМР, рентгенография и другие, не дают полного представления об их атомном строении. На данный момент известно, что структуры одиночных макромолекул фибриллярных белков, в том числе и спидроинов, изменяются в процессе фибриллогенеза. Установлено, что на заключительной стадии формирования белки основной нити паутины содержат p-структуру, но не известно, какие части последовательности их образуют; так же не известно строение тех частей белка, которые не свернуты в p-структуру.

На сегодняшний день достаточно хорошо умеют предсказывать вторичную структуру белков по их аминокислотной последовательности статистическими методами. Но нет достаточно надежного метода расчета третичной структуры и, в частности, Р-слоев. В связи с этим развитие подходов к расчету пространственной структуры белков, в том числе и спидроинов, по их аминокислотным последовательностям является важной прикладной задачей биоинформатики.

Цель и задачи исследования.

Главной целью проведённой работы было установление связей между последовательностью аминокислот в белках основной нити паутины - спидроинах первого и второго типов - и особенностями формирования их пространственных структур. В задачи работы входило:

• анализ локальных и нелокальных особенностей последовательности аминокислот в белках основной нити паутины;

• проведение Фурье-анализа последовательностей спидроинов первого и второго типов для поиска тех элементов аминокислотных последовательностей, которые связаны с генезисом структур и возникновением необычных физико-химических свойств паутины;

• предсказание вторичной структуры спидроинов 1 и 2 по их ам и нокислотной последовател ьности;

• разработка нового метода расчета антипараллельных Р-структур в белках различных типов по их аминокислотной последовательности и его применение к белкам паутины;

• экспериментальный анализ мономолекулярных растворов спидроинов и сухих пленок методами ИК- и КД-спектроскопии.

Научная новизна.

Впервые установлена полная картина распределения периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов, принадлежащих паукам различных видов.

Впервые показано, что предсказываемые по последовательности аминокислот вторичные структуры содержат очень мало участков (3-структуры. В основном они представляют собой сочетание а-спиралей и левых спиралей типа поли-1-пролин II. Экспериментальное исследование водных растворов спидроина 1 и его генно-инженерных аналогов подтвердило результаты проведенного предсказания. Оно позволило также сделать вывод, что на последнем этапе фибриллогенеза в спидроинах происходит переход: левая спираль типа поли-1-пролин II - р-структура.

Выделены последовательности аминокислот, отражающие основные черты периодичностей спидроинов 1 и 2. Соответствующие формулы:

• (F)„ - для спидроина 1;

• ABA СА [D В CD А А] [ D BCD Е Е ] DDB - для спидроина 2.

Показано, что в спидроинах первого и второго типов наблюдаются одинаковые периоды - это 2 и 14. Такие периоды характерны для распределения аминокислот на участках p-структуры. По-видимому именно аминокислоты, образующие эту периодичность, ответственны за образование р-слоев в паутине.

Периодичности распределения аминокислот, определяющие этапы формирования индивидуальных пространственных структур белков-спидроинов, различны и не свойственны таковым для Р-структур. Это и определяет существование квазиглобулярных этапов в фибриллогенезе паутины.

Построена модель процессинга белков паутины на разных этапах ее формирования.

Практическое значение работы.

Полученные в результате анализа аминокислотных последовательностей структурные формулы спидроинов 1 и 2, лежат в основе отбора последовательностей для синтеза спидроино-подобных белков с заданными свойствами генно-инженерными методами. Это позволит получать искусственные волокна шелка паука в количестве, необходимом для получения новых материалов с уникальными свойствами. Использовать такой материал можно будет в различных сферах деятельности человека, в том числе и в области медицины.

Разработанный метод расчета антипараллельной p-структуры может быть применен для определения пространственной структуры белков, топологию которых сложно или невозможно установить с помощью известных экспериментальных методов.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Рагулина, Лариса Евгеньевна

Выводы

1. Показаны принципиальные черты сходства и отличия в распределении аминокислот в последовательностях спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.

2. Впервые установлена картина распределения периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.

3. На основании проведенных исследований распределения периодичностей в последовательностях аминокислот и их характерных особенностей построены искусственные аналоги спидроинов 1 и 2.

4. Проведенные оценки вероятностей распределения вторичных структур вдоль полипептидных цепей спидроинов первого и второго типов свидетельствует о значительном содержании а-спирали и левой спирали типа поли-1-пролин II. Это соответствует квази-глобулярному состоянию макромолекулы с малым процентом содержания Р-структуры.

5. Проведены экспериментальные исследования спидроина 1 и его генно-инженерного аналога. Установлено, что в растворе существует термодинамически устойчивая форма, вторичная структура которой соответствует предсказанной.

6. Доказано, что процедура образования пространственной структуры основной нити паутины включает несколько этапов, в ходе которой реализуются по крайней мере две термодинамически устойчивые формы.

7. Разработан метод расчета антипараллельной Р-структуры в белках. Показано, что его точность превышает точность известных методов расчета аналогичных структур.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Рагулина, Лариса Евгеньевна, 2007 год

1. Фриц Фольрат. Паучьи сети и шелк. // Ж. В мире науки 1992; 5,46-53.

2. S. Tasman, P. R. Shewry. Elastomeric proteins: biologycal roles, structure andmecanisms. // TIBS 2000.

3. M. Berenbaum. Spin control. //Science 1995; Sept./Oct.: 13-15.

4. Gosline J. M., et al. The mechanical design of spider silk: from fibroin sequence to mechanical function. // J. Exp. Biol. 1999; 202: 3295 3303.

5. Cheryl Y. and a.e. Hypotheses that correlate thesequence, structure, and mechanical properties of spider silk protein. //J. Biol. Macromol. 1999; 24: 271-275.

6. Z. Shao, F. Vollrath. Surprising strength of silkworm silk. // Nature 2002; 418: 741.

7. Bo Madsen and a.e. Variability in the mechanical properties of spider silks on three levels: interspecific, inttraspecific and intraindividual. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 301-306.

8. Anne M. F. Moore, Kimly Tran. Material properties of cobweb silk from the black widow spider Latrodectus hesperus. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 277-282.

9. Denny, M., et al. The physical properties of spider's silk and their role in the design of orb webs. // J. Exp. Biol. 1976; 65:483 - 506.

10. Fritz Vollrath. Biology of spider silk. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 81-88.

11. Work R. W. Dimensions, birefringence and force elongation behaviour of major and minor ampullate silk fibres from orb - web spinning spiders. // Text. Res. J. 1977; 47: 650 -662.

12. Lynn W. Jelinski et al. Orientation, structure, wet spinning, and molecular basis for supercontraction of spider dragline silk. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 197 - 201.

13. Michael, В., et al. Synthetic spider silk: a modular fiber. // J. Science 2000; 18: 374 379.

14. J. Gatesy and a.e. Extreme diversity, conservatin, and convergence of spider silk fibroin sequences. // Science 2001; 291: 2603-2605.

15. Simmons, A. H. et al. Molecular orientation and two component nature of the crystalline fraction of spider dragline silk. // J. Science 1996; 271: 84 - 87.

16. D. A. Tirrell. Putting a new on spider silk. // Science 1996; 271:39-40.

17. E. Oroudjev and a.e. Segmented nanofibers of spider dragline silk: Atomic force microscopy and single-molecule force spectroscopy. // Natl. Acad. Sci. USA 2002; 199: 6460-6465.

18. J. D. Van Beek and a.e. The molecula structure of spider dragline silk: folding and oroentation of the protein backbone. // PNAS 2002; vol 99, no. 16,10266-10271.

19. Michael, В., et al. Synthetic spider silk: a modular fiber. // J. Science 2000; 18: 374 379.

20. Rathore О. and Sogah D. Self-assembly of -sheets into nanostructures by poly(alanine) segments incorporated in multiblock copolymers inspired by spider. // J. Am. Chem. Soc. 2001; 123:5231 -5239.

21. Cheril Y., Randolph V. L. Evidence from flagelleform silk cDNA for the structural basia of elasticity and modular nature of spider silk. // J. Mol. Biol. 1998; 275: 773-784.

22. Liang Ding, Cang Chen and a.e. The pentapeptide GGAGG has P|| conformation. // J. Am. Chem. 2003; 125: 8092 8093.

23. Hyoung-Joon Jin, David L. Caplan. Mechanism of silk processing in insects and spiders. //Nature 2003; 424:1057-1061.

24. Fritz Vollrath, David P.Kinght. Liquid crystalline spinning of spider silk. //Nature 2001; 1410: 541-548.

25. E. K. Tillinghast, M. A. Townley. Silk glands of Araneid spiders. Selected morfological and Physiological aspects. // Silk polymers: materials science and biotechnology 1994; 29-44.

26. M. Elices. (2000) Structural Biological Materials Design and structure-property relationships.

27. Makeev, V. Ju. and Tumanyan, V.G. Search of periodicities in primary structure of biopolymers: ageneral Fourier approach. //J. Cabios 1996; 12:49 54.

28. A. Lazaris and a.e. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in Mammalian cells. // Science 2002; 295:472-476.

29. S.R. Fahnestock & L. A. Bedzyk. Production of sinthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. //Mocrobiol. Biotecnol. 1997; 47: 33-39.

30. Vollrath F., Kinght D.P. Liquid crystalline spinning of spider silk. // Nature. 2001. V. 410. P.541.

31. Xu M., Lewis R.V. Structure of a protein superfiber: spider dragline silk. //Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87(18). P. 7120.

32. Финкельштейн A.B. Введение в физику белка. 2002.

33. Pedersen J.T. & Moult J. Protein folding simulation with genetic algorithms and a detailed molecular description. // J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 240.

34. Mohanty D., Elber R. Kinetics of peptide folding: computer simulations of SYPFDV and peptide varians in water. // J.Mol. Biol. 1997. V. 272. P.423.

35. Koehl P. & Levitt M. De novo protein design. I. In search of stability and specificity. // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. P.1161.

36. Chipot C. Free energy calculation in biological systems. How useful are they in practice? // Free energy calculation. P. 183.

37. Kollman P.A. Free energy calculations: Applications to chemical and biochemical phenomena // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 2395.

38. Gosline J.M., DeMont M.E., Denny M.W. The structure and properties of spider silk. // Endeavour 1986;10:37-43.

39. Blackledge T.A., Hayashi C.Y. Silken toolkits: biomechanics of silk fibers spun by the orb web spider Argiope argentata (Fabricius 1775). // J Exp Biol 2006; 209:2452-2461.

40. Hayashi C.Y., Shipley N.H., Lewis R.V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. // Int J Biol Macromol 1999; 24:271-275.

41. Hayashi C.Y., Blackledge T.A., Lewis R.V. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. // Mol Biol Evol 2004; 21: 1950-1959.

42. Sponner A., Schlott В., Vollrath F., Unger E., Grosse F., et al. Characterization of the protein components of Nephila clavipes dragline silk. // Biochemistry 2005; 44: 47274736.

43. Zhao A., Zhao Т., Nakagaki K., Zhang Y-S, SiMa Y., et al. Novel molecular and mechanical properties of egg case silk from wasp spider, Argiope bruennichi. // Biochemistry-US 2006; 45: 3348-3356.

44. Nadia A. Ayoub, Jessica E. Garb, Robin M. Tinghitella, Matthew A. Collin, Cheryl Y. Hayashi. Blueprint for a High-Performance Biomaterial: Full- Length Spider Dragline Silk Genes. // PLoS ONE 2007; Issue 6, e 514.

45. Blackledge T.A., Hayashi C.Y. Silken toolkits: biomechanics of silk fibers spun by the orb web spider Argiope argentata (Fabricius 1775). // J Exp Biol 2006; 209:2452-2461.

46. O'Brien J.P., Fahnestock S.R., Termonia Y., Gardner K.H. Nylons from nature: synthetic analogs to spider silk. // Adv Mater 1998; 10:1185-1195.

47. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silkelastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation. // Transgenic Res. 2004; 13: 51-57.

48. Bini E., Foo C.W.P., Huang J., Karageorgiou V., Kitchel В., et al. RGDfunctionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial // Biomacromolecules 2006; 7: 3139— 3145.

49. Scheller J., Gu'hrs K-H, Grosse F., Conrad U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. // Nat Biotechnol 2001; 19: 573-577.

50. Foo C.W.P., Bini E., Huang J., Lee S.Y., Kaplan D.L. Solution behavior of synthetic silk peptides and modified recombinant silk proteins. // Appl. Phys. 2006; 82: 193-203.

51. Ittah S., Cohen S., Garty S., Cohn D., Gat U. An essential role for the Cterminal domain of a dragline spider silk protein in directing fiber formation. // Biomacromolecules 2006; 7: 1790-1795.

52. Sprague K.U. The Bombyx mori silk proteins: characterization of large polypeptides. // Biochemistry 1975; 14: 925-931.

53. Sponner A., Vater W., Rommerskirch W., Vollrath F., Unger E., et al. The conserved C-termini contribute to the properties of spider silk fibroins. // Biochem Biophys. Res. Commun. 2005; 338: 897-902.

54. Motriuk-Smith D., Smith A., Hayashi C.Y., Lewis R.V. Analysis of the conserved N-terminal domains in major ampullate spider silk proteins. // Biomacromolecules 2005; 6: 3152-3159.

55. Rising A., Hja" lm G., Engstro'm W., Johansson J. N-terminal nonrepetitive domain common to dragline, flagelliform, and cylindriform spider silk proteins. // Biomacromolecules 2006; 7:3120-3124.

56. Sakharkar M.K., Kangueane P. Genome SEGE: A database for 'intronless' genes in eukaryotic genomes. // BMC Bioinformatics 2004; 5: 67.

57. Guerette P.A., Ginzinger D.G., Weber B.H.F., Gosline J.M. Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family. // Science 1996; 272: 112115.

58. Beckwitt R., Arcidiacono S. Sequence conservation in the C-terminal region of spider silk proteins (spidroin) from Nephila clavipes (Tetragnathidae) and Araneus bicentenarius (Araneidae). // J. Biol. Chem. 1994; 269: 6661-6663.

59. Garb JE, DiMauro T, Vo V, Hayashi CY Silk genes support the single origin of orb webs. // Science 2006; 312:1762.

60. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kail S., Peter M. Vogt Use of spider silk fibres as an innovative material in a biocompatible artificial nerve conduit. // J. Cell. Mol. Med. 2006; Vol 10, No 3, pp. 770-777.

61. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard Т., Chothia C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. // J. Mol. Biol. 1995; 247: 536-540.

62. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on positionspecific scoring matrices. // J. Mol. Biol. 1999; 292:195-202.

63. Rost B, Sander C. Third generation prediction of secondary structures. // Methods Mol. Biol. 2000;143:71-95.

64. Wolf Y.I., Grishin N.V., Koonin E.V. Estimating the number of protein folds and families from complete genome data. // J. Mol. Biol. 2000; 299: 897-905.

65. Sternberg M.J., Thornton J.M. On the conformation of proteins: the handedness of the connection between parallel beta-strands. // J. Mol. Biol. 1977;110:269-283.

66. Woolfson D.N., Evans P.A., Hutchinson E.G., Thornton J.M. Topological and stereochemical restrictions in beta-sandwich protein structures. // Protein. Eng. 1993; 6: 461-470.

67. Salem G.M., Hutchinson E.G., Orengo C.A., Thornton J.M. Correlation of observed fold frequency with the occurrence of local structural motifs. // J. Mol. Biol. 1999; 287: 969981.

68. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank. // Nucleic Acids Res. 2000; 28:235-242.

69. Taylor W.R. Towards protein tertiary fold prediction using distance and motif constraints. // Protein Eng. 1991; 4: 853-870.

70. Karplus K., Barrett C., Hughey R. Hidden Markov models for detecting remote protein homologies. // Bioinformatics 1998; 14: 846-856.

71. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z. Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. //Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402.

72. Shi J., Blundell T.L., Mizuguchi K. Fugue: sequence-structure homology recognition using environment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties. // J. Mol. Biol. 2001; 310:243-257.

73. Lindahl E., Elofsson A. Identification of related proteins on family, superfamily and fold level. // J. Mol. Biol. 2000; 295:613-625.

74. Robert E. Steward, Janet M. Thornton. Prediction of Strand Pairing in Antiparallel and Parallel P-Sheets Using Information Theory. // PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 2002;48:178-191.

75. Minor D.L. Jr, Kim P.S. Measurement of the beta-sheet-forming propensities of amino acids. //Nature 1994; 367:660-663.

76. Minor D.L. Jr, Kim P.S. Context-dependent secondary structure formation of a designed protein sequence. //Nature 1996; 380: 730-734.

77. Cootes A.P., Curmi P.M., Cunningham R., Donnelly C., Torda A.E. The dependence of amino acid pair correlations on structural environment. // Proteins 1998; 32 :175-189.

78. Merkel J.S., Regan L. Aromatic rescue of glycine in beta sheets. // Fold. Des. 1998; 3: 449-455.

79. Hutchinson E.G., Sessions R.B., Thornton J.M., Woolfson D.N. Determinants of strand register in antiparallel beta-sheets of proteins. //Protein Sci. 1998; 7:2287-2300.

80. Mandel-Gutfreund Y., Zaremba S.M., Gregoret L.M. Contributions of residue pairing to beta-sheet formation: conservat // J. Mol. Biol. 2001; 305:1145-1159.

81. Merkel J.S., Sturtevant J.M., Regan L. Sidechain interactions in parallel beta sheets: the energetics of cross-strand pairings. // Struct. Fold. Des. 1999; 7:1333-1343.

82. Smith C.K., Regan L. Guidelines for protein design: the energetics of beta sheet side chain interactions. // Science 1995; 270: 980-982.

83. Zaremba S.M., Gregoret L.M. Context-dependence of amino acid residue pairing in antiparallel beta-sheets. // J. Mol. Biol. 1999; 291:463^179.

84. Hubbard T.J. Use of beta-strand interaction pseudo-potentials in protein structure prediction and modelling. // In: Lathrop RH, editor. Protein structure prediction minitrack of the 27th HICSS. New York: IEEE Computer Society Press 1994; p 336-354.

85. Hubbard T.J., Park J. Fold recognition and ab initio structure predictions using hidden Markov models and beta-strand pair potentials. // Proteins 1995; 23:398-402.

86. Bochicchio B, Pepe A, Tamburro AM. On (GGLGY) synthetic repeating sequences of lamprin and analogous sequences. // Matrix Biol. 2001; 20(4):243-250