Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Дашкевич, Наталья Михайловна

• Дашкевич, Наталья Михайловна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Дашкевич, Наталья Михайловна

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА

1.2 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПЛАЗМЕННОМ ЗВЕНЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

1.2.1 Общие сведения о системе свертывания

1.2.2 Активация системы свертывания

1.2.3 Формирование ферментных комплексов

1.2.3 Петли положительной обратной связи

1.2.4 Формирование фибринового сгустка

1.2.5 Ингибиторы свертывания и отрицательные обратные связи

1.3 ТРОМБИН В СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА

1.3.1 Структура тромбина

1.3.2 Функции тромбина в системе плазменного свертывания

1.3.4 Активация тромбоцитов тромбином

1.4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

1.4.2 Пространственно-однородные модели процесса свертывания

1.4.3 Пространственно-распределенные модели процесса свертывания

1.4.4 Пространственно-однородные модели исследования динамики факторов свертывания

1.4.5 Пространственно-распределенные модели исследования динамики факторов свертывания

1.5 АВТОВОЛНОВАЯ ГИПОТЕЗА РАСПРОСТРАНЕНИЯ СВЕРТЫВАНИЯ В ПРОСТРАНСТВЕ

1.5.1 Представление об активных средах

1.5.3 Автоволновая гипотеза распространения процесса свертывания

1.6 ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 МАТЕРИАЛЫ

2.3 ПОДГОТОВКА ПЛАЗМЫ КРОВИ

2.3.1 Получение плазмы крови, свободной от тромбоцитов

2.3.2 Получение плазмы крови, обогащенной тромбоцитами

2.3.3 Работа с замороженной плазмой

2.3.4 Стабилизация pH плазмы

2.3.5 Восполнение плазмы факторами свертывания

2.3.6 Дефибринирование плазмы

2.4 ИММОБИЛИЗАЦИЯ ТРОМБОПЛАСТИНА НА ПОЛИСТИРОЛОВУЮ ПОВЕРХНОСТЬ

2.6 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДНЫХ ВЕЗИКУЛ

2.7 СТАНДАРТНЫЕ ТЕСТЫ: АЧТВ И ИЗМЕРЕНИЕ УРОВНЯ ФАКТОРА VIII

2.8. И ССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ AMC С БЕЖАМИ ПЛАЗМЫ

2.9 ИЗМЕРЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ДИФФУЗИИ AMC

2.10 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СИСТЕМА

2.10.1 Гомогенный тест генерации тромбина

2.10.2 Установка для иследования пространственной динамики генерации тромбина

2.10.2.1 Конструкция кюветы

2.10.2.2 Схема и принцип работы установки

2.10.2.3 Эксперименты в свободной от тромбоцитов плазме

2.10.2.4 Эксперименты в плазме в присутствии тромбоцитов

2.10.2.5 Эксперименты в дефибринированной плазме

2.11. ПРОГРАМНЫЙ КОМПЛЕКС ПОЛУЧЕНИЯ И ОБРАБОТКИ ИЗОБРАЖЕНИЙ

2.11.1 Получение изображений

2.11.2 Обработка экспериментальных кадров

2.11.3 Восстановление распределения активности тромбина

2.11.4 Определение параметров пространственной динамики тромбина

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕТОДИКИ

3.1.1 Измерение коэффициента диффузии AMC

3.1.2 Измерение связывания AMC с белками плазмы

3.1.3 Измерение влияния искажений, вносимых фибриновым сгустком

3.1.4 Сравнение с гомогенным тестом генерации тромбина

3.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА В НОРМАЛЬНОЙ ПЛАЗМЕ

3.3 ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ДИНАМИКИ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА ОТ СИЛЫ АКТВИРУЮЩЕГО СИГНАЛА И ЛИПИДНОГО СОСТАВА ПЛАЗМЫ

3.3.1 Пространственная динамика генерации тромбина при использовании активаторов с низкой плотностью тканевого фактора

3.3.2 Влияние фосфолипидных везикул на пространственную динамику генерации тромбина

3.3.3 Пространственная динамика генерации тромбина в присутствии тромбоцитов

3.4 ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ОБРАТНЫХ СВЯЗЕЙ В РАСПРОСТРАНЕНИИ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА В ПРОСТРАНСТВЕ

3.4.1 Пространственная динамика генерации тромбина в плазме, дефицитной по фактору XI и при добавлении фактора XI

3.4.2 Пространственная динамика генерации тромбина в плазме, дефицитной по фактору VIII и при добавлении фактора VIII

3.5 ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ОБРАТНЫХ СВЯЗЕЙ В РАСПРОСТРАНЕНИИ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА В ПРОСТРАНСТВЕ

3.5.1 Влияние тромбомодулина на пространственную динамику генерации тромбина

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 АВТОВОЛНОВЫЕ СВОЙСТВА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА В ПРОСТРАНСТВЕ

4.2 ВОЗМОЖНЫЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ СМЫСЛ АВТОВОЛНОВОГО РАСПРОСТРАНЕНИЯ ТРОМБИНА

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

АПС - активированный протеин С

AT III - антитромбин III

АЧТВ - Активированное частичное

тромбопластиновое время

AMC - 7-амино-4-метилкумарин

BS А - бычий сывороточный альбумин

ВМК - кининоген с высокой молекулярной массой

ГК-П - гепарин кофактор II

CTI - Corn trypsin inhibitor (ингибитор трипсина из кукурузы)

ME - международная единица активности

ПЗС - прибор с зарядовой связью

ПЭТ - полиэтилентерефталат

ПС - протеин С

nS - протеин S

тПА - тканевой активатор плазминогена

PAR - рецептор, активируемый протеазами

ТФ - тканевой фактор

ТАФИ ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином

ТФПИ - ингибитор пути тканевого фактора

Fn - фибрин

ф11 - фактор II, протромбин

фПа - активный фактор II, тромбин

фУ - фактор V

фУП - фактор VII

фУШ - фактор VIII

ф1Х - фактор IX

ф1Ха - активированный фактор IX

фХ - фактор X

фХа - фактор X

фХ1 - активированный фактор XI

фХ1а - активированный фактор XI

фХП - фактор XII

фХШ - фактор XIII

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование пространственной динамики генерации тромбина в процессе свертывания крови»

ВВЕДЕНИЕ

Система свертывания крови обеспечивает остановку кровотечения при повреждении кровеносного сосуда. Образование гемостатического сгустка происходит в несколько этапов: сужение просвета сосуда, образование тромоцитарного агрегата на месте повреждения и укрепление сгустка, состоящего из клеток крови, полимерной сетью фибрина. Нарушения в работе каждого из этих звеньев могут привести к тромбозу или кровотечению. Активация системы свертывания происходит на поверхности поврежденного сосуда, однако при дальнейшем росте сгустка процесс идет уже без непосредственного контакта с активирующей поверхностью.

Формирование полимерной сети фибрина, удерживающей клетки крови, происходит в результате работы каскада ферментативных реакций - системы плазменного свертывания. Это запутанная система сериновых протеаз, кофакторов и ингибиторов, в которой существует, по крайней мере, шесть положительных и отрицательных обратных связей. На финальном этапе происходит образование и полимеризация мономеров фибрина, полученных из нерастворимого белка фибриногена путем частичного протеолиза тромбином.

Тромбин является ключевым элементом системы свертывания, который выполняет как прямую функцию гемостаза — образование фибриновой сети и активацию тромбоцитов, так и регуляторную - активацию факторов, обеспечивающих положительные и отрицательные обратные связи в системе. Кроме того, тромбин играет важную роль в процессе восстановления тканей.

Нарушения системы свертывания, вызванные дефицитом белков свертывающей системы - факторов VIII, IX и XI - приводят к неконтролируемым кровотечениям. Они связаны с недостаточным образованием фибрина во внутренней области сгустка не контактирующей с

активирующей поврежденной поверхностью кровеносного сосуда. Таким образом, для исследования процессов, происходящих при образовании фибринового сгустка необходимо учитывать пространственную неоднородность процесса.

Важность положительных и отрицательных обратных связей в процессе распространения свертывания в пространстве была подтверждена теоретически и экспериментально. Теоретически было предсказано существование автоволны концентрации тромбина в крови, которая в рамках данного представления является активной средой. Однако до сих пор эта гипотетическая автоволны тромбина не наблюдалась экспериментально. Образование фибрина легко исследовать в эксперименте, так как образование полимерной сети можно наблюдать по светорассеянию. Но до настоящего момента было невозможно восстановить пространственно-временное распределение тромбина внутри растущего сгустка и определить форму возможной автоволны.

Существует метод исследования динамики активации тромбина в гомогенной системе, однако в такой постановке превращение всего доступного фибриногена в фибри и образование сустка происходит при достижении концентрацией тромбина уровня менее 5% от максимального. Таким образом, остается неясным, зачем производится такое количество «лишнего» тромбина. Ответ на этот вопрос может быть найден в рамках рассмотрения процесса роста сгустка в пространственно неоднородной системе.

Методика, позволяющая исследовать пространственную динамику тромбина в процессе формирования сгустка, даст возможность исследовать процессы регуляции системы свертывания на совершенно новом уровне.

Цель работы

Исследовать пространственную динамику генерации тромбина в процессе роста фибринового сгустка в плазме крови

Задачи исследования

1. Создание экспериментальной методики, позволяющей регистрировать пространственно-временное распределение тромбина

2. Исследование характера пространственной динамики тромбина в плазме крови

3. Выявление ключевых факторов, определяющих динамику тромбина в плазме

4. Исследование влияния тромбоцитов на динамику тромбина

Научная новизна

В результате работы создана уникальная экспериментальная методика, позволяющая регистрировать пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента. Было впервые непосредственно показано, что движущей силой роста фибринового сгустка в пространстве является автоволна концентрации активного тромбина, которая может распространяться в крови. Были найдены ключевые факторы, обеспечивающие существование этого феномена и изучена его регуляция.

Научно-практическое значение

Созданная методика может быть использована для исследования пространственно-временного распределения ферментативной активности различных протеаз. Кроме того, разработанный метод может являться чувствительным методом диагностики нарушений плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза. Также он может быть использован для

исследования механизмов действия и эффективности препаратов, применяющихся для терапии врожденных и приобретенных нарушений системы свертывания.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана экспериментальная методика для исследования пространственно-временного распределения активности тромбина в процессе роста фибринового сгустка в плазме крови

2. Экспериментально показано, что распространение активности тромбина в пространстве обладает свойствами автоволны в активной среде

3. Показано, что формирование автоволны определяется составом плазмы, т.е. присутствием белков, обеспечивающих положительные обратные связи в системе и фосфолипидной поверхности, необходимой для протекания реакций каскада плазменного свертывания

4. Показано, что ограничение распространения автоволны в пространстве обеспечиавется работой пути протеина С в присутствии кофактора тромбина - тромбомодулина

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА

Основная функция системы гемостаза - это поддержание целостности кровеносного русла, нарушение которого может привести к гибели организма. Механизм гемостаза включает взаимодействие между стенкой сосуда, тромбоцитами и белками крови[1]. В этой системе очень важно равновесие между образованием плотного сгустка, механически закрывающим повреждение в сосуде, и сохранением функций крови, которые она может выполнять только в жидком состоянии. Нарушения системы гемостаза - как излишнее тромбообразование так и кровоточивость - могут привести к серьезным патологиям.

Самой быстрой реакцией на повреждение является сужение сосуда -вазоконстрикция - и образование агрегата тромбоцитов, закупоривающего место повреждения. Это так называемый первичный гемостаз. Описанные процессы происходят в течение 1-3 мин, за это время происходит остановка кровотечения из мелких сосудов у здорового человека [2]. Для предотвращения вымывания тромбоцитарного сгустка потоком крови он в дальнейшем скрепляется нерастворимым белком фибрином, который, полимеризуясь, образует «сетку», закрепляющую тромбоциты и другие клетки крови [3-5]. Процессы, приводящие к образованию фибринового сгустка, называют вторичным гемостазом [2] или свертыванием крови. Характерное время образования фибриновой сети составляет около 10 минут

ИТаки образом в системе гемостаза выделяется три звена: сосудистое, тромбоцитарное и плазменное. Эти звенья работают не независимо, а активно взаимодействуют на всех уровнях. Активированные тромбоциты

предоставляют липидную поверхность для сборки ферментных комплексов плазменного звена [3,6] и активируют свертывание по так называемому внутреннему пути [7], в свою очередь основной фермент плазменного звена -тромбин - является сильным активатором тромбоцитов [3,6]. Стенки сосуда экспрессируют вещества, влияющие не тромбообразование такие как тромбомодулин, фактор фон Виллебранда, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и многие другие [3,8]. Кроме того, правильная работа плазменного и тромбоцитарного звена необходима для процесса заживления ран [9,10]. Так тромбоциты секретируют медиаторы воспаления, факторы роста и цитокины, тромбин обладает цитокинетической активностью и активностью, схожей с факторами роста [9,11], фибриновая сеть является основой, на которой происходит восстановление ткани, а продукты ее деградации вызывают приток нейтрофилов и макрофагов [9,11].

Данная работа посвящена исследованию плазменного звена гемостаза, поэтому далее его работа будет рассмотрена более подробно.

1.2 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПЛАЗМЕННОМ ЗВЕНЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Система плазменного свертывания является сложным каскадом протеолитических реакций [4,12,13]. Результатом его работы является формирование полимерной сети из фибрина, полученного из растворимого белка фибриногена путем частичного протеолиза тромбином [4,12]. Устройство системы свертывания хорошо изучено с точки зрения биохимии -последние белки были открыты более 20 лет назад [13], однако вопросы регуляции работы этой системы и возможных путей воздействия на нее с целью коррекции нарушений до сих пор не разрешены.

1.2.1 Общие сведения о системе свертывания Общая схема каскада свертывания крови показана на рис.1. Он состоит из нескольких однотипных стадий. На каждой стадии каскада профермент превращается в активный фермент (сериновую протеазу) под действием протеазы, расположенной выше по каскаду (рис.1). Получающийся активный фермент активирует следующий профермент в каскаде в качестве субстрата, активируя его путем частичного протеолиза [4]. Основные белки системы свертывания называются факторами свертывания и обозначаются римскими цифрами в хронологическом порядке их открытия (Таблица 1.1).

Рис.1.1 Упрощенная схема каскада свертывания крови. Воспроизведено из работы [13]. Римскими цифрами обозначены факторы свертывания, буква «а» обозначает активированный фактор, ТИ - тканевый фактор, РС - протеин С, - фибриноген, Рп -фибрин. Односторонними черными стрелками показаны реакции активации факторов свертывания. Фигурными стрелками показано, какими ферментами производится эта активация. Обратимые реакции показаны двусторонними стрелками. Белыми стрелками показаны реакции ингибирования

Таблица 1.1 Основные белки системы плазменного свертывания

Белок Средняя концентрация в плазме (нМ) Функция активированного фактора

Протромбин (фактор II) 1400 протеолиз фибриногена, активация факторов V, VIII, VI, ПС и тромбоцитов

Фактор X 170 активация протромбина и фактора VII

Фактор IX 90 активация фактора X

Фактор XI 30 активация фактора IX

Фактор XIII 90 трансглутаминаза, образование поперечных сшивок в сети фибрина

Фактор VII 10 активация фактороа IX и X

Фактор V 20 кофактор

Фактор VIII 0,7 кофактор

Фибриноген (фактор I) 7600 предшественник фибрина

Тканевый фактор (фактор III) кофактор активации факторов X и IX

Прекаликреин 450 активация фактора XII

Фактор XII 375 активатор фактора XI

Высокомолекулярный кининоген 6000 кофактора активации фактора XII

* Таблица составлена с использованием [3,14,15]

Кроме сериновых протеаз в каскаде свертывания участвуют кофакторы некоторых из этих протеаз, участвующие в формировании ферментных комплексов.

Факторы свертывания в норме циркулируют в плазме в неактивной форме. Однако после активации свертывания, происходит их превращение в активные формы для запуска реакций свертывания. Активные факторы обозначаются добавлением буквы «а» к названию. Фактор I - фибриноген, растворимый белок плазмы, который под действием тромбина (фактора Па) превращается в фибрин, способный образовывать полимерную сеть. Фактор III - тканевый фактор (ТФ) - трансмембранный гликопротеин. Контакт крови с тканевым фактором при повреждении сосуда является с гналом для активации каскада свертывания. Фактор IV системы свертывания не является белком, это ионы кальция Са , которые необходимы сборки ферментных комплексов на поверхности тромбоцитов. Активированный фактор V является кофактором фактора Ха. Комплекс Ха^а, как и фактор Ха является активатором протромбина. Фактор VI не входит перечень факторов свертывания. Активированный фактор VII сам не является активной протеазой, однако в комплексе с тканевым фактором может активировать факторы IX и X. Фактора VIII является кофактором фактора 1Ха. Активированный фактор IX как отдельно, так и в комплексе с фактором VIII активирует фактор X. Активированный фактор XI является активатором фактора IX. Он может быть активирован тромбином или фактором XII. Фактор XII активируется при контакте с отрицательно заряженной чужеродной поверхностью. Фактор ХПа может активировать прекаликреин до каликреина, который, в свою очередь, может активировать фактор XII в комплексе с высокомолекулярным кинином (рис. 1.2) [3].

Кроме того, в процессе свертывания участвуют белки - ингибиторы свертывания (см п 1.2.5)

1.2.2 Активация системы свертывания

Все факторы, присутствуют в крови только в неактивных формах. Исключение составляет фактор VII, следовые количества которого (примерно 1% от общего количества [16] присутствуют в активной форме. Однако без кофактора, которым является тканевый фактор, он не обладает ферментативной активностью и не может запустить каскад свертывания.

Основным физиологическим активатором системы свертывания является тканевый фактор. Он представляет собой мембранный белок, состоящий из N-концевого цитоплазматического домена, трансмембранного домена и С-концевого внешнего домена, связывающегося с фактором Vila [17]. Тканевый фактор присутствует на поверхности почти всех клеток организма, за исключением эндотелия сосудов и клеток крови. Таким образом, тканевый фактор оказывается изолирован от крови, но любое повреждение эндотелия приводит к его взаимодействию с кровью [13]. Путь активации системы свертывания тканевым фактором называется внешним путем активации свертывания.

При повреждении сосуда, кровь приходит в контакт с тканевым фактором (рис. 1.1), который связывается с активированной формой фактора VII на поверхности фибробластов в присутствии ионов кальция Са [18-20]. При связывании с тканевым фактором протеолитическая активность увеличивается в несколько раз в связи с изменением конформации активного сайта фактора Vila [20]. Далее комплекс ТФ-VIIa способен активировать факторы IX и X, запуская каскад свертывания. Это, так называемый, внешний путь активации свертывания. После активации, фактор X начинает активировать тромбин, который, в свою очередь начинает расщеплять фибриноген и активировать факторы V и VIII [4].

Активация по другому, так называемому внутреннему пути, происходит при контакте крови с чужеродной отрицательно заряженной поверхностью,

которая инициирует активацию фактора XII [21]. Этот путь называется внутренним, так как в не мне участвуют белки, не присутствующие в крови.

1п-укго это может быть смоделировано при активацией стеклом. В систему контактного пути так же входят высокомолекулярный кининоген и прекаликреин. Прекаликреин активируется фактором ХНа (рис 1.2). Далее комплекс каликреина с высокомолекулырным кининогеном может посредством обратной связи активировать фактор XII. Большое количество фактора ХПа активирует фактор XI, который далее запускает работу последующих ступеней каскада [23].

Некоторые работы показывают, что активация по контактному пути может происходить и на поверхности активированных тромбоцитов [7,24].

Рис. 1.2. Схема внутреннего пути свертывания. ПК - прекалликреин, К -калликреин, ВМК - кининоген с высокой молекулярной массой. Серые стрелки показывают каталитическое действие ферментов и комплексов. Тонкие черные стрелки -протеолитические реакции активации факторов и кофакторов. Рисунок воспроизведен из работы [22]

Физиологическая роль контактной активации не до конца ясна. Люди с врожденным дефицитом фактора XII не страдают от кровотечений. Дефицит фактора XI, следующего за ним по каскаду, приводит к кровотечениям только

при серьезных травмах [23]. Возможно контактный путь не является физиологически важным для гемостаза, однако возможно, контактный путь играет важную роль при тромбозах [25]. Также контактная система активирует систему фибринолиза и комплемента, обеспечивая взаимодействие различных систем организма [21].

1.2.3 Формирование ферментных комплексов

Для своевременной остановки кровотечения необходимо, чтобы образование фибринового сгустка происходило быстро. Каждая молекула любого фермента каскада активирует множество молекул протеазы, расположенной ниже по каскаду, таким образом достигается эффект усиления исходного сигнала. В системе плазменного свертывания эффект усиления достигается не только усилением активационного сигнала каскадом [26], но и формированием ферментативных комплексов, которые значительно увеличивают скорость реакции.

В системе плазменного свертывания особенно важно формирование ферментных комплексов, состоящих из активных фактора и кофактора, которые работают на 5-7 порядков быстрее, чем отдельные ферменты [27,28]. Все прокоагулянтные комплексы плазменного звена системы состоят из сериновой протеазы и кофактора. Сборка происходит на фосфолипидной поверхности с участием ионов кальция [27,29]. В норме эта поверхность предоставляется активированными тромбоцитами и микровезикулами [3,27,30,31]. Комплексы ТФ-УПа и тромбин-тромбомодулин собираются на поверхности эндотелиальных клеток.

Белки свертывания, участвующие в образовании комплексов могут быть разделены на три категории. 1) Проферменты, которые содержат 9-12 остатков у-карбоксиглутаминовой кислоты на 1чГ-конце так называемых С1а-доменов. Эти остатки образованы в процессе пострансляционной

модификации белка: глутаминовая кислота карбоксилируется при участии витамина К. Поэтому эти протеазы называют витамин К-зависимыми. Они участвуют в связывании с липидной поверхностью при участии ионова Са2+ [27,32]. 2) Факторы V и VIII, являющиеся кофаторами, и сходные по своей структуре. Они состоят из двух полипептидных цепей: легкой и тяжелой, связанных при помощи иона Са . Тяжелая цепь обладает кофакторной активностью, необходимой для формирования комплексов, а легкая цепь служит для связывания с липидной поверхностью [27,33]. 3) Трансмембранные кофакторы - тканевый фактор и тромбомодулин. Они не требуют активации путем частичного протеолиза в отличие от факторов V и VIII. Внеклеточные домены тканевого фактора и тромбомодулина участвуют в образовании ферментных комплексов [34,35].

Активность прокоагулянтных комплексов сильно зависит от состава фосфолипидной мембраны. Для работы внутренней теназы и протромбиназы необходимасмесь нейтральных и отрицательной заряженных фосфолипидов (фосфатидилхолин и фосфатидилсерин). Связывание ткневого фактора с фактором Vila происходит на поверхности, состоящей из нейтральных фосфолипидов, в частности фосфатидилхолина [36]. Аналогично, активация протеина С тромбином не требует отрицательно заряженных фосфолипидов, при том, что реакции инактивации факторов V и VIII происходят на отрицательно заряженной поверхности [37]. Кроме того, комплексы более активны, когда собираются на ненасыщеных фосфолидах. Кроме фосфатидилхолина и фосфатидилсерина в образовании ферментных комплексов принимают участие фосфатидилэтаноламин и сфангомиелин [27].

1.2.3 Петли положительной обратной связи

Как сказано выше, образование ферментных комплексов значительно ускоряет работу каскада свертывания. Это ускорение является результатом

работы положительных обратных связей в системе. Активация факторов V и VIII, происходит путем частичного протеолиза тромбином [3]. Таким образом, небольшое количество тромбина, наработанное фактором X в первые моменты после активации, может дальше активировать факторы V и VIII, которые в свою очередь ускоряют активацию тромбина, включаясь в комплексы внутренней теназы и протромбиназы. Известно, что дефицит фактора VIII - гемофилия А — приводит к тяжелым кровотечениям, так же как и дефицит фактора IX (гемофилия В)[38]. Таким образом, кофакторы системы свертывания не менее важны для ее функционирования, чем сами ферменты.

Другая положительная обратная связь - активация тромбином фактора XI на поверхности тромбоцитов [39]. Эта положительная обратная связь позволяет каскаду свертывания после запуска работать независимо от внешней теназы, так как фактор Х1а является автономной протеазой, работающей без кофактора [39,40].

Врожденный дефицит фактора XI (гемофилия С) - редкое нарушение свертывания. Описание его механизмов до сих пор противоречиво в виду очевидно вторичной роли фактора XI в каскаде свертывания [23,41]. Образование фибрина может происходить при участии только внешнего пути свертывания (рис. 1.1) . Остается неясным, почему человеку нужно небольшое количество фактора 1Ха, производимого активированным тромбином фактором Х1а, если есть избыток фактора 1Ха, произведенного комплексом тканевый фактор-фактор Vila. Одним из возможных объяснений с точки зрения данного исследования является то, что активация фактора XI тромбином необходима для распространения процесса свертывания в пространстве.

Еще одной положительной обратной связью является активация фактором Ха фактора VII, усиливая исходный активационный сигнал [42].

Было показано, что эта обратная связь необходима для поддержания работы каскада свертывания в потоке [43], а так же обеспечивает существование порога по активации системы ТФ [44].

Таким образом, работа положительных обратных связей в системе свертывания обеспечивает автокаталитическое производство тромбина после того, как система была активирована. Через активацию фактора XI тромбином такое самоподдерживающееся производство может осуществляться в любой точке пространства без прямого контакта с активатором .

1.2.4 Формирование фибринового сгустка

Образование фибрина - конечная цель каскада свертывания. Формирование фибриновой сети просиходит внутри первичного тромбоцитарного тромба [45,46] .

На рис. 1.3 показана схема молекулы фибрина и его полимеров. Фибрин представляет собой димер, каждая единица которого состоит из трех полипептидных цепей Аа, В[3 и у [47-49]. В центральной области находятся N-концевые Е-домены мономеров, на концах - С-концевые D-домены. Тромбин отрезает от молекулы фибриногена четыре фрагмента: он сначала отрезает по одному пептиду в Аа цепях, затем по одному пептиду в Вр цепях [50]. Фрагмент молекулы фибриногена, открывающийся после отщепления фибринопептида А, может связываться с активной областью у- цепи, что является достаточным условием для полимеризации. Область, открывающаяся после отрезания фибринопептида В связывается с активной

. 17 пт.

. 17 пт.

а1

Ц|«м I ф

В

Образование поперечных сшивок фактором XIII

Рис.1.3 Схема молекулы фибриногена и его полимера. Рисунок воспроизведен из работы [51]. А. Схема молекулы фибриногена. Показаны а, Р и у цепи. Б - полимеризация молекул фибрина, образующих протофибриллу. В. Трехдоменное взаимодействие между молекулами фибриногена. О- домены связываются с Е-доменом. Связывание укрепляется образованием сшивок между двумя Э-доменама фактором ХШа.

областью на (3-цепи, сшивая нити, сформированные полимеризованным фибрином в латеральном направлении. Фибриновое волокно дополнительно

укрепляется поперечными сшивками, проводимыми фактором ХШа. Сшивка образуется между соседними Э-доменами [52,53].

Реакция полимеризации происходит быстро и необратимо, когда концентрация фибрина достаточна [54]. Кроме того, для превращения всего доступного фибриногена в фибрин достаточно всего 5-10 нМ тромбина [55,56]. Таким образом, регуляция образования фибринового сгустка непрерывно связана с регуляцией образования тромбина.

1.2.5 Ингибиторы свертывания и отрицательные обратные связи

Ингибиторы необходимы для устойчивой работы системы свертывния [57]. В отсутствие ингибиторов, одна молекула тканевого фактора может вызвать свертывание всей крови в организме. Чтобы этого не допустить, в крови постоянно присутствуют ингибиторы свертывания, которые ингибируют следовые количества активных факторов, образующиеся в кровотоке. Однако при превышении некоторого порогового количества ткаевого фактора, каскад свертывания активируется [44].

Основными ингибиторами свертывания являются антитромбин III, гепарин-кофактор II, С1-ингибитор — ингибиторы сериновых протеаз, блокирующие активный центр, ингибитор пути тканевого фактора, а2-макроглобулин, и белки пути протеина С.

Часть ингибиторов не требует активации, и постоянно присутствует в крови в активной форме. Именно они определяют существование порога по активации. Протеин С циркулирует в плазме в неактивной форме, и активируется при работе каскада свертывания.

Антитромбин III ингибирует тромбин и активные факторы IX и X путем связывния и блокирования активных сайтов, гепарин-кофактор II ингибирует тромбин, С1-ингибитор инактивирует фатор Х1а, ХПа и каликреин. а2-Макроглобулин ингибирует все сериновые протеазы, не связываясь с

активным центром [1]. Ингибитор пути тканевого фактора (ТФПИ) связывается с фактором Ха, ингибируя его. Комплекс ТФПИ-Ха ингибирует фактор Vila, но только когда он связян с тканевым фактором. Свободный фактор Vila не подвергается ингибированию [8,58].

Таким образом, ингибирование активации по внешнему пути представляет собой отрицательную обратную связь: активированный фактор X ингибирует свое производство, связываясь с ТФПИ, а затем с комплексом ТФ-VIIa.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дашкевич, Наталья Михайловна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Карвальхо K.A.K.: Гемостаз и тромбоз. In Шиффман Ф.Д. (ed): "Патофизиология крови." Binom Publisher, 2000.

2. Шмидт Р, Тэвс Г: "Физиология человека. Том 2." Москва: Мир,

2010.

3. Colman RW HJMVSE: "Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice." Philadelphia: Lippincott Company, 2010.

4. Schenone M, Furie ВС, Furie В: The blood coagulation cascade. Curr Opin Hematol 2004; 11:272-277.

5. Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, et al.: Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med 2002; 8:1175-1181.

6. Michelson AD.: "Platelets." Elsevier, 2013.

7. Johne J, Blume С, Benz PM, et al.: Platelets promote coagulation factor XII-mediated proteolytic cascade systems in plasma. Biol Chem 2006; 387:173-178.

8. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP: Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost 2001; 86:959-972.

9. Broughton G, Janis JE, Attinger СЕ: The basic science of wound healing. Plast Reconstr Surg 2006; 117:12S-34S.

10. Hoffman M, Harger A, Lenkowski A, et al.: Cutaneous wound healing is impaired in hemophilia B. Blood 2006; 108:3053-3060.

11. Monroe DM, Hoffman M: The clotting system - a major player in wound healing. Haemophilia 2012; 18 Suppl 5:11-16.

12. Butenas S, Mann KG: Blood coagulation. Biochemistry (Mosc ) 2002; 67:3-12.

13. Пантелеев M.A., Атауллаханов Ф.И.: Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 2008; 1:50-62.

14. Mann KG: Biochemistry and physiology of blood coagulation. Thromb Haemost 1999; 82:165-174.

15. Бутенас С, Манн К.Г.: Свертывание крови. Обзор. Биохимия 2002; 67:5г15.

16. Higashi S, Matsumoto N, Iwanaga S: Molecular mechanism of tissue factor-mediated acceleration of factor Vila activity. J Biol Chem 1996; 271:2656926574.

17. Vadivel K, Bajaj SP: Structural biology of factor Vila/tissue factor initiated coagulation. Front Biosci (Landmark Ed) 2012; 17:2476-2494.

18. Butenas S, Lawson JH, Kalafatis M, Mann KG: Cooperative interaction of divalent metal ions, substrate, and tissue factor with factor Vila. Biochemistry 1994; 33:3449-3456.

19. Higashi S, Matsumoto N, Iwanaga S: Molecular mechanism of tissue factor-mediated acceleration of factor Vila activity. J Biol Chem 1996; 271:2656926574.

20. Sabharwal AK, Birktoffc JJ, Gorka J, et al.: High affinity Ca(2+)-binding site in the serine protease domain of human factor Vila and its role in

tissue factor binding and development of catalytic activity. J Biol Chem 1995; 270:15523-15530.

21. Colman RW, Schmaier AH: Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90:3819-3843.

22. Ованесов M.B. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка. 2002. Ref Type: Thesis/Dissertation

23. Smith SB, Gailani D: Update on the physiology and pathology of factor IX activation by factor XIa. Expert Rev Hematol 2008; 1:87-98.

24. Walsh PN, Griffin JH: Contributions of human platelets to the proteolytic activation of blood coagulation factors XII and XI. Blood 1981; 57:106118.

25. Gailani D, Renne T: Intrinsic pathway of coagulation and arterial thrombosis. Arterioscler Thromb Vase Biol 2007; 27:2507-2513.

26. Атауллаханов Ф.И.: Каскады ферментативных реакций и их роль в биологии. Соросовский образовательный журнал 2000; 6:2-10.

27. Zwaal RF, Comfurius Р, Bevers ЕМ: Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim Biophys Acta 1998; 1376:433-453.

28. Mann KG, Nesheim ME, Church WR, et al.: Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 1990; 76:1-16.

29. Mann KG: Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog Hemost Thromb 1984; 7:1-23.

30. Hoffman M, Monroe DM, III: A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001; 85:958-965.

31. Sinauridze EI, Kireev DA, Popenko NY, et al.: Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007; 97:425-434.

32. Kalafatis M, Swords NA, Rand MD, Mann KG: Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochim Biophys Acta 1994; 1227:113-129.

33. Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W: The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 1991; 30:10363-10370.

34. Higashi S, Matsumoto N, Iwanaga S: Molecular mechanism of tissue factor-mediated acceleration of factor Vila activity. J Biol Chem 1996; 271:2656926574.

35. Adams TE, Huntington JA: Thrombin-cofactor interactions: structural insights into regulatory mechanisms. Arterioscler Thromb Vase Biol 2006; 26:1738-1745.

. 36. Bach R, Gentry R, Nemerson Y: Factor VII binding to tissue factor in reconstituted phospholipid vesicles: induction of cooperativity by phosphatidylserine. Biochemistry 1986; 25:4007-4020.

37. Horie S, Ishii H, Hara H, Kazama M: Enhancement of thrombin-thrombomodulin-catalysed protein C activation by phosphatidylethanolamine containing unsaturated fatty acids: possible physiological significance of

phosphatidylethanolamine in anticoagulant activity of thrombomodulin. Biochem J 1994; 301 ( Pt 3):683-691.

38. Bowen DJ: Haemophilia A and haemophilia B: molecular insights. Mol Pathol 2002; 55:127-144.

39. Gailani D, Broze GJ, Jr.: Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253:909-912.

40. Smith SB, Gailani D: Update on the physiology and pathology of factor IX activation by factor XIa. Expert Rev Hematol 2008; 1:87-98.

41. Cawthern KM, van V, Lock JB, et al.: Blood coagulation in hemophilia A and hemophilia C. Blood 1998; 91:4581-4592.

42. Rao LV, Rapaport SI: Activation of factor VII bound to tissue factor: a key early step in the tissue factor pathway of blood coagulation. Proc Natl Acad Sci US A 1988; 85:6687-6691.

43. Shibeko AM, Lobanova ES, Panteleev MA, Ataullakhanov FI: Blood flow controls coagulation onset via the positive feedback of factor VII activation by factor Xa. BMC Syst Biol 2010; 4:5.

44. Balandina AN, Shibeko AM, Kireev DA, et al.: Positive feedback loops for factor V and factor VII activation supply sensitivity to local surface tissue factor density during blood coagulation. Biophys J 2011; 101:1816-1824.

45. Hovig T, Dodds WJ, Rowsell HC, Mustard JF: The transformation of hemostatic platelet plugs in normal and Factor IX deficient dogs. Am J Pathol 1968; 53:355-373.

46. Wester J, Sixma JJ, Geuze JJ, Heijnen HF: Morphology of the hemostatic plug in human skin wounds: transformation of the plug. Lab Invest 1979;41:182-192.

47. Blomback B: Fibrinogen and fibrin—proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res 1996; 83:1-75.

48. Falvo MR, Gorkun OV, Lord ST: The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophys Chem 2010; 152:15-20.

49. Weisel JW: Fibrinogen and fibrin. Adv Protein Chem 2005; 70:247299.

50. Weisel JW: The electron microscope band pattern of human fibrin: various stains, lateral order, and carbohydrate localization. J Ultrastruct Mol Struct Res 1986; 96:176-188.

51. Lim BB, Lee EH, Sotomayor M, Schulten K: Molecular basis of fibrin clot elasticity. Structure 2008; 16:449-459.

52. Levy JH, Greenberg C: Biology of Factor XIII and clinical manifestations of Factor XIII deficiency. Transfusion 2013; 53:1120-1131.

53. Philippou H, Ranee J, Myles T, et al.: Roles of low specificity and cofactor interaction sites on thrombin during factor XIII activation. Competition for cofactor sites on thrombin determines its fate. J Biol Chem 2003; 278:3202032026.

54. Marx G, Blankenfeld A: Kinetic and mechanical parameters of pure and cryoprecipitate fibrin. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4:73-78.

55. Brummel ICE, Paradis SG, Butenas S, Mann KG: Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 2002; 100:148-152.

56. Mann KG, Brummel K, Butenas S: What is all that thrombin for? J Thromb Haemost 2003; 1:1504-1514.

57. Семенов B.B. ХМА: Нелинейные эффекты в кинетике свертывания крови. Биофизика 1990; 35:139-141.

58. Broze GJ, Jr., Girard TJ: Tissue factor pathway inhibitor: structure-function. Front Biosci (Landmark Ed) 2012; 17:262-280.

59. Dahlback B, Villoutreix BO: Regulation of blood coagulation by the protein С anticoagulant pathway: novel insights into structure-function relationships and molecular recognition. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005; 25:1311-1320.

60. Panteleev MA, Ovanesov MV, Kireev DA, et al.: Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein С pathways, respectively. Biophys J 2006; 90:1489-1500.

61. Esmon CT: Regulation of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2000; 1477:349-360.

62. Esmon CT: The protein С pathway. Chest 2003; 124:26S-32S.

63. Esmon CT: Structure and functions of the endothelial cell protein С receptor. Crit Care Med 2004; 32:S298-S301.

64. Nicolaes GA, Dahlback B: Factor V and thrombotic disease: description of a janus-faced protein. Arterioscler Thromb Vase Biol 2002; 22:530538.

65. Bode W: The structure of thrombin: a janus-headed proteinase. Semin Thromb Hemost 2006; 32 Suppl 1:16-31.

66. Crawley JT, Zanardelli S, Chion CK, Lane DA: The central role of thrombin in hemostasis. J Thromb Haemost 2007; 5 Suppl 1:95-101.

67. Huntington JA: Molecular recognition mechanisms of thrombin. J Thromb Haemost 2005; 3:1861-1872.

68. Di CE, Dang QD, Ayala YM: Molecular mechanisms of thrombin function. Cell Mol Life Sci 1997; 53:701-730.

69. Krishnaswamy S: Exosite-driven substrate specificity and function in coagulation. J Thromb Haemost 2005; 3:54-67.

70. Page MJ, Macgillivray RT, Di CE: Determinants of specificity in coagulation proteases. J Thromb Haemost 2005; 3:2401-2408.

71. Dang OD, Vindigni A, Di CE: An allosteric switch controls the procoagulant and anticoagulant activities of thrombin. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92:5977-5981.

72. von dem Borne PA, Meijers JC, Bouma BN: Feedback activation of factor XI by thrombin in plasma results in additional formation of thrombin that protects fibrin clots from fibrinolysis. Blood 1995; 86:3035-3042.

73. Bajzar L, Manuel R, Nesheim ME: Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem 1995; 270:1447714484.

74. Coughlin SR: Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology. J Thromb Haemost 2005; 3:1800-1814.

75. Davey MG, Luscher EF: Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature 1967; 216:857-858.

76. Topalov NN, Yakimenko AO, Canault M, et al.: Two types of procoagulant platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin alpha(IIb)beta(3). Arterioscler Thromb Vase Biol 2012; 32:2475-2483.

77. Dale GL: Coated-platelets: an emerging component of the procoagulant response. J Thromb Haemost 2005; 3:2185-2192.

78. Пантелеев M.A., Атауллаханов Ф.И.: Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции (часть 2). Клиническая онкогематолония 2008; 1:174-181.

79. Bolliger D, Seeberger MD, Tanaka KA: Principles and practice of thromboelastography in clinical coagulation management and transfusion practice. Transfus Med Rev 2012; 26:1-13.

80. Braun PJ, Givens ТВ, Stead AG, et al.: Properties of optical data from activated partial thromboplastin time and prothrombin time assays. Thromb Haemost 1997; 78:1079-1087.

81. Luddington RJ: Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol 2005; 27:81-90.

82. Nielsen VG, Lyerly RT, III, Gurley WQ: The effect of dilution on plasma coagulation kinetics determined by thrombelastography is dependent on antithrombin activity and mode of activation. Anesth Analg 2004; 99:1587-92, table.

83. Nielsen VG, Lyerly RT, III, Gurley WQ: The effect of dilution on plasma coagulation kinetics determined by thrombelastography is dependent on

antithrombin activity and mode of activation. Anesth Analg 2004; 99:1587-92, table.

84. Toh CH, Giles AR: Waveform analysis of clotting test optical profiles in the diagnosis and management of disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin Lab Haematol 2002; 24:321-327.

85. Toh CH: Transmittance waveform of routine coagulation tests is a sensitive and specific method for diagnosing non-overt disseminated intravascular coagulation. Blood Rev 2002; 16 Suppl 1:S11-S14.

86. Shima M, Thachil J, Nair SC, Srivastava A: Towards standardization of clot waveform analysis and recommendations for its clinical applications. J Thromb Haemost 2013; 11:1417-1420.

87. Smith SA: The cell-based model of coagulation. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio ) 2009; 19:3-10.

88. Roberts HR, Hoffman M, Monroe DM: A cell-based model of thrombin generation. Semin Thromb Hemost 2006; 32 Suppl 1:32-38.

89. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, et al.: Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572:45-57.

90. Shen F, Kastrup CJ, Liu Y, Ismagilov RF: Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28:2035-2041.

91. Campbell RA, Overmyer KA, Bagnell CR, Wolberg AS: Cellular procoagulant activity dictates clot structure and stability as a function of distance from the cell surface. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28:2247-2254.

92. Monroe DM, Hoffman M, Roberts HR: Transmission of a procoagulant signal from tissue factor-bearing cell to platelets. Blood Coagul Fibrinolysis 1996; 7:459-464.

93. Hoffman M, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR: Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood 1995; 86:1794-1801.

94. Ataullakhanov FI, Volkova RI, Guriia GT, Sarbash VI: [Spatial aspects of blood coagulation dynamics. III. Growth of clots in vitro]. Biofizika 1995;40:1320-1328.

95. Ataullakhanov FI, Guria GT, Sarbash VI, Volkova RI: Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim Biophys Acta 1998; 1425:453-468.

96. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, et al.: Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3:321331.

97. Sinauridze EI, Volkova RI, Krasotkina YV, et al.: Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim Biophys Acta 1998; 1425:607-616.

98. Fadeeva OA, Panteleev MA, Karamzin SS, et al.: Thromboplastin immobilized on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts. Biochemistry (Mosc ) 2010; 75:734-743.

99. Faxalv L, Tengvall P, Lindahl TL: Imaging of blood plasma coagulation and its propagation at surfaces. J Biomed Mater Res A 2008; 85:11291134.

100. Soshitova NP, Karamzin SS, Balandina AN, et al.: Predicting prothrombotic tendencies in sepsis using spatial clot growth dynamics. Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23:498-507.

101. Ramjee MK: The use of fluorogenic substrates to monitor thrombin generation for the analysis of plasma and whole blood coagulation. Anal Biochem 2000; 277:11-18.

102. Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, et al.: The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32:249-253.

103. Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, et al.: The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb Haemost 2000; 83:589-591.

104. Hemker HC, Al DR, De SE, Beguin S: Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006; 96:553-561.

105. Ninivaggi M, pitz-Castro R, Dargaud Y, et al.: Whole-blood thrombin generation monitored with a calibrated automated thrombogram-based assay. Clin Chem 2012; 58:1252-1259.

106. Mann KG, Butenas S, Brummel K: The dynamics of thrombin formation. Arterioscler Thromb Vase Biol 2003; 23:17-25.

107. Kondratovich AY, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI: Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2002; 1569:86-104.

108. Kastrup CJ, Runyon MK, Lucchetta EM, et al.: Using chemistry and microfluidics to understand the spatial dynamics of complex biological networks. Acc Chem Res 2008; 41:549-558.

109. Жаботинский A.M.: "Концентрационные автоколебания." Москва: Наука, 1974.

110. Филд Р, Бургер М.: "Колебания и бегущие волны в химических системах." Москва: Мир, 1988.

111. Васильев В.А., Романовский Ю.М., Яхно В.Г.: "Автоволновые процессы." Москва: Наука, 1987.

112. Rinzel J, Keller JB: Traveling wave solutions of a nerve conduction equation. Biophys J 1973; 13:1313-1337.

113. Loose M, Fischer-Friedrich E, Ries J, et al.: Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science 2008; 320:789-792.

114. Gray R.A, Jalife J.: Spiral waves and the heart. International Journal of Bifurcation and Chaos 1996;415-435.

115. Ataullakhanov FI, Guriia GT: [Spatial aspects of the dynamics of blood coagulation. I. Hypothesis]. Biofizika 1994; 39:89-96.

116. Атауллаханов Ф.И., Зарницына В.И., Кондратович А.Ю., et al.: Особый клас автоволн - автоволны с остановкой - определяют

пространственную динамику свертывания крови. Успехи физических наук 2002; 172:671-690.

117. Reganon Е, Vila V, Aznar J: Gelation of fibrinogen in plasma. A kinetic study by turbidity measurement. Haemostasis 1984; 14:170-178.

118. Okorie UM, Denney WS, Chatterjee MS, et al.: Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood 2008; 111:3507-3513.

119. Ataullakhanov FI, Zarnitsina VI, Pokhilko A.V., et al.: Spatiotemporal dynamics of blood coagulation and pattern formation. A theoretical approach. International Journal of Bifurcation and Chaos 2002; 12:1985-2002.

120. Ataullakhanov FI, Guriia GT, Safroshkina Al: [Spatial aspects of the dynamics of blood coagulation. II. Phenomenological model]. Biofizika 1994; 39:97-106.

121. Zarnitsina VI, Ataullakhanov FI: Dynamics of spatially nonuniform patterning in the model of blood coagulation. Chaos 2001; 11:57-70.

122. Lobanova E.S., Ataullakhanov FI: Unstable trigger waves induce various intricate dynamic regimes in a reaction-diffusion system of blood clotting. PhysRev Letters 2003; 91:138301-1-138301-4.

123. Panteleev MA, Balandina AN, Lipets EN, et al.: Task-oriented modular decomposition of biological networks: trigger mechanism in blood coagulation. Biophys J 2010; 98:1751-1761.

124. Hope MJ, Bally MB, Webb G, Cullis PR: Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure: characterization of size

distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochim Biophys Acta 1985; 812:55-65.

125. Карамзин С.С. Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2010. Ref Type: Thesis/Dissertation

126. Diamond SL: Engineering design of optimal strategies for blood clot dissolution. Annu Rev Biomed Eng 1999; 1:427-462.

127. Kotova YN, Ataullakhanov FI, Panteleev MA: Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5'diphosphate acting via the P2Y12 receptor. J Thromb Haemost 2008; 6:1603-1605.

128. Franchini M, Frattini F, Crestani S, Bonfanti C: Haemophilia B: current pharmacotherapy and future directions. Expert Opin Pharmacother 2012; 13:2053-2063.

129. Keularts IM, Zivelin A, Seligsohn U, et al.: The role of factor XI in thrombin generation induced by low concentrations of tissue factor. Thromb Haemost 2001; 85:1060-1065.

130. Wielders SJ, Beguin S, Hemker HC, Lindhout T: Factor Xl-dependent reciprocal thrombin generation consolidates blood coagulation when tissue factor is not available. Arterioscler Thromb Vase Biol 2004; 24:1138-1142.

131. Rugeri L, Quelin F, Chatard B, et al.: Thrombin generation in patients with factor XI deficiency and clinical bleeding risk. Haemophilia 2010; 16:771777.

132. Wolberg AS: Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Rev 2007;21:131-142.