Изучение экспрессии синтетических генов спидроина и стабильности их продуктов в растениях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Абдеева, Инна Александровна

• Абдеева, Инна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Абдеева, Инна Александровна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Белки паутины.:.

1.1.1. Свойства белков паутины. 1.1.2. Состав и структура белков-паутины

1.1.3. Механизм прядения нити шелка насекомыми и пауками.

1.1.4. Искусственное прядение нитей паутины .!.

1.1.5. Биоматериалы на основе белков шелка и их применение.

1.2. Гены спидроина и их экспрессия в гетерологичных организмах.

1.3. Лихеназа (р-1,3-1,4-глюканаза) Clostridium termocellum как транскрипционный и трансляционный репортер.л

Глава И. Материалы и методы.

Глава III. Результаты и обсуждение.

3.1. Нуклеотидная последовательность синтетического гена спидроина 1 и ее анализ с целью экспрессии в растениях.

3.2. Получение трансгенных растений гаплоида табака, экспрессирующих синтетические гены спидроина 1.

3.2.1. Конструирование экспрессионных векторов синтетических генов спидроина 1 для трансформации растений табака.

3.2.2. Конститутивная экспрессия синтетических генов белков — аналогов спидроина 1 в трансгенных растениях табака.

3.3. Получение и анализ растений картофеля, экспрессирующих синтетические гены спидроина 1.;.

3.3.1. Разработка методических приемов трансформации растений картофеля сортов отечественной селекции.:.

3.3.2 Молекулярно - биологический анализ растений картофеля, экспрессирующих синтетический ген спидроина 1.;.'.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение экспрессии синтетических генов спидроина и стабильности их продуктов в растениях»

Пауки и паутина - всегда вместе. К настоящему времени описано около 34000 видов пауков, каждый цз которых способен производить несколько различных нитей паутины, которые образуют паутинный шелк. Лучше всех изучены каркасные нити шелка паутины, которые образованы двумя белками - спидроином 1 и 2. Эти белки являются типичными представителями фибриллярных белков.

Литературные данные о структуре последовательностей кДНК и генов белков паутины свидетельствуют о том, что практически все они состоят из большого числа повторяющихся элементов. Наличие большого количества повторов в составе генов белков паутины обусловливают структуры этих белков, состоящих из повторяющихся пептидных мотивов (модулей), в которых полиаланиновью блоки чередуются с участками, обогащенными глицином. Выявлены консенсусные последовательности внутри повторяющихся пептидных модулей у многих белков паутины, которые, в свою очередь, повторяются множество раз по всей длине каждого белка.

Благодаря своим структурным особенностям, белки каркасной нити являются удобными моделями для изучения взаимосвязи между структурой и функциями фибриллярных белков, а также представляют собой уникальный биоматериал, сочетающий удивительную прочность и эластичность: Возможность использования этих белков как для фундаментальных, так и прикладных исследований обусловлена тем, что свойства большинства модулей белков паутины изучены достаточно хорошо у различных видов пауков, и выявлена удивительная корреляция между качественным- составом модулей каждого белка и его физическими свойствами - эластичностью и/или прочностью. Таким образом, меняя последовательности исходных модулей и следя за изменениями механо-химических свойств соответствующих фибрилл, можно, с одной стороны, моделировать структурно-функциональные взаимоотношения белков этого типа, а, с другой стороны, разрабатывать искусственные белки— аналоги белков паутины с заранее. заданными свойствами и создавать на их основе материалы с различным сочетанием свойств прочности и эластичности.

В связи с этим ряд исследователей попытались выделить кДНК природных генов и\или получить генно-инженерные аналоги генов, кодирующих белки паутины, и разработать эффективные системы экспрессии этих генов; Использование для этих целей бактерий не привело, однако, к значительным успехам: выход целевого продукта был невелик, синтезировать белки размером более 1000 аминокислотных остатков оказалось невозможным из-за преждевременной терминации трансляции, клонированные гены были нестабильны, вследствие своей периодической природы; Несколько лучшие показатели были достигнуты в случае использования дрожжей Р1сЫа Однако в этом случае успех ограничивала проблема дорогостоящих ферментаций и сложной процедуры выделения искомых белков из клеток-продуцентов. В связи с вышеизложенным,- поиск и разработка новых эффективных систем экспрессии генов, кодирующих белки шелка паутины, являются ' актуальным направлением исследований. В качестве такой системы экспрессии могут быть предложены растения. Известно, что растения в своем геноме стабильно поддерживают собственные протяженные гены с прямыми повторами и эффективно синтезируют собственные сложные белки типа фибриллярных. Кроме того,, растения в качестве продуцентов обладают такими преимуществами, как наличие высокоэффективных методов трансформации, разработанных для многих видов растений, отлаженная технология сбора, хранения и переработки растительного материала, до их. использования, простота масштабирования производства. Помимо этого, использование природных полимеров позволит снизить токсичную нагрузку, оказываемую высокотехнологическими производствами, на природу.

Цель исследования: изучить возможность использования растений для экспрессии синтетических генов, кодирующих рекомбинантные аналоги белков паутины. ,

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ нуклеотидной последовательности синтетического гена, кодирующего аналог белка спидроина 1, и его аминокислотной последовательности. Для этого:

- определить ОС-содержание в нуклеотидных последовательностях кДНК спидроина 1", синтетического гена 7/5, который был выбран нами для исследований, и генов некоторых видов растений; провести . сравнительный анализ частоты использования кодонов синтетического гена спидроина 1 в растениях табака и растениях картофеля, используемых нами в работе;

- провести анализ; транскрипта синтетического, гена спидроина 1 на наличие областей, которые могут быть узнаны растительными клетками как интроны; провести сравнительный анализ первичной аминокислотной последовательности и состава белкового продукта синтетического гена спидроина 1 и кДНК природного гена спидроина 1.

2. Изучить экспрессию синтетических генов - аналогов генов белка шелка паутины (спидроинов) в модельных растениях табака. Для этого:

- сконструировать растительные экспрессионные векторы, в которых последовательности синтетических генов, кодирующих аналоги белков каркасной нити паутины спидроина 1, содержащие различное число мономеров и слитые в одной рамке считывания с последовательностью репортерного гена лихеназы (/г'сВМ2), находятся под контролем различных промоторов;

- получить и провести молекулярно-биологический анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих гибридные гены спидроина 1.

3. Изучить экспрессию синтетических генов - аналогов генов белка шелка паутины (спидроинов) и стабильность белкового продукта в растениях картофеля. Для этого: - . получить и провести молекулярно-биологический. анализ первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих гибридные гены спидроина 1;

- провести сравнительное изучение экспрессии гибридных генов спидроина 1 в различных органах первичных трансформантов картофеля . (листья и микроклубни);

- определить уровень накопления гибридных белков спидроина 1 в трансгенных растениях картофеля в период вегетации и стабильность этих белков при хранении клубней этих растений.

Научная новизна диссертационной работы. Показано, что геном растений способен поддерживать в своем составе синтетические гены белков паутины, состоящие из повторяющихся последовательностей и осуществлять эффективную экспрессию этих генов с образованием полноразмерных белковых продуктов. Впервые показано, что GC-богатая гетерологичная последовательность гибридного гена спидроина 1 в геноме трансгенных растений табака и картофеля поддерживается в активном состоянии. Продемонстрировано, что растения являются подходящими. продуцентами белков шелка паутины. Присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает проведение отбора и анализа экспрессии таких белков в трансгенных растениях, что является важным при проведении поисковых исследований.

Апробация результатов работы. На IIth International Congress on "Molecular Plant-Microbe Interactions" (С-Петербург, Россия, 2003); Международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Минск, Беларусь, 2004); III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2004); Международной конференции "Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология" (Minsk,

Belarus, 2004); Международной конференции «Новые информационные технологии ■ в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2005); 8th Iranian Congress of Biochemistry and First International Congress of Biochemistry & Molecular Biology (Tehran, Iran, 2005); на заседании научного семинара Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Абдеева, Инна Александровна

Выводы

1. Анализ нуклеотидной последовательности синтетического гена спидроина 1 показал, что синтетический ген не требует модификаций для экспрессии в растениях, поскольку его последовательность не содержит редких ко донов для растений табака и картофеля и транс крипт синтетического гена спидроина 1 не содержит последовательностей, которые могут быть узнаны растительными клетками как интроны, при этом первичная аминокислотная последовательность и состав белкового продукта синтетического гена спидроина 1 схожи с таковыми для природного белка спидроина 1.

2. Геном растений способен поддерживать в своем составе синтетические гены спидроина 1, состоящие из повторяющихся последовательностей и имеющие высокое содержание вС пар, и осуществлять синтез соответствующих белковых продуктов.

3. ОС-богатая гетерологичная последовательность гибридного гена спидроина 1 в геноме трансгенных растений табака и картофеля поддерживается в активном состоянии.

4. Стратегия, основанная на конструировании и экспрессии гибридных белков, в состав которых входит репортерных белок лихеназа, облегчает отбор и анализ экспрессии гибридных белков в трансгенных растениях, и является обоснованной и адекватной при проведении поисковых исследований.

5. Эффективность экспрессии синтетических генов спидроинов и уровень накопления их продуктов в растениях зависят от силы промотора, количества повторов, органоспецифичности и вида растения, и не зависят от фазы онтогенеза и длительности хранения растительного материала.

Заключение

Проведенный анализ нуклеотидной последовательности синтетического гена спидроина 1 показал, что синтетический ген не содержит редких для растений табака и картофеля кодонов, однако, имеет повышенное содержание ОС-пар (62%). Транскрипт синтетического гена спидроина 1 не содержит последовательностей, которые могут быть, узнаны растительными клетками как интроны, при этом первичная аминокислотная последовательность и состав белкового продукта синтетического гена схожи с таковыми для природного белка спидроина 1. Таким образом, из анализа нуклеотидной последовательности синтетического гена можно заключить, что исследуемый нами ген не требует модификаций для экспрессии в растениях.

Изучение экспрессии гибридного гена, содержащего различное число мономеров и последовательность репортерного гена терм о стабильной лихеназы, показало, что растения табака способны осуществлять экспрессию генов, имеющих повторяющиеся мотивы и высокое содержание ОС пар, и синтезировать соответствующие белковые продукты. Соответствие размеров выявляемых гибридных генов теоретически ожидаемым свидетельствует о том, что геном растений способен поддерживать в своем составе синтетические гены белков паутины, состоящие из повторяющихся последовательностей.

Наилучший выход регенерантов, наблюдается в случае использования сорта «Юбилей Жукова». Более высокий процент первичных трансформантов растений картофеля, отобранных по лихеназной: активности^ получен при использовании клубневых эксплантов, по сравнению с таковым для стеблевых. При этом эффективность трансформации при- использовании конструкции с девятью повторами спидроииа была на порядок выше, чем при использовании конструкции с пятью повторами спидроина.

Изучение экспрессии гибридных генов, содержащих различное число мономеров спидроина и последовательность репортерного гена термостабильной лихеназы, показало, что растения картофеля способны осуществлять эффективный синтез гибридных белков спидроина 1, при этом отмечено стабильное содержание гибридных белков спидроина 1 в растениях в период вегетации и при хранении сельскохозяйственных культур, что важно при использовании растений в качестве биофабрик для наработки гетерологичных белков.

В двух видах трансгенных растений - в табаке и картофеле, GC-богатая гетерологичная последовательность гибридного гена спидроина 1 поддерживается в активном состоянии, и, вероятно, проявляет устойчивость к метилированию, аналогично СрО-островкам из генома человека, которые при случайной инсерции в растительный геном оказываются защищенными от метилирования. Эти результаты свидетельствовать в пользу модели^ предложенной Т. Meza с соавторами [Meza.et al., 2002], согласно которой GG-богатые последовательности и соседний трансген (в нашем случае - ген nptll и последовательность репортерного гена лихеназы) поддерживаются в открытой структуре хроматина, которая обеспечивает высокий уровень экспрессии трансгенов.

Результаты по экспрессии гибридных генов в растениях табака и картофеля, а также данные по стабильности очищенного белка спидроина 1. полученного в результате экспрессии синтетического гена в клетках дрожжей, свидетельствуют о том, что «горячие точки» протеолиза в полноразмерном белковом продукте спидроина 1, вероятнее всего, располагаются на стыках белковых мономеров.

Термостабильная лихеназа использована в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов, определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Метод зиммограм - метод качественного определения активности лихеназы - может использоваться как альтернативный методу Вестерн-блот гибридизации, при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортера, поскольку молекулярные массы гибридных белков, определенные методом Вестерн-блот гибридизации, соответствует молекулярным массам этих белков на зимограммах. Стратегия, основанная на конструировании и экспрессии гибридных белков, в состав которых входит репортерных белок, облегчает отбор и анализ экспрессии гибридных белков в трансгенных организмах, и является обоснованной и адекватной при проведении поисковых исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Абдеева, Инна Александровна, 2005 год

1. Голденкова И. В., Мусийчук К. А., Пирузян Э. С. (2003) Бифункциональные репортерные гены: конструирование и экспрессия в клетка про- и эукариот // Молекуляр. биология,-V.37(2).-Р. 1-9.

2. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство,-Москва: Мир, 1991.-408с.

3. Зверлов В. В. (1993). Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характеристика продукта данного гена. . Москва, ИМГ РАН.

4. Мовсесян Н. Р., Ализаде X., Абдеев Р. М., Мусийчук К. А., Попов Ю. Г., Пирузян Э. С. (2001) Трансгенные растения табака, экспрессирующие бактериальные гены термостабильных глюканаз// Генетика,- V.37.- Р.745-752.

5. Мусийчук К. А., Голденкова И. В., Абдеев Р. М., Кобец II. С., Пирузян Э. С. (2000) Получение и свойства делеционных вариантов:лихеназы^ Clostridium thermocellumм создание на их основе бифункциональных гибридных белков// Биохимия,- V.65(12).-Р.1659-1665.

6. Патрушев Л. И. Экспрессия генов.- Москва: Наука, 2000,-527с.

7. Салехи Джузани Г. Р. Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЗ a; Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках . Автореферат кандидатской диссертации,- Москва, 2005.-24с.

8. Яшина И. М., Склярова Н. П., Симаков Е. А., Коршунов А. В. Сорта,картофеля селекции ВНИИКХ / Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха,-Москва: Колос, 2000.-36с.

9. Alliotte Т., Zhu L. Н., Van Montagu М. and Inze D. (1988) Plant expression vectors with the origin of replication of the W-type plasmid sa.// Plasmid.- V.l 9.- P.251-254.

10. Altman G. H., Diaz F., Jakuba C., Calabro Т., Horan R. L., Chen J., Lu H., Richmond J. and Kaplan D. L. (2003) Silk-based biomaterials// Biomaterials.- V.24(3).- P.401-416.

11. Altman G. H., Horan R. L., Lu H. H., Moreau J., Martin I., Richmond J. C. and Kaplan D. L. (2002) Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments// Biomaterials.1. V.23(20).- P.4131-4141.

12. Arai T., Freddi G., Innocenti R. and Tsulcada M. (2004) Biodégradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films// J Appl Polym Sci.- V.91.- P.2383-2390.

13. Arcidiacono S., Mello C., Kaplan D. L., Cheley S. and Bayley H. (1998) Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli// Appl. Microbiol. Biotechnol.- V.49.- P.31-38.

14. Arcidiacono S., Mello C. M., Butler M., Welsh E., Soares J. W., Allen A., Ziegler D., Laue T. and Chase S. (2002) Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks.//Macromolecules.-V.35.-P. 1262-1266.

15. Ashida J., Ohgo K., IComatsu K, Kubota A. and Asakura T. (2003) Determination of the torsion angles of alanine and glycine residues of model compounds of spider silk (AGG)(10) using solid-state NMR methods// J Biomol NMR.- V.25(2).- P.91-103.

16. Bamide G. A., Townley M. A. and Tillinghast E. K. (1988) Orb web recycling in Araneus cavaticus (Araneae, Araneidae) with an emphasis on the adhesive spiral component// The Journal of Arachnology.- V.16(3).- P.303-319.

17. Beclcwitt R. and Arcidiacono S. (1994) Sequence conservation in the C-terminal region of spider silk proteins (Spidroin) from Nephila clavipes (Tetragnathidae) and Araneus bicentenarius (Araneidae)// J Biol Chem:- V.269(9).- P.6661-6663.

18. Bini E., Knight D. P. and Kaplan D. L. (2004) Mapping domain structures in silks from insects and spiders related to protein assembly// J Mol Biol.- V.335(1).- P.27-40.

19. Bradford M. M. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding// Anal. Biochem.- V.72.-P.248-254.

20. Chavancy G., Marbaix G., Huez G. and Cleuter Y. (1981) Effect of tRNA pool balance on rate and uniformity of elongation during translation of fibroin mRNA in a reticulocyte cellfree system// Biochimie.- V.63(7).- P.611-618.

21. Chen X., Knight D. P. and Vollrath F. (2002) Rheological characterization of nephila spidroin solution// Biomacromolecules.- V.3(4).- P.644-648.

22. Chiu W. L., Niwa Y., Zeng W., Harano T., Kobayashi H. and Sheen J. (1996) Engineering GFP as a vital reporter in plants// Curr Biol.- V.6.- P.325-330.

23. Colgin M. A. and Lewis R. V. (1998) Spider minor ampullate silk proteins contain new repetitive sequences and highly conserved non-silk-like "spacer regions"// Protein Sci.~ V.7(3).- P.667-672.

24. Craig C. IL., Riekcl C., Herberstein Mi E., Weber R. S., Kaplan D. and Pierce N. E. (2000) Evidence for diet effects on the composition of silk proteins produced by spiders// Mol? Biol Evol.- V. 17(12).- P. 1904-1913.

25. Cubbit A. B., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A. and Tsien R. Y. (1995) Understanding, improving and using Green Fluorescent Proteins// Trends Biochem. Sei. -V.20.- P.448-455.

26. De Greevc H., Dhaese P., SeurinekJ., Lemmers M., Van Montagu M. and Schell J. (1982) Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid encoded octopine synthase:gene// J. Mol. Appl. Genet.- V.l.- P.499-571.

27. De Picker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P. and Goodman H. (1982) Nopaline synthase, transcript maping and DNA sequence// J. Mol. Appl. Genet.- V.l.- P.561-567.

28. De Wilde C., Van I-Ioudt H., De Buck S., Angenon G., De Jaeger G. and Depiclcer A. (2000) Plants as bioreactors for protein production: avoiding the problem of transgene silencing// Plant Mol Biol.- V.43(2-3).- P.347-359.

29. Dicko C., Kenney J. M., Knight D. and Vollrath F. (2004) Transition to a beta-sheet-rich stmcture in spidroin in vitro: the effects of pH and cations//Biochemistry.- V.43(44).1. P. 14080-14087.

30. Dunn M. G., Avasarala P. N. and Zawadsky J. P. (1993) Optimization of extruded collagen iibersfor ACL reconstruction.// J Biomed Mater Res.- V.27.- P.1545-1552.

31. Frank B. C. and Jackson D. W. (1997) The science of reconstruction of the anterior cruciate ligament// J Bone Joint Surg Am.- V.79.- P.1556-1576.

32. Fukushima Y. (1998) Genetically engineered syntheses of tandem repetitive polypeptides consisting, of glycine-rich sequence of spider dragline silk// Biopolymers.- V,45(4):- P.269-279.

33. Giddings G. (2001) Transgenic plants as protein factories// Current Opinion in Biotechnology V.l2,- P.450-454.

34. Gotoh Y., Tsukada M. and Minoura N. (1998) Effect of the chemical modification of the arginyl residue in Bombyx morí silk fibroin on the attachment and growth of fibroblast eel Is// J Biomed Mater Res.- V.39(3).- P.351-357.

35. Gotoh Y., Tsukada M., Minoura N. and Imai Y. (1997) Synthesis of poly(ethylene glycol)-silk fibroinconjugates and surface interaction between L-929 cells and.the conjugates// Biomaterials.- V. 18(3).- P.267-271.

36. Hayashi C. Y. and Lewis R. V. (1998) Evidence from flagelliform silk cDNA for the structural basis of elasticity and modular nature of spider silks. // J. Mol.Biol. .- V.275.- P:773-784,

37. Hayashi C. Y. and Lewis R. V. (2000) Molecular architecture and evolution of a modular spider silk protein gene// Science.-V.287(5457>- P.1477-1479.

38. Hayashi C. Y. and Lewis R. V. (2001) Spider flagelliform silk: lessons in protein design¿ gene structure, and molecular evolution// Bioessays.- V.23(8).- P.750-756.

39. Hinman M. В., Jones .T. A. and Lewis R. V. (2000) Synthetic spider silk: a modular fiber// Trends Biotechnology.- V.l 8,- P.374-379.

40. Hinman M. B. and Lewis R. V. (1992) Isolation of a clone encoding a second dragline silk fibroin. Nephila clavipes dragline silk is a two-protein fiber// J Biol Chem.- V.267(27).-P. 19320-19324.

41. Hood E. E. and Jillca J. M. (1999) Plant-based production of xenogenic proteins// Curr Opin Biotechnol.- V.l0(4).- P.382-386.

42. Iioran R. L., Antle K., Collette A. L., Wang Y., Huang J., Moreau J. E., Volloch V., Kaplan D. L. and Altman G. H. (2005) In vitro degradation of silk fibroin// Biomaterials.-V.26(l 7).- P.3385-3393.

43. Huemmerich D., Helsen C. W., Quedzuweit S., Oschmann J., Rudolph R. and Scheibel T. (2004) Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility// Biochemistry.- V.43(42).- P.13604-13612.

44. I-Iuemmerich D., Scheibel 'Г., Vollrath F., Cohen S., Gat U. and Ittah S. (2004) Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins// Curr Biol.- V. 14(22).-P.2070-2074.

45. Hutchinson E. and Thornton .Т. (1994) A revised set of potentials for the b-turn formation in proteins. // Protein Science V.3.-P.2207-2216.

46. Inouye K., Kurokawa M:, Nishikawa S. and Tsukada M: (1998) Use of Bombyx mori silk fibroin as a substratum for cultivation of animal cells// J Biochem Biophys Meth.- V.37.-P.159-164.

47. Kaplan D. (1992a) Biosynthesis and processing of silk protein// J Materials Res. Soc. Bull.-V.17(10).-P.41-47.

48. Kempe T. (1985) Multiple-copy genes: production and modification of monomeric peptides from large multimeric fusion proteins // Gene.- V.39.- P.239-245.

49. Kenney J. M., Knight D., Wise M. J. and Vollrath F. (2002) Amyloidogenic nature of spider silk// Eur J Biochem.- V.269(16).- P.4159-4163.

50. Kim U. J., Park J., Kim H. J., Wada M. and Kaplan D. L. (2005) Three-dimensional . aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin// Biomaterials.- V.26(15).- P.2775-2785.

51. Kim U. J., Park J., Li C., Jin H. J., Valluzzi R. and Kaplan D. L. (2004) Structure and properties of silk hydrogels// Biomacromolecules.- V.5(3).- P.786-792.

52. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature.- V.227.- P.680-685.

53. Larrick J. W. and Thomas D. W. (2001) Producing proteins in transgenic plants and animals// Current Opinion in Biotechnology V.12.- P.411-418.

54. Lewis R. V., Hinman M., Kothalcota S. and Fournier M. J. (1996) Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins// Protein Expr Purif.- V.7(4).~ P.400-406.

55. Li M., Ogiso M. and Minoura N. (2003) Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets// Biomaterials.- V.24.- P.357-365.

56. Liivak 0„ Blye A., Shah N. and Jelinski L. W. (1998) A microfabricated wet-spinning apparatus to spin fibers of silk proteins. Structure property correlations. // Macromolecules.-V.31.- P.2947-2951.

57. Lu L., Peter S. J., LymanM. D., Lai H. L., Leite S. M., Tamada J. A., Uyama S., Yacanti J. P., Langer R. and Milcos A, G. (2000) In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glycolicacid) foams//Biomaterials.- V.21.- P.1837-1845.

58. Mascaronhas J. P. and Hamilton D. A. (1992) Artifacts in the localization of GUS activity in anthers of Petunia transformed with a CaMV 35S-GUS construct// Plant J.- V.2.-P.405-408.

59. Meins F. (2000) RNA degradation and models for post-transcriptional gene silencing// Plant Molecular Biology.- V.43.- P.261-273.

60. Meza T. J., Enerly E., Boru B., Larsen F., Mandal A., Aalen R. B. and Jakobsen K. S. (2002) A human CpG island randomly inserted into a plant genome is protected from methylation// Transgenic Res.- V.l 1(2).- P.133-142.

61. Minoura N., Aiba S., Gotoh Y., Tsukada M. and Imai Y. (1995) Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices// J Biomed Mater Res.- V.29(10).- P. 12151221.

62. Olsson O., Koncz C. and Szalay A. (1988) The use of the lux A gene of the bacterial luciferase operon as a reporter gene// Mol. Gen. Genet.- V.15.- P.1-9.

63. Panilaitis B., Altaian G. H., Chen J., Jin H. J., Karageorgiou V. and Kaplan D. L. (2003) Macrophage responses to silk// Biomaterials.- V.24(18).- P.3079-3085.

64. Parkhe A. D., Seeley S. K., Gardner K., Thompson L. and Lewis R. V. (1997) Structural studies of spider silk proteins in the fiber. // J. Mol. Recognit.- V. 10.- P. 1 -6. .

65. Prince J. T., McGrath K. P., DiGirolamo C. M. and Kaplan D. L. (1995) Construction, cloning, and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk// Biochemistry.-V.34(34).- P.10879-10885.

66. Rogers S. O. and Bendich A. J. (1985) Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues// Plant Molecular Biology V.5(2).- P.69-76.

67. Rossi F., Charlton C. A. and Blau H. M. (1997) Monitoring protein-protein interactions in intact eulcaryotic cells by (3-galactosidase complementation// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-V.94.- P.8405-8410:

68. Rousseau M. E., Lefevre T., Beaulieu L., Asalcura T. and Pezolet M. (2004) Study of protein conformation and orientation in silkworm and spider silk fibers using Raman microspectroscopy// Biomacromolecules:- V.5(6).- P.2247-2257.

69. Scheibel T. (2004) Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning, and: engineering of synthetic proteins//Mierob Cell Fact.- V.3(l):- P.14-28.

70. Scheller J., Guhrs K. I-L, Grosse F. and Conrad U. (2001) Production of spider silk proteins in tobacco and potato// Nat Biotechnol.- V. 19(6),- P.573-577.

71. Seidel A., Liivak O. and Jelinski L. W. (1998) Artificial spinning of spider silk.// Macromolecules V.31.- P.6733-6736.

72. Sofia S., McCarthy M. B., Gronowicz G. and Kaplan D. L. (2001) Functionalized silk-based biomaterials for bone:formation// J Biomed Mater Res.- V.54(1).- P.139-148.

73. Szela S., Avtges P., Valluzzi R, Winkler S., Wilson D., ICirschner D. and Kaplan D. L. (2000) Reduction-oxidation control of b-sheet assembly in genetically engineered1,silk// Biomacromolecules.- V. 1,- P.534-542.

74. Tillinghast E. K. (1984) The chemical fractionation of the orb web of Argiope spiders // Insect Biochemistry V.14(l).- P.115-120.

75. Vollrath F. (1999) Biology of spider silk// Int Journal of Biol Macromol.- V.24.- P.81-88.

76. Vollrath F. and Knight D. P. (2001) Liquid crystalline spinning of spider silk//Nature -V.4.1'0.- P.541-548.

77. Winkler S., Wilson D. and Kaplan D. L. (2000) Controlling beta-sheet assembly in genetically engineered silk by enzymatic phosphorylation/dephosphorylation// Biochemistry.-V.39(41).- P.12739-12746.

78. Wong Po Foo C. and Kaplan D. L. (2002) Genetic engineering of fibrous proteins: spider dragline silk and collagen// Adv Drug Deliv Rev.- V.54(8).- P.l 131-1143.

79. Wood T. M. and Bhat K. M. (1988) Methods: for measuring cellulase activities// Meth Enzymol.- V.160.- P.87-112.

80. Wooley P. H., Morren R., Andary J., Sud S., Yang S., Mayton L., Markel D., Sieving A. and Nasser S. (2002) Iiiflammatory responses to orthopaedic biomaterials in the murine air pouch// Biomaterials.- V.23.- P.517-526.

81. WorkR. W. and Young C. T. (1987) The amino acid compositions of major and minor ampullate silks of certain orb-web-building spiders (Araneae, Araneidae)// The Journal of Arachnology.- V.15(l).- P.65-80.

82. XuM. and Lewis R. V. (1990) Structure of a protein superfiber: spider dragline silk// Proc Natl Acad Sci U S A.- V.87(l 8).- P.7120-7124.

83. Yamao Ml (1999) Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus// Genes Dev. .-V.13.- P.511-516.