Разработка методов модификации и переработки фиброина в волокнистые материалы и гидрогели медико-биологического назначения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.17.06, кандидат наук Сажнев Никита Александрович

• Сажнев Никита Александрович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Сажнев Никита Александрович

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Особенности химического строения и структуры фиброина 13 тутового шелкопряда (Bombyx mori)

1.2 Методы выделения фиброина из коконов шелкопряда и 18 получения растворов фиброина

1.3 Изучение конформационных переходов в растворах фиброина 23 и условий формирования Р-складчатой структуры белка

1.4 Гелеобразование в растворах фиброина шелка и возможности 27 применения гидрогелей фиброина в тканевой инженерии

1.5 Электроформование растворов фиброина и 3-D 31 биопринтирование как методы получения пористых биоматериалов

1.6 Применение материалов на основе фиброина шелка и 34 хитозана в тканевой инженерии

Выводы по главе

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика сырья и реактивов

2.2 Методы исследования

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Изучение процесса получения и свойств растворов фиброина

3.1.1 Анализ и оптимизация условий получения водных растворов 63 фиброина из коконов шелкопряда ВотЬух mori

3.1.2 Изучение свойств водных растворов фиброина

3.2 Изучение процессов перевода фиброина в нерастворимое 68 состояние

3.2.1 Изучение влияния этанола на а^Р-конформационный 69 переход в фиброине

3.2.2 Изучение процесса сшивки фиброина бифункциональным 73 реагентом

3.3 Получение не растворимых в воде материалов из растворов 80 фиброина

3.3.1 Получение волокнистых материалов методом 80 электроформования из растворов фиброина

3.3.2 Получение сшитых дженипином широкопористых 87 криоструктуратов из растворов фиброина

3.4 Изучение полимерных систем на основе растворов фиброина 89 и хитозана

3.4.1 Изучение кислотно-основных свойств смешанных растворов 90 хитозана и фиброина

3.4.2 Спектральные и реологические исследования кинетики 93 гелеобразования и сшивки в смешанных растворах хитозана и фиброина

3.5 Разработка биополимерных материалов на основе хитозана и 98 фиброина

3.5.1 Получение биологически-активных пленок на основе 98 фиброина и хитозана, модифицированных дженипином

3.5.2 Изучение процесса электроформования и модификации 113 волокнистых материалов на основе фиброина и хитозана

3.5.3 Получение моноволокон из формовочных растворов на основе 115 хитозана и фиброина

3.5.4 Получение криоструктуратов из растворов хитозана и его 119 смесей с фиброином

3.6 Изучение биосовместимости и перспектив использования 121 материалов на основе фиброина и хитозана

3.6.1 Изучение цитотоксичности и использование пористых 122 гидрогелевых криоструктуратов в качестве 3D-подложки для культивирования животных клеток

3.6.2 Изучение цитотоксичности и использование волокнистых 128 материалов на основе фиброина, полученных методом электроформования в качестве 3D-подложки для культивирования животных клеток

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСМ (AFM) - Атомно-силовой микроскоп

БАВ - Биологически активное вещество

ДМСО - Диметилсульфоксид

ФБ - Фиброин

ХТЗ - Хитозан

Ala - Аланин

FITC (ФИТЦ) - Флуоресцеина изоцианат Gly - Глицин Gp (Дж) - Дженипин

HFIP - 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол, гексафторизопропанол hMSC - Человеческие мезенхимальные стволовые клетки SEM (СЭМ) - Сканирующая электронная микроскопия Ser - Серин

TGA (ТГА) - Термогравиметрический анализ Tyr - Тирозин Val - Валин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов модификации и переработки фиброина в волокнистые материалы и гидрогели медико-биологического назначения»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Биодеградируемые материалы на основе биополимеров широко используются при создании инновационных изделий медико-биологического назначения: рассасывающихся шовных нитей, имплантатов для пластической хирургии, матриц для клеточной и тканевой инженерии и регенеративной медицины. Создание материалов для инновационных медицинских технологий требует использования биополимеров и адекватных технологий их переработки, обеспечивающих эффективное функционирование в организме человека. Поэтому актуальным является разработка новых биополимерных материалов и поиск методов управления их структурой и свойствами. В настоящей работе в качестве таких технологий использованы криотехнологии, электроспининг, а также коагуляционное формование, а в качестве биодеградируемого полимерного сырья структурный белок - фиброин из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori и аминополисахарид хитозан. Полученные из полисахаридов и белков гидрогелевые материалы, имитируют естественную среду организма и таким образом обеспечивают оптимальные условия для роста и регенерации тканей, а после выполнения биологической функции, деградируют под действием биологических сред.

Сформованные из регенерированного фиброина волокна и пленки

растворимы в воде. Известный для хитозана метод предотвращения

растворимости, улучшения водостойкости и механических свойств -

химическое сшивание, - может быть недостаточно эффективным для

фиброина, вследствие низкого содержания в этом белке первичных

аминогрупп, однако добавление хитозана может способствовать

эффективности модификации бифункциональными реагентами. Кроме того,

учитывая, что для фиброина известны несколько возможных

конформационных состояний: растворимые в воде а-спирали или

конформации статистического клубка и не растворимые Р-складчатые

структуры, создание условий для а^Р конформационного перехода при

6

формовании волокон и гидрогелей из регенерированного фиброина позволит воздействовать на растворимость полимерного материала.

Работа посвящена изучению химической и структурной модификации фиброина при переработке биополимерных композиций и выполнялась в соответствии с приоритетными направлениями развития науки, технологий и техники в Российской Федерации в рамках грантов Российского фонда фундаментальных исследований: проекты № 19-38-90325 и № 18-29-17059.

Цель работы заключалась в разработке методов получения не растворимых в воде волокнистых и гидрогелевых материалов медико-биологического назначения путем переработки регенерированного фиброина.

В соответствии с поставленной целью в работе были решены следующие задачи:

- изучены условия перехода фиброина в Р-конформацию в присутствии этанола и их влияние на процесс выделения фиброина из коконов шелкопряда

Bombyx mori;

- изучена кинетика взаимодействия фиброина и природного сшивающего реагента дженипина;

- исследованы закономерности гелеобразования в растворах фиброина и его композиций с хитозаном в процессе сшивки дженипином;

- разработаны методы химической и структурной модификации биополимеров в процессе получения волокнистых и пленочных материалов и после формования биополимерных волокон и гидрогелей;

- разработаны не растворимые в воде биополимерные материалы на основе фиброина и его композиций с хитозаном: лекарственно-наполненные пленки, волокнистые материалы, и криоструктураты гидрогелей, исследованы их морфология и физико-химические свойства;

- изучены биосовместимость и перспективы использования разработанных материалов в качестве искусственных матриксов для тканевой инженерии и систем с контролируемым высвобождением лекарственных соединений.

Методы исследования и технические средства решения задач.

С целью определения физико-химических свойств растворов биополимеров применялись методы вибрационной и ротационной вискозиметрии. Фазовое разделение фиброин-хитозановых систем и систем, химически модифицированных дженипином, проводили с использованием кондуктометрии и вискозиметрии. Получение композиционных матриксов для тканевой инженерии осуществляли методом лиофильной сушки композиций и растворов фиброина и хитозана. Степень набухания биополимерных пленок и биодеградируемых матриксов изучали гравиметрическим методом. С применением метода атомно-силовой, оптической, конфокальной лазерной и сканирующей электронной микроскопии были изучены морфология волокнистых матриксов и пленок, а так же распределение клеток при их культивировании. Получение мононитей из хитозана и его смесей с фиброином осуществляли при помощи коагуляционного формования. Получение нановолокнистых материалов на основе растворов фиброина проводилось методом бескапиллярного электроформования. Цитотоксичность биополимерных матриксов определяли с помощью метода тестирования экстрактов.

Исследования проводились на оборудовании кафедры химии и технологии полимерных материалов и нанокомпозитов и Центра коллективного пользования Российского государственного университета им. А.Н. Косыгина, спектральные исследования осуществлялись н.с. Свидченко Е.А. в Центре коллективного пользования «Центр исследования полимеров» ИСПМ им. Н.С. Ениколопова РАН, криоструктураты получали под руководством д.х.н., проф. Лозинского В.И. в лаборатории криохимии биополимеров, ИНЭОС им. А.Н. Несмеянова РАН. Исследование цитотоксичности пористых гидрогелевых матриксов проводилось н.с. ИБХ РАН Дроздовой М.А.

Научная новизна работы. Впервые:

1. Обоснованы способы перевода композиций хитозана и фиброина в не растворимое в воде состояние: конформационный переход в фиброине и химическая сшивка, и на этой основе предложены технологические решения в области формования волокон.

2. На примере пленок установлено, что обработка водно-этанольным раствором может служить эффективным средством перевода материалов на основе фиброина в не растворимую форму. Доказано, что в основе этого факта лежит конформационный переход фиброина в Р-складчатую конформацию.

3. Установлены новые особенности механизма взаимодействия фиброина и хитозана с дженипином и гелеобразования в их растворах: продолжительный индукционный период роста вязкости и интенсивности поглощения при А=610 нм, предшествующие образованию пространственной сетки сшитых биополимеров.

4. Обнаружено, что индукционный период реакции сшивки фиброина и хитозана (1:1) дженипином, детектируемый по стадии роста интенсивности синей окраски раствора, в 3 раза продолжительнее по сравнению с хитозаном, что создало возможность совместить процесс модификации и технологические операции формования не растворимого в воде волокна, пригодного для использования во влажной среде организма.

5. Установлена взаимосвязь состава формовочных композиций на основе растворов фиброина и хитозана, условий коагуляционного и электроформования мононитей и волокнистых материалов, условий перевода биополимеров в не растворимое состояние и растворимости, осмотических и физико-механических свойств пленок и волокон.

Теоретическая значимость. Установлена роль конформационных переходов фиброина и структурообразования в его смешанных растворах с хитозаном при формовании не растворимых в воде композиционных волокон и гидрогелей. Определены пути воздействия на продолжительность стадий модификации аминогрупп дженипином и образования сшитой

пространственной сетки при получении биополимерных материалов из фиброина и хитозана.

Практическая значимость. Разработаны методы получения волокнистых и гидрогелевых материалов на основе фиброина и его смеси с хитозаном, перспективных для применения в качестве пористых биополимерных матриц для тканевой инженерии и систем с контролируемым высвобождением лекарственных соединений. Разработан способ получения биодеградируемых криоструктуратов с высокой влагоудерживающей способностью, регулируемым размером пор и скоростью биодеградации, и показана эффективность их использования в качестве BD-подложки в процессе культивирования животных клеток. Установлено, что введение фиброина приводит к подавлению воспалительной реакции тканей, усилению клеточной адгезии и пролиферации живых клеток на волокнистом материале из сшитого хитозана. Установлен пролонгирующий эффект иммобилизации биологически активных соединений в структуре сшитых биополимерных пленок из фиброина и хитозана, модифицированных дженипином.

На защиту выносится:

Новые особенности механизма взаимодействия аминосодержащих полимеров фиброина и хитозана с дженипином.

Технологические решения в области формования не растворимых в воде волокон, основанные на реализации перехода фиброина в Р-конформацию и химической сшивке дженипином.

Новый подход к получению не растворимых в воде нитей, нетканых волокнистых и пленочных материалов на основе регенерированного фиброина и хитозана, позволяющий за счет использования в качестве сшивающего реагента дженипина реализовать процесс формования в условиях постоянной вязкости.

Апробация результатов. Результаты работы были изложены на 15

научных конференциях. Из них 13 международных: 9th international conference

"Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safetly-Toxicology and

10

ecology issues" Bionanotox-2018, Crete, Greece, 06-13 may 2018; Международный форум биотехнология: состояние и перспективы развития, Biotech-2018, 23 - 25 мая 2018, Москва, Россия; Международная научно-техническая конференция «Дизайн, технологии и инновации в текстильной и легкой промышленности» (ИННОВАЦИИ -2018), 14-15 ноября 2018 г., Москва, Россия; Четырнадцатая Международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит-2018), 17-23 сентября 2018 г., Севастополь, Россия; VII Всероссийская научная конференция (с международным участием) «Физикохимия полимеров и процессов их переработки», 16-20 сентября 2019 г., Иваново, Россия; XXII Международный научно-практический форум «SMARTEX - 2019», «Физика волокнистых материалов: структура, свойства, наукоёмкие технологии и материалы», 25 - 27 сентября 2019 г., Иваново, Россия; 10th international conference "Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safetly-Toxicology and ecology Issues" Bionanotox-2019, Crete, Greece, 05-12 may 2019; VIII международная конференция «Перспективные полимерные композиционные материалы. Альтернативные технологии. Переработка. Применение. Экология. («Композит-2019»)», 21-23 мая 2019 г., Энегльс, Россия; 11 th international conference "Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safetly-Toxicology and ecology Issues" Bionanotox-2020, Webinar, 0718 September 2020; Международная научно-техническая конференция «Дизайн, технологии и инновации в текстильной и легкой промышленности» (ИННОВАЦИИ -2020), 12 ноября 2020 г., Москва, Россия; Всероссийская научная конференция молодых исследователей с международным участием «инновационное развитие техники и технологий в промышленности (ИНТЕКС-2021)», 12 - 15 апреля 2021 г., Москва, Россия. И 2 Всероссийские научные конференции: Восьмая Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры в стратегии научно-технического развития РФ «Полимеры-2020», 9-13 ноября 2020 г., Москва, Россия; XXVI Всероссийская конференция

«Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик-2020)», 17 - 21 августа

11

2020 г., Казань, Россия; 12th international conference "Biomaterials and nanobiomaterials: Recent Advances Safetly-Toxicology and ecology issues" Bionanotox-2021, Crete, Greece, 27 sep. - 04 oct. 2021; РосХит-2021: Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана, Архангельск, 15 - 19 сентября 2021.

Публикации. Основные положения научно-квалификационной работы (диссертации) опубликованы в 24 печатных работах, 7 из которых - в рецензируемых научных изданиях, входящих в базы Scopus и Web of Science и рекомендованных ВАК при Минобрнауки России.

Структура и объем работы. По своей структуре научно-квалификационная работа (диссертация) состоит из введения, трех глав, выводов по работе и списка литературы. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 64 рисунка, 16 таблиц. Список литературы включает 160 библиографических и электронных источника.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Особенности химического строения и структуры фиброина тутового шелкопряда (Bombyx mori)

Белки шелка присутствуют в железах некоторых членистоногих (таких как шелкопряды, пауки, скорпионы, клещи и пчелы) и превращаются в волокна во время их метаморфоза. Шелк тутового шелкопряда - это волокно, широко используемое в текстильной промышленности. Выход волокна из одного шелкового кокона составляет 600-1500 м [1]. Паутинный шелк неоднороден по своей природе, поэтому биоматериалы на основе шелка обычно получают из волокон тутового шелкопряда. В основном - это шелк, производимый гусеницей Bombyx morí (B. morí), членом семейства Bombycidae.

Шелк - это текстильное волокно, ежегодно производится и обрабатывается около 1000 тонн такого волокна. Очистку шелковых волокон обычно проводят с использованием простой процедуры удаления жиров и серицина щелочными или соляными растворами.

Шелк обладает большой молекулярной массой (200-350 кДа и более) с объемными повторяющимися модульными гидрофобными доменами, которые прерываются небольшими гидрофильными группами [2]. Фиброин шелка, как и креатин и коллаген, относится к фибриллярным белкам. Элементами структуры волокон шелка являются макрофибриллы шириной до 105 нм, которые, в свою очередь, состоят из спирально упакованных нанофибрилл диаметром 90-170 нм [3, 4]. Нанофибриллы могут играть важную роль в придании шелку повышенной прочности. Длина макроцепи фиброина 150 нм; диаметр макроцепи 0,45 нм [5, 6].

Шелковые волокна, производимые культивируемым тутовым шелкопрядом Bombyx morí, в основном состоят из двух белков, серицина и фиброина; они также содержат незначительное количество остатков других аминокислот и различных примесей: жиров, восков и минеральных солей. В

зависимости от штамма кокона содержание фиброина составляет 66,5-73,5, а содержание серицина - 26,5-33,5 мас.%.

Фиброин шелка B. morí состоит из тяжелой (H) и легкой (L) цепей (H- и L-фиброин соответственно), связанных между собой дисульфидной связью [79]. Кроме того, в составе шелка имеется гликопротеин с массой 25 кДа, названный P-25, также нековалентно связанный с этими цепями [10]. Гидрофобные домены тяжелых цепей содержат повторы аминокислот (Ala, Ser, Tyr, Val) и могут образовывать антипараллельные Р-листы (Р-складчатая структура). L-цепь (легкая) гидрофильна по своей природе и относительно эластична. Считается, что белок P-25 играет важную роль в поддержании целостности комплекса шелка [8, 11]. H-фиброин, L-фиброин и P-25 находятся в шелке в соотношении 6:6:1 [12]. Очищенный и переработанный шелк лишен легкой цепи и гликопротеина P-25 [11, 13]. Вместо этого он содержит гомодимеры тяжелой цепи с молекулярной массой ~ 330 кДа, которые образованны отдельными белками (~ 160 кДа) [14].

Гидрофобные домены полимерных цепей шелка, состоящие из повторяющейся аминокислотной последовательности, собраны в нанокристаллы (Р-листы). Гидрофильные связи между этими гидрофобными доменами состоят из объемных и полярных боковых цепей и образуют аморфную часть вторичной структуры белка [15, 16].

Что касается химического состава, волокна Bombyx morí состоят из остатков как минимум 16 аминокислот, соотношение которых варьируется между различными участками надмолекулярной структуры фиброина (табл. 1). Суммарная мольная доля остатков глицина, аланина, серина и тирозина составляет 90%; их последовательность представлена общей формулой [17, 18].

-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Gly-[-Ser-Gly-(Ala-Gly)n-]s-

Tyr-

Таблица 1 - Аминокислотный состав фиброина Bombyx morí [19].

Аминокислота Состав, мол. %

Всего H-фиброин L-фиброин

Глицин 42,9 49,4 10,0

Алании 30,0 29,8 16,9

Серин 12,2 11,3 7,9

Тирозин 4,8 4,6 3,4

Валин 2,5 2,0 7,4

Аспарагиновая кислота 1,9 0,65 15,4

Глутаминовая кислота 1,4 0,70 8,4

Треонин 0,92 0,45 2,8

Фенилаланин 0,67 0,39 2,7

Метионин 0,37 - 0,37

Изолейцин 0,64 0,14 7,3

Лейцин 0,55 0,09 7,2

Пролин 0,45 0,31 3,0

Аргинин 0,51 0,18 3,8

Гистидин 0,19 0,09 1,6

Лизин 0,38 0,06 1,5

Вторичная структура фиброина стабилизируется разного рода взаимодействиями. Водородные связи возникают между функциональными группами пептидных макроцепей и между боковыми фрагментами макромолекул [20].

Полярные карбокси- и аминогруппы в фиброине также могут участвовать в дипольных взаимодействиях, а в случае переноса протона также в электростатических взаимодействиях [21]. Поскольку содержание кислотных и основных групп в фиброине низкое, электростатический фактор не является решающим в формировании вторичной структуры; он, однако, может стать решающим в получении растворов фиброина. Поскольку фиброин

на 75% состоит из неполярных гидрофобных аминокислот, необходимо учитывать также гидрофобные (дисперсионные) взаимодействия, делающие фиброин устойчивым к большинству растворителей.

На данный момент выделяют три основных «типа» вторичных структур натурального фиброина шелка: в кристаллических областях, a-спиральных и Р-складчатых структурах (шелк I и шелк II соответственно), и в аморфных областях, с неупорядоченной конформацией случайных глобул. Жидкий шелк, синтезируемый железой тутового шелкопряда, представляет собой водный раствор фиброина с концентрацией 26 об.%, в котором макромолекулы имеют форму глобулы или a-спирали. Фиброин Bombyx morí содержит 56±5% макромолекул в Р-свернутой форме и 13±5% макромолекул в a-спиральной форме [22]. Таким образом, доля высокоупорядоченных (кристаллических) областей полимера достигает 60-70%.

Шелк II - это структура волокна после прядения тутовым шелкопрядом, она в основном представляет собой антипараллельный Р-лист. Физические и механические свойства регенерированного фиброина шелка зависят от конформации молекулярной цепи и кристаллической структуры [23].

На рисунке 1 показаны проекции сегментов макромолекул, образующих a-спиральные и Р-складчатые структуры. a-спиральная структура образована внутримолекулярными водородными связями, при этом гидрофобные фрагменты смещены к периферии [24]. В Р-свернутой структуре макромолекулы располагаются параллельно или антипараллельно, образуя сложенный лист или слой (Р-лист).

? Н00С^1

г К

а-снираль р-слой

Рисунок 1 - Проекции сегментов макромолекул, образующих а-спиральные и Р-складчатые структуры.

Антипараллельные Р-листы фиброина шелка упакованы «лицом к лицу», «спина к спине»: двойной слой остатков глицина (межплоскостное расстояние 3,5 А) двойной слой остатков аланина/серина (межплоскостное расстояние 5,7 А) двойной слой остатков глицина и др. [25]. Для гидрофобных фрагментов макромолекул эта структура является наиболее энергетически выгодной [26, 27].

Конформация цепи в аморфных блоках представляет собой своеобразный «случайный клубок», который придает шелку эластичность [28, 29]. Критическими факторами, определяющими механические свойства любого вида шелка, являются точный контроль размера, количества, распределения, ориентации и пространственного расположения кристаллических и некристаллических доменов в нанометровом масштабе [30,

31]. Нанокристаллы способствуют выдающимся механическим свойствам шелка, несмотря на дефекты микроструктуры в виде микропустот [15, 32].

Помимо вторичной структуры, в шелковых волокнах также очевидна «иерархическая» надмолекулярная организация [16]. Шелк паука и тутового шелкопряда состоит из пучков - микрофиламентов (0,5-2 мкм), каждый из которых состоит из нанокристаллов и/или полукристаллических доменов [3, 33, 34].

Главное преимущество фиброина шелка по сравнению с другими биополимерами - его высокие механические свойства. Другие важные преимущества фиброина включают в себя хорошую биосовместимость, переработку через водные растворы, биоразлагаемость и наличие доступных для модификации функциональных групп.

Из литературных источников известно несколько способов переработки фиброина, но каждому из них предшествует предварительная обработка. Перед тем, как переработать фиброин, необходимо обработать шелк-сырец для удаления серицина, который способен вызывать воспалительные процессы. Степень удаления серицина определяется количественно путем измерения диаметров волокон и наблюдения за микроструктурами кокона с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM).

Коэффициент дегуммирования (Dr) для получения эффективности вышеуказанных процессов был рассчитан, как описано в [35]. Вкратце, был измерен вес кусков кокона до и после обработки дегуммированием, и коэффициент дегуммирования был рассчитан с использованием следующего уравнения:

1.2 Методы выделения фиброина из коконов шелкопряда и получения растворов фиброина

Wt

DT =

х 100

Wtinitia,

где '^Л^^тш^ - масса обезжиренных волокон кокона и -

начальная масса коконов соответственно [36].

Описанный метод дегуммирования - использование раствора №2С03, может повлиять на характеристики поверхности и механические свойства фиброина шелка, поэтому важно следить за температурой и временем обработки коконов.

Максимальное количество фиброина (около 20 г) легко растворяется в 100 мл водного раствора СаС12, когда концентрация составляет около 40-50% (рис. 2). Но длительное кипячение фиброина шелка в таком растворе разрывает молекулярные цепи.

Сапсеп^гайоп I

Рисунок 2 - Соотношение между растворенным фиброином и концентрацией 100 мл раствора хлорида кальция (мас.%).

На рисунке 3 показана взаимосвязь между временем схватывания геля и рН 3%-х растворов фиброина. Начальный рН раствора фиброина составлял 7,6-7,9. рН раствора регулировали лимонной кислотой, HCl и NaOH. Было обнаружено, что гелеобразование происходило в течение двух дней при рН от 3,0 до 4,0. Также было обнаружено, что при рН ниже 1,5 или выше 13,0 гелеобразования не происходило [37].

9 8

9 7

2 -1 -

Q _J_J_J_J_^--.J_1——I ■ ■-1-1-1-L.

01 2 34 6 6 7 i 9 10П 1213 pH

Рисунок 3 - Время схватывания геля при различных значениях рН 3% раствора фиброина: о лимонная кислота; • HCl; ▲ NaOH.

Конечным результатом является водный раствор чистого фиброина шелка, который затем можно использовать в качестве формовочного. В качестве альтернативы его можно лиофилизировать для длительного хранения или использования для производства материалов в органическом растворителе (1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол, HFIP).

После того, как экстрагированный фиброин шелка перерабатывается в полимерный материал, заключительным этапом переработки является индукция кристалличности. Кристалличность можно вызвать двумя способами: либо погружением в спирт, например, метанол или этанол, либо «отжигом» в воде. Погружение в спирт - это просто и быстро, но, если необходимо избежать использования спирта, можно использовать другой способ. «Отжиг» в воде - это процесс, при котором шелковые материалы выдерживаются во влажной среде в течение нескольких часов. Подробнее описано в исследовании [38].

Методика очистки фиброина шелка от серицина состоит в кипячении коконов или волокон в щелочном растворе. Такой процесс называется дегуммирование. Дегуммированные шелковые волокна могут быть далее

переработаны в шелковые жгуты путем скручивания [4] или же нетканые шелковые матриксы [39].

Растворение фибрина само по себе является сложной задачей, и зависит от источников кокона. Системы растворителей, такие как СаС12/этанол/вода [40], ЬШг [41], ШСК [42], №0И [43] и Са(К0з)2-Ме0И-И20 [44] использовали для растворения фиброиновых волокон. Такие растворы впоследствии подвергаются диализу перед обработкой в различные морфологии биоматериала.

Наиболее простой и дешевый способ растворения фиброина шелка - а в смеси СаС12-С2И50И-И20 (1:2:8 в молярном соотношении) [40]. Такой способ обеспечивает получение светло-желтых, прозрачных растворов, практически без осадка. Основным минусом может являться наличие в системе этанола и переработку при повышенной температуре (от 70оС). Кроме того -необходимо постоянно следить за концентрацией раствора и нагревом.

Получение и регенерация фиброина через 9М бромид лития происходит при комнатной температуре, с концентрацией раствора около 20 мас.% [41]. Минусом такой переработки может быть конечный выход белка -концентрация после диализа против воды колеблется в пределах 7-8 мас.%, теряется больше 50% сырья.

Переработка через тиоционат лития: волокна фиброина шелка (10 г) помещали в 100 мл 10М водного раствора тиоцианата лития с 100 мл расплавленного Са^03)2, перемешивали до растворения при 40 и 100 °С. Нерастворенные волокна фиброина шелка фильтровали по истечении заданного времени, а затем сушили при 140°С [42]. Такой способ достаточно сложен в реализации, схож с системой [40], требует конкретных значений температуры, фиброин растворяется ограничено, остается нерастворенная фаза.

Переработка через щелочной раствор (0,1И №0И) требует соблюдения

условий в виде низкой температуры (4оС) и времени - от 24-х часов [43].

Наиболее экономичный из всех способов переработки. Однако известно, что

21

белки неустойчивы к действию щелочей, и уже 3%-ый раствор гидроксида натрия вызывает щелочной гидролиз, т.е. происходит разрушение, которое усиливается при повышении температуры, концентрации КаОН, продолжительности переработки. Щелочи разрушают пептидные связи. Следовательно, все вышеперечисленные условия растворения фиброина в №ОИ являются минусом такой переработки - необходим четкий контроль температуры, концентрации растворителя и своевременное прекращение процесса.

Было обнаружено, что фиброин шелка растворим в системе нитрат кальция-метанол (75% растворе Са^Оз)2/МеОИ) при температуре 67оС [44]. Данные по вязкости указывают на то, что в солевом растворе наблюдается агрегация фиброиновых цепей. Агрегация может быть вызвана комплексообразованием ионов кальция с фиброиновыми цепями в их амидных связях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сажнев Никита Александрович, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lewis R. Unraveling the weave of spider silk // Bioscience. - 1996. -V. 46. - №. 9. - P. 636-638.

2. Ayoub N. A. et al. Blueprint for a high-performance biomaterial: full-length spider dragline silk genes // PloS one. - 2007. - V. 2. - №. 6. - P. e514.

3. Putthanarat S. et al. Investigation of the nanofibrils of silk fibers // Polymer. - 2000. - V. 41. - №. 21. - P. 7735-7747.

4. Altman G.H. et al. Silk-based biomaterials // Biomaterials. - 2003. - V. 24. - №. 3. - P. 401-416.

5. Tsukada M., Gotoh Y., Minoura N.J. // Seric. Sci. Jpn. - 1990 - V. 59

- №. 2. - P. 325-330.

6. Gotoh Y. et al. Preparation of lactose-silk fibroin conjugates and their application as a scaffold for hepatocyte attachment // Biomaterials. - 2004. - V. 25.

- №. 6. - P. 1131-1140.

7. Shimura K. et al. Studies on silk fibroin of Bombyx mori. I. Fractionation of fibroin prepared from the posterior silk gland // The Journal of Biochemistry. - 1976. - V. 80. - №. 4. - P. 693-702.

8. Zhou C.Z. et al. Silk fibroin: structural implications of a remarkable amino acid sequence // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2001. -V. 44. - №. 2. - P. 119-122.

9. Sashina E.S. et al. Structure and solubility of natural silk fibroin // Russian journal of applied chemistry. - 2006. - V. 79. - №. 6. - P. 869-876.

10. Tanaka K., Inoue S., Mizuno S. Hydrophobic interaction of P25, containing Asn-linked oligosaccharide chains, with the HL complex of silk fibroin produced by Bombyx mori // Insect biochemistry and molecular biology. - 1999. -V. 29. - №. 3. - P. 269-276.

11. Sehnal F., Zurovec M. Construction of silk fiber core in Lepidoptera // Biomacromolecules. - 2004. - V. 5. - №. 3. - P. 666-674.

12. Inoue S. et al. Silk fibroin of Bombyx mori is secreted, assembling a high molecular mass elementary unit consisting of H-chain, L-chain, and P25, with a 6: 6: 1 molar ratio // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - V. 275. - №. 51.

- P. 40517-40528.

13. Kundu B., Kundu S.C. Osteogenesis of human stem cells in silk biomaterial for regenerative therapy // Progress in polymer science. - 2010. - V. 35.

- №. 9. - P. 1116-1127.

14. Inoue S. et al. Nanostructure of Natural Fibrous Protein: In Vitro Nanofabric Formation of Samia c ynthia r icini Wild Silk Fibroin by Self Assembling // Nano Letters. - 2003. - V. 3. - №. 10. - P. 1329-1332.

15. Vollrath F., Porter D. Spider silk as a model biomaterial // Applied Physics A. - 2006. - V. 82. - №. 2. - P. 205-212.

16. Lefevre T., Rousseau M. E., Pezolet M. Protein secondary structure and orientation in silk as revealed by Raman spectromicroscopy // Biophysical journal.

- 2007. - V. 92. - №. 8. - P. 2885-2895.

17. Becker M. A. et al. Silk Polymers: Materials Science and Biotechnology // Kaplan, D. - 1994. - P. 252-269.

18. Valluzzi R., Gido S. P. The crystal structure of Bombyx mori silk fibroin at the air-water interface //Biopolymers: Original Research on Biomolecules.

- 1997. - V. 42. - №. 6. - P. 705-717.

19. Shimura K. et al. The occurrence of small component proteins in the cocoon fibroin of Bombyx mori // The Journal of Sericultural Science of Japan. -1982. - V. 51. - №. 1. - P. 20-26.

20. Baker E.N., Hubbard R.E. Hydrogen bonding in globular proteins // Progress in biophysics and molecular biology. - 1984. - V. 44. - №. 2. - P. 97-179.

21. Dill K.A. Dominant forces in protein folding // Biochemistry. - 1990.

- V. 29. - №. 31. - P. 7133-7155.

22. Trabbic K.A., Yager P. Comparative structural characterization of naturally-and synthetically-spun fibers of Bombyx mori fibroin // Macromolecules.

- 1998. - V. 31. - №. 2. - P. 462-471.

23. Wen D. J. et al. Conformation and crystallinity of silk fibroin // J. Textile. Res. - 2005. - V. 26. - P. 110-112.

24. Padol A.R. et al. Safety evaluation of silk protein film (a novel wound healing agent) in terms of acute dermal toxicity, acute dermal irritation and skin sensitization // Toxicology international. - 2011. - V. 18. - №. 1. - P. 17.

25. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering // Science. - 1993. - V. 260.

- №. 5110. - P. 920-926.

26. Lazo N.D., Downing D.T. Crystalline regions of Bombyx mori silk fibroin may exhibit P-turn and p-helix conformations // Macromolecules. - 1999. -V. 32. - №. 14. - P. 4700-4705.

27. Dwyer D. S. Molecular simulation of the effects of alcohols on peptide structure // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 1999. - V. 49. - №. 7. - P. 635-645.

28. Vollrath F., Knight D.P. Liquid crystalline spinning of spider silk // Nature. - 2001. - V. 410. - №. 6828. - P. 541-548.

29. Vollrath F. Strength and structure of spiders' silks // Reviews in Molecular Biotechnology. - 2000. - V. 74. - №. 2. - P. 67-83.

30. Omenetto F.G., Kaplan D.L. New opportunities for an ancient material // Science. - 2010. - V. 329. - №. 5991. - P. 528-531.

31. Keten S. et al. Nanoconfinement controls stiffness, strength and mechanical toughness of P-sheet crystals in silk // Nature materials. - 2010. - V. 9.

- №. 4. - P. 359-367.

32. Frische S., Maunsbach A.B., Vollrath F. Elongate cavities and skin-core structure in nephila spider silk observed by electron microscopy // Journal of microscopy. - 1998. - V. 189. - P. 64-70.

33. Poza P. et al. Fractographic analysis of silkworm and spider silk // Engineering Fracture Mechanics. - 2002. - V. 69. - №. 9. - P. 1035-1048.

34. Akai H., Nagashima T., Aoyagi S. Ultrastructure of posterior silk gland cells and liquid silk in indian tasar silkworm, Antheraea mylitta Drury (Lepidoptera:

Saturniidae) // International Journal of Insect Morphology and Embryology. - 1993.

- V. 22. - №. 5. - P. 497-506.

35. Wang H.Y., Zhang Y.Q. Effect of regeneration of liquid silk fibroin on its structure and characterization // Soft Matter. - 2013. - V. 9. - №. 1. - P. 138-145.

36. Kundu B. et al. Isolation and processing of silk proteins for biomedical applications // International journal of biological macromolecules. - 2014. - V. 70.

- P. 70-77.

37. Haider Z.A., Arai M., Hirabayashi K. Mechanism of the gelation of fibroin solution // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. - 1993. - V. 57. -№. 11. - P. 1910-1912.

38. Hu X. et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing // Biomacromolecules. - 2011. - V. 12. - №. 5. -P. 1686-1696.

39. Dal Pra I. et al. De novo engineering of reticular connective tissue in vivo by silk fibroin nonwoven materials // Biomaterials. - 2005. - V. 26. - №. 14. -P. 1987-1999.

40. Ajisawa A. Studies on the dissolution of silk fibroin III. The dissolution of silk fibroin by CaCl2-H2OR-OH ternary system solution // The Journal of Sericultural Science of Japan. - 1969. - V. 38. - №. 4. - P. 340-346.

41. Jin H.J. et al. Water-stable silk films with reduced P-sheet content // Advanced Functional Materials. - 2005. - V. 15. - №. 8. - P. 1241-1247.

42. Tao W., Li M., Zhao C. Structure and properties of regenerated Antheraea pernyi silk fibroin in aqueous solution // International Journal of Biological Macromolecules. - 2007. - V. 40. - №. 5. - P. 472-478.

43. Rajan M.K., Balakrishnan A., Jayaraman K. Development of an antibody against a 170-kDa fragment of fibroin isolated from cocoon fibres of Bombyx mori // Journal of biochemical and biophysical methods. - 1992. - V. 25.

- №. 1. - P. 37-43.

44. Mathur A. B. et al. The dissolution and characterization of Bombyx mori silk fibroin in calcium nitrate-methanol solution and the regeneration of films // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 1997. - V. 42. - №. 1. - P. 61-74.

45. Zhao C. et al. Structural characterization and artificial fiber formation of Bombyx mori silk fibroin in hexafluoro-iso-propanol solvent system // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 2003. - V. 69. - №2. 2. - P. 253259.

46. Yao J. et al. Artificial Spinning and Characterization of Silk Fiber from Bombyx m ori Silk Fibroin in Hexafluoroacetone Hydrate // Macromolecules. -2002. - V. 35. - №. 1. - P. 6-9.

47. Um I. C. et al. Wet spinning of silk polymer: I. Effect of coagulation conditions on the morphological feature of filament // International journal of biological macromolecules. - 2004. - V. 34. - №. 1-2. - P. 89-105.

48. Nazarov R., Jin H.J., Kaplan D.L. Porous 3-D scaffolds from regenerated silk fibroin // Biomacromolecules. - 2004. - V. 5. - №2. 3. - P. 718-726.

49. Hirabavashi. K., Ishikawa. H., Kasai. N., Kakudo. M. Fiber-formation mechanism of tussah silk fibroin // Kogyo Kagaku Zashi. - 1970. - V.73.

50. Magoshi J., Nakamura S. Studies on physical properties and structure of silk. Glass transition and crystallization of silk fibroin // J Of Appl. Polym Sci. -1975. - V. 19. - P. 1013-1015.

51. Matsumoto A. et al. Silk fibroin solution properties related to assembly and structure //Macromolecular bioscience. - 2008. - V. 8. - №2. 11. - P. 1006-1018.

52. Su D. et al. Enhancing mechanical properties of silk fibroin hydrogel through restricting the growth of P-sheet domains // ACS applied materials & interfaces. - 2017. - V. 9. - №. 20. - P. 17489-17498.

53. Nogueira G.M. et al. Preparation and characterization of ethanol-treated silk fibroin dense membranes for biomaterials application using waste silk fibers as raw material // Bioresource technology. - 2010. - V. 101. - №. 21. - P. 8446-8451.

54. Zuo B., Liu L., Wu Z. Effect on properties of regenerated silk fibroin fiber coagulated with aqueous methanol/ethanol // Journal of applied polymer science. - 2007. - V. 106. - №. 1. - P. 53-59.

55. Li M. et al. Controlling molecular conformation of regenerated wild silk fibroin by aqueous ethanol treatment // Polymers for Advanced Technologies. -2003. - V. 14. - №. 10. - P. 694-698.

56. Mo C. et al. The effect of water on the conformation transition of Bombyx mori silk fibroin // Vibrational Spectroscopy. - 2009. - V. 51. - №. 1. - P. 105-109.

57. Chen X. et al. Conformation transition kinetics of Bombyx mori silk protein //Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2007. - V. 68. - №. 1.

- P. 223-231.

58. Zhang K., Qian Y., Wang H., Fan L., Huang C., Yin A., Mo X. Genipin-crosslinked silk fibroin/hydroxybutyl chitosan nanofibrous scaffolds for tissue-engineering application // Journal of Biomedical Materials Research Part A. - 2010.

- V. 95A. - P. 870-881.

59. Kim U.J. et al. Structure and properties of silk hydrogels // Biomacromolecules. - 2004. - V. 5. - №. 3. - P. 786-792.

60. Yucel T., Cebe P., Kaplan D.L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels // Biophysical journal. - 2009. - V. 97. - №. 7. - P. 2044-2050.

61. Wang X. et al. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation // Biomaterials. - 2008. - V. 29. - №. 8. - P. 1054-1064.

62. Yucel T. et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives // Journal of structural biology. - 2010. - V. 170. - №. 2. - P. 406-412.

63. Bhardwaj N., Chakraborty S., Kundu S.C. Freeze-gelled silk fibroin protein scaffolds for potential applications in soft tissue engineering // International journal of biological macromolecules. - 2011. - V. 49. - №. 3. - P. 260-267.

64. Matsumoto A. et al. Mechanisms of silk fibroin sol- gel transitions // The journal of physical chemistry B. - 2006. - V. 110. - №. 43. - P. 21630-21638.

65. Lu Q. et al. Silk fibroin electrogelation mechanisms // Acta biomaterialia. - 2011. - V. 7. - №. 6. - P. 2394-2400.

66. Samal S. K., Kaplan D.L., Chiellini E. Ultrasound sonication effects on silk fibroin protein // Macromolecular Materials and Engineering. - 2013. - V. 298. - №. 11. - P. 1201-1208.

67. Ak F. et al. Macroporous silk fibroin cryogels // Biomacromolecules. -2013. - V. 14. - №. 3. - P. 719-727.

68. Wu X. et al. Sodium dodecyl sulfate-induced rapid gelation of silk fibroin // Acta biomaterialia. - 2012. - V. 8. - №. 6. - P. 2185-2192.

69. Calabrese R., Kaplan D.L. Silk ionomers for encapsulation and differentiation of human MSCs // Biomaterials. - 2012. - V. 33. - №. 30. - P. 73757385.

70. Fini M. et al. The healing of confined critical size cancellous defects in the presence of silk fibroin hydrogel // Biomaterials. - 2005. - V. 26. - №. 17. - P. 3527-3536.

71. Zhang W. et al. The use of injectable sonication-induced silk hydrogel for VEGF165 and BMP-2 delivery for elevation of the maxillary sinus floor // Biomaterials. - 2011. - V. 32. - №. 35. - P. 9415-9424.

72. Pallotta I. et al. Characteristics of platelet gels combined with silk // Biomaterials. - 2014. - V. 35. - №. 11. - P. 3678-3687.

73. Aghaloo T.L., Moy P.K., Freymiller E.G. Evaluation of platelet-rich plasma in combination with anorganic bovine bone in the rabbit cranium: a pilot study // International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. - 2004. - V. 19. -№. 1. - P.59-65.

74. Dallari D. et al. Enhanced tibial osteotomy healing with use of bone grafts supplemented with platelet gel or platelet gel and bone marrow stromal cells // JBJS. - 2007. - V. 89. - №. 11. - P. 2413-2420.

75. Kanthan S. R. et al. Platelet-rich plasma (PRP) enhances bone healing in non-united critical-sized defects: a preliminary study involving rabbit models // Injury. - 2011. - V. 42. - №. 8. - P. 782-789.

76. Correia C. et al. Development of silk-based scaffolds for tissue engineering of bone from human adipose-derived stem cells // Acta biomaterialia. -2012. - V. 8. - №. 7. - P. 2483-2492.

77. Oliveira A.L. et al. Aligned silk-based 3-D architectures for contact guidance in tissue engineering // Acta biomaterialia. - 2012. - V. 8. - №. 4. - P. 1530-1542.

78. Jin H.J. et al. Electrospinning Bombyx mori silk with poly (ethylene oxide) // Biomacromolecules. - 2002. - V. 3. - №. 6. - P. 1233-1239.

79. Min B.M. et al. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro // Biomaterials. - 2004. - V. 25. - №. 7-8. - P. 1289-1297.

80. Hofmann S. et al. Remodeling of tissue-engineered bone structures in vivo // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2013. - V. 85.

- №. 1. - P. 119-129.

81. Ki C.S. et al. Development of 3-D nanofibrous fibroin scaffold with high porosity by electrospinning: implications for bone regeneration // Biotechnology letters. - 2008. - V. 30. - №. 3. - P. 405-410.

82. Park S.Y. et al. Electrospun silk fibroin scaffolds with macropores for bone regeneration: an in vitro and in vivo study // Tissue Engineering Part A. - 2010.

- V. 16. - №. 4. - P. 1271-1279.

83. Ghosh S. et al. Direct-write assembly of microperiodic silk fibroin scaffolds for tissue engineering applications // Advanced Functional Materials. -2008. - V. 18. - №. 13. - P. 1883-1889.

84. Dababneh A.B., Ozbolat I.T. Bioprinting technology: a current state-of-the-art review // Journal of Manufacturing Science and Engineering. - 2014. - V. 136. - №. 6.

85. Suntivich R. et al. Inkjet printing of silk nest arrays for cell hosting // Biomacromolecules. - 2014. - V. 15. - №. 4. - P. 1428-1435.

86. Das S. et al. Bioprintable, cell-laden silk fibroin-gelatin hydrogel supporting multilineage differentiation of stem cells for fabrication of three-dimensional tissue constructs // Acta biomaterialia. - 2015. - V. 11. - P. 233-246.

87. Tamada Y. New process to form a silk fibroin porous 3-D structure // Biomacromolecules. - 2005. - V. 6. - №. 6. - P. 3100-3106.

88. Roseti L. et al. Scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and new perspectives // Materials Science and Engineering: C. - 2017. - V. 78. - P. 1246-1262.

89. Chocholata P., Kulda V., Babuska V. Fabrication of scaffolds for bone-tissue regeneration // Materials. - 2019. - V. 12. - №. 4. - P. 568.

90. Qu H. et al. Biomaterials for bone tissue engineering scaffolds: a review // RSC advances. - 2019. - V. 9. - №. 45. - P. 26252-26262.

91. Turnbull G. et al. 3D bioactive composite scaffolds for bone tissue engineering // Bioactive materials. - 2018. - V. 3. - №. 3. - P. 278-314.

92. Dwivedi R. et al. Polycaprolactone as biomaterial for bone scaffolds: Review of literature // Journal of oral biology and craniofacial research. - 2020. -V. 10. - №. 1. - P. 381-388.

93. Seal B.L., Otero T.C., Panitch A. Polymeric biomaterials for tissue and organ regeneration // Materials Science and Engineering: R: Reports. - 2001. - V. 34. - №. 4-5. - P. 147-230.

94. Nair L.S., Laurencin C.T. Biodegradable polymers as biomaterials // Progress in polymer science. - 2007. - V. 32. - №. 8-9. - P. 762-798.

95. Kasoju N., Bora U. Silk fibroin in tissue engineering // Advanced healthcare materials. - 2012. - V. 1. - №. 4. - P. 393-412.

96. Wharram S.E. et al. Electrospun silk material systems for wound healing // Macromolecular bioscience. - 2010. - V. 10. - №. 3. - P. 246-257.

97. Wang X. et al. Biomaterial coatings by stepwise deposition of silk fibroin // Langmuir. - 2005. - V. 21. - №. 24. - P. 11335-11341.

98. Minoura N. et al. Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices // Journal of biomedical materials research. - 1995. - V. 29. -№. 10. - P. 1215-1221.

99. Inouye K. et al. Use of Bombyx mori silk fibroin as a substratum for cultivation of animal cells // Journal of biochemical and biophysical methods. -1998. - V. 37. - №. 3. - P. 159-164.

100. Sofia S. et al. Functionalized silk-based biomaterials for bone formation // Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. - 2001. - V. 54. - №. 1. -P. 139-148.

101. Mandal B.B., Kundu S.C. Cell proliferation and migration in silk fibroin 3D scaffolds // Biomaterials. - 2009. - V. 30. - №. 15. - P. 2956-2965

102. Servoli E. et al. Surface properties of silk fibroin films and their interaction with fibroblasts // Macromolecular bioscience. - 2005. - V. 5. - №. 12. - P. 1175-1183.

103. Marelli B. et al. Compliant electrospun silk fibroin tubes for small vessel bypass grafting // Acta Biomaterialia. - 2010. - V. 6. - №. 10. - P. 40194026.

104. Bhattacharjee P. et al. Investigating the potential of combined growth factors delivery, from non-mulberry silk fibroin grafted poly (s-caprolactone)/hydroxyapatite nanofibrous scaffold, in bone tissue engineering // Applied Materials Today. - 2016. - V. 5. - P. 52-67.

105. Kim H.J. et al. Influence of macroporous protein scaffolds on bone tissue engineering from bone marrow stem cells // Biomaterials. - 2005. - V. 26. -№. 21. - P. 4442-4452.

106. Uebersax L. et al. Biocompatibility and osteoconduction of macroporous silk fibroin implants in cortical defects in sheep // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2013. - V. 85. - №. 1. - P. 107-118.

107. Kim U.J. et al. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial

scaffolds from silk fibroin // Biomaterials. - 2005. - V. 26. - №. 15. - P. 2775-2785.

146

108. Sugihara A. et al. Promotive effects of a silk film on epidermal recovery from full-thickness skin wounds (44552) // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. - 2000. - V. 225. - №. 1. - P. 58-64.

109. Denkba§ E.B., Seyyal M., Pi§kin E. Implantable 5-fluorouracil loaded chitosan scaffolds prepared by wet spinning // Journal of membrane Science. - 2000.

- V. 172. - №. 1-2. - P. 33-38.

110. Deville S., Saiz E., Tomsia A. P. Freeze casting of hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering // Biomaterials. - 2006. - V. 27. - №. 32. - P. 5480-5489.

111. Landi E., Valentini F., Tampieri A. Porous hydroxyapatite/gelatine scaffolds with ice-designed channel-like porosity for biomedical applications // Acta Biomaterialia. - 2008. - V. 4. - №. 6. - P. 1620-1626.

112. Sadeghianmaryan A. et al. Extrusion-based printing of chitosan scaffolds and their in vitro characterization for cartilage tissue engineering // International Journal of Biological Macromolecules. - 2020. - V. 164. - P. 31793192.

113. Lauritano D. et al. Nanomaterials for periodontal tissue engineering: Chitosan-based scaffolds. A systematic review // Nanomaterials. - 2020. - V. 10. -№. 4. - P. 605.

114. Jayakumar R. et al. Graft copolymerized chitosan—present status and applications // Carbohydrate Polymers. - 2005. - V. 62. - №. 2. - P. 142-158.

115. Mourya V.K., Inamdar N.N. Chitosan-modifications and applications: Opportunities galore // Reactive and Functional polymers. - 2008. - V. 68. - №. 6.

- P. 1013-1051.

116. VandeVord P.J. et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice // Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials. - 2002.

- V. 59. - №. 3. - P. 585-590.

117. Madihally S.V., Matthew H.W.T. Porous chitosan scaffolds for tissue engineering // Biomaterials. - 1999. - V. 20. - №. 12. - P. 1133-1142.

118. Nettles D.L., Elder S.H., Gilbert J.A. Potential use of chitosan as a cell scaffold material for cartilage tissue engineering // Tissue engineering. - 2002. - V. 8. - №. 6. - P. 1009-1016.

119. O'Brien F.J. et al. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds // Biomaterials. - 2004. - V. 25. - №. 6. - P. 10771086.

120. Никоноров В.В. и др. Синтез и свойства криогелей хитозана, сшитого глутаровым альдегидом // Высокомолекулярные соединения. Серия А. - 2010. - Т. 52. - №. 8. - С. 1436-1443.

121. Никоноров В.В. и др. Влияние молекулярной массы полимерного предшественника на особенности формирования и свойства ковалентно-сшитых хитозановых криогелей // Высокомолекулярные соединения. Серия А. - 2011. - Т. 53. - №. 12. - С. 2067-2067.

122. De la Riva B. et al. VEGF-controlled release within a bone defect from alginate/chitosan/PLA-H scaffolds // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2009. - V. 73. - №. 1. - P. 50-58.

123. De la Riva B. et al. Local controlled release of VEGF and PDGF from a combined brushite-chitosan system enhances bone regeneration // Journal of Controlled Release. - 2010. - V. 143. - №. 1. - P. 45-52.

124. Lu H. et al. Porous chitosan scaffolds with embedded hyaluronic acid/chitosan/plasmid-DNA nanoparticles encoding TGF-ß1 induce DNA controlled release, transfected chondrocytes, and promoted cell proliferation // PloS one. - 2013. - V. 8. - №. 7. - P. e69950.

125. Li M., Ogiso M., Minoura N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets // Biomaterials. - 2003. - V. 24. - №. 2. - P. 357-365.

126. Horan R.L. et al. In vitro degradation of silk fibroin // Biomaterials. -2005. - V. 26. - №. 17. - P. 3385-3393.

127. Numata K., Cebe P., Kaplan D.L. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals // Biomaterials. - 2010. - V. 31. - №. 10. - P. 2926-2933.

128. Lu Q. et al. Water-insoluble silk films with silk I structure // Acta biomaterialia. - 2010. - V. 6. - №. 4. - P. 1380-1387.

129. You R. et al. Comparison of the in vitro and in vivo degradations of silk fibroin scaffolds from mulberry and nonmulberry silkworms // Biomedical Materials. - 2014. - V. 10. - №. 1. - P. 015003.

130. Pritchard E.M. et al. Incorporation of proteinase inhibitors into silk-based delivery devices for enhanced control of degradation and drug release // Biomaterials. - 2011. - V. 32. - №. 3. - P. 909-918.

131. Aghabegi Moghanjoughi A., Khoshnevis D., Zarrabi A. A concise review on smart polymers for controlled drug release // Drug delivery and translational research. - 2016. - V. 6. - №. 3. - P. 333-340.

132. Ulery B.D., Nair L.S., Laurencin C.T. Biomedical applications of biodegradable polymers // Journal of polymer science Part B: polymer physics. -2011. - V. 49. - №. 12. - P. 832-864.

133. Tian H. et al. Biodegradable synthetic polymers: Preparation, functionalization and biomedical application // Progress in Polymer Science. - 2012. - V. 37. - №. 2. - P. 237-280.

134. Yang N. et al. y-Polyglutamic acid mediated crosslinking PNIPAAm-based thermo/pH-responsive hydrogels for controlled drug release // Polymer Degradation and Stability. - 2017. - V. 144. - P. 53-61.

135. Vashist A., Sharif A. Hydrogels: smart materials for drug delivery // Oriental Journal of Chemistry. - 2013. - V. 29. - №. 3. - P. 861-870.

136. Patil J.S. et al. Ionotropic gelation and polyelectrolyte complexation: the novel techniques to design hydrogel particulate sustained, modulated drug delivery system: a review // Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. -2010. - V. 5. - №. 1. - P. 241-248.

137. Wei M. et al. Stimuli-responsive polymers and their applications // Polymer Chemistry. - 2017. - V. 8. - №. 1. - P. 127-143.

138. Rasool A., Ata S., Islam A. Stimuli responsive biopolymer (chitosan) based blend hydrogels for wound healing application // Carbohydrate polymers. -2019. - V. 203. - P. 423-429.

139. Racine L. et al. Design of interpenetrating chitosan and poly (ethylene glycol) sponges for potential drug delivery applications // Carbohydrate polymers. -2017. - V. 170. - P. 166-175.

140. Sizilio R.H. et al. Chitosan/pvp-based mucoadhesive membranes as a promising delivery system of betamethasone-17-valerate for aphthous stomatitis // Carbohydrate polymers. - 2018. - V. 190. - P. 339-345.

141. Перепелкин К.Е. Физико-химические особенности формования природных фиброиновых нитей. Возможности применения принципов биомиметики в перспективных технологиях получения химических волокон // Известия высших учебных заведений. Химия и химическая технология. -2007. - Т. 50. - №. 11. - С. 3-13.

142. Сашина Е.С. и др. Строение и растворимость фиброина природного шелка (Обзор) // Журнал прикладной химии. - 2006. - Т. 79. - №. 6. - С. 881-888.

143. Ajisawa A. Dissolution of silk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution Studies on the dissolution of silk fibroin.(IX) // The Journal of Sericultural Science of Japan. - 1998. - V. 67. - №. 2. - P. 91-94.

144. Bhattarai N. et al. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility // Biomaterials. - 2005. - V. 26. - №. 31. - P. 6176-6184.

145. Chen J.P., Chen S.H., Lai G.J. Preparation and characterization of biomimetic silk fibroin/chitosan composite nanofibers by electrospinning for osteoblasts culture // Nanoscale research letters. - 2012. - V. 7. - №. 1. - P. 1-11

146. Kildeeva N. et al. Influence of genipin crosslinking on the properties of chitosan-based films // Polymers. - 2020. - V. 12. - №. 5. - P. 1086.

147. Сажнев Н. А. и др. Получение криоструктуратов хитозана с регулируемой пористой морфологией и их использование в качестве 3D-

подложек для культивирования животных клеток // Прикладная биохимия и микробиология. - 2018. - Т. 54. - №. 5. - С. 455-464.

148. Kildeeva N.R., Sazhnev N.A., Zakharova V.A., Gubochkina A.A. Biologically active films and fibers based on chitosan cross-linked by genipin. // Binanotox. 11-th International Conference. - 2020. - P.24.

149. Al-Rekabi Z., Contera S. Multifrequency AFM reveals lipid membrane mechanical properties and the effect of cholesterol in modulating viscoelasticity // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2018. - V. 115. - №. 11. - P. 2658-2663.

150. Marshall Jr G.W. et al. Mechanical properties of the dentinoenamel junction: AFM studies of nanohardness, elastic modulus, and fracture // Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. - 2001. - V. 54. - №. 1. - P. 87-95.

151. Baker S. R. et al. Determining the mechanical properties of electrospun poly-e-caprolactone (PCL) nanofibers using AFM and a novel fiber anchoring technique // Materials Science and Engineering: C. - 2016. - V. 59. - P. 203-212.

152. Liu Y., Chen W., Kim H.-I. Mechanical and Antimicrobial Properties of Genipin-Crosslinked Chitosan/Poly(Ethylene Glycol) IPN. // Journal of Macromolecular Science, Part B: Physics. - 2012. - V. 51. - P. 1069-1079

153. Frick J.M., Ambrosi A. et al. Influence of Glutaraldehyde Crosslinking and Alkaline Post-treatment on the Properties of Chitosan-Based Films // J Polym Environ. - 2018. -V. 26. - P. 2748-2757.

154. Silva R.M. et al. Preparation and characterisation in simulated body conditions of glutaraldehyde crosslinked chitosan membranes // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. - 2004. - V. 15. - P. 1105-1112.

155. Garavand F., Rouhi M. et al. Improving the integrity of natural biopolymer films used in food packaging by crosslinking approach: A review // International Journal of Biological Macromolecules. - 2017. - V.104. - P.687-707.

156. Uhrich K.E. et al. Polymeric systems for controlled drug release // Chemical Reviews-Columbus. - 1999. - V. 99. - №. 11. - P. 3181-3198.

157. Oh J.Y. et al. The anti-inflammatory and anti-angiogenic role of mesenchymal stem cells in corneal wound healing following chemical injury // Stem cells. - 2008. - V. 26. - №. 4. - P. 1047-1055.

158. Khubutiya M.S. et al. Paracrine mechanisms of proliferative, anti-apoptotic and anti-inflammatory effects of mesenchymal stromal cells in models of acute organ injury // Cytotherapy. - 2014. - V. 16. - №. 5. - P. 579-585.

159. Khubutiya M. S. et al. Effect of conditioned medium and bone marrow stem cell lysate on the course of acetaminophen-induced liver failure // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2015. - V. 159. - №. 1. - P. 118-123.

160. Hoffmann A. et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations // Translational stroke research. - 2011. - V. 2. - №2. 1. - P. 106-111.