Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Фадеева, Ольга Александровна

• Фадеева, Ольга Александровна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фадеева, Ольга Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Методы иммобилизации биополимеров.

1.1.2. Методы нековалентной иммобилизации.

1.1.3. Методы ковалентной иммобилизации.

1.2. Применение иммобилизованных биополимеров.

1.3. Белок - тканевой фактор.

1.3.1. Структура тканевого фактора.

1.3.2. Функционирование тканевого фактора.

1.3.3. Регуляция экспрессии тканевого фактора.

1.3.4. Биологические функции тканевого фактора.

1.4. Тромбопластин в методах исследования свертывания крови.

1.5. Постановка задачи.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Доноры крови.

2.3. Подготовка плазмы крови.

2.4. Приготовление пленок с монослоем фибробластов.

2.5. Получение геля на основе альбумина.

2.6. Получение геля на основе альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.

2.7. Получение геля на основе полиэтиленимина.

2.8. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина.

2.9. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением метилцеллюлозы.

2.10. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.

2.11. Получение геля на основе полиакриламидного геля, в состав которого включен тромбопластин.

2.11.1. Приготовление полиакриламидного геля.

2.11.2. Введение тромбопластина в состав полиакриамидного геля.

2.12. Получение пленки для активации поверхности с дальнейшей иммобилизацией тромбопластина.

2.13. Метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность

2.14. Определение плотности тканевого фактора на поверхности.

2.15. Определение функциональной константы диссоциации (К^ комплекса УИа/ТФ.

2.16. Определение параметров пространственного роста сгустка в плазме, крови.

Глава 3. Результаты.

3.1. Подбор реагентов для получения полимерного геля, в состав которого включен тромбопластин.

3.1.1. Разработка геля на основе альбумина, стабилизированного глутаровым альдегидом.

3.1.5. Разработка геля на основе альбумина с добавлением в его состав тромбопластина.

3.1.2. Разработка геля на основе полиэтиленимина.

3.1.3. Разработка геля на основе полиэтиленимина и альбумина.

3.1.4. Разработка геля на основе альбумина и полиэтиленимина с добавлением метилцеллюлозы.

3.1.5. Разработка геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.

3.1.6. Разработка геля на основе полиакриламидного геля, в состав которого включен тромбопластин.

3.2. Разработка и оптимизация метода ковалентной иммобилизации тромбопластина.

3.2.1. Подбор состава пленки для активации поверхности.

3.2.2. Оптимизация условий иммобилизации тромбопластина.

3.3. Сравнение кинетических характеристик иммобилизованного тромбопластина с тканевым фактором фибробластов.

3.3.1. Получение разной плотности тканевого фактора на поверхности пластика.

3.3.2. Кинетика связывания тканевого фактора с фактором УПа.

3.3.3. Сравнение пространственной динамики роста фибринового сгустка в плазме крови при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

3.3.4. Исследование зависимости параметров роста сгустка от плотности тканевого фактора.

3.3.5. Хранение активаторов с иммобилизованным тромбопластином.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином»

Нарушения свертывания крови являются одной из ведущих причин смертности в современном мире, поскольку непременно возникают при сепсисе, травме, многих видах рака, тяжелых кровопотерях, любых существенных операционных вмешательствах и т.д. [1,2]. Диагностика этих нарушений до сих пор остается очень несовершенной и позволяет выявлять далеко не все нарушения в системе гемостаза. Основным недостатком большинства существующих тестов является то, что свертывание протекает одновременно во всем, объеме исследуемой пробы, и это принципиально отличается от условий, в которых сгусток-тромб образуется в живом организме [3,4].

Система гемостаза- представляет собой сложный каскад ферментативных реакций [5]. Свертывание начинается с контакта крови с поверхностью клеток, находящихся в зоне повреждения стенки сосуда-Клетки, находящиеся под эндотелием, имеют на поверхности- белок, который является сигналом для запуска свертывания. Этим главным активатором свертывания является^ интегральный мембранныйs белок -тканевой фактор (ТФ) [6]. Он находится на поверхности всех клеток нашего* организма, не имеющих прямого контакта с кровью. Тканевой фактор не обладает ферментативной активностью, но является кофактором фактора свертывания Vila — сериновой протеазы. Когда фактор Vila связывается с тканевым фактором, получившийся комплекс, называемый внешней теназой, становится способен активировать факторы IX и X, что запускает весь каскад свертывания и приводит к образованию сгустка [5]. Процесс довольно сложен не только с точки зрения биохимических превращений. Важно учитывать его пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания [7]. Пространственная динамика свертывания может быть условно разделена на несколько стадий: 1) активация: в зоне повреждения к кровь контактирует с клетками, имеющими на клеточных мембранах иммобилизованный тканевой фактор; при этом образуется комплекс УПа/ТФ, который начинает процесс свертывания, активируя фактор X на поврежденной поверхности; 2) рост сгустка вдали от активатора, который определяется диффузией и образованием новых активных факторов, не связанным с активностью комплекса УПа/ТФ, а обусловленным специальными реакциями поддержания роста; 3) остановка роста сгустка, которая происходит на довольно большом расстоянии от зоны активации. Она обусловлена особым каскадом биохимпических реакций, инактивирующих активные факторы свертывания.

В традиционных тестах по исследованию свертывания, активаторы добавляются в объем плазмы, и все активно перемешивается. В результате доминирующими оказываются реакции только первой стадии. Нарушения в остальных стадиях обнаруживаются такими методами довольно плохо.

Разработанный в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН метод и прибор для исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови, позволяет наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде [8-10]. В основе метода лежит активация свертывания на, стенке измерительной камеры с помощью специального покрытия, содержащего главный белок-активатор свертывания в организме — тканевой фактор. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков - информацию, которая недоступна гомогенным методам [7,8,11-14]. Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса. Таким образом, например, было показано, что при классических гемофилиях, когда генетически дефектен один из факторов свертывания, нарушения происходят в фазе роста сгустка, но не активации свертывания. Клинические перспективы исследования пространственной динамики свертывания велики, однако его внедрение в клиническую* практику тормозится тем, что в представленном в литературе варианте метода для активации свертывания был использован монослой фибробластов, получаемых в первичной культуре клеток [8]. Такая технология является дорогостоящей и трудоемкой и вряд ли может стать основой для проведения рутинных исследований. Поэтому перед нами встала задача разработать ту часть экспериментальной установки, которая имитирует зону повреждения стенки сосуда. Таким элементом измерительной кюветы является пластинка, на поверхности которой должен находится иммобилизованный тромбопластин. В дальнейшем будем называть ее активатором свертывания. Нужно было разработать активатор свертывания, сравнимый по способности активировать свертывание с поверхностью покрытой фибробластами, но более удобный в применении и стабильный при хранении.

Существует два основных метода иммобилизации белков: физический - сорбция, и химический - ковалентная> сшивка. Мы выбрали химический метод иммобилизации, так как при этом достигается более прочное закрепление белка на поверхности. Кроме того, иммобилизованные таким образом- белки, как правило, гораздо более стабильны. Известны многочисленные способы иммобилизации белков на поверхностях различной природы. Один из наиболее распространенных подходов - это химическая модификация поверхности. Например, обработка стеклянной поверхности 3-аминопропилтриэтоксисиланом приводит к связыванию с поверхностью стекла молекул, имеющих в своем составе первичные аминогруппы. В дальнейшем, эти группы ковалентно связываются с белками [15]. Описан способ нитрования поверхности из полистирола нитротетрафторборатом в тетраметиленсульфоне с последующим восстановлением нитрогрупп хлоридом олова (И), также приводящий к образованию на поверхности первичных аминогрупп [16].

Другой подход состоит в формировании на поверхности пленки* из полимера, содержащего в своем составе активные группы, например, аминогруппы. В этом случае уже не столь важно, поверхность из какого материала находится под пленкой, что позволяет иммобилизовать белок практически на любой поверхности. Описан способ подготовки носителя для иммобилизации белков, который включает осаждение полиамина на носителе типа неорганической окиси (пористого стекла, кремнезема) и обработку покрытого полимером носителя бифункциональным реактивом (глутаровым альдегидом), который^ образует поперечные сшивки в полиамине с целью его закрепления на носителе в виде однородной пленки [17]. Недостатком, этого метода является'то, что хорошая^ пленка образуется только- на тонкоизмельченных макропористых поверхностях с сильноразвитой поверхностью. На гладких поверхностях такая пленка не держится и> растрескивается. Это метод был взят нами за основу ^модифицирован так, чтобы получить активатор с иммобилизованным тромбопластином.

Пель работы: Разработка метода иммобилизации тромбопластина. на поверхности активатора свертывания: Сравнение способности активировать* свертывание крови иммобилизованным- тромбопластином и тканевым фактором фибробластов:

Задачи исследования:

1) Разработать метод иммобилизации тромбопластина на пластиковой поверхности активатора свертывания;

2) Исследовать поверхностную плотность и биохимические характеристики иммобилизованного тканевого фактора* (константу связывания с фУНа, условия хранения активатора свертывания);

3) Исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

Научная новизна. Разработан и оптимизирован, метод получения активатора свертывания с иммобилизованным тромбопластином. При этом' плотность и активность, иммобилизованного тканевого фактора близки к соответствующим параметрам монослоя природных фибробластов. Для активации поверхности пластика на первой стадии иммобилизации белка был выбран метод формирования реакционно-способной пленки, на основе полиэтиленимина. Необходимые механические свойства пленки: прочность ее закрепления, эластичность, равномерное покрытие были достигнуты за счет добавления в раствор полиэтиленимина глутарового альдегида и альбумина. Кинетические характеристики иммобилизованного тромбопластина практически соответствуют аналогичным характеристикам нативного тканевого фактора фибробластов. Он стабилен при хранении (инактивируется с характерным временем 100 дней)- и активирует свертывание in vitro аналогично тканевому фактору на фибробластах.

Практическая значимость работы. Разработан метод- иммобилизации тромбопластина, с помощью которого »получена пластиковая поверхность с плотностью иммобилизованного тканевого фактора примерно равной плотности этого белка на наиболее активных в отношении активации свертывания клетках - фибробластах. Полученный активатор свертывания является новым средством, которое может быть эффективно-использовано при исследовании гемостаза: Применение активатора свертывания в приборе по исследованию пространственной' динамики роста фибринового сгустка, в качестве составной части нового клинического метода, имеет важное практическое значение в диагностике и лечении болезней, связанных с нарушением системы свертывания.

Положения, выносимые на защиту:

1) Разработан метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность;

2) Максимальная, плотность иммобилизованного тканевого фактора близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;

Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на фибробластах;

Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах; Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не более 100 дней.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Фадеева, Ольга Александровна

Выводы

1) Разработанный метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность обеспечивает максимальную плотность тканевого фактора равную 98±12,5 пмоль/м2, которая близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;

2) Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на фибробластах. Для иммобилизованного тканевого фактора Ks равна 0,9 нМ, что в 2,6 раза больше, чем для тканевого фактора на фибробластах;

3) Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах;

4) Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не менее 100 дней.

Благодарности

Эта работа была бы невозможна без помощи и поддержки со стороны моих коллег, которым я хотела бы выразить свою глубокую и искреннюю признательность. Я хочу поблагодарить коллектив лаборатории физической биохимии системы крови: Пантелеева Михаила, Баландину Анну, Карамзина Сергея, Шибеко Алексея, Синауридзе Елену Ивановну, Кузнецову Соню; коллектив лаборатории новых методов препаратной трансфузиологии: Гладуна Виталия, Носову Валерию, Трифонову Елену за поддержку и терпение. Для меня большое удовольствие поблагодарить моих научных руководителей, Фазоила Иноятовича Атауллаханова и Илью Валерьевича Смирнова, за их постоянное внимание, помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фадеева, Ольга Александровна, 2010 год

1. Воробьев АИ, Городецкий ВМ, Шулутко ЕМ, Васильев С А. Острая массивная кровопотеря. М: ГЭОТАР-МЕД, 2001.

2. Chakrabarti R, Das SK. Advances in antithrombotic agents. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 2007; 5: 175-185.

3. Hemker HC, Béguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

4. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции. Клиническая онкогематология 2008; 1: 174-181.

5. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67: 312.

6. Monroe DM, Key NS. The tissue factor-factor Vila complex: procoagulant activity, regulation, and multitasking. J Thromb Haemost 2007; 5: 10971105.

7. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57.

8. Ataullakhanov FI, Volkova RI, Guriia GT, Sarbash VI. Spatial aspects of blood coagulation dynamics. III. Growth of clots in vitro. Biofizika 1995; 40: 1320-1328.

9. Ataullakhanov FI, Guria GT, Sarbash VI, Volkova RI. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim BiophysActa 1998; 1425: 453-468.

10. Sinauridze EI, Volkova RI, Krasotkina YV, Sarbash VI, Ataullakhanov FI. Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 607-616.

11. Kondratovich AY, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2002; 1569: 86-104.

12. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

13. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3: 321-331.

14. Messing, R. A. Enzyme stabilization. 3556945. 1971. US Patent

15. Clark, B. Activated and conjugated polystyrene substrate. 6361936. 2002. US Patent

16. Rohrbach, R. P. Support matrices for immobilized enzymes. 4268419. 1981. US Patent

17. Growdon JH. Biomarkers of Alzheimer disease. Arch Neurol 1999; 56: 281283.

18. Sander C. Genomic medicine and the fixture of health care. Science 2000; 287: 1977-1978.

19. Keusgen M. Biosensors: new approaches in drug discovery. Naturwissenschaften 2002; 89: 433-444.

20. Chatelier RC, Gengenbach TR, Vasic ZR, Griesser HJ. Covalent attachment and non-specific binding of reactive probe molecules onto surfaces. J Biomater Sei Polym Ed 1995; 7: 601-622.

21. Cao L. Carrier-bound immobilized enzymes: principles, applications and design . WILEY-VCH Verlsg GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005.

22. Trevan MD. Enzyme Immobilization by Adsorption. New Protein Techniques Book, 1988.

23. Kronenburg NA, de Bont JM, Fischer L. Improvement of enantioselectivity by immobilized imprinting of epoxide hydrolase from Rhodotorula glutinis. J Mol Catal B:Enzymatic 2001; 16: 121-129.

24. Camarero JA. Recent developments in the site-specific immobilization of proteins onto solid supports. Biopolymers 2008; 90: 450-458.

25. Rusmini F, Zhong Z, Feijen J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules 2007; 8: 1775-1789.

26. Cao L. Immobilised enzymes: science or art? Curr Opin Chem Biol 2005; 9: 217-226.

27. Nelson JM, Griffin EG. Adsorption of invertase. J Am Chem Soc 1916; 38: 1109-1115.

28. Ulbrich R, Golbik R, Schellenberger A. Protein adsorption and leakage in carrier-enzyme systems. Biotechnol Bioeng 1991; 37: 280-287.

29. Angenendt P, Glokler J, Sobek J, Lehrach H, Cahill DJ. Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibody microarray applications. J ChromatogrA 2003; 1009: 97-104.

30. Arenkov P, Kukhtin A, Gemmell A, Voloshchuk S, Chupeeva V, Mirzabekov A. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions. Anal Biochem 2000; 278: 123-131.

31. Afanassiev V, Hanemann V, Wolfl S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res 2000; 28: E66.

32. Choi D, Lee W, Park J, Koh W. Preparation of poly(ethylene glycol) hydrogels with different network structures for the application of enzyme immobilization. BiomedMater Eng 2008; 18: 345-356.

33. Ghanema A, Schurig V. Entrapment of Pseudomonas cepacia lipasewith peracetylated b-cyclodextrin in sol-gel: application to the kinetic resolution of secondary alcohols. TetrahedronAsymmetry 2003; 14: 2547-2555.

34. Nguyen DT, Smit M, Dunn B, Zink JI. Stabilization of creatine kinase encapsulated in silicate sol-gel materials and unusual temperature effects on its activity. Chem Mater 2002; 14: 4300-4306.

35. Reetz MT, Tielman P, Wiesenhoefer W, Koenen W, Zonta A. Second generation sol-gel encapsulated lipases: robust heterogeneous biocatalysts. Adv Syn Catal 2003; 345: 717-728.

36. Daryl К, Eggers A, Joan S. Valentine molecular confinement influences protein structure and enhances thermal protein stability. Protein Sci 2001; 10: 250-261.

37. Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabelcov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques 2003; 34: 1008-20, 1022.

38. Demers N, Agostinelli E, Averill-Bates DA, Fortier G. Immobilization of native and poly(ethylene glycol)-treated ('PEGylated') bovine serum amine oxidase into a biocompatible hydrogel. Biotechnol Appl Biochem 2001; 33: 201-207.

39. Kersten B, Possling A, Blaesing F, Mirgorodskaya E, Gobom J, Seitz H. Protein microarray technology and ultraviolet crosslinking combined with mass spectrometry for the analysis of protein-DNA interactions. Anal Biochem 2004; 331: 303-313.

40. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review. Biosens Bioelectron 1999; 14: 443-456.

41. Cosnier S. Biosensors based on immobilization of biomolecules by electrogenerated polymer films. New perspectives. Appl Biochem Biotechnol 2000; 89: 127-138.

42. Cho HM, Cho DY, Jeon JY, Hwang SY, Ahn IS, Choo J, Lee EK. Fabrication of protein-anchoring surface by modification of Sio(2) with liposomal bilayer. Colloids Surf B Biointerfaces 2009.

43. Ueda T, Watanabe A, Ishihara K, Nakabayashi N. Protein adsorption on biomedical polymers with a phosphorylcholine moiety adsorbed with phospholipid. J Biomater Sci Poly m Ed 1991; 3: 185-194.

44. Jans K, Bonroy K, De PR, Reekmans G, Jans H, Laureyn W, Smet M, Borghs G, Maes G. Stability of mixed PEO-thiol SAMs for biosensing applications. Langmuir 2008; 24: 3949-3954.

45. Cass T, gler, FS. Immobilized biomolecules in analysis. A practical approach. Oxford University Press, 1998.

46. Cruise GM, Scharp DS, Hubbell JA. Characterization of permeability and network structure of interfacially photopolymerized' poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Biomaterials 1998; 19: 1287-1294.

47. Arabi H, Hashemi SA, Fooladi M. Microencapsulation of allopurinol by solvent evaporation and controlled release investigation of drugs. J Microencapsul 1996; 13: 527-535.

48. Arshady R. Preparation of nano- and microspheres by polycondensation techniques. J Microencapsul 1989; 6: 1-12.

49. Latha MS, Jayakrishnan A. A new method for the synthesis of smooth, round, hydrophilic protein microspheres using low concentrations of polymeric dispersing agents. J Microencapsul 1995; 12: 7-12.

50. Gao F, Su ZG, Wang P, Ma GH. Double emulsion templated microcapsules with single hollow cavities and thickness-controllable shells. Langmuir 2009; 25: 3832-3838.

51. Samad A, Sultana Y, Aqil M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv 2007; 4: 297-305.

52. Pohar A, Plazl I, Znidarsic-Plazl P. Lipase-catalyzed synthesis of isoamyl acetate in an ionic liquid/n-heptane two-phase system at the microreactor scale. Lab Chip 2009; 9: 3385-3390.

53. Wilchek M, Bayer EA. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications. Anal Biochem 1988; 171: 1-32.

54. Wacker R, Schroder H, Niemeyer CM. Performance of antibody microarrays fabricated by either DNA-directed immobilization, direct spotting, or streptavidin-biotin attachment: a comparative study. Anal Biochem 2004; 330: 281-287.

55. Ramachandran N, Hainsworth E, Bhullar B, Eisenstein S, Rosen B, Lau AY, Walter JG, LaBaer J. Self-assembling protein microarrays. Science 2004; 305: 86-90.

56. Klibanov AM. Enzyme stabilization by immobilization. Anal Biochem 1979; 93: 1-25.

57. Cuatrecasas P: Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and Polyacrylamide beads. J Biol Chem 1970; 245: 3059-3065.

58. Welle A, Gottwald E, Weibezahn KF. Patterned polymer surfaces for cell culture applications. BiomedTech (Berl) 2002; 47 Suppl 1 Pt 1: 401-403.

59. Bethell GS, Ayers JS, Hancock WS, Hearn MT. A novel method' of activation of cross-linked agaroses with l,l'-carbonyldiimidazole which gives a matrix for affinity chromatography devoid of additional charged groups. J Biol Chem 1979; 254: 2572-2574.

60. Potuzak H, Dean PD. Affinity adsorbents consisting of nucleic acids immobilized via bisoxirane activated polysaccharides. Nucleic Acids Res 1978; 5: 297-303.

61. Sobek J, Schlappbach R. Substrate architecture and functionality defining the properties and performance of DNA, peptide, protain and carbohydrate microarrays. PharmagenomicsSubstrate 2004; 32-44.

62. Avseenko NV, Morozova TY, Ataullakhanov FI, Morozov VN. Immunoassay with multicomponent protein microarrays fabricated by electrospray deposition. Anal Chem 2002; 74: 927-933.

63. Ferrua B, Maiolini R, Masseyeff R. Coupling of gamma-globulin to microcrytstalline cellulose by periodate oxidation. J Immunol Methods 1979; 25: 49-53.

64. Hoffman1 DR, Grossberg AL, Pressman D. Specificity fractionation of antibodies from individual animals against the 3-nitro-4-hydroxy-5-iodophenylacetyl (NIP) determinant. Immunochemistry 1971; 8: 769-784.

65. Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N. Activationr of Sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand, for affinity adsorbent. JBiochem 1979; 85: 1091-1098.

66. Mattson G, Conklin E, Desai S, Nielander G, Savage MD, Morgensen S. A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep 1993; 17: 167-183.

67. Wong SS, Wong LJ. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes. Enzyme Microb Technol 1992; 14: 866-874.

68. Migneault I, Dartiguenave C, Bertrand MJ, Waldron KC. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques 2004; 37: 790-802.

69. Delehanty JB, Ligler FS. Method for printing functional protein microarrays. Biotechniques 2003; 34: 380-385.

70. Brinkley M. A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjug Chem 1992; 3: 2-13.

71. Ohtsuka K, Kajiki R, Waki M, Nojima T, Takenaka S. Immobilization of sunflower trypsin inhibitor (SFTI-1) peptide onto a gold surface and analysis of its interaction with trypsin. Analyst 2004; 129: 888-889.

72. Xu C, Cai H, Xu Q, He P, Fang Y. Characterization of single-stranded DNA on chitosan-modified electrode and its application to the sequence-specific DNA detection. Fresenius J Anal Chem 2001; 369: 428-432.

73. Rasooly A, Herold KE. Biosensors for the analysis of food- and waterborne pathogens and their toxins. J AO AC Int 2006; 89: 873-883.

74. Erickson D, Mandal S, Yang AH, Cordovez B. Nanobiosensors: optofluidic, electrical and mechanical approaches to biomolecular detection at the nanoscale. MicrofluidNanofluidics 2008; 4: 33-52.

75. Engvall E. The ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Clin Chem 2009.

76. Ross JS, Schenkein DP, Kashala O, Linette GP, Stec J, Symmans WF, Pusztai L, Hortobagyi GN. Pharmacogenomics. Adv Anat Pathol 2004; 11: 211-220.

77. Mendoza LG, McQuary P, Mongan A, Gangadharan R, Brignac S, Eggers M. High-throughput microarray-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Biotechniques 1999; 27: 778-6, 788.

78. Huang RP. An array of possibilities in cancer research using cytokine antibody arrays. Expert Rev Proteomics 2007; 4: 299-308.

79. Brody EN, Willis MC, Smith JD, Jayasena S, Zichi D, Gold L. The use of aptamers in large arrays for molecular diagnostics. Mol Diagn 1999; 4: 381388.

80. Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. Anticancer Res 2004; 24: 1159-1165.

81. Nakabayashi N, Williams DF. Preparation of non-thrombogenic materials using 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. Biomaterials 2003; 24: 2431-2435.

82. Ishihara K, Oshida H, Endo Y, Watanabe A, Ueda T, Nakabayashi N. Effects of phospholipid adsorption on nonthrombogenicity of polymer with phospholipid polar group. JBiomedMater Res 1993; 27: 1309-1314.

83. Colman RW. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2006.

84. Owen С A. A History of Blood Coagulation. Rochester: Mayo Foundation, 2001.

85. Douglas S. Coagulation history, Oxford 1951-53. Br J Haematol 1999; 107: 22-32.

86. Butenas S, Branda RF, van't Veer C, Cawthern KM, Mann KG. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation. Thromb Haemost 2001; 86: 660-667.

87. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 2008; 1: 50-62.

88. Roy S, Hass PE, Bourell JH, Henzel WJ, Vehar GA. Lysine residues 165 and 166 are essential for the cofactor function of tissue factor. J Biol Chem 1991; 266: 22063-22066.

89. Nemerson Y. Tissue factor and hemostasis. Blood 1988; 71: 1-8.

90. Martin DM, Boys CW, Ruf W. Tissue factor: molecular recognition and cofactor function. FASEBJ1995; 9: 852-859.

91. Rapaport SI. Regulation of the tissue factor pathway. Ann N Y Acad Sei 1991; 614: 51-62.

92. Komiyama Y, Pedersen AH, Kisiel W. Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor Vila: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor. Biochemistry 1990; 29: 9418-9425.

93. Bom VJ, Bertina RM. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochem J1990; 265: 327-336.

94. Lawson JH, Butenas S, Mann KG. The evaluation of complex-dependent alterations in human factor Vila. J Biol Chem 1992; 267: 4834-4843.

95. Ruf W, Rehemtulla A, Morrissey JH, Edgington TS. Phospholipid-independent and -dependent interactions required for tissue factor receptor and cofactor function. J Biol Chem 1991; 266: 16256.

96. Roy S, Paborsky LR, Vehar GA. Self-association of tissue factor as revealed by chemical crosslinking. J Biol Chem 1991; 266: 4665-4668.

97. Bach R, Königsberg WH, Nemerson Y. Human tissue factor contains thioester-linked palmitate and stearate on the cytoplasmic half-cystine. Biochemistry 1988; 27: 4227-4231.

98. Ruf W, Miles DJ, Rehemtulla A, Edgington TS. Tissue factor residues 157167 are required for efficient proteolytic activation of factor X and factor VII. J Biol Chem 1992; 267: 22206-22210.

99. Furie B, Furie BC. The molecular basis of blood coagulation. Cell 1988; 53: 505-518.

100. Mann KG. Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog Hemost Thromb 1984; 7: 1-23.

101. Cutsforth GA, Whitaker RN, Hermans J, Lentz BR. A new model to describe extrinsic protein binding to phospholipid membranes of varying composition: application to human coagulation proteins. Biochemistry 1989; 28: 7453-7461.

102. Nelsestuen GL, Kisiel W, Di Scipio RG. Interaction of vitamin K dependent proteins with membranes. Biochemistry 1978; 17: 2134-2138.

103. Sakai T, Lund-Hansen T, Thim L, Kisiel W. The gamma-carboxyglutamic acid domain of human factor Vila is essential for its interaction with cell surface tissue factor. J Biol Chem 1990; 265: 1890-1894.

104. Wildgoose P, Kazim AL, Kisiel W. The importance of residues 195-206 of human blood clotting factor VII in the interaction of factor VII with tissue factor. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 7290-7294.

105. Toomey JR, Smith KJ, Stafford DW. Localization of the human tissue factor recognition determinant of human factor Vila. J Biol Chem 1991; 266: 19198-19202.

106. Wildgoose P, Jorgensen T,.Komiyama Y, Nakagaki T, Pedersen A, Kisiel W. The role of phospholipids and the factor VII G la-domain in the interaction of factor VII with tissue factor. Thromb Haemost 1992; 67: 679685.

107. Chase T, Jr., Shaw E. Comparison of the esterase activities of trypsin, plasmin, and thrombin on guanidinobenzoate esters. Titration of the enzymes. Biochemistry 1969; 8: 2212-2224.

108. Smith RL. Titration of activated bovine Factor X. J Biol Chem 1973; 248: 2418-2423.

109. Bach R, Gentry R, Nemerson Y. Factor VII binding to tissue, factor in reconstituted' phospholipid vesicles: induction of cooperativity by phosphatidylserine. Biochemistry 1986; 25: 4007-4020.

110. Neuenschwander PF, Branam DE, Morrissey JH. Importance of substrate . composition, pH and other variables on tissue factor enhancement of factor

111. Vila activity. Thromb Haemost 1993; 70: 970-977.

112. Fiore MM; Neuenschwander PF, Morrissey JH. The biochemical basis for the apparent defect of soluble mutant tissue factor in enhancing the proteolytic activities of factor Vila. J Biol Chem 1994; 269: 143-149.

113. Crompton IE, Waley SG. The determination of specificity constants in enzyme-catalysed reactions. Biochem J1986; 239: 221-224.

114. Morrison SA. Kinetics of activation of human prothrombin. Use of a fluorescein-labeled derivative to obtain kinetic constants as a function of factor V concentration and activation state. Biochemistry 1983; 22: 40534061.

115. Carmeliet P, Collen D. Tissue factor. Int J Biochem Cell Biol 1998; 30: 661667.

116. Krishnaswamy S, Field KA, Edgington TS, Morrissey JH, Mann KG. Role of the membrane surface in the activation of human coagulation factor X. J Biol Chem 1992; 267: 26110-26120.

117. Hemker HC, Al DR, De SE, Béguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006; 96: 553-561.

118. Al DR, Peyvandi F, Santagostino E, Giansily M, Mannucci PM, Schved JF, Béguin S, Hemker HC. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to clinical bleeding. Thromb Haemost 2002; 88: 576582.

119. Tengvall, P. and Lundstrom, I. Determination of polymerization/coagulation in a fluid: 6379976. 2002. US Patent

120. Zweig, S. E., Sharma, S., and Meyer, В. G. Test articles for performing dry reagent prothrombin time assays. 5418141. 1995. US Patent

121. Orvim U, Roald HE, Stephens RW, Roos N, Sakariassen KS. Tissue factor-induced coagulation triggers platelet thrombus formation as efficiently as fibrillar collagen at arterial blood flow conditions. Arterioscler Thromb 1994; 14: 1976-1983. •

122. Козинец Г.И., Макаров В.А. Исследование системы крови в клинической практике. 1997. Москва, Триада-Х.

123. Hoffman M, Monroe DM, III. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001; 85: 958-965.

124. Ataullakhanov FI, Pohilko AV, Sinauridze EI, Volkova RI. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thromb Res 1994; 75: 383-394.

125. Hendriks, M., Verhoeven, M., Cahalan, L. L., Cahalan, P. T., and Fouache, B. Method of modifying the surface of a medical device. 5811151. 1998. US Patent

126. Schullek JR, Ruf W, Edgington TS. Key ligand interface residues in tissue factor contribute independently to factor Vila binding. J Biol Chem 1994; 269: 19399-19403.

127. Defilippi, L. J. Process for preparing immobilized enzymes. 4229536. 1980. US Patent

128. Broze GJ, Jr., Leykam JE, Schwartz BD, Miletich JP. Purification of human brain tissue factor. J Biol Chem 1985; 260: 10917-10920.