Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Пустовалова, Ольга Леонидовна

• Пустовалова, Ольга Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пустовалова, Ольга Леонидовна

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Характеристика каркасного паутинного шелка Nephila sp.

2.1.1 Строение каркасного шелка Nephila sp.

2.1.1.1 Первичная структура спидроинов Nephila sp.

2.1.1.2 . Вторичная и третичная структуры спидроинов Nephila sp.

2.1.1.3 Строение паутинной нити Nephila sp.

2.1.2 Физические свойства спидроинов каркасной нити паутины Nephila sp.

2.1.3 Конформационный переход и его влияние на свойства спидроинов Nephila sp.

2.2 Рекомбинантные белки и белки-аналоги спидроинов: получение, свойства и возможности применения.

2.2.1 Получение рекомбинантных аналогов паутинных белков.

2.2.1.1 Синтез в бактериальных и дрожжевых клетках.

2.2.1.2 Использование культурклеток животных в качестве продуцентов.

2.2.1.3 Трансгенные растения.

2.2.1.4 Трансгенные животные.

2.2.2 Свойства рекомбинантных аналогов спидроинов.

2.2.2.1 Модификация свойств рекомбинантных спидроинов.

2.2.2.2 Генетическая модификация рекомбинантных белков и аналогов введением дополнителных последовательностей и создание кополимеров.

2.2.3 Создание, получение и свойства белка 1F9 - аналога спидроина 1 Nephila clavipes.

2.3 Использование шелка в биоинженерии.

2.3.1. Природный паутинный шелк в биоинженерии.

2.3.1 .1 Паутинный шелк естественного происхождения.

2.3.1.2 Регенерированный паутинный шелк.

2.3.2 Возможности биоинженерного применения рекомбинантных аналогов спидроинов.

3 Материалы и методы.

3.1 Материалы.

3.1.2 Клеточные линии.

3.2 Методы.

3.2.1. Методы изготовления и модификации трехмерных матриксов и пленок

3.2.1 .1 Изготовление полимерных пленок и матриц.

3.2.1.2 Модификация матриксов глутаровым альдегидом.

3.2.1.3 Обработка полимерных матриксов коллагеном.

3.2.2 Исследование физических, морфологических и топографических свойств матриксов.

3.2.2 .1 Изучение структуры поверхности матриксов.

3.2.2.2 Тест на соединенность пор матрицы.

3.2.2.3 Сканирующая электронная микроскопия.

3.2.2.4 Лазерная конфокальная микроскопия.

3.2.2.5 Испытание деструкции матриксов.

3.2.2.6 Изучение механических свойств пористых матриксов

3.2.3 Изучение влияния топографии матрикса на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток.

3.2.3.1 Культивирование клеток.

3.2.3.2 Изучение адгезии и роста клеток в трехмерных матриксах и на поверхности полимерных пленок.

3.2.3.3 Изучение распределения клеток в матрице.

3.2.3.4 Определение жизнеспособности клеток при культивировании в матриксе из спидроина 1.

3.2.3.5 Анализ количества клеток.

3.2.4 Имплантация матриксов в подкожную ткань.

3.2.4.1 Условия хирургического вмешательства и эксперимента

3.2.5 Извлечение имплантата и подготовка образцов тканей.

3.2.5.1 Фиксация образцов и подготовка к микроскопическим исследованиям.

3.2.5.2 Подготовка срезов для гистологических исследований

3.2.5.3 Окраска срезов гематоксилином и эозином.

3.2.6 Микроскопические исследованияимплантата.

3.2.6.1 Световая микроскопия.

3.2.6.2 Витальное окрашивание сосудов в имплантатах.

4 Результаты и обсуждение.

4.1 Физические, морфологические и топографические свойства матриксов из аналога спидроина 1.

4.1.1 Макроструктура трехмерных матриксов.

4.1.2 Микроструктура трехмерных матриксов.

4.1.3 Деструкция матриксов из аналога спидроина 1.

4.1.4 Механические свойства матриксов.

4.2 Культивирование клеток в матрицах из рекомбинантного аналога спидроина 1.

4.2.1 Влияние материала из рекомбинантного аналога спидроина 1 на адгезию и пролиферацию клеток.

4.2.2 Влияние архитектуры трехмерных матриксов из рекомбинантного аналога спидроина 1 на адгезию и пролиферацию клеток

4.2.3 Распределение клеток в матрице.

3.2.4 Жизнеспособность клеток при культивировании в матрицах из рекомбинантного аналога спидроина 1.

3.2.5 Адгезия и пролиферация клеток в модифицированных матриксах из рекомбинантного аналога спидроина 1.

3.2.6 Влияние концентрации полимера при изготовлении матриц из спидроина 1 на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток.

4.3 Исследования местного действия матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации.

4.3.1 Интеграция в окружающие ткани матрицы из рекомбинантного аналога спидроина 1 после имплантации.

4.3.2 Клеточный ответ на имплантацию матрицы из рекомбинантного аналога спидроина 1 in vivo.

4.3.2.1 Ангиогенез и нейрогенез в матрицах из рекомбинантного спидроина 1 in vivo.

4.3.2.2Деградация матриц из рекомбинантного спидроина 1 in vivo

4.3.3 Отсутствие токсического действия матриц in vivo.

5 Выводы.

6 Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1»

Развитие клеточных технологий и вовлечение новых методов молукулярной биологии открывает возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Конструированием аналогов естественных тканей занимается новое синтетическое направление, возникшее на стыке биологии, медицины и технических наук — тканевая инженерия. Основой искусственных тканей становятся носители трехмерного строения (их называют матриксами или матрицами), которые служат субстратом для адгезии аутологичных клеток, способствуя поддержанию их пролиферативной активности, определяют форму и физико-механические свойства медицинского изделия. Выбор материала для изготовления матриксов определяется физическими свойствами и биологической совместимостью. В наше время предпочтение отдается полимерам биологического происхождения или композитным материалам на их основе, так как они, обладая высокой прочностью, не оказывают токсического действия, и более того, могут служить высокоэффективными биостимулярами. Например, для создания матриксов были использованы альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения [Dawson Е. et al., 2008; Lee J. et al., 2008a; Ma P., 2004; Ma P.X., 2008; Sachlos E. and Czernuszka J.T., 2003].

Уникальным материалом, сочетающим высокую прочность и эластичность, является шелк паутинной нити. Эти свойства, наряду с хорошей биологической совместимотью, делают шелк перспективным материалом для использования в тканевой инженерии. Однако получение природного паутинного шелка связано со значительными трудностями и обычно нерентабельно, а количество шелка недостаточно для широкого 6 практического применения. Успехи в расшифровке генов паутинных белков и создание их рекомбинантных аналогов позволило получить материалы, подобные природному шелку. В настоящее время исследуются свойства этих материалов, а также возможность их практического использования. В ГосНИИгенетика был получен 1F9 - аналог белка паутины Nephila clavipes [Богуш В.Г. и др., 2006; Bogush V.G. et al., 2009].

Цель работы: получить и исследовать биологические свойства трехмерных матриксов из рекомбинатного аналога спидроина 1 для применения в тканевой инженерии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать методику получения искусственных матриксов, изучить их физические, морфологические, топографические свойства и скорость деградации в модельной системе.

• Изучить способность искусственных матриксов поддерживать адгезию, пролиферацию и жизнеспособность культивируемых эукариотических клеток.

• Изучить местное действие матриксов после имплантации в ткани животных.

Научная новизна работы. Разработанный в ГосНИИгенетика рекомбинантный аналог природного спидроина Nephila clavipes был впервые использован для изготовления пористых трехмерных матриксов. Были изучены макро- и микроструктурные особенности эти конструкций, их механические свойства и способность к деградации, а также возможности химической модификации этих свойств. Мы показали, что матриксы из аналога спидроина 1 способны поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток in vitro. Впервые было изучено местное действие матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации в ткани животных.

Показано, что после имплантации материал подвергается биодеградации и замещается васкуляризованной новообразованной тканью.

Практическая значимость. Спидроины, обладают уникальным сочетанием механических свойств, являются биосовместимым, биоинертным материалом, способным к биодеградации. Разработка методов получения рекомбинантных аналогов этих белков расширила возможности практического применения спидроинов. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 можно использовать для создания конструкций медицинского назначения, таких как имплантаты для замещения значительных дефектов ткани, целостность которых не может быть восстановлена естественной физиологической репарацией. Матриксы могут служить основой для создания трехмерых клеточных культур in vitro для моделирования различных биологических процессов. Например, такие модели позволяют изучать процессы репарации и клеточной миграции. Культивирование клеток в трехмерной среде расширяет возможности исследования нормальных физиологические функций клеток и влияния на эти функции микроокружения и топографии субстрата. Внедрение новых медицинских технологий и создание новых моделей для исследований в клеточной биологии позволяет серьезно продвинуться в области восстановительной медицины и решить ряд значительных медицинских проблем биотехнологическими методами.

2 Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пустовалова, Ольга Леонидовна

5 Выводы

1. Трехмерные матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 получены методом выщелачивания. Матриксы имеют характерную незамкнутую макропористую структуру с уникальным микропористым строением стенок макропор, характеризуются высокими показателями растяжимости и прочности на разрыв, демонстрируют стабильность in vitro в нейтральной среде и разлагаются при окислении. Механическая прочность и стабильность матриксов увеличивается после химической перешивки

2. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 могут быть использованы для долговременного культивирования эукариотических клеток. Модификация структуры и свойств поверхности матриксов химической перешивкой глутаровым альдегидом, а также изменение концентрации полимера при изготовлении матрикса может влиять на рост клеток.

3. Матриксы из аналога спидроина 1 не вызывают отторжения при имплантации, происходит биорезорбция матриксов и замещение их новообразованной собственной тканью животного, что сопровождается активными процессами неоваскуляризации и нейрогенеза.

1. 6 Благодарности

Выражаю глубокую благодарность за постоянную и неоценимую помощь в проведении данной работы, важные рекомендации, поддержку и критику моему научному руководителю Мойсеновичу Михаилу Михайловичу.

Я искренне признательна моему научному руководителю профессору Агапову Игорю Ивановичу за идейное вдохновение, помощь и участие в обсуждении полученных данных.

Сердечно благодарю Васильеву Тамару Викторовну за помощь в проведении гистологического анализа и оценке полученных результатов.

Выражаю глубокую благодарю своим коллегам А.А. Рамоновой, А.Ю. Архиповой за помощь в проведении ряда экспериментов.

Выражаю признательность всем сотрудникам кафедры физиологии микроорганизмов за доброжелательность и создание в коллективе дружеской атмосферы.

Благодарю своих родных за веру, терпение и помощь, оказанную при подготовке работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пустовалова, Ольга Леонидовна, 2010 год

1. Богуш В.Г., Сазыкин А.Ю., Давыдова ЛИ., Мартиросян В.В., Сидорук К.В., Глазунов А.В., Акашина Р.И., Шматченко Н.А., Дебабов В.Г. Получение, очистка и прядение рекомбинантного аналога спидроина 1. / Биотехнология. 2006. - С.3-12.

2. Соколова О.С., Богуш В.Г., Давыдова Л.И., Полевова С.В., Антонов С.А., Неретина Т.В., Клинов Д.В., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Формирование четвертичной структуры рекомбинантными аналогами белков паутины. / Молекулярная биология. 2009. - Т.6.

3. Acharya С., Ghosh S.K., Kundu S.C. Silk fibroin protein from mulberry and non-mulberry silkworms: cytotoxicity, biocompatibility and kinetics of L929 murine fibroblast adhesion. / J Mater Sci Mater Med. 2008. - V.19, P.2827-2836.

4. Agnarsson I., Boutry C., Blackledge T.A. Spider silk aging: initial improvement in a high performance material followed by slow degradation. / J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 2008. - V.309, P.494-504.

5. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kali S., Choi C.Y., Brandes G., Kasper C., Scheper Т., Guggenheim M., Vogt P.M.

6. Spider silk fibres in artificial nerve constructs promote peripheral nerve regeneration. / Cell Prolif. 2008a. - V.41, P.408-420.

7. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kail S., Choi C.Y., Brandes G., Kasper C., Scheper Т., Guggenheim M., Vogt P.M. Spider silk fibres in artificial nerve constructs promote peripheral nerve regeneration. / Cell Prolif. 2008b. - V.41, P.408-420.

8. Altaian G.H., Diaz F., Jakuba C, Calabro T., Horan R.L., Chen J., Lu H., Richmond J., Kaplan D.L. Silk-based biomaterials. / Biomaterials. -2003.- V.24,P.401-416.

9. Anderson J.M., Rodriguez A., Chang D.T. Foreign body reaction to biomaterials. / Semin Immunol. 2008. - V.20, P.86-100.

10. Arcidiacono S., Mello C., Kaplan D., Cheley S., Bayley H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. / Appl Microbiol Biotechnol. 1998. - V.49, P.31-38.

11. Arcidiacono S., Mello C.M., Butler M., Welsh E., Soares J.W., Allen A., Ziegler D., Laue Т., Chase S. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. / Macromolecules. 2002. - V.35, P.1262-1266.

12. Bacakova L., Filova E., Rypacek F.f Svorcik V., Stary V. Cell adhesion on artificial materials for tissue engineering. / Physiol Res. 2004a.- V.53 Suppl 1, P.S35-S45.

13. Bacakova L., Filova E., Rypacek F., Svorcik, V., Stary V. Cell adhesion on artificial materials for tissue engineering. / Physiol Res. -2004b. V.53 Suppl 1, P.S35-S45.

14. Barr L.A., Fahnestock S.R., Yang J.J. Production and purification of recombinant DP IB silk-like protein in plants. / Molecular Breeding. 2004.- V.13,P.345-356.

15. Bates R.C., Lincz L.F., Burns G.F. Involvement of integrins in cell survival. / Cancer Metastasis Rev. 1995. - V.14, P.191-203.

16. Beckwitt R., Arcidiacono S. Sequence conservation in the C-terminal region of spider silk proteins (Spidroin) from Nephila clavipes (Tetragnathidae) and Araneus bicentenarius (Araneidae). / J Biol Chem. -1994. V.269, P.6661-6663.

17. Bini E., FooC.W., Huang J., Karageorgiou V., Kitchel В., Kaplan D.L. RGD-functionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial. / Вiomacromolecules. 2006. - V.7, P.3139-3145.

18. Brauker J.H., Carr-Brendel V.E., Martinson L.A., Crudele J., Johnston W.D. , Johnson R.C. Neovascularization of synthetic membranes directed by membrane microarchitecture. / J Biomed Mater Res. 1995. -V.29, P.1517-1524.

19. Cai Q., Yang J., BeiJ., Wang S. A novel porous cells scaffold made of polylactide-dextran blend by combining phase-separation and particle-leaching techniques. / Biomaterials. 2002. - V.23, P.4483-4492.

20. Campbell C.E., von Recum A.F. Microtopography and soft tissue response. / J Invest Surg. 1989. - V.2, P.51-74.

21. Candelas G.C., Cintron J. A Spider Fibroin and Its Synthesis. / Journal of Experimental Zoology. 1981. - V.216, P.l-6.

22. Chen X., ShaoZ., Marinkovic N.S., Miller L.M., Zhou P., Chance M.R. Conformation transition kinetics of regenerated Bombyx mori silk fibroin membrane monitored by time-resolved FTIR spectroscopy. / Biophys Chem. 2001. - V.89, P.25-34.

23. Craig C.L., Riekel C. Comparative architecture of silks, fibrous proteins and their encoding genes in insects and spiders. / Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol. 2002. - V.133, P.493-507.

24. Curtis A., Wilkinson C. Topographical control of cells. / Biomaterials. -1997.-V.18, P.1573-1583.

25. Dal P, I, Freddi G., Minic J., Chiarini A., Armato U. De novo engineering of reticular connective tissue in vivo by silk fibroin nonwoven materials. / Biomaterials. 2005. - V.26, P.l987-1999.

26. Dash R., Ghosh S.K., Kaplan D.L., Kundu S.C. Purification and biochemical characterization of a 70 kDa sericin from tropical tasar silkworm, Antheraea mylitta. / Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol. 2007. - V.147, P. 129-134.

27. Daws on E., Mapili G., Erickson K., Taqvi S., Roy K. Biomaterials for stem cell differentiation. / Adv Drug Deliv Rev. 2008. - V.60, P.215-228.

28. Dicko C., Kenney J.M., Knight D., Yollrath F. Transition to a beta-sheet-rich structure in spidroin in viti'o: the effects of pH and cations. / Biochemistry. 2004a. - V.43, P. 14080-14087.

29. Dicko С., Vollrath F., Kenney J.M. Spider silk protein refolding is controlled by changing pH. / Biomacromolecules. 2004b. - V.5, P.704-710.

30. Edwards S.L., Mitchell W., Matthews J.B., Ingham E., Russell S J. Design of nonwoven scaffold structures for tissue engineering of the anterior cruciate ligament. / AUTEX Research Journal. 2004. - V.4, P.86-94.

31. Exler J.H., Hummerich D., Scheibel T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. / Angew Chem Int Ed Engl. 2007. -V.46, P.3559-3562.

32. Fahnestock SR. Novel, recombinantly produced spider silk analogs. Internal Application number PCT/US94/06689, Internal Publication number WO 94/29450

33. Fahnestock S.R., Bedzyk L.A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. / Appl Microbiol Biotechnol. 1997. - V.47, P.33-39.

34. Fahnestock S.R., Irwin S.L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. / Appl Microbiol Biotechnol. 1997. -V.47, P.23-32.

35. Fahnestock S.R., Yao Z., Bedzyk L.A. Microbial production of spider silk proteins. / J Biotechnol. 2000. - V.74, P.105-119.

36. Foo C.W.P., Bini E., Huang J., Lee S.Y., Kaplan D.L. Solution behavior of synthetic silk peptides and modified recombinant silk proteins. / Applied Physics A-Materials Science & Processing. 2006. - V.82, P.193-203.

37. Foschi D., Corsi F., Cellerino P., Rizzi A., Morandi E., Trabucchi E. Angiogenic effects of suture biomaterials. An experimental study in rats. / Eur Surg Res. 2001. - V.33, P.16-20.

38. Fredriksson С., Hedhammar M., Feinstein R., Nordling K., Kratz G., Johansson J., Huss F., Rising A. Tissue Response to Subcutaneously Implanted Recombinant Spider Silk: An in vivo Study. / Materials. 2009. -V.2, P. 1908-1922.

39. Fukushima Y. Genetically engineered syntheses of tandem repetitive polypeptides consisting of glycine-rich sequence of spider dragline silk. / Biopolymers. 1998. - V.45, P.269-279.

40. Gao J., Crapo P.M., Wang Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. / Tissue Eng. 2006. -V.12, P.917-925.

41. Gellynck K., Verdonk P., Forsyth R., Almqvist K.F., Van N.E., Gheysens Т., Mertens J., Van L.L., Kiekens P., Verbruggen G. Biocompatibility and biodegradability of spider egg sac silk. / J Mater Sci Mater Med. 2008a. - V.19, P.2963-2970.

42. Gellynck K., Verdonk P.C., Van N.E., Almqvist K.F., Gheysens T., Schoukens G., Van L.L., Kiekens P., Mertens J., Verbruggen G. Silkworm and spider silk scaffolds for chondrocyte support. / J Mater Sci Mater Med. 2008b. - V.19, P.3399-3409.

43. Gellynck K., Verdonk P.C.M., Almqvist K.F., Van Nimmen E., Gheysens Т., Mertens J., Van Langenhove L., Kiekens P., Verbruggen G. Chondrocyte Growth in Porous Spider Silk 3D-Scaffolds. / European Cells and Materials. 2005. - V.10, P.45.

44. Georgakoudi I., Rice W.L., Hronik-Tupaj M., Kaplan D.L. Optical spectroscopy and imaging for the noninvasive evaluation of engineered tissues. / Tissue Eng Part В Rev. 2008. - V.14, P.321-340.

45. Georgakoudi I., Tsai I., Greiner C., Wong C., Defelice J., Kaplan D. Intrinsic fluorescence changes associated with the conformational state ofsilk fibroin in biomaterial matrices. / Opt Express. 2007. - V.15, P. 10431053.

46. Gibran N.S., Tamura R., Tsou R., Isik F.F. Human dermal microvascular endothelial cells produce nerve growth factor: implications for wound repair. / Shock. 2003. - V.19, P. 127-130.

47. Gosline J.M., Guerette P.A., Ortlepp C.S., Savage K.N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. / J Exp Biol. 1999. - V.202, P.3295-3303.

48. Grip S., Johansson J., Hedhammar M. Engineered disulfides improve mechanical properties of recombinant spider silk. / Protein Sci. 2009. -V.18, P.1012-1022.

49. Guerette P.A., Ginzinger D.G., Weber B.H., Gosline J.M. Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family. / Science. 1996. - V.272, P.l 12-115.

50. Hakimi O., Grahn M.F., Knight D P., Vadgama P. Interaction of myofibroblasts with silk scaffolds 1. / European Cells and Materials. 2005. - V.10,P.5146.

51. Hakimi O., Gheysens Т., Vollrath F., Grahn M.F., Knight D.P., Vadgama P. Modulation of cell growth on exposure to silkworm and spider silk fibers. / J Biomed Mater Res A. 2009. -.

52. Heim M., Ackerschott C.B., Scheibel T. Characterization of recombinantly produced spider flagelliform silk domains. / J Struct Biol. -2010. -.

53. Heim M., Keerl D., Scheibel T. Spider silk: from soluble protein to extraordinary fiber. / Angew Chem Int Ed Engl. 2009. - V.48, P.3584-3596.

54. Helmus M.N., Gibbons D.F., Cebon D. Biocompatibility: meeting a key functional requirement of next-generation medical devices. / Toxicol Pathol. 2008. - V.36, P.70-80.

55. Hermanson K.D., Harasim M.B., Scheibel Т., Bausch A.R. Permeability of silk microcapsules made by the interfacial adsorption of protein. / Phys Chem Chem Phys. 2007a. - V.9, P.6442-6446.

56. Hermanson K.D., Huemmerich D., Scheibel Т., Bausch A.R. Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spider silk. / Advanced Materials. 2007b. - V.19, P.1810-+.

57. Hermes A.C., Davies R.J., Greiff S., Kutzke H., Lahlil S., Wyeth P., Riekel C. Characterizing the decay of ancient Chinese silk fabrics by microbeam synchrotron radiation diffraction. / Biomacromolecules. 2006. -V.7, P.777-783.

58. Hersel U., Dahmen C., Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. / Biomaterials. 2003. - V.24, P.4385-4415.

59. Howe A., Aplin A.E., Alahari S.K., Juliano R.L. Integrin signaling and cell growth control. / Curr Opin Cell Biol. 1998. - V.10, P.220-231.

60. Huang J., WongC., George A., Kaplan D.L. The effect of genetically engineered spider silk-dentin matrix protein 1 chimeric protein on hydroxyapatite nucleation. / Biomaterials. 2007. - V.28, P.2358-2367.

61. Huemmerich D., Helsen C.W., Quedzuweit S., Oschmann J., Rudolph R., Scheibel T. Primary structure elements of spider dragline silksand their contribution to protein solubility. / Biochemistry. 2004a. - V.43, P.13604-13612.

62. Jackson C., Obrien J.P. Molecular-Weight Distribution of Nephila-Clavipes Dragline Silk. / Macromolecules. 1995. - V.28, P.5975-5977.

63. Kaplan D.L. Silk. / Encyclopedia of Polymer Science and Technology. -2004.-V.ll,P.841-850.

64. Karatzas C.N. Production of recombinant spider silk (BiosteelTM) in the milk of transgenic animals. / Transgenic Research. 1999. - V.8, P.463-498.

65. Kasoju N., Bhonde R.R., Bora U. Preparation and characterization of Antheraea assama silk fibroin based novel non-woven scaffold for tissue engineering applications. / J Tissue Eng Regen Med. 2009. - V.3, P.539-552.

66. Kaully Т., Kaufman-Francis K., Lesman A., Levenberg S. Vascularization-the conduit to viable engineered tissues. / Tissue Eng Part В Rev. 2009. - V.15, P. 159-169.

67. Kim U.J., Park J., Kim H.J., Wada M., Kaplan D.L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. / Biomaterials. 2005. - V.26, P.2775-2785.

68. Kluge J.A., Rabotyagova O., Leisk G.G., Kaplan D.L. Spider silks and their applications. / Trends Biotechnol. 2008. - Y.26, P.244-251.

69. Knight D.P., Vollrath F. Changes in element composition along the spinning duct in a Nephila spider. / Naturwissenschaften. 2001. - V.88, P.179-182.

70. Kohn D.H., SarmadiM., HelmanJ.I., Krebsbach P.H. Effects of pH on human bone marrow stromal cells in vitro: implications for tissue engineering of bone. / J Biomed Mater Res. 2002. - V.60, P.292-299.

71. Kweon H., Park Y.H. Dissolution and characterization of regenerated Antheraea pernyi silk fibroin. / Journal of Applied Polymer Science. 2001. - V.82, P.750-758.

72. Lamalice L., Le B.F., Huot J. Endothelial cell migration during angiogenesis. / Circ Res. 2007. - V.100, P.782-794.

73. Lampin M., Warocquier C., Legris C., Degrange M., Sigot-Luizard M.F. Correlation between substratum roughness and wettability, cell adhesion, and cell migration. / J Biomed Mater Res. 1997. - V.36, P.99-108.

74. Lawrence B.D., Marchant J.K., Pindrus M.A., Omenetto F.G., Kaplan D.L. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. / Biomaterials. 2009. -V.30, P.1299-1308.

75. Lazaris A., Arcidiacono S., Huang Y., Zhou J.F., Duguay F., Chretien N., Welsh E.A., Soares J.W., Karatzas C.N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. / Science. 2002. - V.295, P.472-476.

76. Lee J., Cuddihy M.J., Kotov N.A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. / Tissue Eng Part В Rev. 2008a. - V.14, P.61-86.

77. Lee J., Cuddihy M.J., Kotov N.A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. / Tissue Eng Part В Rev. 2008b. - V.14, P.61-86.

78. Lee J.H., Lee S.J., Khang G., Lee H.B. Interaction of fibroblasts on polycarbonate membrane surfaces with different micropore sizes and hydrophilicity. / J Biomater Sci Polym Ed. 1999. - V.10, P.283-294.

79. Lee J.J., Lee S.-G., Park J.C., Yang Y.I., Kim J.K. Investigation on biodegradable PLGA scaffold with various pore size structure for skin tissue engineering. / Current Applied Physics. 2007. - P.e37-e40.

80. Lefevre Т., Boudreault S., Cloutier C., Pezolet M. Conformational and orientational transformation of silk proteins in the major ampullate gland of Nephila clavipes spiders. / Вiomacromolecules. 2008. - V.9, P.2399-2407.

81. Lewis R. Unraveling the weave of spider silk. / Bioscience. 1996. - V.46, P.636-638.

82. Lewis R.V., Hinman M., Kothakota S., Fournier M.J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. / Protein Expr Pur if. 1996. - V.7, P.400-406.

83. Li M., Tao W., Lu S., Zhao C. Porous 3-D scaffolds from regenerated Antheraea pernyi silk fibroin. / Polymers for Advanced Technologies. -2008. -V.19, P.207-212.

84. LI X., YAO J., YANG X., TIAN W., LIU L. Surface modification with fibronectin or collagen to improve the cell adhesion. / Applied Surface Science. 2008. - V.255, P.459-461.

85. Ma P. Scaffolds for tissue fabrication. / Materials Today. 2004. - V.7, P.30-40.

86. MacIntosh A.C., Kearns V.R., Crawford A., Hatton P.V. Skeletal tissue engineering using silk biomaterials. / J Tissue Eng Regen Med. 2008. -V.2, P.71-80.

87. Mandal B.B., Kundu S.C. Biospinning by silkworms: Silk fiber matrices for tissue engineering applications. / Acta Biomater. 2009a.

88. Mandal B.B., Kundu S.C. Cell proliferation and migration in silk fibroin 3D scaffolds. / Biomaterials. 2009b. - V.30, P.2956-2965.

89. Mandal B.B., Kundu S.C. Osteogenic and adipogenic differentiation of rat bone marrow cells on non-mulbeny and mulberry silk gland fibroin 3D scaffolds. / Biomaterials. 2009c. - V.30, P.5019-5030.

90. Mata A., Kim E.J., Boehm C.A., Fleischman A J., Muschler G.F., Roy S. A three-dimensional scaffold with precise micro-architecture and surface micro-textures. / Biomaterials. 2009. - V.30, P.4610-4617.

91. Mata A., Su X., Fleischman A.J., Roy S., Banks B.A., Miller S.K., Midura R.J. Osteoblast attachment to a textured surface in the absence of exogenous adhesion proteins. / IEEE Trans Nanobioscience. 2003. - V.2, P.287-294.

92. Mehta N., Hede S. Spider Silk Calcite Composite. / Hypothesis. -2005. -V.3,P.21-25.

93. Meinel L., Fajardo R., Hofmann S., Langer R., Chen J., Snyder В., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D. Silk implants for the healing of critical size bone defects. / Bone. 2005a. - V.37, P.688-698.

94. Meinel L., Hofmann S., Karageorgiou V., Kirker-Head C., McCool J., Gronowicz G., Zichner L., Langer R., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. / Biomaterials. -2005b. V.26,P.147-155.

95. Mello C.M., Soares J.W., Arcidiacono S., Butler M.M. Acid extraction and purification of recombinant spider silk proteins. / Biomacromolecules. 2004. - V.5, P. 1849-1852.

96. Menassa R., Zhu H., Karatzas C.N., Lazaris A., Richman A., Brandle J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. / Plant Biotechnol J. 2004. - V.2, P.431-438.

97. Miller G.E. Artificial Organs. / Synthesis Lectures on Biomedical Engineering. 2006. - V.l, P. 1-72.

98. Moldovan L, Moldovan N.I. Role of monocytes and macrophages in angiogenesis. / EXS. 2005. - P.127-146.

99. Morgan A.W, Roskov K.E, Lin-Gibson S, Kaplan D.L, Becker M.L, Simon C.G, Jr. Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. / Biomaterials. 2008a. -V.29, P.2556-2563.

100. Morgan A.W, Roskov K.E, Lin-Gibson S, Kaplan D.L, Becker M.L, Simon C.G, Jr. Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. / Biomaterials. 2008b. -V.29, P.2556-2563.

101. Nakazawa Y, Asakura T. Structure determination of a peptide model of the repeated helical domain in Samia cynthia ricini silk fibroin before spinning by a combination of advanced solid-state NMR methods. / J Am Chem Soc. 2003. - V.125, P.7230-7237.

102. Nazarov R, Jin H.J, Kaplan D.L. Porous 3-D scaffolds from regenerated silk fibroin. / Biomacromolecules. 2004. - V.5, P.718-726.

103. O'Brien F.J, Harley В .A, Waller M.A, Yannas I.V, Gibson L.J, Prendergast P.J. The effect of pore size on permeability and cell attachmentin collagen scaffolds for tissue engineering. / Technol Health Care. 2007. -V.15, P.3-17.

104. Osaki S., Yamamoto K., Kajiwara A., Murata M. Evaluation of the resistance of spider silk to ultraviolet irradiation. / Polymer Journal. -2004. V.36, P.623-627.

105. Padera R.F., Colton C.K. Time course of membrane microarchitecture-driven neovascularization. / Biomaterials. 1996. - V.17, P.277-284.

106. Pan Z.J., DiaoJ.Y., Shi J. Morphology and Cell Compatibility of Regenerated Ornithoctonus Huwenna Spider Silk by Electrospinning. / Journal of Fiber Bioengineering and Informatics. 2008. - V.l, P.157-164.

107. Pan Z.J., Li C.P., Xu Q. Active control on molecular conformations and tensile properties of spider silk. / Journal of Applied Polymer Science. 2004. - V.92, P.901-905.

108. Perez-Rigueiro J., Elices M., Plaza G.R., Rueda J., Guinea G.V. Fracture surfaces and tensile properties of UV-irradiated spider silk fibers. / Journal of Polymer Science Part B-Polymer Physics. 2007. - V.45, P.786-793.

109. Prince J.T., McGrath K.P., DiGirolamo C.M., Kaplan D.L. Construction, cloning, and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk. / Biochemistry. 1995. - V.34, P.10879-10885.

110. Rabotyagova O.S., Cebe P., Kaplan D.L. Self-assembly of genetically engineered spider silk block copolymers. / Biomacromolecules. -2009. V.10, P.229-236.

111. Raeber G.P., Lutolf M.P., Hubbell J.A. Mechanisms of 3-D migration and matrix remodeling of fibroblasts within artificial ECMs. / ActaBiomater. 2007. - V.3, P.615-629.

112. Rammensee S., Huemmerich D., Hermanson K.D., Scheibel T., Bausch A.R. Rheological characterization of hydrogels formed by recombinantly produced spider silk. / Applied Physics A-Materials Science & Processing. 2006. - V.82, P.261-264.

113. Rammensee S., Slotta U., Scheibel Т., Bausch A.R. Assembly mechanism of recombinant spider silk proteins. / Proc Natl Acad Sci USA. -2008.-V.105,P.6590-6595.

114. Rose F.R., CysterL.A., Grant D.M., Scotchford C.A., Howdle S.M., Shakesheff K.M. In vitro assessment of cell penetration into porous hydroxyapatite scaffolds with a central aligned channel. / Biomaterials. -2004. V.25, P.5507-5514.

115. Rousseau M.E., Lefevre Т., Pezolet M. Conformation and orientation of proteins in various types of silk fibers produced by Nephila clavipes spiders. / Biomacromolecules. 2009. - V.10, P.2945-2953.

116. Sachlos E., Czernuszka J.T. Making tissue engineering scaffolds work. Review: the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds. / Eur Cell Mater. 2003. -V.5, P.29-39.

117. Saltzman MW. Cell interactions with polymers.Principles of tissue engineering. 2000. - P.221-235.

118. SapedeD., SeydelT., Forsyth V.T., Koza M.A., SchweinsR., Vollrath F., Riekel C. Nanofibrillar structure and molecular mobility in spider dragline silk. / Macromolecules. 2005. - V.38, P.8447-8453.

119. Scheller J., Guhrs K.H., Grosse F., Conrad U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. / Nat Biotechnol. 2001. - V.19, P.573-577.

120. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation. / Transgenic Res. 2004. - V.13, P.51-57.

121. Seidel A., Liivak O., Calve S., Adaska J., Ji G., Yang Z., Grubb D., Zax D.B., Jelinski L.W. Regenerated Spider Silk: Processing, Properties, and Structure. / Macromolecules. 2009a. - V.33, P.775-780.

122. Seidel A., Liivak O., Calve S., Adaska J., Ji G., Yang Z., Grubb D., Zax D.B., Jelinski L.W. Regenerated Spider Silk: Processing, Properties, and Structure. / Macromolecules. 2009b. - V.33, P.775-780.

123. Sharkawy A.A., Klitzman В., Truskey G.A., Reichert W.M. Engineering the tissue which encapsulates subcutaneous implants. I. Diffusion properties. / J Biomed Mater Res. 1997. - V.37, P.401-412.

124. Sieminski A.L., Gooch K.J. Biomaterial-microvasculature interactions. / Biomaterials. 2000. - V.21, P.2232-2241.

125. Simmons A.H., Michal C.A., Jelinski L.W. Molecular orientation and two-component nature of the crystalline fraction of spider dragline silk. / Science. 1996. - V.271, P.84-87.

126. Singhvi R., Stephanopoulos G., Wang D.I. Effects of substratum morphology on cell physiology. / Biotechnol Bioeng. 1994. - V.43, P.764-771.

127. Slotta U., Tammer M., Kremer F., Koelsch P., Scheibel T. Structural analysis of spider silk films. / Supramolecular Chemistry. 2006. - V.18, P.465-471.

128. Sponner A., Schlott В., Vollrath F., Unger E., Grosse F., Weisshart K. Characterization of the protein components of Nephila clavipes dragline silk. I Biochemistry. 2005. - V.44, P.4727-4736.

129. Stark M., Grip S., Rising A., Hedhammar M., Engstrom W., Hjalm G., Johansson J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. / Biomacromolecules. 2007. -V.8, P.1695-1701.

130. Streuli C.H., Bissell M.J. Expression of extracellular matrix components is regulated by substratum. / J Cell Biol. 1990. - V.110, P.1405-1415.

131. Szela S., Avtges P., Valluzzi R., Winkler S.r Wilson D., Kirschner D., Kaplan D.L. Reduction-oxidation control of beta-sheet assembly in genetically engineered silk. / Biomacromolecules. - 2000. - V.l, P.534-542.

132. Taylor M.S., Daniels A.U., Andriano K.P., Heller J. Six bioabsorbable polymers: in vitro acute toxicity of accumulated degradation products. / J Appl Biomater. 1994. - V.5, P. 151-157.

133. TeuleF., Cooper A.R., FurinW.A., Bittencourt D., RechE.L., Brooks A., Lewis R.V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. / Nat Protoc. 2009. -V.4, P.341-355.

134. Thevenot P., Nair A., Dey J., Yang J., Tang L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. /Tissue Eng Part С Methods. 2008. - V.14, P.319-331.

135. Thiel B.L., Guess K.B., Viney C. Non-periodic lattice crystals in the hierarchical microstructure of spider (major ampullate) silk. / Biopolymers. 1997. - V.41, P.703-719.

136. VehoffT., Glisovic A., Schollmeyer H., Zippelius A., Salditt T. Mechanical properties of spider dragline silk: humidity, hysteresis, and relaxation. / Biophys J. 2007. - V.93, P.4425-4432.

137. Vendrely C., Scheibel T. Biotechnological production of spider-silk proteins enables new applications. / Macromol Biosci. 2007. - V.7, P.401-409.

138. Von Recum Andreas F, Shannon Clare E., Cannon Carolyn E., Long Kenwyn J., Van Kooten Theo G., Meyle Jorg. Surface Roughness, Porosity, and Texture as Modifiers of Cellular Adhesion. / Tissue Engineering. 1996. - V.2, P.241-253.

139. Wang Y., Kim H.J., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. / Biomaterials. 2006. -V.27, P.6064-6082.

140. Wang Y., Rudym D.D., Walsh A., Abrahamsen L., Kim H.J., Kim H.S., Kirker-Head C., Kaplan D.L. In vivo degradation of threedimensional silk fibroin scaffolds. / Biomaterials. 2008. - V.29, P.3415-3428.

141. Wen H., LanX., Zhang Y., Zhao Т., Wang Y., KajiuraZ., Nakagaki M. Transgenic silkworms (Bombyx mori) produce recombinant spider dragline silk in cocoons. / Mol Biol Rep. 2009.

142. Williams D.F. On the mechanisms of biocompatibility. / Biomaterials. -2008.-V.29, P.2941-2953.

143. Winkler S., Wilson D., Kaplan D.L. Controlling beta-sheet assembly in genetically engineered silk by enzymatic Phosphorylation/Dephosphorylation, by. / Biochemistry. 2000. - V.39, P.14002.

144. Winyard P.G, Perret D, Harris G, Blake D.R. Thy role of toxic oxygen species in inflammation with special reference to DNA damage. / Whitcher J., Evans S. // Biochemistry of inflammation. 2009. - V.18, P.P. 112.

145. Wong Po F.C., Patwardhan S.V., Belton D.J., Kitchel В., Anastasiades D., Huang J., Naik R.R., Perry C.C., Kaplan D.L. Novel nanocomposites from spider silk-silica fusion (chimeric) proteins. / Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. V.103, P.9428-9433.

146. Work R.W., Emerson P.D. An Apparatus and Technique for the Forcible Silking of Spiders. / Journal of Arachnology. 1982. - V.10, P.l-10.

147. Wu M.H., Urban J.P., Cui Z.F., Cui Z.r Xu X. Effect of extracellular ph on matrix synthesis by chondrocytes in 3D agarose gel. / Biotechnol Prog. 2007. - V.23, P.430-434.

148. Xiang Wu, Xiang-Yang Liu, Ning Du, Gang-Qin Xu, Bao-Wen Li. Molecular spring: -from spider silk to silkworm silk. / Biological Physics. 2009.

149. Xu M., Lewis R.Y. Structure of a protein superfiber: spider dragline silk. / Proc Natl Acad Sci USA.- 1990. V.87, P.7120-7124.

150. Yaltirik M., Dedeoglu K., Bilgic В., Koray M., Ersev H., Issever H., Dulger O., Soley S. Comparison of four different suture materials in soft tissues of rats. / Oral Dis. 2003. - V.9, P.284-286.

151. Yang J.J., Barr L.A., Fahnestock S.R., Liu Z.B. High yield recombinant silk-like protein production in transgenic plants through protein targeting. / Transgenic Research. 2005. - V.14, P.313-324.

152. Zhang X., Reagan M.R., Kaplan D.L. Electrospun silk biomaterial scaffolds for regenerative medicine. / Adv Drug Deliv Rev. 2009. - V.61, P.988-1006.

153. Zhou S., Peng H., YuX., Zheng X., Cui W., Zhang Z., Li X./ Wang J., Weng J., Jia W., Li F. Preparation and characterizationof a novel electrospun spider silk fibroin/poly(D,L-lactide) composite fiber. / JPhys ChemB. -2008. -V.l 12, P.l 1209-11216.

154. Zhou Y., Wu S., Conticello V.P. Genetically directed synthesis and spectroscopic analysis of a protein polymer derived from a flagelliform silk sequence. / Biomacromolecules. 2001. - V.2, P.l 11-125.