Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Парунов, Леонид Александрович

• Парунов, Леонид Александрович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Парунов, Леонид Александрович

Оглавление

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Общие представления о гемостазе человека

2.1.1 Механизмы гемостаза (триада гемостаза)

2.1.2 Плазменное звено свертывания крови

2.1.2.1 Формирование фибринового сгустка

2.1.2.2 Каскад свертывания

2.1.2.3 Два пути активации каскада свертывания

2.1.2.4 Кофакторы и мембран зависимые реакции

2.1.2.5 Ингибирование свертывания

2.2 Внешний путь активации свертывания и его регуляция

2.2.1 Компоненты внешнего пути свертывания

2.2.1.1 ТФ - активатор внешнего пути свертывания

2.2.1.2 Фактор VII

2.2.1.3 TFPI - ингибитор внешнего пути свертывания

2.2.1.3.1 Структура и изоформы TFPI

2.2.1.3.2 Распределение TFPI в системе кровообращения

2.2.1.3.3 TFPI в плазме

2.2.1.3.4 TFPI в тромбоцитах

2.2.2 Регуляция внешнего пути свертывания

2.2.2.1 Механизмы активации свертывания

2.2.2.2 Ингибирование фактора Ха посредством TFPI

2.2.2.3 Ингибирование комплекса \/11а:ТФ посредством TFPI

2.2.2.4 Представления о роли TFPI в гемостазе в организме

2.2.2.5 Роль TFPI в заболеваниях

2.3 Нарушения плазменного гемостаза при гемофилии

2.3.1 Общие сведения о гемофилиях А и Б

2.3.2 Терапия гемофилии А и Б

2.3.2.1 Заместительная терапия

2.3.2.2 Другие способы лечения гемофилии

2.3.2.3 Идея генной терапии гемофилии

2.3.2.4 Идея ингибирования TFPI

2.4 Влияние ингибиторов TFPI на свертывание. Последние данные

2.4.1 Данные исследований с использованием аптамера ВАХ499

2.4.1.1 Фармакокинетические исследования с ВАХ499 и специфичность аптамера

2.4.1.2 Влияние ВАХ499 в тесте генерации тромбина (ТГТ)

2.4.1.3 Влияние ВАХ499 на показания тромбоэластографии (ТЭГ) и тромбоэластометрии (ТЕМ)

2.4.1.4 Изменчивость реакции на ВАХ499

2.4.1.5 Результаты клинических испытаний ВАХ499

2.4.2 Влияние других ингибиторов TFPI на свертывание

2.5 Экспериментальные модели свертывания крови

2.5.1 Модели свертывания in vivo, ex vivo и in vitro

2.5.2 Принципиальные подходы к регистрации свертывания

2.5.3 Пространственно-однородные модели

2.5.4 Пространственно-неоднородные модели

2.5.5 Типы математических моделей. Достоинства и недостатки

2.5.6 Феноменологические модели

2.5.7 Количественные детальные модели

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Приобретенные материалы

3.2 Приготовление активаторов свертывания

3.2.1 Иммобилизация тромбопластина на полистироловую поверхность

3.2.2 Определение плотности иммобилизованного тканевого фактора

3.3 Подготовка образцов плазмы крови

3.3.1 Протокол приготовления свежей плазмы крови

3.3.2 Протокол приготовления лиофилизированной плазмы с дефицитом TFPI

3.3.3 Протокол приготовления замороженной плазмы больных гемофилией А

3.3.4 Стабилизация рН плазмы

3.3.5 Ингибирование контактной активации

3.3.6 Подбор пациентов для исследования взаимодействия лекарственных препаратов

3.3.7 Протокол исследования взаимодействия лекарственных препаратов

3.4 Методы исследования свертывания плазмы крови

3.4.1 Стандартные тесты: АЧТВ и определение уровня фактора VIII

3.4.2 Рост сгустка в пространстве (Тромбодинамика)

3.5 Схема и устройство прибора Тромбоимаджер

3.5.1 Конструкция кюветы

3.5.2 Схема и принцип работы прибора Тромбоимаджер

3.5.3 Получение изображений

3.5.4 Обработка экспериментальных кадров

3.6 Статистическая обработка результатов

3.7 Математическая модель свертывания

4 РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Планирование эксперимента

4.1.1 Выбор реактивов

4.1.2 Описание параметров, характеризующих пространственный роста сгустка

4.1.3 Предварительная оценка влияния TFPI: компьютерное моделирование

4.2 Ингибирование TFPI в плазме здоровых доноров: эксперименты in vitro

4.2.1 Влияние плотности ТФ на эффект от ингибирования TFPI

4.3 Влияние ВАХ499 на свертывание в плазме с дефицитом TFPI

4.3.1 Ингибирование TFPI в плазме здоровых доноров

4.3.1.1 Дозозависимости при активации низкой плотностью тканевого фактора

4.3.1.2 Эффект ВАХ499 при активации средней плотностью тканевого фактора

4.4 Изучение эффектов от ингибирования TFPI в плазме больных гемофилией А

4.4.1 Характеристика исследуемых больных гемофилией А

4.4.2 Ингибирование TFPI в плазме больных гемофилией А

4.4.2.1 Статистическое сравнение эффективности ВАХ499 и Novoseven в ускорении

свертывания плазмы больных гемофилией А

4.5 Совместное влияние TFPI и фУШ на пространственное свертывание плазмы крови

4.5.1 Исследование взаимодействия ВАХ499 и концентратов фактора VIII (компьютерное моделирование)

4.5.2 Исследование взаимодействия ВАХ499 и концентратов фактора VIII (эксперимент)

4.6 Ингибирование TFPI в плазме с дефицитом ф1Х (компьютерное моделирование)

5 ОБСУЖДЕНИЕ

5.1 Границы действия TFPI

5.2 Снижение плотности фибринового сгустка из-за TFPI

5.3 Порог по активации и TFPI

5.4 Эффективность ингибирования TFPI в гемофилии и норме

5.5 Фактор VIII и ингибитор TFPI. Совместное действие и его механизм

5.6 Клиническое значение

5.7 Исключение. Второй тип больных гемофилией А

5.8 Другие формы гемофилии и ингибиторы TFPI

5.9 Сравнение эффектов от rVIIa и ингибирования TFPI

5.10 Недостатки экспериментальной модели

5.11 Экспериментальные ошибки

5.12 Согласие эффективных концентраций ВАХ499 с другими работами

5.13 Специфичность ВАХ499

5.14 ВАХ499 как лекарство и инструмент исследования роли TFPI

6 ВЫВОДЫ

7 БЛАГОДАРНОСТИ

8 ПРИЛОЖЕНИЯ

8.1 Контрольные эксперименты

9 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка»

1 Введение

Задачей системы гемостаза у человека является предотвращение потери крови при нарушении целостности кровеносной системы. Плазменное звено свертывания -одна из важных составляющих этой системы, задачей которого является формирование геля в месте повреждения для предотвращения просачивания жидкости. В свертывании плазмы крови участвует более 30 белков, которые взаимодействуют друг с другом, образуя огромную сеть биохимических реакций. Такая сложная система требует соответствующей регуляции. Это приводит к тому, что даже небольшие нарушения в деликатном балансе про- и антикоагулянтных реакций могут приводить к тяжелым последствиям для организма: тромбозам и кровотечениям.

Одним из важных регуляторных белков в системе свертывания является ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). Он функционирует на стадии активации свертывания крови. На данный момент не известны случаи дефицита TFPI у людей. Кроме того, известно, что гомозиготные по отношению к дефициту TFPI мыши погибают внутриутробно, а люди со сниженным уровнем TFPI имеют повышенную склонность к тромбозам. Это говорит о критически важной роли TFPI в организме.

Относительно недавно была высказана новая идея, как улучшить свертывание в гемофилии: инактивировать ингибитор, регулирующий запуск реакций свертывания крови (TFPI). В последнее время появились работы, посвященные разработке ингибиторов к TFPI и их тестированию. В общем, данные подтверждают их положительный эффект на гемостаз в случае гипокоагуляции. Однако эксперименты in vivo описывают слишком общие эффекты TFPI на свертывание и не способны четко выделить закономерности процессов в связи со многими неопределенностями экспериментальных условий. Все исследования in vitro проводились в гомогенных экспериментах, которые принимают во внимание активности белков свертывания, но не учитывают процессы диффузии. Однако in vivo свертывание активируется на поверхности с тканевым фактором (ТФ), а пространственный рост сгустка происходит во многом за счет диффузии активных факторов. Как было ранее показано, в таких условиях роль некоторых белков в гемостазе может поменяться. Таким образом, пока нет данных о роли TFPI в пространственной динамике свертывания. Не ясно подавляет ли TFPI пространственный рост сгустка и способно ли ингибирование TFPI его улучшить. В свете активного развития идеи ингибирования TFPI у больных гемофилиями полезно было бы знать последствия такой терапии. Для этого требуется понимать механизм, степень

влияния TFPI и условия, при которых ингибиторы TFPI будут оказывать положительное действие на пространственный рост сгустка. На сегодняшний день этот аспект остается не изученным. Кроме того, не известно, как будут взаимодействовать лекарственные препараты ингибиторов TFPI и концентрата фактора VIII при одновременном назначении больному гемофилией А.

Для того чтобы разобраться в этих вопросах в данной работе использовали пространственно-неоднородную экспериментальную модель свертывания (тест Тромбодинамики). Ее ключевая особенность состоит в том, что свертывание плазмы крови запускается поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором (ТФ) и затем распространяется в объем плазмы. Наблюдение за ростом фибринового сгустка производили оптически по светорассеянию методом темного поля. Эта экспериментальная модель имитирует свертывание in vivo, так как учитывает и биохимические реакции системы гемостаза, и процессы диффузии. Ранее данная экспериментальная модель использовалась в работах по изучению нарушений свертывания в гемофилиях А и Б [1-3] и при других дефицитах факторов свертывания [4,5]. Более того, метод показал чувствительность к прокоагулянтным изменениям в плазме, при добавлении тромбоцитарных микровезикул [6] и рекомбинантного активированного фактора VII (rVlla) [7].

Для выбора условий эксперимента, предсказания поведения системы гемостаза и выяснения механизмов влияния TFPI на пространственный рост сгустка в данной работе было проведено математическое моделирование.

Цель работы: Исследовать роль TFPI в пространственном формировании фибринового сгустка в норме и при гемофилии А.

Задачи исследования:

1. Определить диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при которых пространственное свертывание в свободной от тромбоцитов плазме оказывается чувствительным к изменениям концентраций TFPI.

2. В плазме здоровых доноров и больных гемофилией А определить параметры пространственного роста сгустка, на которые оказывает влияние TFPI. Сравнить эффективность усиления внешнего пути свертывания при ингибировании TFPI в плазме нормальных доноров и больных гемофилией А.

i'»

t>

iyv"'' <v. i/и . Ч' » \ , « *,\«t' uvf . V «ч;H' 7 Щ

3. Сравнить действие ингибитора TFPI и рекомбинантного фактора Vila (rVlla) на пространственное формирование сгустка в плазме больных гемофилией А.

4. В математической модели и экспериментах ex vivo исследовать лекарственное взаимодействие концентратов фактора VIII и ингибитора TFPI на пространственное свертывание.

Научная новизна. Впервые влияние TFPI исследовалось в пространственно-неоднородной системе in vitro. Определен диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при котором влияние TFPI на пространственное свертывание оказывается существенным. Определены ключевые параметры пространственного роста, на которые оказывает действие TFPI. Впервые показано, что инактивация TFPI способна улучшить пространственный рост сгустка, сокращая время задержки свертывания и увеличивая скорость его пространственного роста. Показано, что влияние TFPI ограничено тонким приактиваторным слоем в 100-200 мкм, или 10 минутами после начала роста сгустка. Влияние TFPI на пространственную скорость роста вдали от активатора не значительно. Показано, что усиление внешнего пути свертывания через ингибирование TFPI и добавление rVlla оказывают качественно и количественно разные эффекты на пространственный рост фибринового сгустка. Стимуляция гемостаза фактором rVlla приводит к дозозависимому ускорению пространственного роста сгустка на всех расстояниях от активатора, а при концентрациях выше 10 нМ к свертыванию во всем объеме экспериментальной кюветы, в то время как инактивация TFPI ускоряет начальную фазу роста сгустка только вблизи активатора, и это действие обладает эффектом насыщения. Впервые дано предсказание взаимодействия лекарственных препаратов, ингибирующих действие TFPI, и концентратов фактора VIII: увеличение концентрации фактора VIII в крови снижает относительный эффект антагониста TFPI на размер сгустка.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о роли и вкладе TFPI в пространственное свертывание плазмы крови могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых лекарственных препаратов для пациентов больных гемофилией А или другими коагулопатиями. Предсказания относительно взаимодействий препаратов, ингибирующих TFPI, и концентратов фактора VIII могут быть полезными при планировании терапии у больных гемофилией А.

Положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что пространственное свертывание плазмы крови чувствительно к изменениям концентрации ТРР1 в условиях активации системы гемостаза ТФ с низкой плотностью распределения (1-4 пмоль/м2).

2. Показано, что при активации свертывания ТФ с низкой плотностью ТЯР1 влияет на пространственный рост сгустка, главным образом, сокращая время задержки свертывания и увеличивая начальную скорость роста сгустка. Область ускорения формирования сгустка ограничивается тонким слоем вблизи активатора.

3. Показано, что ингибирование ТРР1 способно улучшить пространственное свертывание в плазме больных гемофилией А.

4. Показано, что г\/11а и антагонисты ТРР1 оказывают качественно разные эффекты на свертывание плазмы крови.

2 Обзор литературы 2.1 Общие представления о гемостазе человека

2.1.1 Механизмы гемостаза (триада гемостаза)

Эволюционное развитие организмов привело к усложнению их строения и к

усложнению функционирования разных органов и систем. Затронуло это и систему гемостаза: замкнутая система кровообращения, сильные потоки, высокое давление и сложный клеточный состав крови требовали механизмов для быстрой и надежной остановки кровотечения. Однако не любое формирование тромба подойдет для такой системы кровообращения: полное перекрытие сосудов может быть опасным для жизни. Все описанные сложности привели к тому, что система гемостаза человека одновременно использует три разных механизма для предотвращения кровопотери:

1. вазоконстрикцию - сужение поврежденного сосуда для снижения объема крови, проходящей через него (сосудистый гемостаз);

2. тромбоцитарный гемостаз, при котором тромбоциты, активируясь и агрегируя в месте повреждения, образуют пломбу, препятствующую вытеканию других клеток крови, но проницаемую для жидкости;

3. плазменный гемостаз, в результате работы которого в месте повреждения образуется гель, полностью предотвращающий вытекание жидкости [8-10].

Механизмы гемостаза часто группируются в две категории: первичный (сосудисто-тромбоцитарный) и вторичный (плазменный) [11]. Первичный гемостаз реагирует на повреждение в первые 1-3 минуты, в то время как плазменная система свертывания завершает герметизацию сосуда за 10 минут. Таким образом, первичный гемостаз быстро снижает кровопотерю, а плазменный гемостаз формирует фибриновый сгусток и окончательно герметизирует место повреждения и упрочняет тромб.

Описанные механизмы не разделимы и работают одновременно, однако, в зависимости от места повреждения, может преобладать тот или иной способ остановки кровопотери. В маленьких и некритически важных сосудах кровотечение может быть перекрыто вазоконстрикцией. Большие сосуды не перекрываются. В артериях, при быстром потоке крови, фибриновый сгусток формируется с трудом, однако, приносимые потоком тромбоциты хорошо формируют тромбоцитарный агрегат, так называемый белый тромб [10,11], который затем прорастает фибриновой сеткой [8]. В сосудах с медленным течением крови формируются сгустки, состоящие преимущественно из

фибриновой сети и запутавшихся в ней эритроцитов, такие тромбы называются красными [12,13].

Не смотря на то, что механизмы разделяют, они тесно переплетены друг с другом. При активации тромбоциты выбрасывают в кровоток белки плазменной системы свертывания, тем самым усиливая и ускоряя ее работу. Помимо этого, на мембране активированных тромбоцитов собираются ферментативные комплексы из плазменных белков, что тоже ускоряет формирование фибринового геля [14,15]. Одновременно с этим белок плазменного звена системы гемостаза тромбин активирует тромбоциты [16]. Стенки сосудов так же играют важную роль в гемостазе [15,17]. Стенками сосуда выделяются и/или синтезируются множество биологически активных веществ, которые тоже способны влиять на рост тромба. К ним относится ингибитор пути тканевого фактора (ТРР1), фактор Виллебранда, оксид азота (N0), простациклин, тромбомодулин, эндотелии, тканевый фактор (ТФ). В норме стенки сосуда покрыты эндотелием, который обладает антикоагулянтной активностью, что, вероятно, обуславливает рост тромба только в месте повреждения сосуда [8,18,19]. В дальнейшем речь пойдет лишь о плазменном звене свертывания.

2.1.2 Плазменное звено свертывания крови 2.1.2.1 Формирование фибринового сгустка Плазменное звено системы гемостаза представляет собой множество белков, формирующих каскад ферментативных реакций [8,19] (Рис. 1). Работа всей этой сети биохимических реакций нацелена только на один результат: образование из растворимого белка фибриногена мономерного фибрина. Далее, полимеризуясь, фибрин образует волокна, которые упрочняются и образуют сеть фибриновых волокон, закрывающих место повреждения сосудистой стенки.

\ г/

(\Л1а) фермент | V» | кофактор ( Х1а1 ингибирование

зимоген [ V | прокофактор ©-активация

Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Ферментативный катализ и превращения под его действием показаны красными и черными стрелками соответственно. Ингибирование показано короткими пустыми стрелками. Условные обозначения: ТФ - тканевый фактор, римскими цифрами обозначены соответствующие факторы свертывания, РС - протеин С, Fg - фибриноген, Рп - фибрин. Два находящихся рядом обозначения факторов свертывания -комплекс, образованный этими факторами (например, ХаУа). Рисунок воспроизведен из |20|.

Фибриноген - это гликопротеин весом 340 кДа. Фибриноген имеет вытянутую форму длиной 450 А и состоит из трех пар полипептидов, обозначаемых как Аа, В(3 и у цепи (Рис. 2). Полипептиды располагаются симметрично относительно центра молекулы.

У клубок

г

У карман

домен — Э —

домен — Е —

Рклубок

.0 с.*' ^ЗД* ^ Р карман

домен — О —

7 карман

/карман

Рис. 2. Схематическое устройство молекулы фибриногена. Аа, Вр и у цепи обозначены синим, зеленым и красным цветом соответственно. р и у клубки содержат карманы комплементарные к областям в Е-домене, которые обнажаются после отщепления РрА и РрВ (не показаны). Рисунок адаптирован из |22|

Полипептиды образуют на концах молекулы глобулярные Э-домены, в которых ВЗ и у цепи формируют 3 и у «клубки». В каждом из двух Р-доменов есть два, так называемых, «кармана» Р и у. Центральная часть молекулы фибриногена называется Е-

доменом и представляет из себя клубок, содержащий 1Ч-концы всех шести полипептидов [21].

Молекула фибриногена симметрична, и имеет две Аа и две ВЗ цепи. Тромбин отрезает в центральном Е домене от каждой Аа и вр цепи по фибринопептиду А (РрА) и В (РрВ) соответственно. После отрезания РрА открывшийся новый участок фибриногена способен связываться с карманом у цепи соседней молекулы (в районе Р-домена). Отрезание РрВ приводит к тому, что обнажившийся участок может входить в карман 3 цепи в О-домене [23]. Итого тромбин отрезает от фибриногена 2 РрА и 2 РрВ пептида. Молекулы фибрина связываются друг с другом «внахлест»: одна половина Е-димера связывается с двумя карманами аир другой молекулы фибрина, а другая половина Е-димера - с двумя карманами третьей молекулы. Таким образом, образуются длинные цепочки - протофибриллы. Упрощенная схема образования протофибрилл показана на Рис. 3.

фибриноген

тромбин

С2)—^Ё^—(¿р) фибрин-мономер

фибринопептиды V *

£

полимеризация

чСГ,

протофибрилла

Рис. 3. Упрошенная схема формирования протофибрилл фибрина. Рисунок адаптирован из (22).

Далее протофибриллы способны слипаться друг с другом. В этом участвует еще один белок, фактор ХШа, который формирует перекрестные сшивки между протофибриллами. Это завершает образование полимеризованного нерастворимого фибрина [24,25]. Фактор XIII называют еще фибрин-стабилизирующим фактором, потому что он повышает прочность сгустка и его устойчивость к системе фибринолиза, которая призвана разрушать сгусток спустя некоторое время после его образования. Склеивающиеся протофибриллы образуют ветвящуюся и растущую в толщину сеть фибриновых волокон (Рис. 4).

В данном литературном обзоре представлена только упрощенная картина формирования фибриновой сети. В реальности отщепление четырех фибринопептидов

от молекулы фибриногена происходит не одновременно, а последовательно, с образованием промежуточных форм фибрина [23,26]. Кроме того, аС домены фибриногена, тоже принимают участие в полимеризации фибрина и оказываются важны для механических свойств и стабильности сгустка [27]. Однако эти подробности сильно выходят за рамки данного обзора.

Рис. 4. Фибрииовая сеть. Рисунок воспроизведен из [28].

Как уже говорилось выше, тромбоцитарный агрегат в месте повреждения формируется раньше фибринового сгустка, поэтому фибриновая сеть прорастает внутри уже сформировавшегося тромбоцитарного агрегата. Таким образом, фибриновый сгусток превращает жидкую плазму между тромбоцитами в гель, предотвращая просачивание жидкости и способствуя укреплению тромба [29].

2.1.2.2 Каскад свертывания

Плазменное звено свертывания включает в себя множество химических реакций (Рис. 1). Однако превращение фибриногена в фибрин - единственная реакция в каскаде свертывания, которая приводит к изменению физического состояния плазмы крови. Все остальные реакции имеют исключительно регуляторное значение, обеспечивая формирование сгустка только при повреждении стенок сосуда и контролируя его рост строго в месте этого повреждения.

Основные белки системы свертывания называются факторами свертывания и нумеруются римскими цифрами в историческом порядке их открытия (Табл. 1). Часть из них имеют собственные имена, например фактор I, который имеет более употребляемое название - фибриноген.

Как уже говорилось, превращение фибриногена (фактор I) в фибрин происходит под действием тромбина. Тромбин принадлежит к классу сериновых протеиназ -ферментов, способных расщеплять пептидные связи в белках (протеолиз). Сериновые протеиназы, в том числе и тромбин, синтезируются в организме в неактивном виде. В этой форме они свернуты так, что их активные сайты недоступны для других белков. В неактивном состоянии такой белок может циркулировать в клетке или крови, не

приводя ни к каким последствиям. Для его активации, требуется расщепить пептидную связь, удерживающую часть белка, которая блокирует его активный сайт. Принято добавлять к номеру фактора приставку "а", чтобы показать, что тот находится в активной форме. Так неактивным предшественником тромбина является белок протромбин (фактор II). Чтобы он превратился в тромбин (фактор На) требуется другая активная сериновая протеиназа (фактор Ха), которая расщепит пептидную связь и, которая, в свою очередь, тоже в норме циркулирует в крови в неактивном виде (фактор X). Активация же фактора X происходит под действием следующей активной сериновой протеиназы -фактора 1Ха. А фактор IX активируется фактором Х1а. А фактор XI, в свою очередь, активируется тромбином, замыкая последовательные ферментативные реакции и образуя положительную обратную связь. Вся система следующих друг за другом взаимодействий показана на Рис. 1. Таким образом, продукт каждой ферментативной

реакции ускоряет последующую реакцию [17,19,35].

Фактор или международное название Содержание в плазме 4 Основная функция после

нМ м кг/мл активации

1 (фибриноген) 8800 3000 Структурный белок, образует фибриновую сеть - сгусток

II (протромбин) 1400-2000 100 Расщепление фибриногена, активация факторов VII, V, VIII, XI, протеина С и тромбоцитов

V 20 10 Кофактор активации фактора II

VII21 10 0,5 Активация факторов X и IX

VIII 0,7 0,1-0,2 Кофактор активации фактора X

IX 90 5 Активация фактора X

X 170 10 Активация протромбина

XI 30 5 Активация фактора IX

XII 375 30 Активация фактора XI

ПК (прекалликреин) 450 Активация фактора XII

вмк (высокомолекулярный кининоген) 6000 Кофактор активации фактора XII

ТФ (тромбопластин, тканевый фактор) _3> - Кофактор активации факторов X и IX

XIII 70 19 Формирование перекрестных сшивок между нитями фибрина

Табл. 1. Факторы свертывания крови.

Таблица составлена с использованием материалов [17,30-32].

1) Концентрации факторов даны приблизительно: в норме наблюдаются вариации (от -50/+100% для фУШ до ±20% для большинства других факторов). Кроме того, существует разброс в данных разных авторов, вызванный разными подходами к оценке концентраций белков свертывания.

2) В крови помимо фУИ циркулируют следовые количества активированной формы фактора (0,10,01%) [17,31,33].

3) Современные данные показывают, что ТФ может находиться в крови: в составе лимфоцитов и, возможно, тромбоцитов; всего - не более 0,2 пМ [34].

Перечисленные протеиназы составляют каркас каскада, однако помимо них существует много других факторов. Фактором IV были названы ионы кальция (Са2+), необходимые для взаимодействия белков системы гемостаза с фосфолипидными поверхностями, на которых происходит сборка фактор-кофакторных комплексов. Фактор V является кофактором фактора X. Связываясь друг с другом в своих активированных формах, они образуют комплекс, называемый протромбиназой. Комплекс Xa:Va способен осуществлять протеолиз протромбина. Фактор VII самопроизвольно медленно распадается с образованием своей активной формы - фактора Vila. ф\/11а способен образовывать комплекс со своим кофактором - тканевым фактором (ТФ). Комплекс VllarTO называется внешней теназой и способен активировать фактор X. Фактор VIII является кофактором фактора 1Ха. В своей активной форме он образует комплекс с фактором 1Ха, называемый внутренней теназой и активирующий фактор X. Фактор XI может активироваться фактором XII, который, в свою очередь, активируется инородной заряженной поверхностью и является началом внутреннего пути свертывания. Фактор XIII - трансглутаминаза, стабилизирует растворимые полимерные волокна фибрина и превращая его в нерастворимую форму фибрина. Дополнительно надо отметить, что активность тромбина (фактора IIa) распространяется не только на фибриноген, но и на факторы свертывания V, VIII и XI.

Кроме уже перечисленных белков, в системе гемостаза работают и другие вещества, которые не называют факторами. К ним относятся белки внутреннего пути активации (прекалликреин и высокомолекулярный кининоген) и ингибиторы свертывания (антитромбин III, протеин С, протеин S, гепарин, тромбомодулин, ингибитор пути тканевого фактора).

2.1.2.3 Два пути активации каскада свертывания

Так как все сериновые протеиназы, составляющие остов каскада свертывания, в норме циркулируют в крови в форме предшественников, для инициации свертывания требуется внешний сигнал, который бы их активировал. Исторически выделяют два пути активации плазменного гемостаза: внешний и внутренний пути свертывания.

Основными компонентами внешнего пути свертывания являются два белка -фактор Vila и тканевый фактор (ТФ). Фактор Vila, постоянно присутствует в плазме крови в очень малых количествах и имеет по отношению к фактору X слабую активность, которая в норме не приводит к инициации свертывания из-за быстрого подавления

плазменными ингибиторами. Белок ТФ - это трансмембранный гликопротеин, экспрессирующийся всеми клетками организма, за исключением клеток, напрямую контактирующих с кровью (клетки крови и эндотелия). Таким образом, в норме ТФ изолирован от крови. Повреждение эндотелия приводит к тому, что кровь вступает в контакт с клетками, имеющими на своей поверхности этот белок. Связываясь с ТФ, фактор Vila начинает активировать факторы IX и X с гораздо большей скоростью. Эти события и запускают процесс свертывания по внешнему пути. Более подробно функционирование и регуляция этого пути описаны ниже.

Второй путь активации называют внутренним. Активация через внутренний путь наблюдается в экспериментах in vitro, в которых свертывание активируется инородной поверхностью (часто стеклом) [35,36]. Этот путь активации еще называют контактным. Данный путь свертывания не показан на Рис. 1. Составляющими внутреннего контактного пути являются фактор XII, калликреин и высокомолекулярный кининоген (ВМК). Контакт фактора XII с отрицательно-заряженной поверхностью приводит к конформационным изменениям белка, после этого он начинает активировать сам себя до ХНа [37]. Далее включаются в работу петли положительных обратных связей и это еще усиливает производство фактора ХПа. В результате, образуется большое количество фактора ХМа, который активирует фактор XI. Появление активного фактора XI приводит к активации всего каскада свертывания. Последовательно вниз по схеме на Рис. 1 активируются ф1Х, фХ и протромбин. В организме человека, по-видимому, внутренний путь активации не играет существенной роли, потому что люди с дефицитом фХМ не испытывают проблем со свертыванием [38,39]. Описанный путь активации называют внутренним, так как для его него не требуется дополнительных компонентов, кроме тех, что уже присутствуют в крови.

2.1.2.4 Кофакторы и мембран зависимые реакции

Описанный метод производства тромбина приводил бы к крайне медленному формированию фибринового сгустка, так как активности фХа и ф1Ха сами по себе достаточно низки. После связывания этих белков с их кофакторами ^Va и ф\/111а, соответственно) производство тромбина ускоряется в 105-107 раз [40-45]. Комплекс IXarVllla называют внутренней теназой, он превращает фХ в фХа, а комплекс Xa:Va -протромбиназой, он расщепляет протромбин до тромбина. Для сборки этих комплексов требуются ионы кальция и отрицательно заряженная фосфолипидная поверхность [46].

По всей видимости, в организме она предоставляется активированными тромбоцитами, макровезикулами и липопротеинами плазмы [6,14,47,48].

Кофакторы не являются ферментами, они находятся в крови в своих неактивных формах ф\/Ш и ф\/. Их активация происходит тромбином [41,45,49,50], поэтому пока тромбина нет, кофакторы остаются не активными. Таким образом, на первой стадии, после активации, свертывание происходит медленно. Образовавшиеся факторы 1Ха и Ха превращают небольшое количество протромбина в тромбин. Этот тромбин затем активирует кофакторы ф\/111 и ф\/, которые затем войдут в комплексы внутренней теназы и протромбиназы и ускорят образование тромбина. Посредством описанных реакций тромбин ускоряет скорость своего производства [51]. Таким образом, в системе свертывания реализуются положительные обратные связи: продукт реакции ускоряет собственное производство [52].

2.1.2.5 Ингибирование свертывания Каскад из факторов свертывания и внешний путь активации успешно бы справлялись с инициацией свертывания и поддержанием этого процесса, однако, в описанной системе даже одна молекула ТФ может активировать систему гемостаза и это в конечном итоге приведет к свертыванию всей плазмы в организме. Этой ситуации допускать нельзя, поэтому для предотвращения таких неконтролируемых последствий в крови присутствуют ингибиторы свертывания [18,32,53]. Они блокируют или расщепляют активные формы факторов. В случае незначительной и неопасной для организма (в смысле кровопотери) активации системы гемостаза, ингибиторы подавляют свертывание. При сильной активации свертывания система ингибиторов не справляется, и начинается ростфибринового сгустка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Парунов, Леонид Александрович, 2013 год

10 Список литературы

1. Ovanesov MV, Krasotkina JV, UPyanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov Fl. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim BiophysActa 2002; 1572: 45-57.

2. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov Fl. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

3. Negrier C, Dargaud Y, Bordet JC. Basic aspects of bypassing agents. Haemophilia 2006; 12 Suppl 6: 48-52.

4. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, Ataullakhanov Fl, Saenko EL. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3: 321-331.

5. Panteleev MA, Ovanesov MV, Kireev DA, Shibeko AM, Sinauridze El, Ananyeva NM, Butylin AA, Saenko EL, Ataullakhanov Fl. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein С pathways, respectively. BiophysJ 2006; 90: 1489-1500.

6. Sinauridze El, Kireev DA, Popenko NY, Pichugin AV, Panteleev MA, Krymskaya OV, Ataullakhanov Fl. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007; 97:425434.

7. Ovanesov MV, Panteleev MA, Sinauridze El, Kireev DA, Plyushch OP, Kopylov KG, Lopatina EG, Saenko EL, Ataullakhanov Fl. Mechanisms of action of recombinant activated factor VII in the context of tissue factor concentration and distribution. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19: 743-755.

8. Colman RW. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. Hirsh J., Marder V. J. Saltzman E. W. 2010. Philadelphia: Lippincott Company, 2010.

9. Schenone M, Furie ВС, Furie В. The blood coagulation cascade. Curr Opin Hematol 2004; 11: 272-277.

10. Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, Furie ВС, Furie В. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med 2002; 8:1175-1181.

11. Шмидт P. Физиология человека. T.2. Тевс Г. 1996. М.:Мир.

12. Beltrami Е, Jesty J. The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation. Math Biosci 2001; 172:1-13.

13. Lowe GD. Virchow's triad revisited: abnormal flow. Pathophysiol Haemost Thromb 2003; 33: 455-457.

),

л tl «

«if >'

11 m

Hi, H

H" •

ft

УМ

ii t

'До

•'ikWih'

h;t>t't

Ь 1) I tuii\ 4

>' (ГнГЛ/, н

' I (1 <t{ " ' 1

/Äv

t Щ ),

i 1

14. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost 2002; 88:186-193.

15. Kalafatis M, Swords NA, Rand MD, Mann KG. Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochim Biophys Acta 1994; 1227:113-129.

16. Solum NO. Procoagulant expression in platelets and defects leading to clinical disorders. Arterioscler Thromb Vase Biol 1999; 19: 2841-2846.

17. Балуда ВП. Физиология системы гемостаза. Балуда MB, Деянов ИИ, and Тлепшуков ИЛ. 2013. Москва.

18. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost 2001; 86: 959-972.

19. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67: 3-12.

20. Пантелеев M.A. Механизмы регуляции свертывания крови. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук. 2010.

21. Lim ВВ, Lee EH, Sotomayor М, Schulten К. Molecular basis of fibrin clot elasticity. Structure 2008; 16: 449-459.

22. Weisel JW. Fibrinogen and fibrin. Adv Protein Chem 2005; 70: 247-299.

23. Blomback B, Hessel B, Hogg D, Therkildsen L. A two-step fibrinogen-fibrin transition in blood coagulation. Nature 1978; 275: 501-505.

24. Blomback B. Fibrinogen and fibrin-proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res 1996; 83:1-75.

25. Brummel KE, Butenas S, Mann KG. An integrated study of fibrinogen during blood coagulation. J Biol Chem 1999; 274: 22862-22870.

26. Higgins DL, Lewis SD, Shafer JA. Steady state kinetic parameters for the thrombin-catalyzed conversion of human fibrinogen to fibrin. J Biol Chem 1983; 258: 9276-9282.

27. Weisel JW, Medved L. The structure and function of the alpha С domains of fibrinogen. Ann N YAcadSci 2001; 936: 312-327.

28. Collet JP, Moen JL, Veklich Yl, Gorkun OV, Lord ST, Montalescot G, Weisel JW. The alphaC domains of fibrinogen affect the structure of the fibrin clot, its physical properties, and its susceptibility to fibrinolysis. Blood 2005; 106: 3824-3830.

29. Furie B, Furie ВС. Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med 2008; 359: 938949.

30. Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови. 1978. Москва, Медицина.

31. Dahlback В. Blood coagulation. Lancet 2000; 355:1627-1632.

32. Mann KG. Biochemistry and physiology of blood coagulation. Thromb Haemost 1999; 82:165-174.

33.

34.

35.

36,

37,

38,

39,

40

41

42

43,

44

45

46

47

48

'¡W

Wildgoose P, Nemerson Y, Hansen LL, Nielsen FE, Glazer S, Hedner U. Measurement of basal levels of factor Vila in hemophilia A and B patients. Blood 1992; 80: 25-28.

Glover G, Mclntire LV, Brown CH, III, Natelson EA. Rheological properties of fibrin clots. Effects of fibrinogen concentration, Factor XIII deficiency, and Factor XIII inhibition. J Lab Clin Med 1975; 86: 644-656.

Colman RW, Schmaier AH. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90: 3819-3843.

Revak SD, Cochrane CG, Bouma BN, Griffin JH. Surface and fluid phase activities of two forms of activated Hageman factor produced during contact activation of plasma. J Exp Med 1978; 147: 719-729.

Samuel M, Pixley RA, Villanueva MA, Colman RW, Villanueva GB. Human factor XII (Hageman factor) autoactivation by dextran sulfate. Circular dichroism, fluorescence, and ultraviolet difference spectroscopic studies. J Biol Chem 1992; 267:19691-19697.

Lammle B, Wuillemin WA, Huber I, Krauskopf M, Zurcher C, Pflugshaupt R, Furlan M. Thromboembolism and bleeding tendency in congenital factor XII deficiency-a study on 74 subjects from 14 Swiss families. Thromb Haemost 1991; 65:117-121.

RATNOFF OD, COLOPY JE. A familial hemorrhagic trait associated with a deficiency of a clot-promoting fraction of plasma. J Clin Invest 1955; 34: 602-613.

Hill-Eubanks DC, Lollar P. von Willebrand factor is a cofactor for thrombin-catalyzed cleavage of the factor VIII light chain. J Biol Chem 1990; 265:17854-17858.

Monkovic DD, Tracy PB. Activation of human factor V by factor Xa and thrombin. Biochemistry 1990; 29:1118-1128.

van DG, Tans G, Rosing J, Hemker HC. The role of phospholipid and factor Villa in the activation of bovine factor X. J Biol Chem 1981; 256: 3433-3442.

Mann KG, Krishnaswamy S, Lawson JH. Surface-dependent hemostasis. Semin Hematol 1992; 29: 213-226.

Mann KG, Nesheim ME, Church WR, Haley P, Krishnaswamy S. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 1990; 76:1-16.

Nesheim ME, Mann KG. Thrombin-catalyzed activation of single chain bovine factor V. J Biol Chem 1979; 254:1326-1334.

Rosing J, Tans G, Govers-Riemslag JW, Zwaal RF, Hemker HC. The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex. J Biol Chem 1980; 255: 274-283.

Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation. J Biol Chem 1976; 251: 5233-5236.

Sims PJ, WiedmerT, Esmon CT, Weiss HJ, Shattil SJ. Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity. J Biol Chem 1989; 264:17049-17057.

49

50

51,

52,

53

54,

55

56

57

58,

59

60

61

62

63,

64,

$

(i'i< 1

Pieters J, Willems G, Hemker HC, Lindhout T. Inhibition of factor IXa and factor Xa by antithrombin lll/heparin during factor X activation. J Biol Chem 1988; 263:1531315318.

Rick ME, Hoyer LW. Thrombin activation of factor VIII: the effect of inhibitors. Br J Haematol 1977; 36: 585-597.

Brummel KE, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 2002; 100:148-152.

Beltrami E, Jesty J. Mathematical analysis of activation thresholds in enzyme-catalyzed positive feedbacks: application to the feedbacks of blood coagulation. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 8744-8748.

Шиффманн Фдж. Патофизиология крови. 2000. СПб, Бином.

Rosenberg RD, Damus PS. The purification and mechanism of action of human antithrombin-heparin cofactor. J Biol Chem 1973; 248: 6490-6505.

Buchanan MR, Boneu B, Ofosu F, Hirsh J. The relative importance of thrombin inhibition and factor Xa inhibition to the antithrombotic effects of heparin. Blood 1985; 65:198-201.

Ellis V, Scully M, MacGregor I, Kakkar V. Inhibition of human factor Xa by various plasma protease inhibitors. Biochim Biophys Acta 1982; 701: 24-31.

Ellis V, Scully MF, Kakkar W. Inhibition of prothrombinase complex by plasma proteinase inhibitors. Biochemistry 1984; 23: 5882-5887.

Kurachi K, Fujikawa K, Schmer G, Davie EW. Inhibition of bovine factor IXa and factor Xabeta by antithrombin III. Biochemistry 1976; 15: 373-377.

Scott CF, Colman RW. Factors influencing the acceleration of human factor Xla inactivation by antithrombin III. Blood 1989; 73:1873-1879.

Stead N, Kaplan AP, Rosenberg RD. Inhibition of activated factor XII by antithrombin-heparin cofactor.J Biol Chem 1976; 251: 6481-6488.

Highsmith RF, Rosenberg RD. The inhibition of human plasmin by human antithrombin-heparin cofactor. J Biol Chem 1974; 249: 4335-4338.

Maruyama K, Morishita E, Karato M, Kadono T, Sekiya A, Goto Y, Sato T, Nomoto H, Omi W, Tsuzura S, Imai H, Asakura H, Ohtake S, Nakao S. Antithrombin deficiency in three Japanese families: one novel and two reported point mutations in the antithrombin gene. Thromb Res 2013; 132: ell8-el23.

Kalafatis M, Rand MD, Mann KG. The mechanism of inactivation of human factor V and human factor Va by activated protein C. J Biol Chem 1994; 269: 31869-31880.

Nicolaes GA, Tans G, Thomassen MC, Hemker HC, Pabinger I, Varadi K, Schwarz HP, Rosing J. Peptide bond cleavages and loss of functional activity during inactivation of factor Va and factor VaR506Q by activated protein C. J Biol Chem 1995; 270:2115821166.

65. Esmon CT. Regulation of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2000; 1477: 349360.

66. Panteleev MA, Baiandina AN, Lipets EN, Ovanesov MV, Ataullakhanov Fl. Task-oriented modular decomposition of biological networks: trigger mechanism in blood coagulation. Biophys J 2010; 98:1751-1761.

67. Kirschfink M, Nürnberger W. CI inhibitor in anti-inflammatory therapy: from animal experiment to clinical application. Mol Immunol 1999; 36: 225-232.

68. Broze GJ, Jr., Leykam JE, Schwartz BD, Miletich JP. Purification of human brain tissue factor. J Biol Chem 1985; 260:10917-10920.

69. Osterud B, Tindall A, Brox JH, Olsen JO. Thromboplastin content in the vessel walls of different arteries and organs of rabbits. Thromb Res 1986; 42: 323-329.

70. Drake TA, Morrissey JH, Edgington TS. Selective cellular expression of tissue factor in human tissues. Implications for disorders of hemostasis and thrombosis. Am J Pathol 1989; 134:1087-1097.

71. Flossel C, Luther T, Muller M, Albrecht S, Kasper M. Immunohistochemical detection of tissue factor (TF) on paraffin sections of routinely fixed human tissue. Histochemistry 1994; 101:449-453.

72. Nemerson Y. Tissue factor and hemostasis. Blood 1988; 71:1-8.

73. Maynard JR, Dreyer BE, Stemerman MB, Pitlick FA. Tissue-factor coagulant activity of cultured human endothelial and smooth muscle cells and fibroblasts. Blood 1977; 50: 387-396.

74. Drake TA, Ruf W, Morrissey JH, Edgington TS. Functional tissue factor is entirely cell surface expressed on lipopolysaccharide-stimulated human blood monocytes and a constitutively tissue factor-producing neoplastic cell line. J Cell Biol 1989; 109: 389395.

75. Bach R, Rifkin DB. Expression of tissue factor procoagulant activity: regulation by cytosolic calcium. Proc Natl Acad Sei U S A 1990; 87: 6995-6999.

76. Ohkubo YZ, Morrissey JH, Tajkhorshid E. Dynamical view of membrane binding and complex formation of human factor Vila and tissue factor. J Thromb Haemost 2010; 8: 1044-1053.

77. Krishnaswamy S, Field KA, Edgington TS, Morrissey JH, Mann KG. Role of the membrane surface in the activation of human coagulation factor X. J Biol Chem 1992; 267: 26110-26120.

78. Morrissey JH, Pureza V, vis-Harrison RL, Sligar SG, Rienstra CM, Kijac AZ, Ohkubo YZ, Tajkhorshid E. Protein-membrane interactions: blood clotting on nanoscale bilayers. J Thromb Haemost 2009; 7 Suppl 1:169-172.

79. Mulder AB, Smit JW, Bom VJ, Blom NR, Ruiters MH, Halie MR, van der MJ. Association of smooth muscle cell tissue factor with caveolae. Blood 1996; 88:1306-1313.

80. Bach RR. Tissue factor encryption. Arterioscler Thromb Vase Biol 2006; 26:456-461.

81. Bach RR, Moldow CF. Mechanism of tissue factor activation on HL-60 cells. Blood 1997; 89: 3270-3276.

82. Fair DS. Quantitation of factor VII in the plasma of normal and warfarin-treated individuals by radioimmunoassay. Blood 1983; 62: 784-791.

83. Seligsohn U, Kasper CK, Osterud B, Rapaport SI. Activated factor VII: presence in factor IX concentrates and persistence in the circulation after infusion. Blood 1979; 53: 828837.

84. Girard TJ, Tuley E, Broze GJ, Jr. TFPIbeta is the GPI-anchored TFPI isoform on human endothelial cells and placental microsomes. Blood 2012; 119:1256-1262.

85. Girard TJ, Warren LA, Novotny WF, Likert KM, Brown SG, Miletich JP, Broze GJ, Jr. Functional significance of the Kunitz-type inhibitory domains of lipoprotein-associated coagulation inhibitor. Nature 1989; 338: 518-520.

86. Petersen LC, Björn SE, Olsen OH, Nordfang O, Norris F, Norris K. Inhibitory properties of separate recombinant Kunitz-type-protease-inhibitor domains from tissue-factor-pathway inhibitor. Eur J Biochem 1996; 235: 310-316.

87. Hackeng TM, Rosing J. Protein S as cofactor for TFPI. Arterioscler Thromb Vase Biol 2009; 29: 2015-2020.

88. Ndonwi M, Tuley EA, Broze GJ, Jr. The Kunitz-3 domain of TFPI-alpha is required for protein S-dependent enhancement of factor Xa inhibition. Blood 2010; 116:13441351.

89. Werling RW, Zacharski LR, Kisiel W, Bajaj SP, Memoli VA, Rousseau SM. Distribution of tissue factor pathway inhibitor in normal and malignant human tissues. Thromb Haemost 1993; 69: 366-369.

90. Novotny WF, Girard TJ, Miletich JP, Broze GJ, Jr. Platelets secrete a coagulation inhibitor functionally and antigenically similar to the lipoprotein associated coagulation inhibitor. Blood 1988; 72: 2020-2025.

91. Maroney SA, Haberichter SL, Friese P, Collins ML, Ferrel JP, Dale GL, Mast AE. Active tissue factor pathway inhibitor is expressed on the surface of coated platelets. Blood 2007; 109:1931-1937.

92. Novotny WF, Girard TJ, Miletich JP, Broze GJ, Jr. Purification and characterization of the lipoprotein-associated coagulation inhibitor from human plasma. J Biol Chem 1989; 264:18832-18837.

93. Dahm A, Van H, V, Bendz B, Rosendaal F, Bertina RM, Sandset PM. Low levels of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) increase the risk of venous thrombosis. Blood 2003; 101: 4387-4392.

94. Lindahl AK, Jacobsen PB, Sandset PM, Abildgaard U. Tissue factor pathway inhibitor with high anticoagulant activity is increased in post-heparin plasma and in plasma from cancer patients. Blood Coagul Fibrinolysis 1991; 2:713-721.

95. Hubbard AR, Jennings CA. Inhibition of the tissue factor-factor VII complex:

96. Lesnik P, Vonica A, Guerin M, Moreau M, Chapman MJ. Anticoagulant activity of tissue factor pathway inhibitor in human plasma is preferentially associated with dense subspecies of LDL and HDL and with Lp(a). Arterioscler Thromb 1993; 13:1066-1075.

97. Sandset PM, Abildgaard U, Larsen ML. Heparin induces release of extrinsic coagulation pathway inhibitor (EPI). Thromb Res 1988; 50: 803-813.

98. Broze GJ, Jr., Lange GW, Duffin KL, MacPhail L. Heterogeneity of plasma tissue factor pathway inhibitor. Blood Coagul Fibrinolysis 1994; 5: 551-559.

99. Huang Q, Neuenschwander PF, Rezaie AR, Morrissey JH. Substrate recognition by tissue factor-factor Vila. Evidence for interaction of residues Lysl65 and Lysl66 of tissue factor with the 4-carboxyglutamate-rich domain of factor X. J Biol Chem 1996; 271: 21752-21757.

100. Nemerson Y, Repke D. Tissue factor accelerates the activation of coagulation factor VII: the role of a Afunctional coagulation cofactor. Thromb Res 1985; 40: 351-358.

101. Nakagaki T, Foster DC, Berkner KL, Kisiel W. Initiation of the extrinsic pathway of blood coagulation: evidence for the tissue factor dependent autoactivation of human coagulation factor VII. Biochemistry 1991; 30:10819-10824.

102. Neuenschwander PF, Fiore MM, Morrissey JH. Factor VII autoactivation proceeds via interaction of distinct protease-cofactor and zymogen-cofactor complexes. Implications of a two-dimensional enzyme kinetic mechanism. J Biol Chem 1993; 268: 21489-21492.

103. Monroe DM, Key NS. The tissue factor-factor Vila complex: procoagulant activity, regulation, and multitasking. J Thromb Haemost 2007; 5:1097-1105.

104. Shibeko AM, Woodle SA, Lee TK, Ovanesov MV. Unifying the mechanism of recombinant FVIIa action: dose dependence is regulated differently by tissue factor and phospholipids. Blood 2012; 120: 891-899.

105. Wesselschmidt R, Likert K, Huang Z, MacPhail L, Broze GJ, Jr. Structural requirements for tissue factor pathway inhibitor interactions with factor Xa and heparin. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4: 661-669.

106. Huang ZF, Wun TC, Broze GJ, Jr. Kinetics of factor Xa inhibition by tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem 1993; 268: 26950-26955.

107. Broze GJ, Jr., Warren LA, Novotny WF, Higuchi DA, Girard JJ, Miletich JP. The lipoprotein-associated coagulation inhibitor that inhibits the factor Vll-tissue factor complex also inhibits factor Xa: insight into its possible mechanism of action. Blood 1988; 71: 335-343.

108. Wesselschmidt R, Likert K, Girard T, Wun TC, Broze GJ, Jr. Tissue factor pathway inhibitor: the carboxy-terminus is required for optimal inhibition of factor Xa. Blood 1992; 79: 2004-2010.

109. Hackeng TM, Sere KM, Tans G, Rosing J. Protein S stimulates inhibition of the tissue factor pathway by tissue factor pathway inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 3106-3111.

110. Chang JY, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR. TFPIbeta, a second product from the mouse tissue factor pathway inhibitor (TFPI) gene. Thromb Haemost 1999; 81: 45-49.

111. Chen HH, Vicente CP, He L, Tollefsen DM, Wun TC. Fusion proteins comprising annexin V and Kunitz protease inhibitors are highly potent thrombogenic site-directed anticoagulants. Blood 2005; 105: 3902-3909.

112. Callander NS, Rao LV, Nordfang O, Sandset PM, Warn-Cramer B, Rapaport SI. Mechanisms of binding of recombinant extrinsic pathway inhibitor (rEPI) to cultured cell surfaces. Evidence that rEPI can bind to and inhibit factor Vila-tissue factor complexes in the absence of factor Xa. J Biol Chem 1992; 267:876-882.

113. Pedersen AH, Nordfang O, Norris F, Wiberg FC, Christensen PM, Moeller KB, Meidahl-Pedersen J, BeckTC, Norris K, Hedner U,. Recombinant human extrinsic pathway inhibitor. Production, isolation, and characterization of its inhibitory activity on tissue factor-initiated coagulation reactions. J Biol Chem 1990; 265:16786-16793.

114. Baugh RJ, Broze GJ, Jr., Krishnaswamy S. Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem 1998; 273: 4378-4386.

115. Kuharsky AL, Fogelson AL. Surface-mediated control of blood coagulation: the role of binding site densities and platelet deposition. Biophys J 2001; 80:1050-1074.

116. Panteleev MA, Zarnitsina VI, Ataullakhanov Fl. Tissue factor pathway inhibitor: a possible mechanism of action. Eur J Biochem 2002; 269: 2016-2031.

117. Hamik A, Setiadi H, Bu G, McEver RP, Morrissey JH. Down-regulation of monocyte tissue factor mediated by tissue factor pathway inhibitor and the low density lipoprotein receptor-related protein. J Biol Chem 1999; 274:4962-4969.

118. Sevinsky JR, Rao LV, Ruf W. Ligand-induced protease receptor translocation into caveolae: a mechanism for regulating cell surface proteolysis of the tissue factor-dependent coagulation pathway. J Cell Biol 1996; 133: 293-304.

119. Crawley JT, Lane DA. The haemostatic role of tissue factor pathway inhibitor. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 233-242.

120. van ', V, Mann KG. Regulation of tissue factor initiated thrombin generation by the stoichiometric inhibitors tissue factor pathway inhibitor, antithrombin-lll, and heparin cofactor-ll. J Biol Chem 1997; 272: 4367-4377.

121. Mann KG, van't VC, Cawthern K, Butenas S. The role of the tissue factor pathway in initiation of coagulation. Blood Coagul Fibrinolysis 1998; 9 Suppl 1: S3-S7.

122. Mann KG, Orfeo T, Butenas S, Undas A, Brummel-Ziedins K. Blood coagulation dynamics in haemostasis. Hamostaseologie 2009; 29: 7-16.

123. Hockin MF, Jones KC, Everse SJ, Mann KG. A model for the stoichiometric regulation of blood coagulation. J Biol Chem 2002; 277:18322-18333.

124. Jesty J, Beltrami E. Positive feedbacks of coagulation: their role in threshold regulation. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005; 25: 2463-2469.

125. Huang ZF, Higuchi D, Lasky N, Broze GJ, Jr. Tissue factor pathway inhibitor gene disruption produces intrauterine lethality in mice. Blood 1997; 90: 944-951.

126. Chan JC, Carmeliet P, Moons L, Rosen ED, Huang ZF, Broze GJ, Jr., Collen D, Castellino FJ. Factor VII deficiency rescues the intrauterine lethality in mice associated with a tissue factor pathway inhibitor deficit. J Clin Invest 1999; 103:475-482.

127. Pedersen B, Holscher T, Sato Y, Pawlinski R, Mackman N. A balance between tissue factor and tissue factor pathway inhibitor is required for embryonic development and hemostasis in adult mice. Blood 2005; 105: 2777-2782.

128. Eitzman DT, Westrick RJ, Bi X, Manning SL, Wilkinson JE, Broze GJ, Ginsburg D. Lethal perinatal thrombosis in mice resulting from the interaction of tissue factor pathway inhibitor deficiency and factor V Leiden. Circulation 2002; 105: 2139-2142.

129. Duering C, Kosch A, Langer C, Thedieck S, Nowak-Gottl U. Total tissue factor pathway inhibitor is an independent risk factor for symptomatic paediatric venous thromboembolism and stroke. Thromb Haemost 2004; 92:707-712.

130. Knottnerus IL, Winckers K, Ten CH, Hackeng TM, Lodder J, Rouhl RP, Staals J, Govers-Riemslag JW, Bekers O, van Oostenbrugge RJ. Levels of heparin-releasable TFPI are increased in first-ever lacunar stroke patients. Neurology 2012; 78:493-498.

131. Ariens RA, Alberio G, Moia M, Mannucci PM. Low levels of heparin-releasable tissue factor pathway inhibitor in young patients with thrombosis. Thromb Haemost 1999; 81: 203-207.

132. Bladbjerg EM, Madsen JS, Kristensen SR, Abrahamsen B, Brixen K, Mosekilde L, Jespersen J. Effect of long-term hormone replacement therapy on tissue factor pathway inhibitor and thrombin activatable fibrinolysis inhibitor in healthy postmenopausal women: a randomized controlled study. J Thromb Haemost 2003; 1: 1208-1214.

133. Harris GM, Stendt CL, Vollenhoven BJ, Gan TE, Tipping PG. Decreased plasma tissue factor pathway inhibitor in women taking combined oral contraceptives. Am J Hematol 1999; 60:175-180.

134. Bladbjerg EM, Skouby SO, Andersen LF, Jespersen J. Effects of different progestin regimens in hormone replacement therapy on blood coagulation factor VII and tissue factor pathway inhibitor. Hum Reprod 2002; 17: 3235-3241.

135. Luyer MD, Khosla S, Owen WG, Miller VM. Prospective randomized study of effects of unopposed estrogen replacement therapy on markers of coagulation and inflammation in postmenopausal women. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86:36293634.

136. Peverill RE, Teede HJ, Smolich JJ, Malan E, Kotsopoulos D, Tipping PG, McGrath BP. Effects of combined oral hormone replacement therapy on tissue factor pathway inhibitor and factor VII. Clin Sci (Lond) 2001; 101: 93-99.

137. mini-Nekoo A, Futers TS, Moia M, Mannucci PM, Grant PJ, Ariens RA. Analysis of the tissue factor pathway inhibitor gene and antigen levels in relation to venous thrombosis. Br J Haematol 2001; 113:537-543.

138. Hoke M, Kyrle PA, Minar E, Bialonzcyk C, Hirschl M, Schneider B, Kollars M, Weltermann A, Eichinger S. Tissue factor pathway inhibitor and the risk of recurrent venous thromboembolism. Thromb Haemost 2005; 94: 787-790.

139. Sidelmann JJ, Bladbjerg EM, Gram J, Munster AM, Jespersen J. Tissue factor pathway inhibitor relates to fibrin degradation in patients with acute deep venous thrombosis. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19: 405-409.

140. Asakura H, Ontachi Y, Mizutani T, Kato M, Saito M, Morishita E, Yamazaki M, Suga Y, Takami A, Miyamoto K, Nakao S. Elevated levels of free tissue factor pathway inhibitor antigen in cases of disseminated intravascular coagulation caused by various underlying diseases. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12:1-8.

141. Takahashi H, Sato N, Shibata A. Plasma tissue factor pathway inhibitor in disseminated intravascular coagulation: comparison of its behavior with plasma tissue factor. Thromb Res 1995; 80: 339-348.

142. Velasco F, Lopez-Pedrera C, Borrell M, Fontcuberta J, Torres A. Elevated levels of tissue factor pathway inhibitor in acute non-lymphoblastic leukemia patients with disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul Fibrinolysis 1997; 8: 70-72.

143. Novotny WF, Brown SG, Miletich JP, Rader DJ, Broze GJ, Jr. Plasma antigen levels of the lipoprotein-associated coagulation inhibitor in patient samples. Blood 1991; 78: 387393.

144. Dockal M, Knappe S, Palige M, Panholzer-Riedrich K, Kolm A, Hartmann R, and et al. The procoagulant activity of BAX513 correlates with the plasma level of full-length tissue factor pathway inhibitor (TFPI). ISTH 2011, Conference Proceedings.

145. Ariens RA. The quest for the Holy Grail of tissue factor pathway inhibitor deficiency has just begun. J Thromb Haemost 2005; 3: 649-650.

146. Duckers C, Simioni P, Spiezia L, Radu C, Gavasso S, Rosing J, Castoldi E. Low plasma levels of tissue factor pathway inhibitor in patients with congenital factor V deficiency. Blood 2008; 112: 3615-3623.

147. Castoldi E, Simioni P, Tormene D, Rosing J, Hackeng TM. Hereditary and acquired protein S deficiencies are associated with low TFPI levels in plasma. J Thromb Haemost 2010; 8: 294-300.

148. Dahm AE, Sandset PM, Rosendaal FR. The association between protein S levels and anticoagulant activity of tissue factor pathway inhibitor type 1. J Thromb Haemost 2008; 6: 393-395.

149. Dahm AE, Bezemer ID, Sandset PM, Rosendaal FR. Interaction between tissue factor pathway inhibitor and factor V levels on the risk of venous thrombosis. J Thromb Haemost 2010; 8:1130-1132.

150. Tardy-Poncet B, Piot M, Chapelle C, Berger C, Tardy B. Difference in TFPI levels between haemophilia A and B patients. Haemophilia 2011; 17: 312-313.

151. Lenting PJ, van Mourik JA, Mertens K. The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function. Blood 1998; 92: 3983-3996.

152. Баркаган Е.С. Геморрагические заболевания и синдромы. М., Медицина.

153. Soucie JM, Evatt В, Jackson D. Occurrence of hemophilia in the United States. The Hemophilia Surveillance System Project Investigators. Am J Hematol 1998; 59: 288294.

154. Giannelli F, Choo KH, Rees DJ, Boyd Y, Rizza CR, Brownlee GG. Gene deletions in patients with haemophilia В and anti-factor IX antibodies. Nature 1983; 303:181-182.

155. White GC, Rosendaal F, Aledort LM, Lusher JM, Rothschild C, IngerslevJ. Definitions in hemophilia. Recommendation of the scientific subcommittee on factor VIII and factor IX of the scientific and standardization committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost 2001; 85: 560.

156. Konkle BA, Josephson NC, Nakaya Fletcher SM, Thompson AR. Hemophilia A. 1993.

157. Rizza CR, Spooner RJ. Treatment of haemophilia and related disorders in Britain and Northern Ireland during 1976-80: report on behalf of the directors of haemophilia centres in the United Kingdom. Br Med J (Clin Res Ed) 1983; 286: 929-933.

158. van DK, van der Bom JG, Lenting PJ, de Groot PG, Mauser-Bunschoten EP, Roosendaal G, Grobbee DE, van den Berg HM. Factor VIII half-life and clinical phenotype of severe hemophilia A. Haematologica 2005; 90: 494-498.

159. Sallah S. Inhibitors to clotting factors. Ann Hematol 1997; 75:1-7.

160. Kurnik K, Bidlingmaier C, Engl W, Chehadeh H, Reipert B, Auerswald G. New early prophylaxis regimen that avoids immunological danger signals can reduce FVIII inhibitor development. Haemophilia 2010; 16: 256-262.

161. Ghosh K, Shetty S. Immune response to FVIII in hemophilia A: an overview of risk factors. Clin Rev Allergy Immunol 2009; 37: 58-66.

162. Franchini M. Thrombotic complications in patients with hereditary bleeding disorders. Thromb Haemost 2004; 92: 298-304.

163. Gale AJ, Pellequer JL. An engineered interdomain disulfide bond stabilizes human blood coagulation factor Villa. J Thromb Haemost 2003; 1:1966-1971.

164. Gale AJ, Radtke KP, Cunningham MA, Chamberlain D, Pellequer JL, Griffin JH. Intrinsic stability and functional properties of disulfide bond-stabilized coagulation factor Villa variants. J Thromb Haemost 2006; 4:1315-1322.

165. Kopecky EM, Greinstetter S, Pabinger I, Buchacher A, Romisch J, Jungbauer A. Effect of oriented or random PEGylation on bioactivity of a factor VIII inhibitor blocking peptide. Biotechnol Bioeng 2006; 93: 647-655.

166. Baru M, Carmel-Goren L, Barenholz Y, Dayan I, Ostropolets S, Slepoy I, Gvirtzer N, Fukson V, Spira J. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Thromb Haemost 2005; 93:1061-1068.

167.

168.

169.

170.

171.

172.

173.

174.

175.

176.

177.

178.

179.

180.

181.

#

Wk

Spira J, Plyushch OP, Andreeva TA, Andreev Y. Prolonged bleeding-free period following prophylactic infusion of recombinant factor VIII reconstituted with pegylated liposomes. Blood 2006; 108: 3668-3673.

Hay CR, Negrier C, Ludlam CA. The treatment of bleeding in acquired haemophilia with recombinant factor Vila: a multicentre study. Thromb Haemost 1997; 78:1463-1467.

Hedner U, Kisiel W. Use of human factor Vila in the treatment of two hemophilia A patients with high-titer inhibitors. J Clin Invest 1983; 71:1836-1841.

Hedner U, Ginsburg D, Lusher JM, High KA. Congenital Hemorrhagic Disorders: New Insights into the Pathophysiology and Treatment of Hemophilia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2000; 241-265.

Dargaud Y, Lienhart A, Negrier C. Prospective assessment of thrombin generation test for dose monitoring of bypassing therapy in hemophilia patients with inhibitors undergoing elective surgery. Blood 2010; 116: 5734-5737.

Berntorp E, Collins P, D'Oiron R, Ewing N, Gringeri A, Negrier C, Young G. Identifying non-responsive bleeding episodes in patients with haemophilia and inhibitors: a consensus definition. Haemophilia 2011; 17: e202-e210.

Hay CR. Thrombosis and recombinant factor Vila. J Thromb Haemost 2004; 2:16981699.

Peerlinck K, Vermylen J. Acute myocardial infarction following administration of recombinant activated factor VII (Novo Seven) in a patient with haemophilia A and inhibitor. Thromb Haemost 1999; 82:1775-1776.

Hedner U. Recombinant factor Vila (NovoSeven) as a hemostatic agent. Dis Mon 2003; 49: 39-48.

van ', V, Golden NJ, Mann KG. Inhibition of thrombin generation by the zymogen factor VII: implications for the treatment of hemophilia A by factor Vila. Blood 2000; 95: 1330-1335.

Monroe DM, Hoffman M, Oliver JA, Roberts HR. Platelet activity of high-dose factor Vila is independent of tissue factor. Br J Haematol 1997; 99: 542-547.

Turecek PL, Varadi K, Gritsch H, Auer W, Pichler L, Eder G, Schwarz HP. Factor Xa and prothrombin: mechanism of action of FEIBA. Vox Sang 1999; 77 Suppl 1: 72-79.

Gallistl S, Cvirn G, Leschnik B, Muntean W. Respective roles of factors II, VII, IX, and X in the procoagulant activity of FEIBA. Blood Coagul Fibrinolysis 2002; 13: 653-655.

Himmelspach M, Richter G, Muhr E, Varadi K, Turecek PL, Dorner F, Schwarz HP, Schlokat U. A fully recombinant partial prothrombin complex effectively bypasses fVlll in vitro and in vivo. Thromb Haemost 2002; 88:1003-1011.

IMPORTANT DRUG WARNING Risk of thrombotic and thromboembolic events following infusion of FEIBA VH or FEIBA NF, particularly following the administration of high doses and/or in patients with thrombotic risk factors. 2013. http://www.fda.gov/downloads/Biolo-gics/SafetvAvalability/UCM221755.pdf.

182.

183.

184.

185,

186,

187,

188

189,

190,

191,

192,

193,

194,

fS,

1*1

Roth DA, Tawa NE, Jr., O'Brien JM, Treco DA, Selden RF. Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. N Engl J Med 2001; 344:1735-1742.

Powell JS, Ragni MV, White GC, Lusher JM, Hillman-Wiseman C, Moon TE, Cole V, Ramanathan-Girish S, Roehl H, Sajjadi N, Jolly DJ, Hurst D. Phase 1 trial of FVIII gene transfer for severe hemophilia A using a retroviral construct administered by peripheral intravenous infusion. Blood 2003; 102: 2038-2045.

Andrews JL, Shirley PS, Iverson WO, Sherer AD, Markovits JE, King L, Lyons RM, Kaleko M, Connelly S. Evaluation of the duration of human factor VIII expression in nonhuman primates after systemic delivery of an adenoviral vector. Hum Gene Ther 2002; 13: 1331-1336.

Chuah MK, SchiednerG, Thorrez L, Brown B, Johnston M, Gillijns V, Hertel S, Van RN, Lillicrap D, Collen D, VandenDriessche T, Kochanek S. Therapeutic factor VIII levels and negligible toxicity in mouse and dog models of hemophilia A following gene therapy with high-capacity adenoviral vectors. Blood 2003; 101:1734-1743.

Nordfang O, Valentin S, Beck TC, Hedner U. Inhibition of extrinsic pathway inhibitor shortens the coagulation time of normal plasma and of hemophilia plasma. Thromb Haemost 1991; 66: 464-467.

Welsch DJ, Novotny WF, Wun TC. Effect of lipoprotein-associated coagulation inhibitor (LACI) on thromboplastin-induced coagulation of normal and hemophiliac plasmas. Thromb Res 1991; 64: 213-222.

van ', V, HackengTM, Delahaye C, Sixma JJ, Bouma BN. Activated factor X and thrombin formation triggered by tissue factor on endothelial cell matrix in a flow model: effect of the tissue factor pathway inhibitor. Blood 1994; 84:1132-1142.

Erhardtsen E, Ezban M, Madsen MT, Diness V, Glazer S, Hedner U, Nordfang O. Blocking of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) shortens the bleeding time in rabbits with antibody induced haemophilia A. Blood Coagul Fibrinolysis 1995; 6: 388-394.

Broze GJ, Jr. The rediscovery and isolation of TFPI. J Thromb Haemost 2003; 1:16711675.

Johnson K, Hung D. Novel anticoagulants based on inhibition of the factor Vila/tissue factor pathway. Coron Artery Dis 1998; 9: 83-87.

Novotny WF, Palmier M, Wun TC, Broze GJ, Jr., Miletich JP. Purification and properties of heparin-releasable lipoprotein-associated coagulation inhibitor. Blood 1991; 78: 394-400.

Liu T, Scallan CD, Broze GJ, Jr., Patarroyo-White S, Pierce GF, Johnson KW. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Thromb Haemost 2006; 95: 68-76.

Prasad S, Lillicrap D, Labelle A, Knappe S, Keller T, Burnett E, Powell S, Johnson KW. Efficacy and safety of a new-class hemostatic drug candidate, AV513, in dogs with hemophilia A. Blood 2008; 111: 672-679.

195. Michael Dockal, R.Hartmann, T.Polakowski, F.Osterkamp, W.Kammlander, E.Panholzer, A.Kolm, C.Redl, H.Ehrllich, and F.Scheiflinger. Improvement of hemostasis in hemophilia by peptides inhibiting tissue factor pathway inhibitor. 2013. ISTH 2011 Conference proceedings.

196. Waters EK, Genga RM, Schwartz MC, Nelson JA, Schaub RG, Olson KA, Kurz JC, McGinness KE. Aptamer ARC19499 mediates a procoagulant hemostatic effect by inhibiting tissue factor pathway inhibitor. Blood 2011; 117: 5514-5522.

197. Chang JY, Chantrathammachart P, Monroe DM, Key NS. Studies on the mechanism of action of the aptamer BAX499, an inhibitor of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Res 2012; 130: el51-el57.

198. Gissel M, Orfeo T, Foley JH, Butenas S. Effect of BAX499 aptamer on tissue factor pathway inhibitor function and thrombin generation in models of hemophilia. Thromb Res 2012; 130: 948-955.

199. Gorczyca ME, Nair SC, Jilma B, Priya S, Male C, Reitter S, Knoebl P, Gilbert JC, Schaub RG, Dockal M, McGinness KE, Pabinger I, Srivastava A. Inhibition of tissue factor pathway inhibitor by the aptamer BAX499 improves clotting of hemophilic blood and plasma. J Thromb Haemost 2012; 10:1581-1590.

200. Shenbagapriya P, Nair Sukesh Chandran, Devadarshini Mercy, Abraham Aby, Mathews Vikram, and Srivastava Alok. Aptamer BAX499, a potent and specific inhibitor of TFPI, corrects hemostasis parameters of hemophilic blood. ISTH 2011 Conference Proceedings. 2013.

201. First-in-Human and Proof-of-Mechanism Study of ARC19499 Administered to Hemophilia Patients. 2013. http://clinicaltrials.gov/ct2/show/results/NCT01191372.

202. Michael Dockal, S.Knappe, M.Palige, K.Panholzer-Riedrich, A.Kolm, R.Hartmann, M.Gorczyca, B.Jilma, and F.Scheifli. The procoagulant activity of BAX513 correlates with the plasma level of full-length tissue factor pathway inhibitor (TFPI). 2013. ISTH 2011 Conference Proceedings.

203. Michael Dockal, M.C.L.G.D.Thomassen, M.C.L.G.D.Thomassen, C.Duckers, R.Hartmann, F.Scheiflinger, and J.Rosing. Inhibition of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) by small peptides protects FXa and enhances FXa and thrombin formation in model systems and in plasma. 2013. ISTH 2011 Conference Proceedings.

204. Michael Dockal, M.Fries, J.Brandstetter, M.Ludwiczek, G.Kontaxis, K.Prohaska, A.Hofbauer, W.Kammlander, R.Hartmann, H.Ehrlich, and Fritz Scheiflinger. Peptides binding ti Kunitz domain 1 of tissue factor pathway inhibitor inhibit the interaction with factor Xa. 2013. 2011 Conference Proceedings.

205. Michael Dockal, Sabine Knappe, SusanneTill, Michael Palige, Christina Miki Szabo, Zhenqing Zhang, Klara Michalkova, Hartmut Ehrlich, and Friedrich Scheiflinger. Structural and functional characterisation of non-anticoagulant sulfated polysaccharides for the treatment of hemophilia. 2013. ISTH 2011 Conference Proceedings.

206. Werner Hoellriegl, Michael Dockal, Alexandra Schiviz, John Philip Lawo, Dagmar Verdino, Peter Leidenmuehler, Hans-Peter Schwarz, Hartmut Ehrlich, Rudolf

i

207.

208,

209,

210,

211,

212,

213,

214,

215,

216,

217,

218

219

Hartmann, Eva-Maria Muchitsch, and Friedrich Scheiflinger. Inhibition of tfpi efficiently improves hemostasis in hemophilic mice. 2013. ISTH 2011 Conference Proceedings.

Hilden I, Lauritzen B, Sorensen BB, Clausen JT, Jespersgaard C, Krogh BO, Bowler AN, Breinholt J, Gruhler A, Svensson LA, Petersen HH, Petersen LC, Balling KW, Hansen L, Hermit MB, Egebjerg T, Friederichsen B, Ezban M, Bjom SE. Hemostatic effect of a monoclonal antibody mAb 2021 blocking the interaction between FXa and TFPI in a rabbit hemophilia model. Blood 2012; 119: 5871-5878.

Dockal M, Hartmann R, Fries M, Prohaska K, Pachlinger R, Polakowski T, Brandstetter H, and Scheiflinger F. Structure of a cyclic peptide binding to Kunitz domain 1 and 2 inhibiting tissue factor pathway inhibitor (TFPI). 2013. ISTH 2013 Conference Proceedings.

Petersen LC. Hemostatic properties of a TFPI antibody. Thromb Res 2012; 129 Suppl 2: S44-S45.

Peterson L, Hilden I, Bjorn S, and Sorensen B. Blocking of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) with mAb 2021 promotes thrombin generation in FVIII deficient plasma. 2013. ISTH 2011 Conference proceedings.

Chowdary P, Friedrich U, Lethagen S, and Angchaisuksiri P. A new treatment concept for haemophilia: Safety, pharmacokinetics and pharmacodynamics of single i.v. and s.c. doses of a monoclonal anti-TFPI antibody in healthy males and haemophilia subjects. 2013. ISTH 2013 Conference Proceedings.

Safety of NNC 0172-0000-2021 in Healthy Male Subjects and Subjects With Haemophilia A or B (Explorer 1). 2013. http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01228669.

Investigation of the Pharmacokinetics of NNC172-2021, at Two Different Dose Levels, in Healthy Japanese Subjects. 2013. http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01555749.

Maroney SA, Cooley BC, Ferrel JP, Bonesho CE, Nielsen LV, Johansen PB, Hermit MB, Petersen LC, Mast AE. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109: 39273931.

Dejana E, Villa S, de GG. Bleeding time in rats: a comparison of different experimental conditions. Thromb Haemost 1982; 48:108-111.

Kurz KD, Main BW, Sandusky GE. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res 1990; 60: 269-280.

Mann KG, Brummel-Ziedins K, OrfeoT, Butenas S. Models of blood coagulation. Blood Cells Mol Dis 2006; 36:108-117.

Collins PW, Macchiavello LI, Lewis SJ, Macartney NJ, Saayman AG, Luddington R, Baglin T, Findlay GP. Global tests of haemostasis in critically ill patients with severe sepsis syndrome compared to controls. Br J Haematol 2006; 135: 220-227.

Luddington RJ. Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol 2005; 27: 81-90.

fl^i' hi

W '' 1

nv

•V »,

n

220.

221,

222,

223,

224.

225.

226.

227,

228

229

230,

231,

232,

233.

234,

1,1

#

Nielsen VG, Lyerly RT, III, Gurley WQ. The effect of dilution on plasma coagulation kinetics determined by thrombelastography is dependent on antithrombin activity and mode of activation. Anesth Analg 2004; 99:1587-92, table.

Salooja N, Perry DJ. Thrombelastography. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: 327-337.

MacDonald SG, Luddington RJ. Critical factors contributing to the thromboelastography trace. Semin Thromb Hemost 2010; 36: 712-722.

Alexander DC, Butt WW, Best JD, Donath SM, Monagle PT, Shekerdemian LS. Correlation of thromboelastography with standard tests of anticoagulation in paediatric patients receiving extracorporeal life support. Thromb Res 2010; 125:387392.

Hemker HC, Béguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Béguin S. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb Haemost 2000; 83: 589-591.

Hemker HC, Giesen P, AIDieri R, Regnault V, de SE, Wagenvoord R, LecompteT, Beguin S. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyperand hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32: 249-253.

Hemker HC, Al DR, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr Opin Hematol 2004; 11:170-175.

Hemker HC, Al DR, De SE, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006; 96: 553-561.

Al DR, de LB, Hemker HC. Thrombin generation: what have we learned? Blood Rev 2012; 26:197-203.

Runyon MK, Kastrup CJ, Johnson-Kerner BL, Ha TG, Ismagilov RF. Effects of shear rate on propagation of blood clotting determined using microfluidics and numerical simulations. J Am Chem Soc 2008; 130: 3458-3464.

Shen F, Kastrup G, Ismagilov RF. Using microfluidics to understand the effect of spatial distribution of tissue factor on blood coagulation. Thromb Res 2008; 122 Suppl 1: S27-S30.

Shen F, Kastrup CJ, Liu Y, Ismagilov RF. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2035-2041.

Fogelson AL, Hussain YH, Leiderman K. Blood clot formation under flow: the importance of factor XI depends strongly on platelet count. Biophys J 2012; 102:10-18.

Атауллаханов ФИ, Волкова РИ, Гурия ГТ, and Сарбаш ВИ. Пространственные аспекты свертывания крови. III. Рост сгустков in vitro. 2013. Биофизика 1995; 1320-1328., 40.

235. Ataullakhanov Fl, Guria GT, Sarbash VI, Volkova Rl. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim Biophys Acta 1998; 1425:453468.

236. Kastrup CJ, Runyon MK, Shen F, Ismagilov RF. Modular chemical mechanism predicts spatiotemporal dynamics of initiation in the complex network of hemostasis. Proc Natl AcadSci USA 2006; 103:15747-15752.

237. Faxalv L, Tengvall P, Lindahl TL. Imaging of blood plasma coagulation and its propagation at surfaces. J Biomed Mater Res A 2008; 85:1129-1134.

238. Hoffman M, Monroe DM, III. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001; 85: 958-965.

239. Hoffman M, Monroe DM, III. The action of high-dose factor Vila (FVIIa) in a cell-based model of hemostasis. Dis Mon 2003; 49:14-21.

240. Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am 2007; 21:1-11.

241. Sinauridze El, Kireev DA, Popenko NY, Pichugin AV, Panteleev MA, Krymskaya OV, Ataullakhanov Fl. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007; 97: 425434.

242. Balandina AN, Shibeko AM, Kireev DA, Novikova AA, Shmirev II, Panteleev MA, Ataullakhanov Fl. Positive feedback loops for factor V and factor VII activation supply sensitivity to local surface tissue factor density during blood coagulation. Biophys J 2011; 101:1816-1824.

243. Khanin MA, Rakov DV, Kogan AE. Mathematical model for the blood coagulation prothrombin time test. Thromb Res 1998; 89: 227-232.

244. Broze GJ, Jr. Tissue factor pathway inhibitor and the current concept of blood coagulation. Blood Coagul Fibrinolysis 1995; 6 Suppl 1: S7-13.

245. Пантелеев MA, Зарницина ВИ, Морозова O/l, Лобанов АИ, Ованесов MB, Коротина НГ, Лобанова ЕС, and Атауллаханов ФИ. Математическое моделирование пространственно-временной динамики свертывания крови. 2013. Труды межд. конф. "Параллельные вычисления и задачи управления".

246. Shibeko AM, Lobanova ES, Panteleev MA, Ataullakhanov Fl. Blood flow controls coagulation onset via the positive feedback of factor VII activation by factor Xa. BMC Syst Biol 2010; 4: 5.

247. Fogelson AL, Tania N. Coagulation under flow: the influence of flow-mediated transport on the initiation and inhibition of coagulation. Pathophysiol Haemost Thromb 2005; 34: 91-108.

248. Jones КС, Mann KG. A model for the tissue factor pathway to thrombin. II. A mathematical simulation. J Biol Chem 1994; 269: 23367-23373.

249. Krasotkina YV, Sinauridze El, Ataullakhanov Fl. Spatiotemporal dynamics of fibrin formation and spreading of active thrombin entering non-recalcified plasma by diffusion. Biochim BiophysActa 2000; 1474: 337-345.

250. Sinauridze El, Volkova Rl, Krasotkina YV, Sarbash VI, Ataullakhanov Fl. Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim BiophysActa 1998; 1425: 607-616.

251. Heil W, Grunewald R, Amend M, Heins M. Influence of time and temperature on coagulation analytes in stored plasma. Clin Chem Lab Med 1998; 36:459-462.

252. Ованесов MB. Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 2002.

253. Карамзин СС. Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка iv-vitro. 2013. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва 2010.

254. Campbell RA, Overmyer КА, Bagnell CR, Wolberg AS. Cellular procoagulant activity dictates clot structure and stability as a function of distance from the cell surface. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2247-2254.

255. Marx G, Blankenfeld A. Kinetic and mechanical parameters of pure and cryoprecipitate fibrin. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4: 73-78.

256. Weisel JW, Nagaswami C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophys J 1992; 63:111-128.

257. Monroe DM, Hoffman M, Oliver JA, Roberts HR. A possible mechanism of action of activated factor VII independent of tissue factor. Blood Coagul Fibrinolysis 1998; 9 Suppl 1: S15-S20.

258. Zwaginga JJ, de Boer HC, IJsseldijk MJ, Kerkhof A, Muller-Berghaus G, Gruhlichhenn J, Sixma JJ, de Groot PG. Thrombogenicity of vascular cells. Comparison between endothelial cells isolated from different sources and smooth muscle cells and fibroblasts. Arteriosclerosis 1990; 10: 437-448.

259. Hatakeyama K, Asada Y, Marutsuka K, Sato Y, Kamikubo Y, Sumiyoshi A. Localization and activity of tissue factor in human aortic atherosclerotic lesions. Atherosclerosis 1997; 133: 213-219.

260. Okorie UM, Denney WS, Chatterjee MS, Neeves KB, Diamond SL. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood 2008; 111: 3507-3513.

261. Klintman J, Astermark J, Berntorp E. Combination of FVIII and by-passing agent potentiates in vitro thrombin production in haemophilia A inhibitor plasma. Br J Haematol 2010; 151: 381-386.

262. Livnat T, Martinowitz U, Zivelin A, Seligsohn U. Effects of factor VIII inhibitor bypassing activity (FEIBA), recombinant factor Vila or both on thrombin generation in normal and haemophilia A plasma. Haemophilia 2008; 14: 782-786.

263. Dockal M, Knappe S, Palige M, Panholzer-Riedrich K, Kolm A, Hartmann R, Gorczyca M, Jilma B, and Scheiflinger F. High plasma levels of endogenous tissue factor pathway inhibitor strongly correlate with poor blood clotting when factor fVIII is inhibited. 2013. ISTH 2011 Conference Proceeding.

264. Butenas, S., Gissel, M., Thomas, 0, and Mann, K. G. Tissue factor pathway inhibitor aptamer as a potential drug for hemophilia treatment. 2013. ISTH 2011 Conference Proceedings.