Особенности пространственной динамики тромбообразования в кровотоке тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат биологических наук Авилов, Олег Эрнестович

• Авилов, Олег Эрнестович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Авилов, Олег Эрнестович

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ СПЕЦИАЛЬНЫХ ТЕРМИНОВ,

УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СИМВОЛОВ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о коагуляционном звене гемостаза

1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний пути активации

1.1.2. Петли положительной обратной связи. Образование сгустка

1.1.3. Фибринолиз

1.2. Гемофилии А, В, С

1.2.1. Гемофилия - природа заболевания, его виды и типы

1.2.2. Возможные механизмы нарушения свертывания при гемофилиях

1.3. Анализ существующих направлений работ. Экспериментальные модели

1.4. Постановка задачи

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

2.1.1. Материалы

2.1.2. Доноры крови

2.1.3. Получение плазмы крови

2.1.4. Стабилизация молочной кислотой. Процесс дегазации

2.1.5. Рекальцификация плазмы

2.1.6. Культура фибробластов

2.1.7. Схема исследования

2.2. Экспериментальная система

2.2.1. Конструкция проточной камеры

2.2.2. Экспериментальная установка

2.2.3. Проблема контактной активации

2.2.4. Рекальцифицикация в потоке

2.2.5. Проблема дегазации

2.2.6. Крепление активатора

2.2.7. Программный комплекс обработки экспериментальных данных

2.3.1. Влияние потока на форму тромба

2.3.1.1. Особенности формы тромба

2.3.1.2. Эффект роста тромба против потока

2.3 Л .3. Эффект формирования сгустка без покрытия активатора

2.3.2. Влияние потока на процесс формирования тромба

2.3.2.1. Динамика формирования тромба в потоке плазмы крови

2.3.2.2. Зависимость времени задержки от скорости потока плазмы крови

2.3.2.3. Зависимость скорости роста сгустка от скорости потока плазмы крови

2.3.2.4. Зависимость угла переднего фронта фибринового сгустка от скорости потока плазмы крови

2.3.2.5. Зависимость толщины сгустка от скорости потока плазмы крови

2.3.2.6. Особенности кинетики светорассеяния

2.3.2.7. Особенности формирования сгустка плазмы доноров страдающих гемофилией А

2.3.2.8. Зависимость времени задержки от линейного размера активатора

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7. ПРИЛОЖЕНИЯ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ СПЕЦИАЛЬНЫХ ТЕРМИНОВ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СИМВОЛОВ

АПС - активированный протеин С

АТIII - антитромбин III

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ВМК - кининоген с высокой молекулярной массой

ГК-П - гепарин кофактор II

КТИ - ингибитор трипсина из зерен кукурузы

(ингибитор фактора ХПа) МЕ - международная единица активности

ПАШ - ингибитор активатора плазмииогена 1 ПАШ - ингибитор активатора плазминогена

ПВДФ

ПЗС

ПЭТ

ПС

Ш

СБТИ ТАФИ

ТВ

тПА

ТФ

ТФПИ ФС фП фПа

фУ

дифтор поливинилиден прибор с зарядовой связью полиэтилентерефталат протеин С протеин Б

ингибитор трипсина из соевых бобов активируемый тромбином ингибитор фибринолиза

тромбиновое время

тканевой активатор плазминогена

тканевой фактор

ингибитор пути тканевого фактора фосфатидилсерин фактор II, протромбин активный фактор II, тромбин фактор V

фУП - фактор VII

фУШ - фактор VIII

фУ1П:С - коагуляционная активность фактора VIII

ф1Х - фактор IX

ф1Х:С - коагуляционная активность фактора IX

фХ - фактор X

фХ1 - фактор XI

фХП - фактор XII

фХШ - фактор XIII

AMC - 4-метил-7-аминокумарин

С1-И - С1-ингибитор

rVIIa - рекомбинантный фактор Vila

52 - В ОС-Ala-Pro-Arg-AMC (í-jV-бутоксикарбонил-

аланил-пролил-аргинил-7-амино-4-метилкумарин)

53 - BOC-Ile-Gly-Arg-AMC а2-М - а2-макроглобулин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности пространственной динамики тромбообразования в кровотоке»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Повреждение кровеносных сосудов приводит к контакту субэндотелиальных структур (коллагеновые волокна, фибробласты, гладкомышечные клетки) с кровью. При этом происходит формирование сгустка, закрывающего место повреждения с целью предотвращения потери крови.

Образование тромба является сложным пространственно-временным процессом, который происходит в условиях потока крови и начинается на поверхности поврежденного сосуда, углубляясь далее в сосудистое пространство. Нарушения свертывания - неконтролируемые кровоточивость или тромбообразование - сопровождают большинство патологических процессов с летальным исходом. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире на сегодняшний день живет до 600 тыс. человек, страдающих гемофилией разных форм и степени тяжести [105]. Поэтому научно обоснованный подход понимания пространственных процессов свертывания крови, способствующий патогенетически эффективному лечению гемофилии, является актуальной проблемой современной биологии и медицины.

В последние годы как зарубежные, так и отечественные исследователи обращают особое внимание изучению биохимических реакций, ответственных за начало образования тромба, увеличение его размеров, а также физических процессов (диффузия, ток крови и др.), которые влияют на динамику формирования тромба. Одновременно актуальной остается проблема, связанная с диагностикой патологии системы свертывания крови. В настоящее время уже существуют экспериментальные модели, позволяющие регистрировать образование тромба как in vivo посредством регистрации изображений в живых организмах [39, 30, 12, 40], так и in vitro путем моделирования роста кровяного сгустка в искусственной среде [99, 18, 62].

Среди методов исследования можно выделить три направления: исследование системы свертывания в гомогенной среде (с перемешиванием), в

системах без перемешивания и в системах с наличием потока. Несмотря на то, что последний подход является самым приближённым к условиям in vivo (так как в живом организме практически всегда присутствует ток крови), его изучению уделяется крайне мало внимания.

Анализ литературных источников показывает, что подавляющее большинство опубликованных учеными работ посвящено исследованию роста тромбоцитарного сгустка и эффектов системы свертывания крови, связанных с агрегацией тромбоцитов. Однако с учетом того факта, что в организме основным инициатором гемостаза в настоящее время признан исключительно внешний путь свертывания. Поэтому моделирование роста фибринового сгустка обязательно должно включать данный способ активации, а именно посредством использования тканевого фактора. Кроме того, тромбоцитарное звено сильно искажает результаты, которые можно получить на начальной стадии инициирования механизмов свертывания крови. В работах проф. Атауллаханова Ф.И. и Гурия Г.Т. [10, 7, 8] была выдвинута гипотеза, согласно которой пространственное (но не гомогенное) формирование сгустка происходит автоволновым образом. Следовательно, рост фибринового сгустка является пространственно-неоднородным процессом. Отсюда разумным упрощением постановки экспериментов будет исследование образования сгустка в потоке рекальцифицированной плазмы свободной от тромбоцитов. Следовательно, и наблюдаться должен тромб в системе, позволяющей запечатлевать его формирование в пространстве [6, 9, 87, 13, 37].

В гомогенной системе с полным перемешиванием получить ограниченные тромбы нельзя, т.к. в этом случае активатор не локализован, а распределен во всем объеме, поэтому происходит образование множественных сгустков, и свертывание охватывает изучаемый образец плазмы целиком. В настоящее время практически отсутствуют постановки экспериментов, позволяющие измерять рост фибринового сгустка в потоке плазмы in vitro. Поэтому в качестве объекта изучения роли пространства в динамике формирования сгустка была выбрана модель коагуляции, которая с одной стороны упрощена

(сгусток растет в потоке рекальцифицированной свободной от тромбоцитов плазмы крови человека, приведенной в контакт с поверхностью активатора (монослой фибробластов)), но с другой стороны именно в такой постановке пространственный аспект свертывания проявляется наиболее сильно.

В этой связи целыо нашей работы является экспериментальное изучение пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.

Исходя из поставленной цели исследований, для решения были выдвинуты следующие задачи:

1. Определить пространственную динамику тромбообразования в кровотоке разных доноров.

2. Изучить зависимость характера формирования фибринового сгустка от биофизических показателей крови (насыщенность или ненасыщенность тромбоцитами, замороженная или незамороженная плазма и скорость ее движения).

3. Исследовать влияние потока плазмы крови на физические характеристики тромба (скорость роста и угол переднего фронта, конфигурация и толщина, кинетика светорассеивания).

4. Разработать экспериментальную систему для моделирования формирования тромба in vitro и метод диагностики нарушений гемостаза in vivo.

Научная иовизна. Впервые выявлены особенности пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.

Установлена зависимость скорости роста, угла переднего фронта, формы, толщины и кинетики светорассеивания, определяющих физические характеристики тромба, от кровотока.

Показана корреляция биофизических параметров крови с особенностями тромбообразования в ее плазме.

Впервые использован метод темного поля для регистрации формирования тромба в потоке плазмы и определен биологический эффект использования препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания крови при гемофилии.

Экспериментально доказано положительное влияние замораживания плазмы страдающих гемофилией доноров на рост фибринового сгустка и его физические характеристики, а также зависимость от обработки синтетическим красителем.

Разработана экспериментальная система, позволяющая моделировать тромбообразование и предложен метод диагностики нарушений системы свертывания крови.

Новизна полученных научных положений, выводов и рекомендаций поддержана проектом ОАО «РОСНАНО» (Госрегистрация в реестре проектов № 687).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты диссертационных исследований имеют фундаментальный характер и дополняют современную теорию о механизмах пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови.

Разработан биофизический прибор для диагностики патологий системы свертывания крови доноров.

Реализация результатов исследований. Научные положения, разработки и практические рекомендации используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», Чебоксарского политехнического института (филиал) ФГБОУ ВПО «Московский государственный открытый университет им. В. С. Черномырдина» и могут быть использованы при написании учебных пособий по физиологии, биохимии и гематологии для студентов вузов медико-биологических специальностей.

Апробация работы. Основные научные положения, выводы и практические рекомендации диссертационной работы доложены на

Международных («Modeling of Blood Deceases» в University Claude Bernard Lyon 1 (France, Lyon, 2007); XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Switzerland, Geneve, 2007), «Математическая биология и биоинформатика» (Россия, Пущино, 2006), «Биология - наука 21 века» (Россия, Пущино, 2007)) конференциях, а также расширенном заседании НИЛ биотехнологии и экспериментальной биологии ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева» (Чебоксары, 2011).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Физиологические механизмы образования тромба в потоке плазмы у нормальных и страдающих гемофилией доноров определяются биофизическими параметрами крови.

2. Существуют корреляционные отношения между кровотоком и скоростью роста, углом переднего фронта, конфигурацией, толщиной, кинетикой светорассеивания фибринового сгустка.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях согласно перечню ВАК России.

Структура и объём диссертации. Работа включает следующие разделы: введение (5 е.), обзор литературы (35 е.), собственные исследования (43 е.), обсуждение результатов исследований (4 е.), выводы (1 е.), практические рекомендации (1 е.), список литературы (11 с.) и приложения (13 е.).

Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного исполнения, содержит 2 таблицы и 36 рисунков. Список литературы включает 107 источников, в том числе 96 зарубежных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представление о коагуляционном звене гемостаза

1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний

пути активации

Контактная активация Чужеродная поверхность

XII .

•-¡-¡Хна

Внешний путь Повреждение сосуда

тт

VII У»аГ

;т>- Са" УНа

^ЗиПРЛСЕ.

Активация

Внутренний путь

XI

; у"* ■

' - - • Х1а

IX

1Ха ;

Г [. К я << 1

1Ха Са" УШа

\ >

\ N ,

\ ! г'Л , ..............

Ь-' Ь\ —рСа РС

Ха

и !

* * & Ь

НЙОНЕШЙР" у /у? =

/ 4&у

А , ,

■ . рномошше

Хв Сз" уа

Т! /■А

, Протромбин 4 „ Тромбин

Ч>и6риноген> Фибрин

«Полимеризация

Элонгация ■ Остановка

Рис. 1. Схема каскада системы свертывания. На схеме приведены три стадии работы каскада свертывания: активация (по внешнему и внутреннему пути), элонгация (красные стрелки - петли положительной обратной связи) и остановка (синие стрелки - петли отрицательной обратной связи терминации). Тонкие коричневые стрелки - петли протеолетических реакций. Прямоугольниками показаны Са2+ зависимые элементы каскада -протромбиназа, внутренняя и внешняя теназы

Процесс гемостаза инициируется повреждением эндотелия сосуда и заканчивается образованием тромба, останавливающего кровопотерю [1]. В системе свертывания выделяют три звена - тромбоцитарное, плазменное и сосудистое. Тромбоцитарное звено обеспечивает адгезию и агрегацию тромбоцитов и формирование тромбоцитарной части сгустка, плазменное звено - свертывание плазмы крови и формирование сгустка в месте повреждения.

Свернувшаяся плазма представляет собой частично нерастворимые полимеры фибрина. Его предшественник, фибриноген, находится в плазме в растворимом виде, и появляется в результате каскада реакций, составляющих системы свертывания. В состав данного каскада входят 13 факторов свертывания, из которых семь активируются до сериновых протеаз (факторы XII, XI,. IX, X, II, VII и прекалликреин), три являются кофакторами этих реакций (факторы V, VIII и кинниноген с высокой молекулярной массой, ВМК), один — кофактор/рецептор (тканевой фактор, ТФ), еще один — трансглутаминаза (фактор XIII). На каждой стадии предшественник фактора превращается в соответствующий фермент (сериновую протеазу), который катализирует превращение следующего профермента в протеазу. Значительное усиление свертывания осуществляется через петли положительных обратных связей, охватывающих каскад (фактор Па->факторы Vila и Х1а, фактор Па-исофакторы Va и Villa, фактор Ха—»фактор Vila), и через образование фактор-кофакторных комплексов ^VIIa-TO, фIXa-фVIIIa, фXa-фVa), что увеличивает активность соответствующих ферментов, и как результат скорости

5 7

соответствующих реакций в 10-10 раз. Это в свою очередь приводит к тому, что динамика свертывания обладает сильно выраженным нелинейным поведением.

Активация свертывания может осуществляться по двум путям -внутреннему и внешнему [5,7,8,62]. Внутренний путь осуществляется от контакта с искусственными (чужеродными) поверхностями, и практически не реализуется in vivo, и до сих пор не найдено физиологического активатора контактной фазы [10,32,100]. При активации контактной фазы сначала

происходит адсорбция белков на поверхность, и в зависимости от свойств поверхности и скорости оседания белков время, за которое она оказывается, покрыта SAP (surface activated proteins, активируемые поверхностью белки) сильно варьирует. Далее конформационные изменения, которые происходят вследствие взаимодействия SAP с заряженными элементами поверхности, приводят к тому, что они способны запустить систему контактной активации [32]. Контактная активация участвует в запуске системы свертывания, и состоит из профермента фХП, кофактора кинниногена и профермента прекалликреина, которые объединены рядом положительных обратных связей (см. рис.1).

Образование сгустка по внешнему пути запускается при помощи гликопротеина тканевого фактора (ТФ) [8,72]. ТФ - отсутствует на мембране тех клеток, которые в норме соприкасаются с плазмой крови (клеток крови и эндотелия), и присутствует на всех остальных, следовательно, при нарушении эндотелиального барьера ТФ попадает в кровь в области повреждения сосуда. Как только ТФ провзаимодействовал с плазмой - запускается механизм активации системы свертывания по внешнему пути. Сначала образуется комплекс внешняя теназа— фУИа-ТФ [24,79]. После сборки на фосфолипидной мембране, фермент-

Таблица 1. Основные факторы свертывания крови

Фактор (принятое название) Содержание в плазме Основная функция после активации

нМ мкг/мл

I (фибриноген) 8800 3000 Структурный белок, образует фибриновую сеть - сгусток

II (протромбин) 1400-2000 100 Расщепление фибриногена, активация факторов VII, V, VIII, XI, протеина С и тромбоцитов

V 20 10 Кофактор активации фактора

II

VII 10 0.5 Активация факторов X и IX

VIII 0.7 0.1-0.2 Кофактор активации фактора X

IX 90 5 Активация фактора X

X 170 10 Активация протромбина

XI 30 5 Активация фактора IX

XII 375 30 Активация фактора XI

ПК (прекалликреин) 450 Активация фактора XII

вмк (высокомолекуляр ный кининоген) 6000 Кофактор активации фактора XII

ТФ (тромбопластин, тканевой фактор) . 2> Кофактор активации факторов X и IX

XIII 70 19 Образование пептидных связей между отдельными нитями фибрина

Таблица составлена с использованием материалов [5, 7,62,34]. Концентрации факторов даны приблизительно: в норме у человека наблюдаются вариации (от -50/+100% для фУШ, и до ±20% для большинства других факторов). Кроме того, существует разброс в данных разных авторов, вызванный разными подходами и методиками в оценке концентраций белков свертывания.

В крови помимо фУП циркулируют следовые количества активированной формы фактора (0.1-0.01%) [102].

2) Современные данные показывают, что ТФ может находиться в крови: в составе лимфоцитов и, возможно, тромбоцитов; всего - не более 0.2 пМ [46].

коферментный комплекс фУНа-ТФ становится способным быстро активировать фактор X. Фактор Ха, в свою очередь, активирует протромбин и расщепляет

молекулу фУИ с образованием активного фермента фУПа. Число инициирующих свертывание комплексов фУПа-ТФ быстро растет в результате работы положительных обратных связей фХа—>фУНа и тромбин—>фУИа. При этом, хотя фХа и активирует фУП примерно в 570 раз быстрее, чем тромбин [25], из-за значительной разницы в концентрациях фХа и тромбина, в фазе инициации свертывания (ш vitro) основную роль играет последняя реакция [24].

1.1.2. Петли положительной обратной связи. Образование сгустка

Дальнейшие реакции в системе свертывания, необходимые для образования сгустка, одинаковы для обоих путей активации. Они включают в себя петли обратной связи для образования комплексов (теназа и протромбиназа), которые во много раз увеличивают скорости реакций, полимеризацию фибрина и образование сгустка.

Показано, что тромбин, который превращает фибриноген в фибрин, является катализатором своего производства [13]. Тромбин в свою очередь активирует факторы V и VIII, которые, не обладая ферментативной активностью [54], в образовании двух комплексов: протромбиназы фХа-фУа и внутренней теназы ф1Ха-фУШа [63,65,17,57]. Формирование этих комплексов является ключевым этапом процесса свертывания, поскольку протромбиназа и теназа в ~105-107 раз более эффективны по отношению к своим субстратам фП и фХ, чем факторы Ха и 1Ха соответственно [63, 65,92,73]. Сборка обоих комплексов осуществляется на фосфолипидных поверхностях, обладающих отрицательным зарядом, а именно на фосфатидилсерине. Фосфатидилсерин (ФС) присутствует в мембранах тромбоцитов, эритроцитов, лимфоцитов, а также эндотелиальных клеток [107] (5-30% от общего состава мембранных липидов).

Конечная цель активации коагуляционного каскада — образование фибрина, как основы тромба. Внутренне устройство каскада, а именно сборка фермент-коферментных комплексов и

положительные обратные связи

приводят к взрывному, автокаталитическому производству тромбина,

Рис. 2. Микрофотография фибринового сгустка. Сеть полимеризованных фибриновых волокон является надежным препятствием не только для клеток крови, но и для плазмы.

который и осуществляет превращение фибриногена в фибрин, осуществляя реакцию полимеризации и как результат свертывание крови. Фибриноген — гликопротеин, присутствующим в плазме и в ос-гранулах тромбоцитов [20,69]. Показано, что образование фибрина в крови и в плазме начинается с первого момента появления тромбина [20,23]. Превращение фибриногена в фибрин протекает в три этапа [5,20,23,69]. На первом этапе тромбин воздействует на № концевые участки цепей А и В фибриногена, вызывая протеолиз, который отделяет от аминного конца этих цепей две молекулы фибринопептидов. В результате этой реакции фибриноген преобразуется в фибрин-мономер, в центре которого образуется реакционная поверхность с измененным электронным зарядом. Реакционная поверхность фибрин-мономера взаимодействует с комплементарными поверхностями на Ы-концах других молекул фибрин-мономера. Таким образом, происходит спонтанная агрегация фибрин мономеров - их полимеризация — второй этап. При этом мономеры оказываются соединены между собой посредством гидрофобных, ионных и

водородных взаимодействий. Данный полимер считается растворимым, так как он легко растворяется в растворах при кислом рН. Фибриновые волокна в сечении состоят из трех-десяти молекул фибрина [101] и в

,, tfpi

Vila: : :Ха

X

XI la, К.

Xla

Vila

IXa 1 li'.'i

УЗ АРС^РС

TFPI:Xa

TFPI

I"g -*• knfs)

XHIa

Vila

АТШ

a2-M

хшпг

C'llnh

IXa l"îl

uXa v..

"На

i'S Filial V

l-n(i)

НК-П

Xllla

Рис. 3. Ингибиторы системы свертывания

На схеме приведены: АТШ - антитромбин III, а2-М - а2-макроглобулин, HK-II

- гепарин кофактор II, С1 Inh - С1 -ингибитор. (Б) ТФПИ - ингибитор пути тканевого фактора; система протеина С: PC - протеин С, АРС - активированный протеин С, PS - протеин S, ТМ - тромбомодулин.

пространстве образуют сеть.

На третьем этапе под влиянием фактора Xllla растворимый фибрин-полимер превращается в нерастворимый (фибрин I) [20,23]. Фактор XIII катализирует образование пептидной связи между глютамином и лизином через последовательные ацетилирование и деацетилирование. После стабилизации фХШа многократно повышается устойчивость сгустка к действию химических растворителей и системы фибринолиза и увеличивается жесткость сгустка [42,71,83]. Однако, структура сгустка (размер волокон, ячеек сети) практически не зависит от присутствия или отсутствия фХШ [71,83].

Процесс свертывания контролируется активируемыми в ходе гемостаза белками - ингибиторами, которые снижают скорость протеолитических реакций и защищают от нежелательного тромбообразования.

Таблица 2. Компоненты ингибирушщей системы

Ингибиторы Сокращение (общеприня тое) Содержание в плазме Основная цель ингибитора

нМ мкг/мл

Антитромбин III AT III 2500 150 Тромбин, факторы Ха, 1Ха

Гепарин кофактор II ГКII 1200 70 Тромбин

С1-ингибитор С1-И 250 250 Факторы Х1а, ХИа, калликреин

а2- макроглобулин а2-М 2800 2000 Факторы На, Ха, 1Ха, ХПа, Х1а, калликреин

Ингибитор пути тканевого фактора ТФПИ 2.5 0.1 Факторы Ха и Vila

Система протеина С:

Активированн ый протеин С АПС 60 4 Факторы Va, Villa, протромбиназ а

Протеин S ns 300 25 Протромбиназ а и факторы Va, Villa (кофактор АПС)

Тромбомодул ТМ - - Кофактор

ин активации ПС

тромбином

Таблица составлена с использованием материалов [5, 8,62,58]. Концентрации ингибиторов даны приблизительно: в норме наблюдаются вариации (±20%). Кроме того, существует разброс в данных разных авторов, вызванный разными подходами к оценке концентраций белков свертывания.

К основным ингибиторам свертывания относятся: антитромбин III (AT III), гепариновый кофактор II (ГК II) и С1-ингибитор (Cl-И); ингибитор пути тканевого фактора (ТФПИ); а2-макроглобулин (а2-М) [8] и система протеина С. Большая часть из них не требует активации, кроме АПС и ТФПИ, которые начинают оказывать тормозящее действие уже в ходе свертывания крови, после появления факторов IIa и Ха. AT III, ГК II, а2-М и С1 -И присутствуют в плазме в концентрациях, многократно превышающих концентрации предшественников всех факторов свертывания вместе взятых (<2 мкМ). При этом основную часть ингибиторной активности плазмы определяет AT III [5,54,41], который в разной степени ингибирует почти все ферменты коагуляционного каскада: тромбин, ф1Ха, фХа, фХ1а и фХНа. AT III нейтрализует тромбин и другие протеазы посредством ковалентного связывания. В результате формируется неактивный комплекс между ферментом и ингибитором.

а2-Макроглобулин ингибирует множество протеаз, включая тромбин, фактор Ха, плазмин, калликреин. Было показано, что на долю а2-М приходится около 10% ингибирующей фХа активности плазмы и 25% ингибирования тромбина [41]. Ингибитор образует ковалентные комплексы с ферментами, причем в данном случае активный центр фермента не блокируется и может взаимодействовать с субстратами небольшой массы. Второй важный ингибитор тромбина, гепарин кофактор II [5, 8,62]. Дефицит ГК II также сопровождается склонностью к тромбозам, но ингибирующее воздействие ГК II менее выражено по сравнению с таковым у AT III [8] (см. рис. 3).

Поскольку эффективность ингибирования описанными антикоагулянтами (AT III, ГК II, а2-М, Cl-И) практически не зависит от количества активных факторов свертывания, роль этих ингибиторов состоит главным образом в обеспечении порога по активации свертывания и удалении активных факторов после образования сгустка [13,83,55,106]. Экспериментально показано, что для преодоления ингибиторного потенциала плазмы требуется время и определенная сила инициирующего сигнала как по внешнему [20,26,84], так и по внутреннему [7,15] пути. Когда же каскад свертывания преодолел порог по активации, начинается взрывное производство тромбина, которое может идти вплоть до полного исчерпания протромбина [69,93]. Кинетика производства тромбина слабо зависит от предшествующих ингибиторов из-за наличия в системе свертывания ряда эффективных петель положительной обратной связи [13,83,55,106]. В ходе свертывания активность и концентрация ингибиторов не увеличивается, а, наоборот, может уменьшаться. В отличие от перечисленных ингибиторов, TFPI и система протеина С оказывают ингибирующее действие уже после начала работы каскада свертывания, когда появляются фХа и тромбин. Их действие представляет собой отрицательные обратные связи (см. рис. 3), что ограничивает процесс свертывания временными и пространственными рамками [8,100,104,106].

Ингибитором ТФ является ингибитор типа Кюница сложного механизма действия, направленного не просто на ТФ, а последовательно на все три главных участника внешней инициации свертывания: фактор Ха, фактор Vila и ТФ [94]. Инактивация посредством ингибитора пути тканевого фактора (ТФПИ) происходит в две стадии [94]. Сначала ТФПИ связывается с фХа и инактивирует его (см. рис. 3). Затем образовавшийся комплекс ТФПИ-фХа связывается с комплексом фVIIa-TФ и инактивирует его (кальций-зависимый ингибиторный комплекс). В отсутствие фХа ТФПИ неактивен по отношению к ТФ. Быстро ингибируя небольшие количества ТФ после инициации каскада свертывания, ТФПИ играет важную роль в поддержании нормального гемостаза [62]. В чистых системах белков и ингибиторов свертывания ТФПИ

приводит к удлинению времени до наступления взрывного производства тромбина и заметному уменьшению скорости этого производства [93], а вместе с АТ III вызывает полную остановку свертывания в фазе инициации, если активация осуществляется небольшими концентрациями ТФ [94]. Удаление ТФПИ из нормальной и гемофильной плазмы резко сокращает время свертывания по внешнему пути [74].

Ещё одна динамическая система, ограничивающая производство тромбина, состоит из протеазы активированного протеина С (АПС) и двух кофакторов -протеина S и тромбомодулина (ТМ) [36]. Протеин С - витамин К-зависимый белок, циркулирует в крови в неактивной форме [107]. Активный протеин С (АПС) является ингибитором, образующимся в процессе свертывания в объеме плазмы [8,100,104]. ПС активируется тромбином, но активность свободного тромбина по отношению к ПС мала по сравнению с активностью к факторам V, VIII и фибриногену. Связывание тромбина с ТМ приводит к изменению соотношения активностей на противоположное: реакция активации ПС тромбином ускоряется в 20 000 раз, а скорость прокоагулянтных реакций падает в 100 раз [36]. Тромбомодулин - это трансмембранный белок, присутствующий в значительных концентрациях на поверхности эндотелиальных клеток. Некоторое количество ТМ было найдено также на поверхности тромбоцитов и в плазме на везикулах, испускаемых эндотелиальными клетками. АПС инактивируется несколькими ингибиторами: ингибитором протеина С, al-антитрипсином, а2-макроглобулином, al-антиплазмином и ПАИ-1 [36].

Кроме уже описанных, ингибирующее действие на свертывание in vivo отмечено для ряда продуктов активации факторов свертывания [5]. Считается, что фибрин и фибриноген могут обладать антикоагулянтным эффектом, сорбируя большие концентрации тромбина [5]. На молекуле тромбина имеется высоко-аффинный сайт связывания с фибриногеном, причем после расщепления фибриногена аффинность сайта меняется слабо. Остающийся связанным с фибрином тромбин, видимо, неспособен активировать другие

факторы свертывания. При этом тромбин недоступен и для инактивации ингибиторами, и поэтому после распада комплекса тромбин-фибрин(оген) или лизиса сгустка в плазму внутри уже сформированной фибриновой сети могут поступать некоторые количества активного фермента. Предполагается, что регуляторная роль этих молекул тромбина заключается в противодействии фибринолизу.

1.1.3. Фибрииолиз

XI 1а, К, ПК

А Т"Т : . VI 1

и АН Л

Урокиназа — Ироурокиназа

иАП-2

\2~тмтшшяш%ммя

>мбриеа (Ц-дииер)

Фибриноген х-

ПД Фибриногена

Рис. 4. Реакции фибринолиза

К - калликреин, НК - кининоген с высокой молекулярной массой, тАП -тканевой активатор плазминогена, ПД фибрина - продукты деградации фибрина. Жирным шрифтом выделены ингибиторы: иАП-1,2 ингибиторы активации плазминогена 1 и 2, ТАФИа - активируемый тромбином ингибитор

фибринолиза (активная форма)

После того, как тромб сформирован, а место повреждения сосуда успешно репарировано, необходимость в сгустке отпадает. Поэтому важно разрушить фибриновую сеть, чтобы уменьшить вероятность тромбоза и восстановить кровоток в данном сосуде до нормального состояния. Эту задачу выполняет система фибринолиза - происходит ферментативное расщепление плазмином фибриновых волокон на растворимые фрагменты различного размера.

Плазмин присутствует в крови в виде своего неактивного плазменного предшественника - плазминогена [5]. Активация фибринолиза осуществляется по внутреннему и внешнему пути. Активация по внешнему пути обусловлена поступлением в сосудистое русло тканевых и сосудистых активаторов, превращающих плазминоген в плазмин (см. рис. 4).

Пусковым механизмом фибринолитической системы по внутреннему пути является система контактной активации [37]. В процессе активации фибринолиза по внутреннему пути принимают участие фХП, прекалликреин и кининоген с высокой молекулярной массой (ВМК). фХИ превращает прекалликреин в калликреин, который индуцирует образование плазмина из плазминогена. Кинины, образуемые при активации фХП, ВМК и прекаликреина, также участвуют в активации плазминогена. Они способствуют освобождению активатора плазминогена из тканей, что позволяет сделать заключение о связи фХПа с процессом выделения тПА из сосудистой стенки. Остается открытым вопрос о значимости участия фХП в тотальной активации фибринолиза, основной вклад в которую вносит тканевой активатор тПА [72,91,37].

Физиологические ингибиторы фибринолиза подразделяют на две группы [33]. Первую составляют антиактиваторы, тормозящие активацию плазминогена, а вторую - антиплазмины, ингибирующие действие плазмина. Антиплазминовой активностью обладают а2-антиплазмин, а2-макроглобулин, а 1-антитрипсин, интер-а-трипсиновый ингибитор, а1-химотрипсин, комплекс антитромбин Ш-гепарин и С1-ингибитор. При образовании плазмина в крови его инактивация, в основном, осуществляется а2-антиплазмином; при генерализованной активации плазмина в крови и полном потреблении а2-антиплазмина на инактивацию плазмина его избыток ингибируется а2-макроглобулином. Роль других ингибиторов плазмина незначительна [35]. Антитромбин III является медленно действующим ингибитором плазмина. В настоящее время идентифицированы два ингибитора активатора плазминогена: ПАИ-1 и ПАИ-2. ПАИ-1 обнаружен в эндотелии сосудов, печеночных клетках

и других тканях [88]. В плазме крови его содержание незначительное, более высокое в тромбоцитах [19]. При освобождении ПАИ-1 из эндотелия его концентрация в крови нарастает. ПАИ-1 ингибирует тПА, циркулирующий в крови. ПАИ-2 впервые был обнаружен в плаценте и крови беременных женщин. а2-Макроглобулин и С1-ингибитор также обладают способностью ингибировать действие активатора плазминогена, однако, их антиплазминовая активность выше. В организме, активации плазминогена, помимо ингибиторов его активатора, препятствует постоянное и быстрое освобождение крови от активаторов плазминогена тПА печенью [103].

В плазме также присутствует еще один ингибитор фибринолиза -активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (ТАФИ), металлопротеаза с В-подобной карбоксипептидазной активностью [16]. В плазме ТАФИ циркулирует в неактивной форме (проТАФИ). После активации, ТАФИа удаляет карбокситерминальные лизиновые основания частично деградированных молекул фибрина, что приводит к предотвращению связывания плазминогена с фибрином. Таким образом, предотвращается образование комплекса между плазминогеном, тПА и фибрином. Активацию проТАФИ осуществляет тромбин, однако, как и в случае с протеином С, эта реакция многократно усиливается, когда тромбин образует комплекс с тромбомодулином [16]. Таким образом, тромбин помимо прокоагулянтной функции (образование фибрина и активация кофакторов V и VIII и фактора XI) и ингибиторной (активация ПС), обладает и антифибринолитическим действием. In vitro при удалении проТАФИ подверженность сгустков лизису увеличивается. При гемофилии недостаточная активация ТАФИ вследствие замедленного производства тромбина in vitro также ведет к повышенной активности фибринолиза [21], и восстановить устойчивость сгустков к лизису можно повышением уровня ТАФИ [68] или восстановлением скорости производства тромбина при помощи фактора VIII [68] или фактора Vila [59]. Также обнаружено, что при гемофилии плазменный уровень проТАФИ может быть снижен [14].

Следует отметить, что характерные времена свертывания плазмы и лизиса сгустка сильно отличаются. Несмотря на то, что инициация лизиса происходит одновременно с инициацией свертывания, лизис in vitro наблюдаются через десятки минут или часов, а образование сгустка занимает минуты. Хотя при определенных условиях in vitro можно добиться относительного ускорения начала лизиса (путем добавления больших концентраций активаторов фибринолиза [ссылка]), вероятно, процесс фибринолиза в организме протекает медленнее и позже формирования сгустка [74]. Однако, динамика фибринолиза in vivo в значительной степени остается неизученной.

1.2.Гемофилии А, В, С 1.2.1. Гемофилия - природа заболевания, его виды и типы

Одним из тяжелейших врожденных нарушений свертывания крови является гемофилия, которая связана с дефектом, частичным или полным отсутствием некоторых белков ферментативного коагуляционного каскада. Недостаточность любого фактора (за исключением дефицита фактора XII [48], ВМК [31] и прекалликреина [47]) может стать причиной возникновения геморрагического синдрома [11]. В настоящее время имеются сообщения о наследственном дефиците каждого из факторов свертывания. Наиболее распространенными являются гемофилии, и все они - дефициты факторов внутреннего пути свертывания [11].

Считается, что впервые о наследственности этого заболевания упомянуто в Талмуде. Было отмечено, что если у матери двое сыновей умирали от кровотечения после обрезания, третий сын освобождался от этой процедуры [85]. Описание гемофилии как заболевания, поражающего мужчин и передающегося женщинами, было сделано уже в 1803 году. Существенный вклад в понимание гемофилии был внесен в 1937 году Patek A.J. и Taylor F.H.L. [76], описавшими антигемофильный фактор, теперь известный как фактор VIII. В конце 40-х годов Pavlovsky A. (Argentina) [77] обнаружил, что коагуляционный дефект у одного больного гемофилией может нормализоваться

вливанием крови от другого больного. Исправление нарушенного свертывания при смешивании плазм неродственных больных подтвердило существование двух различных форм гемофилии. В 1952 году Sidney G.W. et al. [86] обнаружили прежде неизвестный фактор свертывания - плазменный компонент тромбопластина (фактор IX) - и заболевание, связанное с его недостаточностью, которое они назвали "новым заболеванием, похожим на гемофилию".

В 1954 году на Конгрессе Международного Общества Гематологов в Париже для заболевания, связанного с дефицитом фУШ, был официально определен термин гемофилия А, а с дефицитом ф1Х - гемофилия В. Позднее был введен термин "гемофилия С" (дефицит фактора XI). Общее число больных гемофилией в мире в 1990 г. составило 350 ООО человек [60], частота встречаемости в мире в среднем 1:1000 000 человек (0.000 01%), в США -1:3000 (0.03%). Данные процентные доли за последние годы неуклонно увеличиваются.

Гемофилия А вызвана частичным, или полным отсутствием, снижением активности фактора VIII в плазме [61]. Гемофилия А - самый распространенный тип гемофилии (составляет 80-85 % всех случаев гемофилии). Полагают, что в мире гемофилией А в среднем страдают 30-100 из 1 млн человек. В США Гемофилия А встречается у 25 из 100 000 мужчин [89]. Поскольку ген фактора VIII локализован в Х-хромосоме, то сыновья женщин-носителей гена гемофилии имеют шанс его унаследовать в 50 % случаев. У мужчин заболевание проявляется кровоточивостью. Все сыновья гемофиликов здоровы, в то время как дочери обязательно являются носителями дефектной хромосомы. Гемофилия А редко встречается у женщин, ею страдают лишь девочки, рожденные от гемофилика-мужчины и женщины-носителя гемофилии.

Гемофилия В (болезнь Кристмаса) вызвана дефицитом фактора IX, возникающим в результате Х-сцепленной мутации/делеции в гене ф1Х [45]. Гемофилия В, подобно гемофилии А, вызывает кровотечения, но частота их в 5

раз ниже, чем при дефиците фУШ. Больные гемофилией В составляют приблизительно 15 - 20% больных всеми гемофилиями.

Тяжесть кровоточивости при гемофилиях А и В можно предсказать на основании уровня прокоагулянтной активности дефицитного фактора [11,104]. Так как при гемофилиях А и В поражается одна и та же ступень каскада свертывания крови (образование внутренней теназы), пациенты имеют схожие клинические проявления [11]. Они включают спонтанные кровотечения, особенно в суставы и мышцы, длительные кровотечения после небольших порезов и травм. Повторные кровотечения ведут к формированию деформаций суставов. Спонтанные же обычно встречаются при средней и тяжелой формах заболевания; у пациентов с легкой формой они развиваются после травм и оперативных вмешательств, включая стоматологические манипуляции. У больных с уровнем прокоагулянтной активности указанных факторов <1% спонтанные и тяжелые осложнения, связанные с кровотечением, проявляются в раннем детстве. Кровоизлияния приводят к тяжелым последствиям, если больной не получит незамедлительного и адекватного лечения. У больных со средней степенью патологии (фУШ:С или ф1Х:С — 1-5% нормы) кровотечение развивается после незначительной травмы или хирургического вмешательства, а также может быть спонтанным. У больных со слабой степенью гемофилии (фУШ:С или ф1Х:С — 5-40%) кровотечение возникает только после травмы или хирургического вмешательства. Примерно половина больных гемофилией А страдают тяжелой формой заболевания.

Гемофилия С (дефицит фХ1) - крайне редкое заболевание (1-3% от общего числа гемофиликов в мире). Гемофилия С распространена главным образом среди евреев Ашкенази: в этой популяции частота встречаемости гомозиготного типа составляет 1 на 190 человек и для гетерозиготного 1 на 8 человек [86]. При этом различий в частоте кровотечений у гомо- и гетерозиготов найдено не было [82]. В отличие от классических гемофилий (гемофилии А и В), осложнений вызывает мало, спонтанные кровотечения в суставы и мягкие ткани не характерны. Кровотечения могут обычно

возникать при сильных травмах и хирургическом вмешательстве, однако четкая корреляция между тяжестью кровотечений и уровнем фактора XI остутствует [86].

Общие принципы лечения гемофилий сводятся к возмещению дефицита препаратами, содержащими дефицитные факторы свертывания (заместительная терапия) [43]. Лечение спонтанного кровотечения требует переливаний концентратов факторов для повышения уровня активности факторов VIII, IX и XI в плазме до 30% нормы, но при подготовке к обширному хирургическому вмешательству его рекомендуется повысить до 100%, что обеспечит остановку посттравматического кровотечения [43]. Время полужизни фЛ^Ш в кровотоке составляет 12-18 часов, ф1Х - 20-30 часов, фХ1 - 2-3 дня. Принято, что через пять периодов полужизни после предыдущего введения концентрата фЛ^Ш (или ф1Х) в крови больного остается лишь базальное содержание дефицитного фактора [70].

Сравнительно недавно для лечения гемофилий стали использоваться рекомбинантные факторы свертывания. К числу новых антигемофильных рекомбинантных препаратов относится фактор Vila (rVIIa, NovoSeven®) [49]. Несмотря на то, что фактор VII участвует только во внешнем пути свертывания, клинические данные показывают, что rVIIa быстро обеспечивает гемостаз как у больных тяжелыми формами гемофилий А, В и С [50], так и у больных с ингибиторами к фЛ^Ш и ф1Х. Предполагаемый механизм действия NovoSeven основывается на том, что: (1) rVIIa снимает ингибирующее действие фЛ^П, который конкурирует с фVIIa за ТФ, и (2) фVIIa может активировать ф1Х и фХ в отсутствие своего естественного кофактора ТФ, хотя это процесс идет значительно медленнее. В системах из чистых белков свертывания было показано, что в присутствии ФС-везикул фактор Vila в концентрациях, значительно превышающих плазменные (-1000 раз), может компенсировать дефицит фЛ^Ш [95]. Аналогичные результаты были получены в чистой системе в присутствии тромбоцитов [67] (в данном случае тромбоциты выступали в качестве источников ФС). Также было показано, что фактор Vila может

восстанавливать нарушенное ингибирование лизиса сгустка в плазме больных гемофилией через увеличение производства тромбина, что приводит к нормализации скорости активации ТАФИ [59]. Однако, в цельной крови in vitro эффект фактора Vila на свертывание плазмы больных тяжелой формой гемофилии (в т.ч. ингибиторной) был незначительным [27].

1.2.2. Возможные механизмы нарушения свертываиия при гемофилиях

Выраженная кровоточивость при дефицитах факторов внутреннего пути свертывания указывает на их критическую важность для нормального гемостаза. Однако, традиционные представления о свертывании не могут убедительно объяснить это обстоятельство в силу того, что факторы Villa, IXa и XIa слабо вовлечены в последовательность реакций, которые сопровождают образование сгустка в экспериментах in vitro. Поскольку, как есть все основания полагать, in vivo происходит активация только внешнего пути [6,64,10], в запуске свертывания факторы внутреннего пути принимать участия не могут. Действительно, когда in vitro тканевой фактор помещается в плазму, быстро образовавшаяся внешняя теназа фУПа:ТФ производит фХа прямо, и тем самым катализирует сборку протромбиназы [63]. Таким образом, инициации тканевым фактором достаточно для производства тромбина и образования сгустка, а вовлечение в этот процесс внутренней теназы (фУШа:ф1Ха) может показаться излишним.

Описанный "гемофилический" парадокс стал причиной наиболее острых дискуссий именно в последнее десятилетие прошлого века, когда, как уже говорилось выше, стало очевидным, что контактная активация, т.е. внутренний путь, не инициируется при повреждении сосуда [4]. Однако, еще в 60-х годах в экспериментах Josso F. [52] было показано, что время свертывания плазмы, смешанной с тканевым тромбопластином (ТФ) может зависеть от фУШ, но только при очень малых концентрациях активатора. В 1977 году было найдено биохимическое объяснение этому эффекту [75]. Внешняя теназа, помимо фХ, может активировать и ф1Х, тем самым осуществляя "петлю Джоссо" между

внешним и внутренним путями свертывания ("альтернативный внешний путь свертывания" [66]). В последующие годы был предпринят ряд попыток измерить скорость этой реакции [53,81], но она оказалась в несколько раз ниже прямой реакции активации комплексом фУПа:ТФ фактора X, и поэтому не могла служить объяснением гемофилического парадокса. Открытие ингибитора внешнего пути свертывания (ТФПИ) и тот факт, что ф1Ха в комплексе с ф Villa (внутренняя теназа) оказался в 50 раз эффективнее внешней теназы в расщеплении фХ [74], привел к следующему гипотетическому механизму нарушения гемостаза у больных с дефицитами фУШ и ф1Х. Согласно этой гипотезе, при повреждении сосуда кровь вступает в контакт с ограниченной концентрацией ТФ, которая с появлением фХа быстро ингибируется ТФПИ. В то же время, ф1Ха, произведенный на ранних этапах инициации свертывания, с появлением фУШа участвует в образовании внутренней теназы, роль которой заключается в поддержании производства фХа по мере ингибирования непосредственного инициатора свертывания, ТФ. Однако, описанная гипотеза не объясняет кровоточивости при дефиците фХ1 и накладывает жесткие ограничения на максимальную концентрацию ТФ, достаточную для различий в свертывании между нормальной и дефицитной по фУШ или ф1Х плазмами. Большие концентрации ТФ, появляющиеся в месте повреждения сосуда in vivo, легко преодолевают ингибирующее действие ТФПИ и должны приводить к нормальному образованию сгустков у гемофиликов. Интересное дополнение гипотезы о механизме быстрого удаления внешней теназы, экспрессированной в месте повреждения было сделано в работе, математически моделирующей псевдо-пространственное образование тромба [56]. Согласно математической симуляции, оседающие на место повреждения тромбоциты должны быстро закрывать несущую ТФ клеточную поверхность, тем самым повышая значимость протекающих в объеме ф1Ха:фУШа-зависимых реакций.

Дальнейшее развитие описанный гипотетический механизм получил, когда классические "гомогенные" представления о свертывании были дополнены пространственным аспектом формирования сгустка. В организме в нормальном

состоянии активатор (ТФ) экспрессируются только в месте повреждения сосуда, а не перемешан во всем объеме плазмы, как это происходит при свертывании в пробирке. Очевидно, в ходе роста тромба большую роль должна играть диффузия активных факторов от места повреждения вглубь плазмы. Вдали от связанного на сосудистой стенке комплекса фУПа:ТФ, роль внутренней теназы в поддержании свертывания может быть велика по двум причинам. Во-первых, внутренняя теназа по отношению к фХ активнее в 50 раз, чем внешняя теназа [63]. Во-вторых, показано, что в плазме активированный ф1Х ингибируется антитромбином III во много раз медленнее, чем фХа [79]. Таким образом, диффундирующие от места повреждения ф1Ха и фУШа эффективно и долго могут производить фХа, распространяя свертывание в места, где нет ТФ. Согласно этой гипотезе, дефицит факторов IX и VIII при гемофилиях А и В должен приводить к образованию в месте повреждения сгустков, меньших по размеру или плотности, чем в норме.

Автоволновой механизм пространственного свертывания объясняет необходимость не только факторов IX, VIII, но и фактора XI. Согласно автоволновой гипотезе свертывания [2], в организме скорость роста сгустка определяется скоростью бегущей самоподдерживающейся автоволны тромбина. При дефиците факторов внутреннего пути, но не факторов контактной активации, нарушается петля положительной обратной связи тромбин->фХ1а—>ф1Ха->фХа—кгромбин, и самоподдерживающееся

распространение тромбина становится невозможным. Таким образом, с позиций автоволновой гипотезы свертывания, кровоточивость при гемофилии вызвана меньшей скоростью роста сгустка, особенно на больших расстояниях от места повреждения сосуда.

В последние годы получил определенное экспериментальное подтверждение "некоагуляционный" механизм нарушения гемостаза при дефицитах факторов внутреннего пути свертывания. Согласно этой гипотезе [79], первичный сгусток у больных гемофилией образуется, однако, в отличие от нормальной плазмы, такой сгусток более подвержен лизису. Известно, что

тромбин помимо прокоагулянтных, обладает и антифибринолитическими свойствами, активируя ТАФИ (активируемый тромбином ингибитор фибринолиза [21,96]). Показано, что замедленная динамика производства тромбина при гемофилии приводит нарушенному ингибированию лизиса [21,68,59]. Также предполагается, что in vivo внутри образовавшегося сгустка присутствует постоянная активность тромбина, поддерживающаяся через петлю тромбин—»фХ1а—»ф1Ха-> ->фХа—»тромбин [21]. Возможно, присутствие тромбина внутри сгустка не только оказывает отрицательное влияние на фибринолиз, но и способствует некоторому уплотнению уже сформировавшегося тромба за счет дополнительной активации фХШа и фибриногена [96,29].

1.3. Анализ существующих направлений работ. Экспериментальные

модели

а

■Ш1

■

и

штШ/Ят

Ш

ш

йШи

шШЯШ

ЕО

—ЯЫ)

мЯШ

мм

Изложенные выше современные представления о системе свертывания были получены за счет экспериментов в системах без потока. Следовательно, пока что не выяснено влияние потока на систему свертывания. В мире существует несколько научных групп, ведущих

исследование свертывания в потоке.

Рассмотрим

Рис. 5 Эволюция тромба во времени подробнее

Панель а: красный цвет - агрегация тромбоцитов, содержание этих

фиолетовый цвет - накопление фибрина, зеленый работ.

цвет - ТФ; Панель Ь: эволюция растущего сгустка т Свертывание

уЬю во времени КР0ВИ ~ это защитный

механизм, который

поддерживает герметичность системы кровообращения. Патологические процессы, такие как атеросклероз, связаны с тромбообразованием, поэтому в группе Шарокка Фалати и Питера Гросса [39] считают, что исследования состояния сосудов живых организмов с подобными патологиями жизненно важны. Однако до недавних пор набор инструментов для подобного

наблюдения в «живой» среде был крайне ограничен. Поэтому Фалати и Гросс и др. поставили перед собой задачу: разработать такую систему, с помощью которой можно было бы наблюдать за работой системы свертывания прямо в потоке в живой ткани. Для отображения формирования тромба в потоке использовалась конфокальная и широкополостная микроскопия [39,30]. Построенная авторами система позволяет получать изображения сразу по нескольким каналам флюоресценции на разных длинах волн для разных веществ.. Повреждение стенки сосуда осуществлялось с помощью лазера, луч которого фокусировался микроскопической оптикой. Были исследованы расположение и образование сгустка в потоке, накопление ТФ при росте одиночном тромбе. Процесс инициации роста in vivo сопровождался начальным накоплением ТФ сверху по течению крови в потоке над местом повреждения. После же ТФ оказывался распределен в тромбе (ТФ при этом был биологически активен). Для получения флуоресцентной картины подопытным мышам вводились антитела на некоторые клеточные (тромбоциты) и белковые компоненты крови (тканевой фактор и фибрин). Это позволило Фалати и Гроссу не только точно обнаружить их местоположение, но количественно их оценить. Однако, свои результаты авторы приводят в виде относительных единиц флюоресценции, не давая количественной оценки для тромбоцитов. Места скопления соответствующих компонентов хорошо видны на рис.5.

Секция а на рисунке — это изображения снятые обычной черно-белой камерой через оптику конфокального микроскопа, потом флуоресцентная фотография, потом наложенные друг на друга, и график зависимости светимости тромбоцитов от времени. Секции b и с — аналогичные данные для фибрина и ТФ. При многоканальном одновременном сканировании образца оказалось, что тромбоциты - это основной компонент сгустка при артериальном росте, при этом фибрин был локализован вверх по течению крови, и далее распространился более чем на 75% объема тромба в процессе роста. Тканевой фактор находился вдоль стенки сосуда и на передней грани растущего сгустка (т.е. навстречу течению) [39]. Фалатти и Гроссу удалось

отследить расположение исследуемых факторов свертывания в процессе роста сгустка в реальном времени при помощи

высокоскоростной четырехканальной фотографии. Для

получения

распределения клеток и

основных веществ (ТФ,

фибрин) в тромбе были

использованы

Рис.6. Кинетика накопления фибрина, ТФ

флуоресцентные метки

и тромбоцитов

(А1еха-350, 488 и 660).

На панелях рисунков показана кинетика накопления

Снимок

фибрина, тромбоцитов, ТФ - как в виде графиков в

непосредственно сразу

у.е., так и в виде флюоресценции

после повреждения не

показал почти никакой светимости, а следовательно, и наличия тромбоцитов. Через 4 секунды уже стало заметно их накопление на поврежденной поверхности стенки сосуда. Дальнейшую эволюцию во времени можно проследить по изображениям на рис.5, где красным цветом показано свечение тромбоцитов, фиолетовым — фибрина, зелёным — тканевого фактора, а эволюция показана для наложенных друг на друга трёх типов изображений.

На рис. 7 показано принципиальное устройство установки, созданной группой Фалатти и Гросса [38]. На предметном столе микроскопа лежит подопытная мышь, на которую сфокусирован микроскоп. Лазер соединен с оптикой микроскопа, что позволяет очень точно создавать маленькое по размерам место повреждения стенки сосуда. Микроскоп соединен через блок

сопряжения с персональным компьютером, который с помощью соответствующего программного обеспечения производит обработку и анализ полученных изображений.

В результате проделанной работы Фалати и Гросс смогли качественно охарактеризовать

образование

тромбоцитарного

сгустка.

Количественная оценка (скорость роста тромба, концентрации фибрина, ТФ,

количество

тромбоцитов) по

полученным данным на данный момент невозможна. На рис. 5. хорошо видно, что по достижении определённых

ШОЕР1Е 1.0

СОРОСА!

■и

Заключение диссертации по теме «Физиология», Авилов, Олег Эрнестович

4. ВЫВОДЫ

1. Выявлены физиолого-биохимнческие механизмы пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы при насыщенной и ненасыщенной тромбоцитами крови у нормальных и страдающих гемофилией доноров in vivo и in vitro.

2. Установлены два типа поведения зависимости времени задержки тромбообразования от скорости кровотока: линейный рост - скорость движения в диапазоне от 0 до 700 мин"1; нелинейный рост - скорость движения от 701 до 1400 мин"1. При скорости движения потока плазмы более 1400 мин"1 значения времени задержки формирования тромба теряют физиологический смысл.

3. Показана нелинейная зависимость угла переднего фронта растущего фибринового сгустка и интенсивности его роста вглубь сосудистого канала от скорости кровотока, которые в диапазоне от 0 до 250 мин"1 уменьшаются в 8-10 раз (Р<0,001), что свидетельствует о сопротивлении тромба потоку плазмы.

4. Доказано, что если у нормальных и страдающих гемофилией доноров время задержки тромбообразования было одинаковым, то у последних отмечены понижение интенсивности роста фибринового сгустка и кинетики светорассеивания в приактиваторной области, подтверждающее нарушение пространственной динамики формирования тромба у больных гемофилией.

5. Разработаны научно-обоснованная система, позволяющая моделировать процесс формирования фибринового сгустка in vitro, а также математический метод для регистрации биофизических показателей крови, физических характеристик тромба и их статистической обработки.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментальные разработки диссертационных исследований являются научной базой по созданию серийной версии биофизического прибора для диагностики нарушений системы свертывания крови (проект ОАО «РОСНАНО» - Госрегистрация в реестре проектов № 687). Запуск клинических исследований серийного образца прибора намечен на 2014 год.

2. Научные положения, выводы и рекомендации используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», Чебоксарского политехнического института (филиал) ФГБОУ ВПО «Московский государственный открытый университет им. В. С. Черномырдина» и могут быть использованы при написании учебных пособий по физиологии, биохимии и гематологии для студентов вузов медико-биологических специальностей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Авилов, Олег Эрнестович, 2012 год

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авилов О. Э., Экспериментальное исследование пространственной динамики свертывания тромба в потоке плазмы крови / О.Э. Авилов, С.Г. Григорьев // Вестник ЧГПУ им. И. Я. Яковлева, Чебоксары: Чуваш, гос. пед. ун-т, 2011, №2 (70), Ч. 1, с. 3-8.

2. Атауллаханов, Ф.И., Пространственные аспекты свертывания крови. ГГипотеза / Ф.И. Атауллаханов, Г.Т. Гурия // Биофизика - 1994; 39 с.89-96.

3. Атауллаханов, Ф.И., Пространственные аспекты свертывания крови. П.Феноменологическая модель / Ф.И. Атауллаханов, Г.Т. Гурия,

A.Ю. Сафрошкина // Биофизика - 1994; 39 — с.97-106.

4. Атауллаханов, Ф.И., Пространственные аспекты свертывания крови. III. Рост тромба in vitro / Ф.И. Атауллаханов, Р.И. Волкова, Г.Т. Гурия,

B.Й. Сарбаш // Биофизика - 1995; 40 - с. 1320.

5. Балуда, В.П., Физиология системы гемостаза (под ред. проф. Балуды В.П.) / В.П. Балуда, М.В. Балуда, И.И. Деянов, И.Л. Тлепшуков - М, 1995.

6. Горяинова, И.Н., Возможности фармакологической коррекции тромбоцитарных дисфункции у новорожденных телят с диспепсией / И.Н. Горяинова, И.Н. Медведев, Т.А. Белова // Вестинк ОГУ, №12, 2007, — с.124-127.

7. Зубаиров, Д.М., Биохимия свертывания крови / Д.М. Зубаиров -М: Медицина, 1978.

8. Карвальхо, А.К.А., Гемостаз и тромбоз / Ф.Дж. Шиффман, Патофизиология крови, М: Binom Publishers, 2000.

9. Медведев, И.Н., Методические подходы к ранней диагностике тромбоцитопатии при различной соматической патологии / И.Н. Медведев, М.М. Наумов, М.Н. Павлов // Фундаментальные исследования — 2006 — с.49-50.

10. Севастьянов, В.И., Общие представления о процессах взаимодействия чужеродной поверхности с кровью. // Биосовместимость (под ред. проф. Севастьянова В.И.) - М, 1999.

11. Баркаган, З.С., Геморрагические заболевания и синдромы / З.С. Баркаган // М., Медицина, 1988.

12. Avilov, О.Е., Mathematical Modeling of Fibrin Clot Formation in the Presence of Blood Flow / О. E. Avilov, A. M. Shibeko, E. S. Lobanova et al // 1st International Conference «Mathematical Biology and Bioinformatics» — Russia, Puschino, 2006 - P. 55-56.

13. Avilov, О. E., Innovative Experimental Methods Open New Properties of Blood Coagulation / О. E. Avilov // Moscow University Bulletin, Moscow: Lomonosov Moscow State University — 2010, vol.65, — P. 407^11.

14. Antovic, J., Total thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) antigen and pro-TAFI in patients with haemophilia A / J. Antovic, , S. Schulman, A. Eelde, M.Blomback // Haemophilia. — 2001 Nov; 7(6) - P. 557-60.

15. Ataullakhanov, F.I., Calcium threshold in human plasma clotting kinetics / F.I. Ataullakhanov, A.V. Pohilko, E.I. Sinauridze, R.I. Volkova // Thrombosis Results - 1994 Aug 15; 75(4) - P. 383-94.

16. Bajzar, L., Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and an antifibrinolytic pathway / L. Bajzar // Arterioscler Thromb Vase Biol. — 2000 Dec; 20(12) -P.2511-8.

17. Barton, P.G., Relationship between factor V and activated factor X in the generation of prothrombinase / P.G. Barton, C.M. Jackson, D.J. Hanahan // Nature - 1967 May 27; 214(91) - P. 923-4.

18. Bogdanov, Vladimir Y., Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein / Vladimir Y. Bogdanov, Viji Balasubramanian, James Hathcock, OanaVele, Mark Lieb, Yale Nemerson // Nature Medicine - April 2003; volume 9, number 4.

19. Booth, N.A., Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in plasma and platelets / N.A. Booth, AJ. Simpson, A. Croll, B. Bennett, I.R. MacGregor //. Br J Haematol. — 1988 Nov; 70(3) - P. 327-33.

20. Blomback, B., Fibrinogen and fibrin—proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis / B. Blomback // Thrombosis Results - 1996 Jul 1; 83(1) - P.l-75.

21.Broze, G.J. Jr, Coagulation-dependent inhibition of fibrinolysis: role of carboxypeptidase-U and the premature lysis of clots from hemophilic plasma / G.J. Broze Jr, D.A.Higuchi //Blood. — 1996 Nov 15; 88(10) - P. 3815-23.

22. Bremme, K., A laboratory method for determination of overall haemostatic potential in plasma. I. Method design and preliminary results / K. Bremme, M. Blomback // Thrombosis Results - 1999 October 15; 96(2) - P. 145-56.

23. Brummel, K.E., An integrated study of fibrinogen during blood coagulation / K.E. Brummel, S. Butenas, K.G. Mann // J Biol Chem. - 1999 Aug 6; 274(32) - P. 22862-70.

24. Butenas, S., Evaluation of the initiation phase of blood coagulation using ultrasensitive assays for serineproteases / S. Butenas, C. van 't Veer, K.G. Mann // Journal of Biology and Chemistry - 1997 Aug 22; 272(34) -P. 21527-33.

25. Butenas, S., Kinetics of human factor VII activation / S. Butenas, K.G. Mann // Biochemistry - 1996Feb 13; 35(6)-P. 1904-10.

26. Butenas, S., Models of blood coagulation / S. Butenas, C. van 't Veer, K. Cawthern, K.E. Brummel, K.G. Mann // Blood Coagul Fibrinolysis - 2000 Apr; 11 Suppl 1 - P. S9-13.

27. Butenas, S., Mechanism of factor Vila-dependent coagulation in hemophilia blood / S. Butenas, K.E. Brummel, R.F. Branda, S.G. Paradis, K.G. Mann // Blood. — 2002 Feb 1; 99(3) - P. 923-30.

28. Camerer, E., Cell biology of tissue factor, the principal initiator of blood coagulation / E. Camerer, A.B. Kolsto, H. Prydz // Thromb Res. - 1996 Jan 1; 81(1) - P. 1-41.

29. Cawthern, K.M., Blood coagulation in hemophilia A and hemophilia C / K.M. Cawthern, C. van't Veer, J.B. Lock, M.E. DiLorenzo, R.F. Branda, K.G. Mann //. Blood. — 1998 Jun 15; 91(12) - P. 4581-92.

30. Celi, A., Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy / A. Celi, G. Merrill-Skoloff, P. Gross, D. Falatti, B. Furie, S. Sim, R. Flaumenhaft // Thrombosis and Haemostasis - 2003 Oct - P. 60-68.

31.Colman, R.W., Human kininogen deficiency with diminished levels of plasminogen proactivator and prekallikrein associated with abnormalities of the Hageman factor-dependent pathways / R.W. Colman, A. Bagdasarian, R.C. Talamo et al. // J Clin Invest. — 1975; 56 - P. 1650-1662.

32. Colman, R.W., Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes / R.W. Colman, R.W. Schmaier // Blood, - 1997, 90 - P. 3819-3843.

33. Collen, D., The plasminogen (fibrinolytic) system / D. Collen // Thrombosis and Haemostasis - 1999 Aug; 82(2) - P. 259-70.

34. Dahlback, B., Blood coagulation / B. Dahlback // Lancet —2000, May 6; 355(9215)-P. 1627-32.

35. Edy, J., Inhibition of plasmin by normal and antiplasmin-depleted human plasma / J. Edy, F. De Cock, D. Collen // Thromb Res Suppl. - 1976 Apr; 8(4) -P. 513-8.

36. Esmon, C.T., Regulation of blood coagulation / C.T. Esmon // Biochim Biophys Acta - 2000 March 7; 1477(1-2) - P. 349-60.

37. Fadeeva, O. A., Thromboplastin immobilized on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts / O.A. Fadeeva, M.A. Panteleev, S.S. Karamzin, A.N. Balandina, I.V. Smirnov, F.I. Ataullakhanov.// Biochemistry (Moscow), Volume 75, Number 6 — P.734-743.

38. Sharokh, Falatti, In Vivo Models of Platelet Function and Thrombosis / Sharokh Falatti, Peter Gross, Glenn Meller-Skoloff, Barbara C. Furie, Bruce Furie // Methods in Molecular Biology - 2004; vol 272 - P. 187-189.

39. Sharokh, Falatti, Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor, and fibrin during thrombus formation in the mouse / Sharokh Falatti, Peter Gross, Glenn Meller-Skoloff, Barbara C. Furie, Bruce Furie // NATURE MEDICINE -October 2002, vol 8, n. 10.

40. Falati, S., Platelet PECAM-1 inhibits thrombus formation in vivo / S. Falati, S. Patil, P.L. Gross, M. Stapleton, G. Merrill-Skoloff, N.E. Barrett, K.L. Pixton, H. Weiler, B. Cooley, D.K. Newman, P.J. Newman, B.C. Furie, B. Furie, J.M.Gibbins // Blood - 2006, Jan 15; 107(2) - P. 535-41.

41. Friedberg, R.C., The role of endothelium in factor Xa regulation: the effect of plasma proteinase inhibitors and hirudin / R.C. Friedberg, P.O. Hägen, S.V. Pizzo // Blood - 1988 May; 71(5) - P. 1321-8.

42. Glover, C.J., Rheological properties of fibrin clots. Effects of fibrinogen concentration, Factor XIII deficiency, and Factor XIII inhibition / C.J. Glover, L.V. Mclntire, C.H. Brown 3rd, E.A. Natelson // J Lab Clin Med. - 1975 Oct; 86(4) - P. 644-56.

43. Guinto, E.R., Identification of residues linked to the slow~>fast transition of thrombin / E.R. Guinto, A. Vindigni, Y.M. Ayala, Q.D. Dang, E. Di Cera // Proc Natl Acad Sei USA. — 1995 Nov 21; 92(24) - P. 11185-9.

44. Grabowski, Eric F., Platelet Aggregation in Flowing Blood at a Site of Injury to an Endothelial Cell Monolayer: Quantitation and Real-Time Imaging with the TAB Monoclonal Antibody / Eric F. Grabowski // The American Society of Hematology - 1990.

45. Giannelli, F., Gene deletions in patients with haemophilia B and anti-factor IX antibodies / F. Giannelli, K.H. Choo, D.J. Rees, Y. Boyd, C.R. Rizza, G.G. Brownlee//Nature. — 1983 May 12-18; 303(5913)-P. 181-2.

46. Giesen, P.L., Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis / P.L. Giesen, U.Rauch, B. Bohrmann, D. Kling, M. Roque, J.T. Fallon, J.J.

Badimon, J. Himber, M.A. Riederer, Y. Nemerson 11 Proc Natl Acad Sci U S A. — 1999 Mar 2; 96(5) - P. 2311-5.

47. Hathaway, W.E., Evidence for a new plasma thromboplastin factor. I. Case report, coagulation studies and physicochemical properties / W.E. Hathaway, L.P. Belhasen, H.S. Hathaway // Blood. — 1965;26 - P. 521-532.

48. Hoak, J.C., Myocardial infarction associated with severe factor-XII deficiency / J.C. Hoak, L.W. Swanson, E.D. Warner, W.E. Conno // Lancet. — 1966; 2(7469)-P. 884-886.

49. Hay, C.R., The treatment of bleeding in acquired haemophilia with recombinant factor Vila: a multicentre study / C.R. Hay, C. Negrier, C.A. Ludlam // Thromb Haemost. 1997 Dec; 78(6) - P. 1463-7.

50. Hedner, U., Factor Vila in the treatment of haemophilia / U. Hedner // Blood Coagul Fibrinolysis. — 1990 Aug; 1(3) - P. 307-17.

51. Hoffman, M., A cell-based model of hemostasis / M. Hoffman, D.M. Monroe 3rd. // Thromb Haemost. — 2001; 85(6) - P. 958-65.

52. Josso, F., Interaction of tissue factor and factor VII at the earliest phase of coagulation / F. Josso, O. Prou-Wartelle // Thromb Diath Iiaemorrh. 17 (1965) P. 35-44.

53.Jesty, J., Kinetics of the tissue factor-dependent activation of coagulation Factors IX and X in a bovine plasma system / J. Jesty, S.A. Silverberg // J Biol Chem. — 1979 Dec 25; 254(24) - P. 12337-45.

54. Kane, W.H., Blood coagulation factors V and VIII: structural and functional similarities and their relationship to hemorrhagic and thrombotic disorders / W.H. Kane, E.W. Davie // Blood - 1988 Mar; 71(3) - P. 539-55.

55. Khanin, M.A., A mathematical model of the kinetics of blood coagulation / M.A. Khanin, V.V. Semenov // J Theor Biol. - 1989 Jan 23; 136(2) - P. 12734.

56. Kuharsky, A.L., Surface-mediated control of blood coagulation: the role of binding site densities and platelet deposition / A.L. Kuharsky, A.L. Fogelson // Biophys J. — 2001 Mar;80(3) - P. 1050-74.

57. Krishnaswamy, S., Assembly of prothrombinase complex / S. Krishnaswamy, M.E. Nesheim, E.L. Pryzdial, K.G. Mann // Methods Enzymol - 1993; 222 - P. 260-80.

58. Kirschfink, M., CI inhibitor in anti-inflammatory therapy: from animal experiment to clinical application / M. Kirschfink, W. Nürnberger // Mol Immunol. — 1999 Mar-Apr; 36(4-5) - P. 225-32.

59. Lisman, T., Inhibition of fibrinolysis by recombinant factor Vila in plasma from patients with severe hemophilia A / T. Lisman, L.O. Mosnier, T. Lambert, E.P. Mauser-Bunschoten, J.C. Meijers, H.K. Nieuwenhuis, P.G. de Groot// Blood — 2002 Jan 1; 99(1)-P. 175-9.

60. Lee, C.A., Towards achieving global haemophilia care. World Federation of Hemophilia programmes / C.A. Lee // Haemophilia. — 1998 Jul; 4(4) -P. 463-73.

61. Lenting, P.J., The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function / P.J. Lenting, J.A. van Mourik, K. Mertens // Blood. — 1998 Dec 1; 92(11)-P. 3983-96.

62. Mann, K.G. Biochemistry and physiology of blood coagulation / K.G. Mann // Thrombosis and Haemostasis - 1999 Aug; 82(2) - P. 165-74.

63. Mann, K.G., Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes / K.G. Mann, M.E. Nesheim, W.R. Church, P. Haley, S. Krishnaswamy // Blood - 1990 Jul 1; 76(1) - P. 1-16.

64. Mann, K.G., Biochemistry and physiology of blood coagulation / K.G. Mann // Thromb Haemost. — 1999 Aug; 82(2) - P. 165-74.

65. Mann, K.G., Surface-dependent hemostasis / K.G. Mann, S. Krishnaswamy, J.H. Lawson // Semin Hematol - 1992 Jul; 29(3) - P. 213-26.

66. Marlar, R.A., An alternative extrinsic pathway of human blood coagulation / R.A. Marlar, A.J. Kleiss, J.H. Griffin // Blood. — 1982 Dec; 60(6) - P. 1353-8.

67. Monroe, D.M., Platelet activity of high-dose factor Vila is independent of tissue factor / D.M. Monroe, M.Hoffman, J.A. Oliver, H.R. Roberts // Br J Haematol. — 1997 Dec; 99(3) - P. 542-7.

68. Mosnier, L.O., The defective down regulation of fibrinolysis in haemophilia A can be restored by increasing the TAFI plasma concentration / L.O. Mosnier, T. Lisman, H.M. van den Berg, H.K. Nieuwenhuis, J.C. Meijers, B.N.Bouma // Thromb Haemost. — 2001 Oct; 86(4) - P. 1035-9.

69. Mosesson, M.W., Fibrinogen structure and fibrin clot assembly / M.W. Mosesson // Semin Thromb Hemost. - 1998; 24(2) - P. 169-74.

70. Morfini, M., The design and analysis of half-life and recovery studies for factor VIII and factor IX. Factor VIII/Factor IX Scientific and Standardization Committee of the International Society for Thrombosis and Haemostasis / M. Lee, A. Messori // Thromb Haemost. — 1991 Sep 2; 66(3) - P. 384-6.

71.Muller, M.F., Electron microscopy of fine fibrin clots and fine and coarse fibrin films. Observations of fibers in cross-section and in deformed states / M.F. Muller, H. Ris, J.D. Ferry // Journal of Molecular Biology - 1984 Apr 5; 174(2)-P. 369-84.

72. Nemerson, Y., Tissue factor and hemostasis / Y. Nemerson // Blood -1988 Jan; 71(1)-P. 1-8.

73. Nesheim, M.E., Thrombin-catalyzed activation of single chain bovine factor V / M.E. Nesheim, K.G. Mann // J Biol Chem. - 1979 Feb 25; 254(4) - P. 132634.

74. Nordfang, O., Inhibition of extrinsic pathway inhibitor shortens the coagulation time of normal plasma and of hemophilia plasma / O. Nordfang, S. Valentin, T.C. Beck, U. Hedner // Thrombosis Haemostasis - 1991 Oct 1; 66(4) - P. 464-7.

75. Osterud, B., Activation of factor IX by the reaction product of tissue factor and factor VII: additional pathway for initiating blood coagulation / B. Osterud, S.I. Rapaport // Proc Nat Acad Sci USA. — 1977; 74 - P. 5260-5264.

76. Patek, A.J., Hemophilia. II. Some properties of a substance obtained from normal human plasma effective in accelerating the coagulation of the hemophilic blood / A.J. Patek, F.H.L. Taylor // J Clin Invest. — 1937; 16 -P. 113-124.

77. Pavlovsky, A., Contribution of pathogenesis to hemophilia / A. Pavlovsky // Blood. —1947; 2-P. 185-191.

78. Peter L. A., Blood-borne tissue factor: Another view of thrombosis / Peter L. A. Giesen, Ursula Rauch, Bernd Bohrmann, Dorothee Kling, Merce Roque, John T. Fallon, Juan J. Badimon, Jacques Himber, Marcus A. Riederer, Yale Nemerson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - March 1999, Medical Sciences Vol. 96-P. 2311-2315

79. Pieters, J., Inhibition of factor IXa and factor Xa by antithrombin III/heparin during factor X activation / J. Pieters, G. Willems, H.C. Hemker, T. Lindhout // J Biol Chem. — 1988 Oct 25; 263(30)-P. 15313-8.

80. Rao, L.V., Studies of the activation of factor VII bound to tissue factor / L.V. Rao, T. Williams, S.I. Rapaport // Blood - 1996 May 1; 87(9) - P. 373848.

81. Rao, L.V., Factor Vila/tissue factor-catalyzed activation of factors IX and X on a cell surface and in suspension: a kinetic study / L.V. Rao, T. Robinson, A.D. Hoang // Thromb Haemost. — 1992 Jun 1; 67(6) - P. 654-9.

82. Ragni, M.V., Comparison of bleeding tendency, factor XI coagulant activity, and factor XI antigen in 25 factor Xl-deficient kindreds / M.V. Ragni, D. Sinha, F.Seaman, J.H. Lewis, J.A. Spero, P.N. Walsh // Blood. — 1985 Mar; 65(3)-P. 719-24.

83. Ryan, E.A., Structural origins of fibrin clot rheology / E.A. Ryan, L.F. Mockros, J.W. Weisel, L. Lorand // Biophys Journal - 1999 Nov; 77(5) -P. 2813-26.

84. Rand, M.D., Blood clotting in minimally altered whole blood / M.D. Rand, J.B. Lock, C. van't Veer, D.P. Gaffney, K.G. Mann // Blood - 1996 Nov 1; 88(9) -P. 3432-45.

85. Rosner, F., Hemophilia in the Talmud and rabbinic writings / F. Rosner // Ann Intern Med. — 1969 Apr; 70(4) — P. 833-7.

86. Seligsohn, U., Factor XI deficiency / U. Seligsohn // Thromb Haemost. — 1993 Jul 1; 70(1)-P. 68-71.

87. Shibeko, Alexey M, Blood flow controls coagulation onset via the positive feedback of factor VII activation by factor Xa / Alexey M Shibeko, Ekaterina S Lobanova, Mikhail A Panteleev, Fazoil I Ataullakhanov.// BMC Syst Biol. — 2010; 4-P. 5.

88. Simpson, A.J., Distribution of plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in tissues / A.J. Simpson, N.A. Booth, N.R. Moore, B. Bennett // J Clin Pathol. — 1991 Feb; 44(2)-P. 139-43.

89. Soucie, J.M., Occurrence of hemophilia in the United States. The Hemophilia Surveillance System Project Investigators / J.M. Soucie, B. Evatt, D. Jackson // Am J Hematol. — 1998 Dec; 59(4) - P. 288-94.

90. Stockmans, F., Technique to Investigate Mural Thrombus Formation in Small Arteries and Veins: Comparitive Morphometric and Histological Analysis / F. Stockmans, J.M. Stassen, J. Vermylen, M.F. Hoylaerts, A.A. Nystrom // Ann Plast Surg - 1997; 38 - P. 56-62.

91. Ursula, Rauch, Tissue Factor, the Blood, and the Arterial Wall / Ursula Rauch, Yale Nemerson // TCM - 2000, volume 10, no. 4.

92. Van Dieijen, G., The role of phospholipid and factor Villa in the activation of bovine factor X. / G. Van Dieijen, G. Tans, J.Rosing, H.C. Hemker // J Biol Chem. - 1981 April 10; 256(7)-P. 3433-42.

93. Van't Veer, C., Regulation of tissue factor initiated thrombin generation by the stoichiometric inhibitors tissue factor pathway inhibitor, antithrombin-III, and heparin cofactor-II / C. Van't Veer, K.G. Mann // J Biol Chem. - 1997 Feb 14; 272(7)-P. 4367-77.

94. Van 't Veer, C., Inhibitory mechanism of the protein C pathway on tissue factor-induced thrombin generation. Synergistic effect in combination with tissue factor pathway inhibitor / C. Van't Veer, , N.J. Golden, M. Kalafatis, K.G. Mann // J Biol Chem. - 1997 Mar 21; 272(12) - P. 7983-94.

95. van't Veer C., Inhibition of thrombin generation by the zymogen factor VII: implications for the treatment of hemophilia A by factor Vila / N.J. Golden, K.G. Mann // Blood. — 2000 Feb 15; 95(4) - P. 1330-5.

96. von dem Borne, P.A., Feedback activation of factor XI by thrombin in plasma results in additional formation of thrombin that protects fibrin clots from fibrinolysis / P.A. von dem Borne, J.C. Meijers, B.N. Bouma // Blood. —1995 Oct 15; 86(8)-P. 3035-42.

97. Viji, Balasubramanian, Platelets, circulating tissue factor, and fibrin colocalize in ex vivo thrombi: real-time fluorescence images of thrombus formation and propagation under defined flow conditions / Viji Balasubramanian, Eric Grabowski, Alessandra Bini, Yale Nemerson // The American Society of Hematology - 2002.

99. Viji, Balasubramanian, Platelets, circulating tissue factor, and fibrin colocalize in ex vivo thrombi: real-time fluorescence images of thrombus formation and propagation under defined flow conditions / Viji Balasubramanian, Eric Grabowski, Alessandra Bini, Yale Nemerson // The American Society of Hematology - 2002.

100. Vroman, L., The importance of surfaces in contact phase reactions / L. Vroman // Semin Thrombosis and Hemostasis - 1987 Jan; 13(1) - P. 79-85.

101. Weisel, J.W., Twisting of fibrin fibers limits their radial growth / J.W. Weisel, C. Nagaswami, L. Makowski // Proc National Academy of Science USA - 1987 Dec; 84(24)-P. 8991-5.

102. Wildgoose, P., Measurement of basal levels of factor Vila in hemophilia A and B patients / P. Wildgoose, Y. Nemerson, L.L. Hansen, F.E. Nielsen, S. Glazer, U. Hedner // Blood, 1992 Jul 1; 80(1) - P. 25-8.

103. Wing, L.R., Clearance of t-PA, PAI-1, and t-PA-PAI-1 complex in an isolated perfused rat liver system / L.R. Wing, G.M. Hawksworth, B. Bennett, N.A. Booth // J Lab Clin Med. — 1991 Feb; 117(2) - P. 109-14.

104. White, G.C. 2nd, Definitions in hemophilia. Recommendation of the scientific subcommittee on factor VIII and factor IX of the scientific and standardization committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis / G.C. White 2nd, F. Rosendaal, L.M. Aledort, J.M. Lusher, C. Rothschild, J. Ingerslev // Thromb Haemost. — 2001 Mar; 85(3) - P. 560.

105. World Federation of Hemophilia, Annual report, 2010, P. 1-12.

106. Zarnitsina, V.I., A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. I. The model description / V.I. Zarnitsina, A.V.Pokhilko, F.I. Ataullakhanov // Thromb Results. - 1996 Nov 15; 84(4)-P. 225-36.

107. Zwaal, R.F., Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells / R.F. Zwaal, A.J. Schroit // Blood - 1997 Feb 15; 89(4)-P. 1121-32.